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Tema 1 ADN recombinante

Manipulacin in vitro de cidos nucleicos (ADN) Enzimas que actan sobre cidos nucleicos: protenas purificadas extradas de bacterias. De manera natural forman parte del ciclo celular normal. - ADN polimerasas: sintetizan ADN - Nucleasas: cortan o degradan - Enzimas de modificacin de extremos: para conseguir residuos concretos - Ligasas: unen fragmentos de ADN Nucleasas Enzimas que degradan ADN y/ o ARN rompiendo los enlaces fosfodister entre nucletidos. Se clasifican segn su actividad: - Exonucleasas: eliminan nucletidos de los extremos hacia el interior de la molcula. No ataca a molculas circulares. - Endonucleasas: cortan en medio de la molcula o cadena

Pueden ser especficas de ADN o ARN, de cadena simple (ss) o doble (ds) Ejemplos: Exonucleasa del fago : ADN ds 5 3 Exonucleasa III: ADN ds 3 5 Nucleasa Bal31: exonucleasa 3 5 especfica de ADN ds. Tambin es endonucleasa sobre ARN ss Nucleasa S1: endonucleasa de ss, tanto ADN como ARN. Tambin corta la segunda cadena de molcula ds cuando hay una muesca DNasa I: especfica de ADN. Corta preferentemente en pirimidinas (C y T). Uso en produccin de muescas y mapeo de unin de protenas. Endonucleasa RNasa A: especfica de ARN ss. Elimina ARN presente en preparaciones de ADN y la cadena de ARN en un hbrido ADN: ARN RNasa H: actividades endonucleasa, exo 5 3 y exo 3 5 sobre ARN presente en hbridos hbrido ADN:ARN

Endonucleasas de restriccin o restrictivas

Catalizan el corte de molculas de ADNds en sitios especficos. Los fragmentos obtenidos son especficos y se denominan fragmentos de restriccin. Reconocen una secuencia corta bicatenaria: sitio o diana de restriccin

2 Forman parte de los sistemas de restriccin-modificacin (RM) bacterianos, no ataca al ADN bacteriano porque est metilado. Defensa /proteccin frente a la entrada de ADN extrao. Sistemas RM Desempean, en la clula bacteriana, una funcin de proteccin gentica, dirigida a impedir el establecimiento en su interior de material gentico exgeno que pudiera codificar productos capaces de alterar la vida celular. El sistema incorpora dos actividades enzimticas ambas con una misma especificidad de secuencia. - Metilasa: metil-transferasa (M). la metilacin protege al ADN en sitios especficos - Endonucleasa (R): cataliza la rotura de las dos hebras de ADN si no se encuentra metilada al menos una de ellas. El sitio o diana de reconocimiento es una corta secuencia de pares de bases, constituido por las dos hebras Hay tres tipos de sistemas RM: 9 Sistemas RM tipo I: tienen tres subunidades (metilasa, restrictasa y especificidad). Reconocen y metilan una secuencia, pero el corte se produce fuera de la diana de reconocimiento y en secuencia no especfica 9 Sistemas RM tipo III: tienen dos subunidades: metilacin /especificidad y restriccin. El corte se produce fuera de la diana de reconocimiento. 9 Sistemas RM tipo II: Actividad restrictasa y metilasa en protenas distintas. Reconocen y actan sobre la misma secuencia (diana de reconocimiento). Rotura en sitios especficos y definidos. Tipos I y III Tipo II

Endonucleasas de restriccin tipo II

Son de una gran especificidad, actan sobre una diana concreta Nomenclatura: EcoRI - 3 primeras letras indican gnero y especie de donde se aisl - 4 letra indica cepa - Nmero romano indica orden de aislamiento Dianas - Secuencia ADNds: cataliza la hidrlisis simultnea de las dos hebras de un ADN bicatenario y no acta sobre estructuras monohebra. - Entre 4-8 bp (pueden ser ms). Constituida por una secuencia especfica de algunos pares de bases. - Generalmente palindrmicas Punto de rotura simtrico respecto del eje de la diana, uno en cada hebra. Pueden producir extremos: - Romos: rotura en enlaces enfrentados - Cohesivos (5 protuberantes o 3 protuberantes): rotura en enlaces no enfrentados

5 protuberantes

3 protuberantes

Romos

Cohesivos

4 Enzimas que producen extremos compatibles

Isosquizmeros Reconocen y cortan la misma secuencia, en algunos casos de manera distinta, comparten el sitio de restriccin. CCC GGG C GGGCC GGG CCC CCGGG C SmaI XmaI

CCCGGG GGGCCC

Ambas enzimas reconocen y cortan la misma secuencia, en algunos casos de manera distinta. SmaI rompe por puntos enfrentados, por el enlace central de la diana, y XmaI rompe entre la primera y la segunda C. Endonucleasas de especificidad relajada. En alguna posicin de la diana no requiere base especifica, sino que acepta ms de una. La relajacin de la especificidad aumenta la probabilidad de aparicin de la diana, por tanto el tamao medio de los fragmentos obtenidos sern ms pequeos.

AvaI CauI

CYCGRG CCSGG

HaeI BspCI

WGGCCW GCNNNNGC

Y: pirimidina (C/T) R: purina (A/G) S: G/C W: A/T N: cualquiera

Anlisis y separacin de fragmentos de ADN mediante electroforesis

Migracin de molculas de ADN a travs de un soporte reticulado (matriz) dentro de un tampn por accin de un campo elctrico. El comportamiento de una molcula viene definido por su movilidad electrofortica, que depende de la carga, el tamao y la forma de la misma. Matriz Soporte reticulado a travs del cual se desplazan las molculas que se analizan. El entramado tridimensional forma poros cuyas dimensiones deben permitir el paso de las molculas. Un entramado denso produce poros pequeos y las molculas de tamao similar o mayor encuentran gran resistencia y se retrasan . Agarosa: polisacrido de estructura lineal, derivado de algas. Insoluble a temperatura ambiente, pero soluble a 100 C. Cuando se enfra gelifica. Por sus poros pueden desplazarse molculas con dimensiones medias (hasta 40-50 kb) Poliacrilamida: polmero formado por acrilamida y N, N-metilbisacrilamida. La concentracin de ambos reactivos define el grado de reticulacin del gel. Son estables qumica y mecnicamente en un

5 amplio rango de pH y temperatura. Polimeriza mediante agentes qumicos. Presenta mayor poder de separacin al permitir una mayor densidad de reticulacin, una red ms tupida y unos poros menores. Se suele aplicar al anlisis de fragmentos pequeos (5-500 pb), por ejemplo el aislamiento y purificacin de pequeos fragmentos de ADN amplificados y de secuenciacin. Permite separar fragmentos de cidos nucleicos que se diferencian en 1 nucletido. Tampn Ofrece una conductividad apropiada en el medio, mediante la aportacin de una concentracin moderada de iones, y para mantener un valor constante de pH a lo largo de todo el proceso asegurando una carga constante en las molculas que se estn separando. Mantienen la temperatura que aumenta por el paso de la corriente y de la resistencia presentada por el medio y el soporte, y puede afectar al soporte (matriz) y a la estructura de las molculas. Varios tipos que puede afectar a la movilidad de las molculas. ADN es cido, por tanto tiene carga negativa y migrar hacia el polo positivo. Se colocarn las muestras siempre en el polo negativo.

Preparacin de muestra Muestra disuelta en tampn de carga: compuesto de alta densidad (glicerol o ficoll), para que la muestra no flote en el gel, ms uno o dos colorantes, para separar tamaos de molculas. De color oscuro sern las molculas pequeas y de color claro las grandes. El colorante permite seguir la marcha del proceso. Marcadores de tamao: patrn conocido de tamaos, se obtienen comercialmente. Mezcla de fragmentos de tamao conocido. Visualizacin del gel: Tincin con bromuro de etidio que se intercala entre las bases, emite fluorescencia (naranja intensa) con luz ultravioleta. Cuando las molculas de cido nucleico estn saturadas de etidio la fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de cido nucleico, lo que permite disponer de un procedimiento alternativo para su cuantificacin.

Factores que influyen en la separacin Tamao fragmentos: a mayor tamao, menor distancia recorrida - Agarosa: 50 bp- 40 kb - Poliacrilamida: 5-500 bp Concentracin de agarosa/ poliacrilamida: grado de reticulacin del gel Conformacin/ topologa de las molculas: importante en plsmidos (molculas circulares) - Forma circular: migran ms rpido sufren superenrollamiento facilitando su movimiento a travs de la matriz. A mayor superenrollamiento mayor ser su movilidad. - Forma circular abierta: migran ms lento, no presentan superenrollamiento. - Forma lineal: intermedia, serpentean a travs de los poros y avanzan segn su tamao.

FL FC

FCA

ADN polimerasas
Enzimas que sintetizan ADN ADN polimerasa dependiente de molde: requieren una hebra molde que dirija la seleccin del dNTP que ha de ser incorporado. Necesitan un cebador o primer de oligonucletidos.

Actividades de las polimerasas - Sntesis 5 3

3 sntesis

Exonucleasa 3 _ 5 : corrige errores

exonucleasa

exonucleasa

Exonucleasa 5_ 3: degrada por delante si se encuentra una cadena y sintetiza por detrs. 9 ADN polimerasas utilizadas en investigacin ADN polimerasa I E. Coli. Temperatura ptima 37C

7 Posee las 3 actividades. Rellena huecos en un ADN ds que los contenga, es la base de participacin en sistemas de reparacin in vivo. Degrada los extremos 5 fosforilados de un ADN ds o un hbrido ADN: ARN. Aplicaciones: - Uso en marcaje de ADN: se hace una muesca en una hebra y se ceba con nucletidos marcados radiactivamente. Klenow polimerasa: fragmento grande de ADN polimerasa I de E coli Carece de actividad 5 3 exonucleasa Uso en marcaje de ADN y relleno de extremos. Aplicaciones: - Relleno de extremos de ADN ds con terminales 3 retrados formando terminales romos. - Marcaje de extremos 5 protuberantes, solamente Taq polimerasa ADN polimerasa de Thermus aquaticus Termoestable, temperatura ptima 72 C. Soporta hasta 95 C Presenta: - Actividad ADN polimerasa 5 _ 3 sobre un ADN ss cebado. - Actividad exonucleasa 5 _ 3 dependiente de la actividad polimerizadora Aplicaciones: - Secuenciacin de ADN - Amplificacin de regiones especficas de ADN mediante PCR Retrotranscriptasa Transcriptasa reversa, dependiente de ARN. Utiliza ARN como molde. Sntesis de ADNc (copiado)

Aplicaciones de las ADN polimerasas: PCR

Polymerase Chain Reaction o Reaccin en cadena de la polimerasa. Amplificacin directa y dirigida de un fragmento de ADN ARN. Tenemos que conocer la secuencia o parte de ella del fragmento a amplificar, estas regiones son utilizadas como cebadores Objetivos: - Amplificar cantidad ADN disponible - Detectar secuencia nica - Obtener molculas de ADN bicatenario para obtener una secuencia concreta, se precisan dos cebadores
3 5 3 5 3 5 3 5

La reaccin de amplificacin consiste en la repeticin de un ciclo integrado por tres etapas: - Desnaturalizacin del ADN molde mediante la elevacin de la temperatura para conseguir la unin de los cebadores. - Hibridacin de cebadores: reduciendo la temperatura se induce su unin a las zonas complementarias del ADN desnaturalizado. Tras la unin de cada cebador a su secuencia complementaria, se forma una estructura monocatenaria cebada, sustrato de las polimerasas. - Elongacin: llevando la disolucin a una temperatura adecuada y en presencia de un gran exceso molar de los cuatro dNTPs, la polimerasa elonga el sustrato cebado.

8 Para realizar la PCR se necesita: Molde de ADN que se quiere amplificar Cebadores: oligonucletido monocatenario de secuencia idntica a una corta regin de cada una de las dos hebras, localizadas en los extremos de la regin que se quiere amplificar. Polimerasa 2+ Tampn con Mg , imprescindibles para el funcionamiento de la polimerasa Ciclo 1

Paso 1: Desnaturalizacin

Paso 2: Hibridacin

Paso 3: Polimerizacin

Se aumenta la temperatura a 94C. Ciclo 2

Los cebadores reconocen los extremos temperatura ptima 50-60C. Depende del porcentaje de G/ C. Ciclo 3

Polimerizacin, temperatura ptima 72C, la de la enzima. 1000 pb /m

Aumenta exponencialmente 20 ciclos amplificar 10 copias

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Se consigue el fragmento exacto que se quiere

9 El producto mayoritario es un fragmento de ADNds cuyos extremos corresponden a los terminales 5 de los cebadores y cuya longitud est definida por la posicin de stos en la secuencia del ADN original. Durante la reaccin se producen otras molculas ms largas cuya concentracin en la mezcla no aumenta o lo hace de forma lineal. nicamente la concentracin del segmento limitado por ambos cebadores crece de manera exponencial, con lo que, tras varios ciclos de amplificacin, este producto es mayoritario. La temperatura es el parmetro esencial a controlar, que ha de ser muy alta en la primera etapa para asegurar la desnaturalizacin, se reduce en la segunda para permitir la unin a los cebadores y la ms adecuada para el buen funcionamiento de la polimerasa sin que se afecte la integridad del molde cebado en la ltima etapa.

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11 Caractersticas de las polimerasas a emplear en PCR: - Termoestable - Fidelidad: Tasa de error Taq polimerasa 10-4 Tasa de error Pfu polimerasa 10-6 Limitaciones de la PCR: - Tenemos que conocer la secuencia a amplificar o las regiones flanqueantes - Lmite de tamao del fragmento a amplificar: unas 5-10 kb. Funciona mejor con 5 kb

Diseo de cebadores
5-GATTTTGCAATCGGCGATCGCGTCCGCTTGGCCGCTCAGCCACCCTACCTAAAAAGTGCTGACCCGTTGC-3 3-CTAAAACGTTAGCCGCTAGCGCAGGCGAACCGGCGAGTCGGTGGGATGGATTTTTCACGACTGGGCAACG-5

La longitud de los oligonucletidos cebadores suele ser del rango de 15-30 . cuanto mayor sea su tamao, mayor es la probabilidad de que se asocien a secuencias no perfectamente complementarias y conduzcan a la amplificacin de productos no especficos. Cuanto ms corto sea el cabador, ms perfecta tiene que ser su complementaridad con el molde y ms especfica ser la amplificacin, aunque su unin al molde es ms dbil y con menor rendimiento. La composicin de bases de los cebadores es importante por el efecto que tiene sobre la estabilidad del hbrido; lo ideal es que tengan un 50% de GC. Si el porcentaje es inferior interesa una mayor longitud, para evitar una baja temperatura de fusin. Deben evitarse secuencias con bases repetidas (ms de 3-4 seguidas) para dificultar uniones no correctas. Hay que reducir la posibilidad de formacin de estructuras bicatenarias no productivas : - Intramoleculares: cebadores con estructura secundaria - Intermoleculares: cebadores parcialmente complementarios entre s. Desnaturalizamos
5-GATTTTGCAATCGGCGATCGCGTCCGCTTGGCCGCTCAGCCACCCTACCTAAAAAGTGCTGACCCGTTGC-3 3-CACGACTGGGCAACG-5 3-CTAAAACGTTAGCCGCTAGCGCAGGCGAACCGGCGAGTCGGTGGGATGGATTTTTCACGACTGGGCAACG-5 5-GATTTTGCAATCGGC-3

Polimerizacin
5-GATTTTGCAATCGGCGATCGCGTCCGCTTGGCCGCTCAGCCACCCTACCTAAAAAGTGCTGACCCGTTGC-3 3-CTAAAACGTTAGCCGCTAGCGCAGGCGAACCGGCGAGTCGGTGGGATGGATTTTTCACGACTGGGCAACG-5 5-GATTTTGCAATCGGCGATCGCGTCCGCTTGGCCGCTCAGCCACCCTACCTAAAAAGTGCTGACCCGTTGC-3 3-CTAAAACGTTAGCCGCTAGCGCAGGCGAACCGGCGAGTCGGTGGGATGGATTTTTCACGACTGGGCAACG-5

Los cebadores han de estar presentes en la reaccin a una concentracin adecuada. Para la amplificacin de secuencias especficas se utilizan cebadores especficos derivados de regiones conocidas que flanquean a la secuencia blanco. Cuando la secuencia es desconocida se utilizan cebadores arbitrarios. Los cebadores solapantes se emplean para reducir la presencia de productos de amplificacin inespecficos; el resultado de una primera reaccin es utilizado como sustrato de una segunda con cebadores ms cortos de secuencia idntica e incluida en la de los primeros.

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Aplicaciones de la PCR
Obtencin de grandes cantidades de un fragmento determinado de ADN Deteccin de una secuencia concreta de ADN en diferentes muestras y /o en muestras contaminadas Diagnstico de enfermedades: Deteccin de mutaciones, deleciones, inserciones y genes concretos. Las deleciones o inserciones pueden deducirse de variaciones de tamao de los productos amplificados. Deteccin de patgenos: - Anlisis de muestras microbiolgicas basado en la deteccin de secuencias especficas de microorganismos utilizando cebadores especficos. - Deteccin de infecciones basado en la amplificacin selectiva de ciertas secuencias. Produccin de sondas Reconstruccin y amplificacin de ADN a partir de muestras degradadas, para realizar estudios evolutivos. Los fragmentos degradados sirven como cebadores para la PCR.

Amplificacin de secuencias largas a partir de fragmentos de degradacin cortos. La PCR es capaz de regenerar piezas del ADN original de tamao mucho mayor. Teniendo en cuenta que los fragmentos de la muestra, resultado de la degradacin del ADN original, solapan unos con otros, las etapas de desnaturalizacin e hibridacin inducir la formacin de hbridos con extremos 3 retrados que podran ser elongados por la polimerasa para generar fragmentos de mayor longitud. Este mecanismo se repite varios ciclos y el resultado es la recuperacin de largas molculas de bicatenarias a partir de pequeos fragmentos iniciales. As se han conseguido preparar grandes trozos de ADN de especies extinguidas, a partir de muestras de fsiles, permiten un estudio de la evolucin molecular. Fragmento de ADN

reconstruido
Construccin de un ADN sinttico con cebadores solapantes ADN sinttico que incorpora las secuencias de los 6 cebadores iniciales Se puede construir un gen sinttico mediante ciclos sucesivos de PCR a partir de oligonucletidos sintticos y solapantes, que se van aadiendo ordenadamente a la reaccin, actan como cebadores.

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13 Introduccin de modificaciones en las secuencias de ADN En los extremos (promotores, dianas de corte,) Cambios en los extremos de la molcula Se introducen cebadores que incluyan en su extremo 5 la secuencia de una diana de restriccin ausente en la regin que se quiere amplificar. Aunque esta regin no hibride con el molde (como una pequea cola), la presencia de bases no apareadas en el extremo 5 no afecta a la capacidad de olignucletido para cebar la polimerizacin, en los siguientes ciclos de PCR la secuencia extra resulta incorporada y se crean molculas de doble hebra que contienen las nuevas secuencias dianas en sus extremos. Para expresar el gen en otro organismo se colocan promotores en el gen.

Mutaciones en puntos interiores (mutagnesis dirigida). Se trabaja con 4 cebadores, 2 terminales y 2 internos. Los dos cebadores internos son dos oligonucletidos sintticos, complementarios, que contienen en su interior la alteracin (sustitucin, delecin o insercin) que se desea incorporar. Su hibridacin sobre la hebra molde no es perfecta, pero la reaccin funciona. En la primera amplificacin se utilizan uno de los cebadores extremos y el interior de la hebra complementaria, generndose un fragmento que nace en un terminal de la regin y finaliza en la zona que incluye mutacin. En una segunda, la PCR se lleva a cabo sobre el molde cebado con el otro oligonucletido interno (portador de la mutacin) y el procedente del 2 extremo del DNA blanco; se consigue un 2 fragmento desde la zona central mutada hasta el segundo extremo de la secuencia blanco. Se purifican los fragmentos amplificados y se eliminan los cebadores y se mezclan ambos productos que se unen por la secuencia central mutada, presentan 3 retrado que puede ser elongado por la polimerasa hasta completar el molde. Finalmente, una tercera reaccin de PCR con los dos cebadores terminales conduce a la amplificacin de la secuencia portadora de la alteracin deseada,

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14 - Modificacin de la secuencia: Deleciones Amplificacin de de una parte de una secuencia del ADN mediante la utilizacin de cebadores de la regin interna, no terminales. Y de una manera ms amplia, en un conjunto de reacciones de PCR cebadas por una serie de oligonucletidos progresivamente desplazados (solapantes), se puede generar un conjunto de mutantes de delecin perfectamente definidos. Un cebador en una cadena y varios solapantes en la otra, tres cebadores que hibridan en tres regiones diferentes

Obtencin ADN monocatenario - PCR asimtrica

Permite la produccin de grandes cantidades de una determinada secuencia monocatenaria, para secuenciar. Se utilizan 2 cebadores a distinta concentracin (difieren en un factor de 100) la reaccin produce inicialmente fragmentos de ADNds, pero llega un momento en que el cebador limitante se agota; el segundo contina cebando la sntesis de una de las hebras. El resultado es la amplificacin de una secuencia de ADN ss en cantidad suficiente para el anlisis de su secuencia. El producto no sirve de molde y no se consigue tanto. Amplificacin secuencias desconocidas - PCR inversa

En los siguientes ciclos se amplifica

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15 Se realiza una digestin del ADN origen con una enzima de restriccin que no presente dianas en la regin conocida, ligado (ligasa) intramolecular de los fragmentos producidos para que formen crculos. A partir de ah se realiza PCR utilizando dos cebadores diseados a partir de la regin de secuencia conocida y apuntando hacia las regiones adyacentes. La polimerasa acta sobre la molcula circular que contiene la regin conocida y amplificar un fragmento lineal con origen y final en dicha zona y que incluye las secuencias que la flanqueaban en el ADN original. La unin entre estas ltimas queda marcada por la presencia de un sitio de restriccin para la enzima usada en la digestin. Los dos fragmentos obtenidos se amplifican con PCR. RT-PCR: amplificacin de secuencias de ARN por retrotranscripcin y PCR. Deteccin de molculas de ARN, clonaje de ADNc de un mensajero, construccin de bibliotecas de ADNc, obtencin de material para anlisis de secuencia. Amplificamos usando como molde ARNm Mtodo 1: Uso de oligo (dT), se une a la cola poli (A) de la mayora de los mensajeros eucariotas, se consigue la amplificacin de la secuencia completa de los ARNm que lleven la cola poli (A). Se construye una cadena de ADN. Hbrido ARN : ADN Amplificacin de todos los ARNm de una mezcla Se aade ribonucleasa H que degrada ARN, dejndola actuar un tiempo sin que destruya todo el ARN para as tener cebadores con los que la polimerasa pueda sintetizar la cadena complementaria. Mtodo 2: Uso de oligo especfico, permite la amplificacin de un ARNm especfico entre una mezcla. No hbrida en cola poli (A), sino ms adelante, no hace falta RT-PCR. Se construye un cebador del ARNm la polimerasa elonga cadena de ADN, se consigue un hbrido ARN-ADN que se desnaturaliza y en el 2 ciclo se tienen los dos cebadores especficos para las dos cadenas. No se degrada el ARN, no molesta, se amplifica el ADN bicatenario. La cantidad de producto por PCR es proporcional a la cantidad de ARNm que hay.

Aplicaciones de las ADN polimerasas: Secuenciacin

Determinacin de la secuencia de nucletidos de un fragmento de ADN Partimos de ADN1c (unicatenario). Dos mtodos. Obtencin de coleccin de fragmentos que comparten un mismo extremo 5, pero difieren en su extremo 3

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16 Mtodo de Maxam y Gilbert (rotura qumica del ADN) Marcaje de la cadena a secuenciar. Se tienen muchas copias de las cadenas que se quieren secuenciar, que se marcan radiactivamente en extremo 5. Se preparan cantidades en alcuotas y se someten a cuatro tratamientos qumicos:

G G+A C+T C

En cada muestra se elimina una determinada base, y luego se produce hidrlisis, la molcula se rompe por el lugar donde se produce la modificacin. El marcaje radiactivo se observa en 5. Se realiza electroforesis en gel de poliacrilamida, en calles distintas. Aparece la primera banda, fragmento ms grande en G+A pero no en G por tanto el nucletido es A. Se sigue secuenciando.

Mtodo de Sanger (amplificacin enzimtica del ADN)

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17 Sntesis enzimtica del ADN Secuenciamos la cadena complementaria Uso de ddNTPs: paran la reaccin, la polimerasa los reconoce y los coloca en la cadena sin problemas y ya no plimeriza ms. Se marcan radiactivamente. 4 reacciones: mezcla de 4 dNTPs ms una pequea cantidad de ddATP. Cada vez que entra un ddATP la cadena se para y como est marcada radiactivamente se puede detectar. Este mtodo es el ms utilizado y ha permitido la automatizacin. ojo! Est escrita al revs, se lee de 5 a 3

Automatizacin Marcaje de cada ddNTP con un fluorforo distinto, dar colores distintos en un detector de fluorescencia. Se hace una sola reaccin con los 4 ddNTPs, la cadena acaba en un color que representa una base. Se realiza una electroforesis capilar, que se coloca delante del detector de fluorescencia, se transfieren los datos a un ordenador que dar un cromatograma. Se mezcla el molde con el cebador, ddNTPs, y polimerasa. Se hacen varios ciclos de PCR y se amplifica una sola cadena.

Enzimas de modificacin de extremos

Aaden o eliminan grupos de los extremos 5 3 17

18 Fosfatasa alcalina Eliminacin del grupo fosfato 5 en ADN y ARN Usos: - Eliminacin de fosfatos en 5, para su sustitucin por fosfatos marcados con 32P mediante reaccin con quinasa. - Eliminacin de restos fosfato de los terminales 5 de fragmentos de dsADN, para impedir su dimerizacin, polimerizacin o circularizacin. Polinucletido quinasa T4 (PNK) Cataliza la transferencia de un fosfato del ATP a un extremo 5 de ADN y /o ARN Se usan en: - Eliminacin / adicin de fosfatos dependiendo de las necesidades de clonacin 32 - Sustitucin del fosfato 5 por grupo fosfato marcado (P ): Marcaje de ADN y/ o ARN Transferasa terminal o desoxinucleotidil terminal tranferasa Cataliza la transferencia de dNTPs al extremo 3-OH de molculas de ADN (ss ds). Similar a la polimerasa pero NO COPIA MOLDE, aade nucletidos al azar. No se considera una polimerasa. Se utiliza en: - La obtencin de homopolmeros en los extremos de una cadena para generar extremos cohesivos de secuencia conocida. Contando el tiempo de reaccin se puede conocer los nucletidos aadidos. - Marcaje de los extremos 3 Poli(A) polimerasa Incorpora residuos de A a partir de ATP al extremo 3 de un ARNss, creabdo una cola poli(A) Se utiliza en: - Marcaje de ARN y en adicin de colas poli(A) a mensajeros como paso previo a la obtencin de ADNc

Ligasas
Enzimas que catalizan la unin entre dos extremos de ADN. Requiere energa en forma de ATP NAD. Requiere Mg2+ Papel in vivo: unin de muescas (replicacin /reparacin)

Una molcula lineal se puede unir quedando circular Dos molculas lineales con extremos compatibles se unen formando una sola molcula Unin de muescas durante la replicacin /reparacin, une covalentemente dos nucletidos

Ligasa de T4

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19 Cataliza la unin de extremos compatibles de dos molculas de ADN o de los extremos de una misma molcula.

Extremos cohesivos Extremos romos Ms difcil, las molculas deben chocar y encontrar la ligasa Se forma un apareamiento no permanente, porque queda una muesca en cada cadena, la ligasa la encuentra. Es ms fcil, ms eficiente y ms rpida.

Requisitos: Extremos compatibles Extremo 5 a unir debe estar fosforilado por lo menos en una de las cadenas, solo es necesaria la fosforilacin en una cadena Si la molcula es grande se puede hacer circular y para evitarlo se alteran los extremos 5 conservando los fosfatos en una de las molculas y eliminando los de la otra. Se desfosforila la molcula ms grande para evitar que se circularice. 9 Extremos de los fragmentos a unir - Extremos cohesivos generados con la misma enzima Recuperamos la diana de corte. - Extremos cohesivos generados con enzimas diferentes No siempre recuperamos la diana de corte - Extremos romos No siempre recuperamos la diana de corte 9 Modificacin de extremos para generar extremos compatibles - Conversin de extremos cohesivos en romos Eliminacin de regin monocadena: exonucleasas especfica de cadena sencilla que elimina nucletido a nucletido hasta llegar a la zona de cadena bicatenaria. No se recupera la diana de corte. Relleno de extremos: polimerasas + dNTPs. Sintetiza lo que falta. Slo si tenemos 5 protuberantes!. Se recupera la diana de corte. - Conversin de extremos romos en cohesivos: consiste en la construccin de una regin homopolimrica en los extremos 3 de un ADNds Homopolmeros terminales: Transferasa terminal. Se forma una cola poli(G) y otra poli( C )

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20 Linkers: cortas secuencias ADNds de extremos romos con dianas para enzimas de restriccin que producen extremos cohesivos. Se pueden sintetizar y tener grandes cantidades. Una gran concentracin facilita la unin. Se requiere cortar con enzimas de restriccin.

Adaptadores: Piezas cortas de ADNds con extremos cohesivos correspondientes a dos enzimas diferentes. No requiere corte

Dos extremos cohesivos

BamHI

Un extremo romo y otro cohesivo CGGCCG GCCGGCTTAA

GATCCGGCCG GCCGGCTTAA
EcoRI

Pueden fabricarse con dos oligonucletidos Pueden fabricarse uniendo dos linkers y cortando despus Linker CCGGATCCGG GGCCTAGGCC BamHI GATCCGGCCG GCCGGCTTA A CCGGATCCGGCCGAATTCGG GGCCTAGGCCGGCTTAAGCC

CCGAATTCGG GGCTTAAGCC Linker

EcoRI

Modificacin de extremos para favorecer /evitar la ligacin Fosforilacin de extremos 5 Polinucletido quinasa Unin de linkers /adaptadores construidos con oligonucletidos sintticos Ligacin de productos de PCR Fosfatasa alcalina Evitar autoligacin de los extremos de una misma molcula de ADN 20

Desfosforilacin de extremos 5

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Clonacin de ADN recombinante

Clon: conjunto de clulas derivadas de una nica clula progenitora y, por lo tanto, poseedoras de idntico contenido gentico. Clonar un ADN significa aislar y disponer de una clon de clulas portadoras de una misma molcula de ADN recombinante. Aplicaciones: - Aislamiento y amplificacin de secuencias gnicas - Estudio de regiones genmicas medias y grandes, y de genomas completos - Produccin de protenas y otros compuestos

La secuencia que interesa clonar se corta con la enzima de restriccin adecuada o se amplifica con PCR. Luego se una a un vector que es el que permite integrar el inserto en otro organismo. El vector es el ADN recombinante. Luego se cultivan las clulas y se obtienen muchas copias del inserto. Para recuperar el ADN recombinante se rompen las clulas hospedadoras. Las clulas hospedadoras ofrecen todos los sistemas genticos y bioqumicos y actan como un laboratorio especializado donde se lleva a cabo el proceso diseado.

La clonacin implica: Mantenimiento dentro de la clula Transferencia a la descendencia Amplificacin (aumento del n de copias), en cada clula puede haber cientos de copias del ADN recombinante Expresin del ADN clonado, que se pueda transcribir y traducir el gen clonado Tres elementos clave en clonacin: Inserto (ADN a clonar) Vector Clula hospedadora

Inserto o ADN pasajero

Puede ser un obtiene: -

nico fragmento o una coleccin de secuencias, forman parte de las genotecas. Se

Por digestin con endonucleasas de restriccin Digestin con endonucleasas de restriccin Producto de PCR ADNc, en eucariotas a partir de un mRNA 21

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Clula hospedadora

Debe aceptar la molcula recombinante sin afectar su integridad, y permitir que se mantenga estable en sus descendientes. La clula ms utilizada es Escherichia coli, es un organismo modelo, se han realizado mucos estudios y se conoce casi perfectamente; tiene fcil y rpido crecimiento, los medios de cultivo utilizados son sencillos (Carbono, Nitrgeno y sales). Se divide cada 30-40 minutos. Existe una gran coleccin de mutantes. Nos interesan mutantes deficiente en restrictasas y recombinacin para que no destruyan el vectory para evitar que el vector se integre en el cromosoma bacteriano y no pueda manipularlo. Tambin se utilizan otras bacterias (gram-positivas y gram-negativas). A veces interesa expresar el gen en el mismo organismo del que se extrae el inserto. En eucariotas se utilizan levaduras, Saccharomyces cerevisiae, simple y unicelular, se divide cada 3 horas. Plantas, clulas aisladas o plantas completas. Lneas celulares animales (cultivos in vitro), tiles para trabajo con genes de organismos superiores y terapia gnica. Embriones animales, fuente para la obtencin de individuos transgnicos, de inters para el conocimiento de la biologa de organismos superiores.

Mtodos de introduccin de ADN en las clulas 9 Transformacin Captacin de ADN desde el medio extracelular Tratamiento con compuestos qumicos para alterar la envuelta, provoca poros, se da choque trmico, la temperatura aplicada depende del organismo receptor. Las clulas tratadas qumicamente alterando su envuelta se denominan clulas competentes. Si se introduce ADN procedente de virus (sin encapsidar) hablamos de transfeccin 9 Infeccin Usamos un virus (partcula vrica) para introducir el ADN dentro de la clula, normalmente animales. 9 Electroporacin Uso de descargas elctricas para alterar la envoltura 9 Transfeccin con ADN precipitado con fosfato de calcio Forma clsica de introducir ADN en clulas eucariotas en cultivo, el ADN est unido al precipitado y la clula lo endocita. 9 Lipofeccin ADN en solucin se acompleja con vesculas formadas por lpidos catinicos (liposomas). Los liposomas se fusionan con la membrana plasmtica. Se usa en clulas animales en cultivo, protoplastos (clulas sin pared) de levaduras o clulas vegetales 9 Microinyeccin Usamos un aguja /pipeta muy fina para inyectar el ADN directamente dentro del ncleo, normalmente en ovocitos de anfibio y embriones 9 Biolstica Bombardeamos las clulas con pequeos proyectiles de oro o tungsteno que tienen adherido el ADN. Eficaz en clulas de pared o envoltura fuerte (clulas vegetales), para no destruir el tejido. Molcula de ADN, generalmente de pequeo tamao, con caractersticas (y /o secuencia) conocida y capacidad de replicacin autnoma. Generalmente basados en plsmidos bacterianos o genomas vricos. Capaces de recibir al inserto y en el interior celular es capaz de hacer que el hospedador lo replique y de que sus copias se repartan correctamente entre las clulas descendientes.

Vector

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23 Se puede dividir en dos grandes grupos: Vectores de clonacin /propagacin: solo mantienen y propagan el inserto de inters. Vectores de expresin: poseen los elementos /seales necesarios para la transcripcin y traduccin del inserto en la clula hospedadora. Estos elementos deben ser funcionales. - Podemos clasificarlos segn: Origen (procariota /eucariota) Tipo de molcula (plsmido, virus, cromosoma artificial, etc) Tamao del inserto que puede incorporar Tipo de clula donde puede replicarse y /o expresarse Tipo de marcador de seleccin Caractersticas de un vector - Origen de replicacin: debe tener un origen de replicacin (regin ori) que sea activo en la clula hospedadora. Permite la replicacin dentro de la clula husped y el correcto reparto de copias entre las clulas hijas o su propagacin por infeccin (caso de los virus). Define el organismo /s utilizable /s como clula hospedadora. - Marcador de seleccin. Permite distinguir/ seleccionar las clulas que contienen el vector. Los ms utilizados son genes de resistencia a antibiticos. Confiere una cualidad especial a la clula. - Sitios de clonacin mltiple (MCS o polylinkers). Cortas secuencias que contienen mltiples dianas de restriccin de corte nico en el vector, donde se coloca el inserto. - Marcadores de seleccin adicionales. Que permitan la deteccin/ seleccin de los recombinantes. - Seales de transcripcin y /o traduccin. En el caso de vectores de expresin. Deben ser funcionales en la clula hospedadora. Tipos de vectores - Derivados de plsmidos (bacterianos, de levaduras, de plantas) - Derivados de virus (bacterianos, animales o de plantas) - De origen mixto, compuestos por piezas de diferente origen. Con ms de un origen de replicacin - Cromosomas artificiales

Vectores para el clonaje en Escherichia coli Vectores plasmdicos

Los plsmidos son estructuras adaptadas al entorno celular, disponen de las seales precisas para que la maquinaria celular lleve a cabo su replicacin y particin y la expresin de sus genes. La posibilidad de introducir en su molcula un fragmento de ADN extrao de manera que no se vean afectadas esas funciones esenciales permite disponer de un vehculo de clonaje en bacterias. Plsmido es una molcula circular de ADN bicatenario de pequeo tamao. En bacterias y algunos eucariotas. Admiten insertos de unas 10-15 kb. Utilizan la maquinaria celular para replicarse. - Replicn: regin donde se producen las interacciones con los elementos replicativos, y es responsable del mantenimiento del plsmido en la clula hospedadora. Normalmente los plsmidos presentan un nico replicn. El replicn incluye el origen de replicacin (ori) y los elementos de control que actan en cis. El tipo de replicn define: Grupo de incompatibilidad: Plsmidos con replicones idnticos o relacionados son incompatibles N de copias del plsmido: - Plsmido de replicacin estricta: 1-5 copias clula - Plsmido de replicacin relajada: 15-20 copias clula Rango de hospedador: especie /s donde puede replicarse 23

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pBR322:

Tiene 4363 pb, le da buena capacidad de transporte, ms de 10 pb. Contiene genes de resistencia a ampicilina (ampR) y a tetraciclina (tetR) No tiene MCS Contiene otras dianas de restriccin repartidas, algunas dentro de los genes de resistencia. Esto permite una inactivacin de la resistencia por insercin de un fragmento de ADN en esa zona. Unas 20 copias por clula.

Permite inactivacin por insercin, Si introducimos un inserto en una diana interna de uno de los genes de resistencia, se pierde la resistencia correspondiente. Si se inserta en el gen tetR las clulas obtenidas podrn ser tetS-ampR y tetR-ampR. Si se siembran en cultivo con ampicilina crecern todas las clulas que hayan sido transformadas. Si se hacen crecer estas colonias en un medio con tetraciclina solo crecern las tetR, y se pueden recuperar de la placa con ampicilina. La incorporacin del inserto en el sitio BamHI del vector lineal inactiva la funcin de resistencia a tetraciclina, pero si la ligasa los une y recirculariza el gen tetR se recompone y las clulas transformadas sern resistentes.

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El rendimiento conseguido en la transformacin de un cultivo bacteriano es inversamente proporcional al tamao del ADN que se intenta introducir. Cuanto menor sea el vector mayor espacio queda para el inserto. Por ello se eliminaron secuencias superfluas. Eliminacin de secuencias superfluas: Menor tamao del vector (2,6-3,2 kb), Mayor tamao del inserto (ms de 12 kb) Poseen un MCS, permite elegir entre diferentes enzimas de restriccin y permite realizar clonacin direccional. El clonaje direccional, donde el vector tiene MCS asimtrico, le permite recibir insertos con diferentes tipos de extremos, incluso haciendo uso de dos dianas, se puede lograr la insercin del ADN extrao en una orientacin nica y forzada al mismo tiempo que se evita la posible recircularizacin del ADN vector. 9 Deteccin de recombinantes mediante color (identificacin cromognica) Esta serie de vectores se ha dotado de un sistema gnico que permite distinguir clones transformados por ADN recombinante de los que han sido transformados por vector recircularizado. Este sistema es el Opern lac. El opern lac de E. coli es el responsable del catabolismo del disacrido lactosa. Es una unidad transcripcional compuesta por tres genes estructurales (lacZ, lacY y lacA). LacZ codifica la enzima -galactosidasa, cataliza la hidrlisis de glucosa y galactosa de la molcula de lactosa; tambin es capaz de hidrolizar anlogos como X-gal, compuesto incoloro pero su hidrlisis conduce a un producto de color azul. El sistema presenta una regulacin negativa inducible por su sustrato (lactosa o anlogos, como IPTG). La regin reguladora del opern est compuesta por un promotor (Plac) para la unin de la ARNpolimerasa, y un operador (Olac) secuencia que solapa con el promotor y a la que se une la protena represora codificada en el gen lacI. En ausencia de sustrato, la protena represora se une al operador e impide la accin de la ARNpolimerasa; pero el sistema se induce por la presencia de un sustrato que se une a la protena represora inactivndola y permitiendo la transcripcin del opern. En una estirpe normal de E. coli, el anlogo IPTG induce la sntesis de -galactosidasa, por lo que cuando crece en un medio con X-gal produce colonias azules.

Vectores serie pUC

lacZ (-galactosidasa) Degrada lactosa en glucosa + galactosa

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26 Hay estirpes mutantes incapaces de degradar lactosa porque el gen lacZ no se expresa o porque su producto no manifiesta actividad -galactosidasa, estas estirpes producen colonias blancas cuando crecen sobre X-gal. Una de estas mutaciones (M15) presenta una delecin en lacZ
Mutantes M15

En presencia de un pptido () procedente de la expresin de los primeros codones del gen lacZ, idntico a la regin N-terminal de la protena completa, la protena defectuosa recupera su actividad -galactosidasa. Ambos polipptidos se unen para formar un complejo enzimticamente activo.
-galactosidasa inactiva

El sistema incorporado a la serie pUC es un fragmento de ADN del cromosoma de E.coli que contiene el comienzo del opern lac, las regiones reguladoras (promotor y operador) y el comienzo del gen lacZ (la regin codificadora del pptido ). Inducido por IPTG se expresar pptido que lleva a cabo la complementacin sobre -galactosidasa defectuosa. Cuando las cepas mutantes lacZM15 son transformadas por un ADN que contenga este sistema, crecern en un medio con IPTG y X-gal formando colonias azules.

Complementacin -galactosidasa activa

Degradacin de X-gal: color azul!

Expresin fragmento N-terminal lacZ Se expresa en C-terminal

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27 Complementa mutante M15 MCS est dentro de lacZ

Deteccin plsmido pUC Resistencia a ampicilina En medio con X-gal: Color azul!!! Colonias azules: vector sin modificar Colonias blancas: plsmido recombinante

Vectores basados en bacterifagos

9 Fago ADN bicatenario de 49 kb. Infecta a E. coli Dos tipos de ciclo: - Ciclo ltico: replicacin del fago, lisis y liberacin de partculas vricas - Ciclo lisognico: el ADN se integra en el cromosoma de la bacteria y permanece dormido hasta induccin de ciclo ltico

Calva de

lisis

En las calvas de lisis hay ADN que se purifica

Formas del ADN de : - Forma lineal (dentro de la cpsida): en las regiones terminales presenta extremos 5 protuberantes, formados por secuencias de 12 nucletidos, monocatenarias y complementarias entre s, son cohesivos; son sitios cos - Forma circular cerrada (forma integrativa) debido a la asociacin de los sitios cos. Concatmeros lineales (tras replicacin; sustrato para empaquetar el ADN) Se empaqueta cualquier fragmento de 37-52 kb de ADN flanqueado por secuencias cos. Organizacin del genoma de : los genes que codifican funciones relacionadas se encuentran agrupados y se transcriben simultneamente. Para el ciclo ltico completo solo es necesario la regin de las protenas de la cpside y la regin de protenas de regulacin. La regin de integracin puede ser sustituida por el ADN que se quiere clonar. Regin no esencial

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Vectores de insercin

Hemos eliminado parte de la regin no esencial. Los puntos de corte generan dos fragmentos llamados brazos Introducimos un sitio nico de corte. Puede realizar el ciclo ltico. Tamao del inserto: unas 8 kb como mucho Seleccin fagos recombinantes: - Punto de corte en gen cI (gen represor de lisis). Si se coloca el inserto en medio de cI siempre realizar el ciclo ltico, calvas claras. Si ni se rompe cI se vern calvas turbias, porque realiza el ciclo lisognico y ltico. Recombinantes producen clavas ms claras. - Fragmento lacZ con sitio de corte. En X-gal dar calvas azules

Vectores de sustitucin Sustituimos toda la regin no esencial por un ADN de relleno Cambiamos el ADN de relleno por nuestro inserto Podemos incluir sistemas de seleccin dentro del ADN de relleno Tamao del inserto de hasta 22 kb No pueden producir lisogenia ni integrarse en el genoma, pero tampoco nos interesa

Uso de la forma circular cerrada Igual que si fuera un plsmido. Transfeccin, una vez en la clula se comporta como un virus.

Uso de la forma lineal Se corta el ADN vrico y se coloca el inserto, se forman concatmeros, se introducen las protenas de la cpside y la purificada. Empaquetamiento in vitro. Se selecciona el tamao para el empaquetamiento, ste se har cuando haya brazo izquierdo-inserto-brazo derecho. Una vez empaquetado se infecta la clula.

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29 Csmidos Vectores derivados del fago . Combina caractersticas de plsmido, replicn mnimo para la replicacin de copias, y de fago las secuencias cos para empaquetar. El empaquetado es necesario para introducirlo en la bacteria, porque es un plsmido muy grande. Plsmido que contiene sitios cos de . Necesarios para la encapsidacin. Empaquetamos in vitro con cpside de y producimos infeccin. Dentro de la bacteria se comporta y replica como un plsmido Ojo: Aislamos colonias, no calvas!!!! Podemos clonar en ellos hasta 46-47 kb, pero para encapsidarlo no puede tener ms de 37-52 kb Seleccionamos en funcin de los marcadores que tengamos en el plsmido

9 Vectores basados en M13 M13 es un fago filamentoso de E. coli. ADN monocatenario. Infecta a travs de los pili. El ADN es lineal dentro de la cpside pero una vez dentro de la bacteria se hace bicatenario y circular, es la forma infectiva, es la que sintetiza las protenas de la cpside, solo copias de una cadena, luego sale de la clula, no provoca lisis, la clula ralentiza su crecimiento. El tamao no es restrictivo en este fago: a mayor cantidad de ADN, mayor se hace la cpside. Insertos de 8-10 kb pueden ser inestables. Podemos aislar la forma replicativa y manipularla como si fuera un plsmido. No podemos eliminarle genes, ya que todos son imprescindibles. Introducimos inserto en regin intergnica II-IV III-VIII. La volvemos a introducir en la bacteria y prosigue el ciclo. El ADN que podemos obtener de la clula es bicatenario, si lo conseguimos una vez que el fago ha salido el ADN ser monocatenario.

F-pilus DNA

M13

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Fagmidos Plsmido que posee la regin del fago M13 que contiene el origen de replicacin. Ms eficiente en la replicacin al ser un plsmido y admite insertos ms grandes No puede empaquetar por si solo en el interior celular, necesita de un fago M13 ayudante. Se infecta la bacteria con las dos partculas, pero se obtienen dos partculas diferentes, unas tendrn el inserto y otras el ADN del ayudante. Se crea un ayudante mutante, que solo produzca protenas de la cpside .

9 Cromosomas artificiales de bacterias BACs Basados en el plsmido F de E. coli (contienen su origen de replicacin) Permiten clonar unas 300 kb 9 Derivados del fago P1 Similar a Podemos empaquetar en su cpside hasta 125 kb 9 Cromosomas artificiales derivados de P1 Combinan caractersticas de los BACs y P1 Hasta 300 kb 9 Fsmidos Similares a los csmidos. Contienen el origen de replicacin de F Menor n de copias que los csmidos. Ms estables En todos estos caben ms kb para clonar y tienen un origen de replicacin especial.

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31 Vectores plasmdicos para expresin de protenas en E. coli Vectores de clonacin que poseen seales de transcripcin y traduccin funcionales en E. coli Transcripcin Regin promotora: secuencias reguladoras (5) Terminador promotor +

Traduccin - RBS sitio de unin al ribosoma - Secuencia Shine-Dalgarno (SD) - ATG: sitio de inicio, codifica Met - Secuencia de stop

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Regiones promotoras en E.coli

Fuerza del promotor (P): depende de la afinidad por la ARN polimerasa. Mecanismo de regulacin (operador, op): para controlar cuando y cuanto expresamos, es muy importante. Dependiendo del promotor se tendr ms o menos expresin y esto depende de la afinidad por el mecanismo de transcripcin. Promotores hbridos funcionan mejor que los originales
Regulado por represor lac y CRP Regulado por represor trp. Ms fuerte que Plac

Permite regulacin por T

Slo se transcribe por la ARN pol de T7

Mutante lac no sensible a CRP Hbridos entre Ptrc y Olac. Fuerte expresin regulado por represor lac

Terminadores en E.coli
No son imprescindibles, pero mejoran la expresin. Se usan terminadores de genes conocidos (rrnB ARNr 5S de E.coli) Transcritos muy largos pueden afectar a la replicacin del plsmido y disminuir la expresin Gen rrnB ARNr 5S E. coli tL y tR de los genes tempranos de fago

RBS sitio de unin al ribosoma

Importante para la unin rpida y eficiente del ribosoma Secuencia S-D: varia entre 3 y 9 pb. No muy conservada No esta presente en genes eucariotas 32

33 9 Tipos de secuencias a expresar - Regiones /genes procariotas que contienen sus seales nativas o Regin promotora, terminador y RBS propios o Clonamos toda la unidad transcripcional en un plsmido de clonacin tpico Regiones /genes procariotas que tienen regin promotora mala El promotor es muy dbil, no tenemos buena regulacin o carece de promotor y /o mecanismo de regulacin. El inserto contiene el RBS, la ORF y el codon de STOP Utilizamos un vector que posee las seales de transcripcin adecuadas y un MCS Realizamos una fusin transcripcional entre las secuencias del vector y las del inserto Regiones /genes que no poseen buen RBS o carecen de RBS El vector contiene el RBS (secuencia SD + ATG) Tenemos que clonar nuestra ORF en fase con el ATG del vector Fusin traduccional entre las secuencias del vector y las del inserto

Regulacin de la expresin
La mayora contienen el operador del opern lac : regulacin por represor de lac (lacI) Ojo: Tenemos el plsmido en alto/ medio n de copias : represor limitante!. En una clula normal en estado natural, hay pocas molculas de represor, stas solo regulan una o dos copias del opern. Dos estrategias: Estirpes de E. coli que sobreexpresan el represor lacIq, de forma constitutiva. El plsmido contiene el gen lacI bajo el control de promotor constitutivo. Si tenemos un vector con el promotor, el operador y la protena X que queremos expresar, luego tiene resistencia a ampicilina que se lee en una direccin y el represor lacI que se lee en direccin contraria, reprimiendo a lacI la protena se expresa. Control de la expresin: IPTG, es un anlogo de lactosa que la bacteria no puede degradar. El IPTG se une al represor, pero no se degrada, por lo tanto la cantidad de protena producida es proporcional a la concentracin de IPTG aadida. -

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34 Vectores con seales de transcripcin Los usamos para genes que poseen un buen RBS El plsmido proporciona la regin promotora, seguida de un MCS y un terminador pKK177-3

Algunos vectores posee secuencia SD justo antes del MCS: podemos clonar solo la ORF

Vectores con sitio de clonaje inmediato a un ATG Genes que no poseen buen RBS o carecen de l (genes eucariotas) El ATG est codificado en el vector, y el sitio de clonacin solapa con el ATG NdeI CATATG NcoI CCATGG Fusin traduccional pTRC99a

Expresamos la protena nativa Podemos usar cualquier otro sitio de clonacin, pero entonces la protena que se exprese tendr ms aminocidos en el Nterminal Cuidado con la fase de lectura!!!

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35 - Ejemplo de fusin traduccional para expresin Queremos expresar el gen eucariota Shv en E. Coli. La secuencia del ADNc es:

Tenemos el plsmido de expresin pORF, con tres variantes que difieren en la pauta de lectura del sitio de corte EcoRI

En qu variante tendramos que clonar el ADNc digerido con EcoRI para que se expresara correctamente Shv?

Pauta de lectura correcta!!

Codon de STOP antes de llegar al inicio de Shv

Pauta de lectura incorrecta: se sintetiza un pptido de secuencia diferente a Shv

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Produccin de protenas de fusin

Expresin in vivo de una protena hbrida obtenida por fusin traduccional de dos ORFs El vector proporciona las seales reguladoras y una ORF con un MCS Tenemos que clonar nuestra ORF en fase con la ORF presente en el vector Podemos tener: ORF del vector::ORF de inters. El gen se clona en el MCS y la protena resultante estar en N-terminal la protena del vector y en C-terminal la protena clonada. (P-ORFvector-MCS) ORF de inters::ORF del vector. La N-terminal estar la protena clonada y en Cterminal la protena del vector (P-MCS-ORFvector)

Ventajas o inters del uso de protenas de fusin Muchas protenas eucariotas son ms estables si las expresamos fusionadas a una protena de E. coli, si no son estables las protenas degeneran o se acumulan en bloques de inclusin y no se pueden rescatar, pero fusionadas con protenas de E.coli se vuelve estable. La protena resultante conserva las actividades de ambas protenas: deteccin fenotpica Facilita la purificacin de la protena de inters: cromatografa de afinidad o secrecin al medio extracelular Fciles de detectar e identificar en una mezcla: gran tamao y existencia de anticuerpos contra la protena del vector. Fusin traduccional: ojo con la pauta lectura!! Existe una seal de proteolisis especfica en la secuencia frontera entre las dos protenas, hay proteasas que reconocen una secuencia concreta y separan las protenas.

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37 Purificacin protenas de fusin Cromatografa de afinidad

Exclusin por tamao. Esquema general de preparacin de protenas nativas mediante la expresin de un producto de fusin, su purificacin por retencin por afinidad y su rotura endoproteoltica.

Ejemplos de protenas de fusin para purificacin Sistema del apndice /cola de histidina Incluye un conjunto de vectores: R Derivados de Pbr322: con ori ColE1 y gen de Ap Promotor fuerte que reconoce la ARN-polimerasa de E.coli Operador lac duplicado, para asegurar una represin eficaz RBS bacteriano Codones de stop en los tres marcos de lectura Dos fuertes terminadores de la transcripcin Un MCS colocado en todos los marcos de lectura entre los distintos vectores Secuencia codificadora de 6 residuos de histidina para la sntesis del apndice (tag) La protena expresada llevar un apndice de 6 histidinas en los extremos N o C-terminal. Para Nterminal, secuencia de un vector tpico; para C-terminal, se modifica la pauta de lectura, donde codifica prolina, para que codifique histidina. Fusionamos nuestra protena a una secuencia de 6 histidinas, 2+ La histidina tiene afinidad por el nquel. Purificamos con resina cargada con Ni Elumos con tampn que contenga imidazol, ste es un anlogo de la estructura de histidina No suele afectar a la actividad de la protena y muchas veces no se elimina

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Sistema de la GST GST es la enzima glutatin S-transferasa. La regin N-terminal de la protena de fusin corresponde a la GST, capaz de ser retenida en columnas de glutation-Sepharosa y eluida con glutation reducido. Purificamos con resina que contiene glutatin. Elumos con glutatin reducido. Los vectores de la serie pGEX contienen el promotor Ptac, la regin codificadora de la GST con su RBS interno, la secuencia que codifica la seal de endopeptidasa y un pollinker.

Sistema de la MBP MBP es la protena de unin a maltosa. La protena de fusin lleva en su mitad N-terminal la MBP; es retenida en columnas de agarosa-amilosa y eluida con maltosa. Purificamos con agarosa-amilosa. Elumos con maltosa. Los vectores pMAL llevan el promotor Ptac, el RBS y la secuencia codificadora del gen malE que codifica a la MBP, una regin espaciadora que codifica 10 residuos de asparagina (para aislar conformacionalmente las dos mitades de la protena de fusin), una secuencia que codifica una seal de reconocimiento para una endopeptidasa y un polylinker que interrumpe el gen lacZ (lo que permite detectar recombinantes sobre X-gal)

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39 Algunos problemas /limitaciones de la expresin de protenas en E. coli - Toxicidad de la protena: Podemos trabajar con un plsmido de menor nmero de copias o integrar el gen en el cromosoma - Efecto del uso de codones La frecuencia de uso de codones sinnimos es diferente en cada especie La cantidad de ARNt para codones de baja frecuencia es limitante. Se han construidos estirpes de E. coli con ARNt raros y son capaces de expresar protenas con codones que normalmente no expresan. Si aparecen codones raros baja la velocidad de la traduccin y empiezan a aparecer fallos - Plegamiento incorrecto de la protena: E. coli no posee todas las chaperonas necesarias. Si la protena no se pliega bien se forman agregados insolubles: cuerpos de inclusin, no se pueden purificar. Podemos disminuir la velocidad de crecimiento o inducir la sntesis de chaperonas. Al disminuir la velocidad de crecimiento la sntesis de protenas es ms lenta y se van plegando a medida que se van sintetizando. Hay mutantes que expresan chaperonas. - Modificacin post-traduccional. Algunas protenas requieren ser modificadas tras la traduccin para ser activas. Podemos introducir los genes de las enzimas modificadoras en E. coli o bien expresar la protena en el tipo celular adecuado

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40 Vectores para clonaje en bacterias diferentes de E. coli Bacterias de inters: Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces (antibiticos), etc Utilidades: hay que modificarlas - Degradacin de compuestos - Descontaminacin de suelos - Produccin industrial de enzimas y /o antibiticos Dificultades: - Poca eficiencia en la introduccin de ADN - Falta de mutantes que carezcan de sistemas de restriccin - Limitaciones en el n de vectores replicativos y marcadores de seleccin. El origen de replicacin define la bacteria en al que se puede clonar el vector; no hay ningn origen de replicacin funcional, los marcadores existentes no se expresan. Dos opciones: - Plsmidos de amplio espectro, capaces de replicarse en cualquier bacteria - Vectores derivados de plsmidos naturales especficos Ejemplo de plsmido de amplio espectro: RSF1010 - dos genes de resistencia a antibiticos, SuR (sulfonamida) y SmR (estreptomicina) - dos orgenes de replicacin: oriV, vegetativo oriT o nic: dirige la transferencia del plsmido por conjugacin - tres genes que codifican protenas de replicacin: repA, repB y repC - genes para la movilizacin: mob - sitios nicos para endonucleasas de restriccin Este plsmido se puede construir y mantener en E.coli, y por conjugacin transferirlo a otras bacterias. 9 Pseudomonas Estas bacterias son capaces de metabolizar compuestos orgnicos y llevar a cabo reacciones de destoxificacin con metales pesados, por ello es de gran inters por su aplicacin en biodegradacin y biorremediacin. Se utilizan vectores derivados del plsmido natural pVS1 de amplio espectro Resistente a la mayora de antibiticos: se usan genes de resistencia a Hg y a Amp (carbenicilina) 9 Bacillus Muy fcil de transformar: competente natural, como respuesta a una limitacin de nutrientes. Las molculas de ADNds son absosrbidas por la superficie de la clula competente, capta fcilmente el ADN. Vectores derivados de plsmido natural o del fago 105, muy similar al fago . Tiene seales de transcripcin /traduccin especficas propias: factor sigma, SD y codones de inicio diferentes (UUG, GUG y CUG). Para expresar las protenas hay que usar los sistemas de la bacteria.

Vectores para clonaje en levaduras

9 Saccharomyces cerevisiae Levadura unicelular no patgena que se reproduce por gemacin y crece en medios simples. Se considera organismo modelo para otros eucariotas, de rpido y fcil crecimiento en laboratorio, existen mutantes disponibles. Tiempo de generacin 3 horas, temperatura ptima 30C. Son fcilmente transformables. Permite expresar protenas que necesitan modificacin pos-traduccional. Como marcadores de seleccin son poco usados los genes de resistencia a antibiticos se utilizan: - NeoR resistencia a G418, aminoglucsido capaz de impedir el crecimiento de las clulas eucariotas por inhibicin de la sntesis de protenas

41 Marcadores nutricionales: complementacin de auxotrofas. Existe un gran conjunto de cepas auxtrofas, mutantes en rutas biosintticas de aminocidos, genes implicados en sntesis de aminocidos (histidina, leucina, triptfano...) o de nucletidos (UMP), y de los genes de levadura que los complementan (HIS3, LEU2, TRP1, URA3...), aislados y purificados, lo que permite utilizar estos genes como marcadores de seleccin sobre las cepas auxtrofas correspondientes.
Necesitan leucina

El gen LEU2, sintetiza leucina. El mutante leu2- necesita medio con leucina para no morir, si se introduce un plsmido con el gen LEU2, la clula ya no necesita leucina en el medio, puesto que la sintetiza el plsmido. Para seleccionar a la transformacin, se cultivan en un medio sin leucina, las clulas transformadas sobreviven.

Las clulas que llevan el plsmido sobreviven en medio sin leucina

Vectores plasmdicos para levaduras 9 Plsmidos integrativos (YIPs) Bsicamente son plsmidos bacterianos con un gen de levaduras (LEU2). Se integran por recombinacin homloga, ya que no pueden replicarse en levaduras. Si la copia del cromosoma est mutada, podemos utilizar el gen de levaduras como marcador de seleccin de los recombinantes. El plsmido no se replica porque no tiene origen de replicacin para levadura.

Gen de levaduras

pBR322

Recuperamos gen URA3 funcional!!!

42 9 Plsmidos replicativos (YRPs) Poseen una secuencia ARS (secuencia de replicacin autnoma) Son inestables: no segregan correctamente al dividirse la clula, se distribuyen mal y tienden a quedarse asociados a la clula madre. Se pierden al cabo de varias divisiones. Presenta un nmero moderado de copias, son tiles para ensayos de complementacin y se recuperan fcilmente, excepto si se ha integrado en el cromosoma. 9 Minicromosomas o plsmidos ARS/CEN La inestabilidad de los vectores YRP se corrige incorporando la regin centromrica de algn cromosoma, CEN (especfica para cada especie de levadura). Estos nuevos vectores, YCp, muestran una segregacin equitativa en la divisin celular, se comporta de forma anloga a un minicromosoma. De menor nmero de copias. La recuperacin de la secuencia clonada es difcil por la poca concentracin en la que se encuentra. Siguen siendo inestables: se pierden!!! 9 Plsmidos derivados del plsmido de 2m Plsmido natural de S. cerevisiae. 50-100 copias por clula haploide, representa 2-4 % del ADN celular total. Sin funcin conocida. Secuencias clave para la replicacin: ori y REP1/REP2 Se comporta como un minicromosoma circular. Funciona como un plsmido bacteriano. Se ha utilizado para construir plsmidos lanzadera.

Plsmidos lanzadera E. coli-S.cerevisiae Origenes de replicacin de pBR322 (E. coli) y 2m (S. cerevisiae), permite la seleccin de transformantes de ambos tipos celulares. Se alcanza una frecuencia de transformacin muy alta, se mantiene en forma de plsmido multicopia. Fcil recuperacin. Tiene marcadores de seleccin, ApR para E.coli y y un gen de levadura con alguna auxotrofa. Se realiza la construccin /seleccin de colonias ApR del ADN recombinante en E. coli y luego se introduce en levadura. Hay que trabajar con mutantes delecionados, que el gen no se encuentre en el cromosoma para que el plsmido no se integre, as se obtienen mayor nmero de copias. Si tenemos copia del marcador en el cromosoma podemos tener integracin (como los YIPs)

43 9 YACs Contiene centrmero y telmeros, mantienen la estabilidad del cromosoma. Lo construimos /mantenemos en forma de plsmido de 10-12 kb. Se puede mantener en E.coli y levaduras. Para el clonaje, se preparan los brazos del vector a partir de un vector lanzadera mantenido como plsmido en E.coli. Tiene ADN de relleno, secuencias centromricas, marcadores de seleccin y origen de replicacin. Los cromosomas de levaduras tienen entre 250-1700 kb Los YACs nos permiten clonar fragmentos de 600-1400 kb

Cromosomas artificiales de levaduras

Clonacin en un YAC Podemos incorporar un gen marcador en la secuencia que sustituimos para comprobar que la clonacin se ha hecho bien. Se corta el ADN circular de forma que queden los dos brazos, cada brazo lleva un marcador de seleccin y, en su extremo, un telmero. El inserto se une a los dos brazos quedando un ADN lineal. Se ponen marcadores de seleccin, el gen Trp y el gen URA3.

44 Vectores para expresin en levaduras Los promotores son diferentes de los de bacterias Necesitamos activadores transcripcionales y regiones reconocidas por ellos

Esquema de la regin promotora de un gen tpico de levadura. La caja TATA: inicio de la transcripcin, donde se une la polimerasa Regin iniciadora o de inicio de la transcripcin Secuencias activadoras y represoras anteriores: UAS y URS Secuencias activadoras y represoras posteriores: DAS

Promotores ms usados: - ADH1 alcohol deshidrogenasa: inducible por glucosa, expresin constitutiva - Promotores genes GAL: promotor fuerte, inducibles por galactosa

Vectores para clonaje/ expresin en plantas

9 Plsmido Ti de Agrobacterium tumefaciens A.tumefaciens infecta a travs de heridas produciendo tumores. Es capaz de transferir ADN desde su citoplasma al interior de clulas de plantas, de forma natural. Solo infecta algunas dicotiledneas. Plsmido Ti de unas 200 kb, es el agente inductor del proceso. Es un ADNds circular, grande que codifica lsa funciones de virulencia y tumoracin. Posee numerosos genes implicados en la infeccin, en el crecimiento del tumor y en determinar la especificidad del husped. ADN-T: fragmento de 15-30 kb que se integra en el genoma de la planta de forma estable. La integracin ocurre de forma aleatoria, si se integra en medio de un gen lo inactiva. Tiene oncogenes.

45 Introduccin de genes en plantas utilizando el plsmido Ti Sistema binario de transferencia: uso de dos vectores Transferimos el ADN-T de un miniT utilizando un plsmido Ti accesorio sin ADN-T. Ambos se introducen en A.tumefaciens, las protenas codificadas en el grande permiten que se integre el ADN del miniT.

Plsmido Ti accesorio

MiniT

Sistema de cointegracin Introducimos por recombinacin homloga un plsmido de E. coli en el plsmido Ti. El plsmido recombinante resultante transfiere la regin ADN-T que incluye ahora el plsmido de E. coli

9 Vectores lanzadera E. coli-plantas basados en Ti El ADN-T solo precisa de dos repeticiones de 24 pb en los extremos para transferirse al genoma de la planta. En el vector de E.coli se clona el inserto, se necesita un plsmido accesorio. En le genoma de la planta se integran las secuencias que hay entre los extremos. Solo se modifican las clulas afectadas. Si infectamos protoplastos, podemos regenerar plantas completas que posean el ADN transferido en todas sus clulas.

46 9 Plsmido Ri de Agrobacterium rhizogenes Similar al psmido Ti A. rhizogenes induce aumento del nmero de races adventicias, solo en algunas dicotiledneas distintas de las que infecta A.tumefaciens. Problemas con Ti y Ri Agrobacterium slo infecta a dicotiledneas Transferencia directa de genes Empleamos un plsmido de E. coli (pBR322) Incubamos protoplastos con el plsmido y polietilenglicol Plsmido se adhiere a la membrana de la clula y se induce la endocitosis. Poco eficiente. Integracin al azar por recombinacin no homloga

Marcadores de seleccin en plantas - Neo /apt: Resistencia a kanamicina, G418 o neomicina - Dihidrofolato-reductasa: Resistencia a metotrexato - hyg : Resistencia a higromicina Vectores vricos para plantas La mayora de virus de plantas son de tipo ARN. Difcil manejo/ manipulacin. Son muy especficos. Vectores de ADN: 9 Caulimovirus - Tiene restriccin de tamao para empaquetar, como lambda - Podemos generar vectores tipo fagmido - Problema: infecta a muy pocas especies 9 Geminivirus - Infecta a monocotiledneas - Problema: su ADN sufre deleciones y reorganizaciones durante la infeccin

Vectores para clonacin en clulas animales

Se utilizan lneas celulares en cultivo. Mtodos de transferencia de ADN: transfeccin - Precipitacin con fosfato clcico - Liposomas - Microinyeccin - Electroporacin Marcadores de seleccin - Resistencia a antibiticos: no suelen usarse, pero se utiliza el gen neo modificado de E. coli, confiere resistencia a G418, anlogo de kanamicina - Rutas metablicas biosintticas de precursores de ADN: Rutas de novo: parten de compuestos simples (glicocola, aspartato) para construir las molculas de los desoxinucletidos pricos y pirimidnicos Rutas de recuperacin: utilizan el conjunto de bases nitrogenadas y el de mononucletidos, alimentado por procesos degradativos de cidos nucleicos, para la construccin de la estructura nucleotdica.

47 TK timidina quinasa: es uno de los marcadores ms utilizado. El gen codifica una enzima (timidina kinasa) con actividad implicada en una de las rutas de biosntesis de desoxinucletidos. La timidina se convierte en dTTP en una reaccin catalizada por la timidina kinasa. Se han podido aislar mutantes defectivos en actividades de las rutas de recuperacin: - APRT-: defectivas en adenina-fosforribosil-transferasa, enzima que convierte la adenina en AMP) - HGPRT-: defectivas en hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa, enzima que transforma la hipoxantina en IMP y la guanina en GMP - TK-: defectivas en timidina-kinasa

Xantina-guanina fosforribosil-transferasa (XGPRT): esta enzima de E.coli es anloga de la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa de mamferos. Sintetiza GMP a partir de xantina. Utiliza como sustratos hipoxantina, guanina y xantina. Un fragmento de ADN que exprese la actividad XGPRT es capaz de convertir clulas de mamfero HGPRT- en HGPRT+ y permitirlas crecer en un medio HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Seales de transcripcin /traduccin

Esta seal la proporciona el vector para permitir incorporar la cola poliA al ARNm

El tipo de promotor determina el nivel de expresin y en que tipo de clulas se expresa

48 Esquema de unidad transcripcional - Regin promotora: necesita la unin de protenas activadoras, factores generales de transcripcin. Cada promotor dice donde y cuando se va a expresar el gen. La mayora tienen secuencias de reconocimiento: La caja TATA, para la correcta ubicacin de la ARNpolimerasa II Elementos anteriores (upstream promoter elements): antes de la caja TATA y son responsables de la velocidad del proceso de iniciacin de la transcripcin - Seales de terminacin y poliadenilacin: el transcrito primario (pre-mRNA) es modificado en su estrmo 3, y una rotura por un punto intermedio y la sntesis de una cola poliA en 3 creado tras la rotura - seales del procesamiento interno del transcrito primario: los genes eucariotas estn interrumpidos por intrones, que son transcritas y luego eliminadas segn un mecanismo de unin (splicing) de exones. - Seales para la traduccin del mRNA: los mensajeros eucariotas son minocistrnicos. Tras la fase de maduracin son transportados al citoplasma para su traduccin por el ribosoma. ste entra en contacto con el mRNA por 5 que acta como sitio de unin al ribosoma. La lectura de tripletes procede desde el primer AUG hasta el codn stop. Este mecanismo no hace necesaria la inclusin de seales para la traduccin en el vector. - Casetes de expresin para clulas eucariotas: incorporan seales de iniciacin de la transcripcin (promotor y potenciadores), un sitio de clonaje para el pasajero que se quiere expresar, un intrn y la seal de poliadenilacin. Vectores vricos para clonacin en clulas animales La mayora de los vectores son bastante especficos en cuanto al tipo celular (clulas permisivas). Se puede trabajar con plsmidos y todas sus seales pero, la clula animal tarda mucho en dividirse, aunque la protena en cuestin se expresa, el plsmido se pierde al dividirse la clula. En clulas animales no se habla de transformar sino de transfectar. Vectores derivados de SV40. SV40 es un virus del grupo del papiloma, produce infeccin ltica en clulas de mono. Virus que infecta a primates. Genoma de 5243 pb, circular, muy bien aprovechado. Se emplean en cultivos de clulas de rin de mono verde africano. Slo empaqueta 5300 bp, se usa para secuencias pequeas. Se pueden obtener 2 tipos de vectores, dependiendo de las funciones del virus que retienen: Vectores transductores o de reemplazamiento: Realizan el ciclo vrico completo: replican y empaquetan el genoma. Tiene poca capacidad de transporte, que se resuelve con el empleo de dos derivados defectivos del virus que no son capaces de replicar por s mismos, pero si lo hacen en una infeccin conjunta. Mantenemos el origen de replicacin, las secuencias necesarias para empaquetar el genoma y un tamao entre 3,9-5,3 kb. Eliminamos genes de replicacin o de encapsidacin, reemplazamos por inserto. Necesitamos un virus ayudante para replicar/ empaquetar. Un vector de reemplazamiento de los genes tardos, no tiene capacidad de encapsidar pero si de replicar, la clula infectada puede lisar pero no se consiguen partculas vricas. Un vector ayudante defectivo en genes tempranos, no puede replicar pero si encapsidar. Una transfeccin conjunta agrupa en la clula todos los genes que dirigen el ciclo completo (complementacin).

49 Se puede utilizar como virus ayudante a un mutante que codifica una protena T termosensible. Tras la infeccin mixta el cultivo crece a temperatura restrictiva: - las clulas transfectadas por el ADN mutante no producen copias, no se produce la lisis. - solo las clulas transfectadas por ambos ADN propagarn la infeccin. - Las clulas que tienen el ADN recombinante no encapsidan

Podemos usar clulas COS Hay vectores de reemplazamiento de la regin temprana, han sido sustituidos por el ADN pasajero. Este ADN no se puede replicar porque carece de la protena T necesaria para el proceso, pero hay clulas capaces de aportar esta protena, son clulas COS. Tienen en el cromosoma insertado un SV40 defectivo, pero que produce la protena T necesaria para la replicacin. Podemos empaquetar los vectores de reemplazamiento de genes de replicacin y tener slo virus recombinantes. Vectores no infectivos o plasmdicos Sin capacidad infectiva pero con capacidad para transportar pasajeros sin lmite de tamao. son pocos los tipos celulares que pueden ser infectados por el virus (clulas permisivas) pero son muchas las clulas que pueden ser transfectadas eficazmente por su ADN y en las que se alcanza gran nivel de expresin a partir de las seales virales. Constan de: - Slo contienen el origen de replicacin de SV40 - Promotor de amplio espectro - Seal de poliadenilacin - Intrn de la protena T de SV40 - Un MCS - Marcador de seleccin Pueden replicarse en clulas de mono, pero no empaquetarse. Si tenemos marcador de seleccin los mantenemos como si fueran plsmidos (10-100 copias) -3 -5 Con frecuencia de 10 -10 tenemos integracin en el genoma. Se pueden construir vectores lanzadera.

Vectores derivados de BPV: virus del papiloma bovino Papilomavirus: produce verrugas. Especie especfico, solo infecta a vacas pero es capaz de producir una morfologa transformada en clulas de roedor in vitro, pero no de propagarse en cultivo de tejidos. En estos sistemas celulares, el virus no produce viriones, su ADN replica dentro de la clula como un episoma pero no se propaga. Slo se obtienen virus maduros de las clulas epidrmicas de las verrugas.

50 Puede replicarse en otras clulas bovinas y de roedores (en cultivo): - No se integra en el genoma - 10-100 copias por clula - no necesita marcadores de seleccin - Se transmite a la descendencia - Tiene la capacidad de transformar las clulas de un cultivo en tumorales. - Los transformantes crecen en foco o colonia Podemos construir vectores lanzadera E. coli-BPV que usamos como si fueran plsmidos. Retrovirus Poseen un genoma RNA, su ruta replicativa pasa por una fase en la que su informacin gentica aparece en forma de ADNds. Necesita obtener un ADNc para replicarse, insertarse en el genoma y expresar protenas. Slo infectan clulas en divisin. No provocan lisis celular, sino que funcionan como M13 Su genoma posee secuencias importantes para: - Retrotranscripcin: R, U3,U5, P y Pu - Procesamiento de intrones: S - Encapsidacin: - Integracin en el genoma: LTR (repeticiones terminales largas). Provoca la expresin excesiva de lo que va detrs. Muchos retrovirus son oncognicos. 2 mecanismos: Incorporacin al genoma de oncogenes: el virus transporta un gen implicado en regulacin del ciclo celular, pero mutado Alteracin de la regulacin de los genes adyacentes: las secuencias de LTR tienen promotores muy activos que transcriben hacia afuera

Uso de vectores derivados de retrovirus Dejamos las secuencias LTR, necesarias para su integracin en el genoma, y las , dirige el proceso de ensamblaje del virin, y sustituimos el resto por el inserto y el gen marcador.

Los genes virales, gag, pol, env, son dispensables ya que las funciones que codifican pueden ser aportadas por otro provitus. As se han construido vectores de reemplazamiento. Se insertan en el genoma y se quedan estables en cultivo, en forma de provirus. Si le damos las protenas del virus, podemos producir partculas vricas infectivas.

51 La construccin del recombinante se suele hacer en E.coli y con vectores bacterianos, mediante la unin de las secuencias retrovirales adecuadas y el ADN pasajero. Mediante transfeccin se introduce en la lnea celular que adems es coinfectada con un virus ayudante. La transcripcin de la secuencia de ADN viral recombinante da lugar a un mRNA recombinante que entra en el ciclo replicativo retroviral como RNA genmico, pudiendo ser empaquetado o convertido en provirus. La expresin de los genes retrovirales conduce a la aparicin de una mezcla de partculas virales infectivas que continan la infeccin. El ayudante es el que marca la especificidad de hospedador. Realizan ciclo completo: obtenemos progenie de virus. Obtenemos las protenas que necesita de profago ayudante: progenie mixta Si el profago es mutante en que impide el ensamblaje de su RNA viral, las clulas producen todas las protenas necesarias para el empaquetado, son clulas empaquetadoras. Cuando las clulas de esta lnea son transfectadas con un DNA proviral recombinante, defectivo, se producen partculas virales recombinantes infectivas y puras, sin mezcla de ningn virus ayudante, tenemos progenie pura del retrovirus recombinante.

Vectores derivados de otros virus Adenovirus - No se integran en el genoma - Producen alta respuesta inmunolgica en organismos completos Adenoasociados - Requieren coinfeccin con un adenovirus o virus herpes - Producen alta respuesta inmunolgica en organismos completos Herpes - Genoma muy grande (difcil manejo) - Citotxico Baculovirus - Para introduccin y expresin de genes en cultivos de clulas de insectos

52

Genotecas
Conjunto de clulas ( o virus) que albergan, fragmentado e incorporado en un vector, todo el contenido gentico (ADN) de un cierto organismo. 2 datos siempre importantes: Tamao de la genoteca: nmero de clones que la forman. Depende del tamao del ADN de partida y del vector a utilizar (tamao medio del inserto) Representatividad: porcentaje de las secuencias originales que est presente en los clones de la genoteca. Es una medida de la calidad de la genoteca Objetivos: - Conservacin del ADN de una estirpe, especie o individuo. - Aislamiento de secuencias y genes. - Estudio de grandes regiones genmicas y genomas completos. - Inicio de los proyectos de secuenciacin Tipos en funcin del ADN pasajero mixto que contienen: Genotecas genmicas: Contienen el genoma completo de una especie, en forma de fragmentos clonados. Genotecas parciales o bancos de genes: Contienen las secuencias de un ADN ms simple, como un megaplsmido bacteriano o un cromosoma eucaritico aislado (genoteca cromosmica) Genotecas de ADNc: Proceden de la clonacin de los ADNc obtenidos de un tipo celular concreto. Contienen las secuencias que han sido expresadas en la clula original. Utilizadas en para el aislamiento de genes expresados en tejidos especficos y para el estudio de los mecanismos que regulan esa expresin. Son secuencias carentes de intrones, permite su expresin en sistemas procariticos. Genotecas genmicas Contienen, fragmentado, todo el material gentico (genoma) de una especie. Nos interesa que los clones sean solapantes Cualidades /caractersticas de la genoteca a tener en cuenta: - Representatividad: Debe contener todas las secuencias presentes en el ADN de partida. Debe mantenerse y no disminuir durante la conservacin y amplificacin de la genoteca. - Complejidad (o tamao): nmero mnimo de clones que debe tener la genoteca para que todo el ADN de partida est representado. - Tamao medio de los insertos: Importante si queremos aislar genes completos de genomas eucariotas, para lograr el aislamiento de un gen completo, la biblioteca debe contener insertos suficientemente grandes. El tamao de la genoteca depende de la relacin que existe entre la longitud del material inicial y el tamao medio de los insertos. En la prctica, necesitamos un nmero de clones independientes mayor del terico para asegurarnos la representatividad de la genoteca: N = ln (1-P) / ln (1-1/n) N: nmero de recombinantes independientes P: probabilidad de hallar un inserto dado n: tamao ADN original /tamao medio insertos Se aconseja la construccin de genotecas con pasajeros grandes porque son ms manejables al estar formadas por un menor nmero de clones y ofrecen ms facilidad en el aislamiento de genes completos. A ms nmero de clones mayor fiabilidad. Pasos clave en la construccin de la genoteca: 9 Mtodo de fragmentacin del ADN de partida Define la complejidad de la genoteca, su representatividad y la facilidad de clonacin de los insertos. Digestin con endonucleasas: en teora, se puede anticipar el tamao promedio de los fragmentos, pero no es real. Dependiendo de la posicin de las dianas en relacin con la secuencia de un gen, puede que la digestin con una enzima rompa al gen en varias piezas impidiendo que aparezca completo en la genoteca.

53 Fragmentacin por mtodos fsicos: ultrasonidos. Produce una rotura al azar, por sitios no especficos. Los fragmentos resultantes requieren algn tratamiento para reparar sus extremos. La rotura al azar presenta una heterogeneidad mayor, aumenta la probabilidad de aislar un determinado gen completo y disminuye la probabilidad de que se pierdan secuencias por estar localizadas en fragmentos grandes no clonables. Muchos fragmentos solaparn entre s. Digestin parcial con una endonucleasa de diana corta (4 pb). Controlando las condiciones de digestin se pueden conseguir fragmentos de mayor tamao. produce fragmentos solapantes, aumentando las posibilidades de clonaje de cualquier secuencia y permitiendo el desplazamiento por el genoma

Digestin total con enzima A (corte poco frecuente; diana 6 bp)

Fragmentacin por mtodos fsicos (inespecfica)

Digestin parcial con enzima B (corte muy frecuente; diana 4 bp)

Fcil unir los insertos Insertos de tamao heterogneo Representatividad media Clones no solapantes

Difcil unir los insertos Insertos de tamao homogneo Representatividad alta Clones solapantes Fcil unir los insertos Insertos de tamao homogneo Representatividad alta Clones solapantes

9 Seleccin del vector de clonacin Depende del tamao de los insertos a clonar. Determina la conservacin y facilidad de anlisis de la genoteca Vectores usados en construccin de genotecas genmicas: Genomas pequeos: Plsmidos o derivados de (reemplazamiento) Genomas grandes: BACs o YACs Esquema para construir una genoteca con . Obtencin del ADN. Fragmentacin. ADN . Ligacin entre ambos. Empaquetamiento, en cada fago habr un fragmento de la genoteca. Amplificar la genoteca mediante cultivos, se consiguen calvas de lisis con . Para conservar la genoteca se puede congelar, en E.coli se debe aadir un agente criognico; se pueden hacer diluciones.

54 Conservacin y amplificacin de la genoteca Importante que la viabilidad de la genoteca y su representatividad no se pierda durante el almacenamiento y /o amplificacin. Los vectores derivados de se pueden almacenar ms tiempo sin prdida de viabilidad y pierden menos representatividad al amplificar la genoteca. Genotecas de ADNc Se obtienen al clonar los ADNc obtenidos a partir de los ARNm purificados de un cierto tipo celular. Refleja los genes que se estn expresando en ese tejido o momento del desarrollo. Permite identificar genes especficos. Tiene menor complejidad que las genotecas genmicas. Representatividad: No todos los ADNc estn igual de representados, ya que depende de la abundancia de los ARNm. A la hora del aislamiento de un clon es necesario tener en cuenta la concentracin de su ARNm en el sistema de partida.

Enriquecimiento: Podemos enriquecer la genoteca en el ADNc de inters mediante fraccionamiento por tamaos de los ARNm o uso de cebadores especficos en la obtencin de los ADNc. Genotecas de expresin Se construyen con un vector de expresin, aporta las seales necesarias para que el inserto pueda ser transcrito y traducido en la clula hospedadora. Permite que la genoteca pueda ser analizada a travs de los productos codificados en los pasajeros y de su posible actividad, alternativa para la deteccin y aislamiento de clones. El pasajero se inserta en un sitio localizado dentro de un gen presente en le vector, de manera que la expresin conjunta de ambos puede conducir a la sntesis de una protena mixta. Interesante que sea promotor inducible. As evitamos que se pierda la deteccin de clones que codifiquen para protenas txicas. G. de expresin genmicas En procariotas: poco ADN no codificante Representatividad puede ser menor: sobretodo las obtenidas por digestin Necesitamos nmero mayor de clones. Tener en cuenta la pauta de lectura. Usar vectores que difieran en la pauta de lectura. G. de expresin de ADNc En eucariotas: mucho ADN no codificante. Podemos expresar esas protenas en E. coli. El diseo de los cebadores nos permite que todos los ADNc se clonen en la pauta de lectura adecuada. Anlisis /escrutinio de la genoteca La utilidad de una genoteca es funcin de un mtodo que permita identificar, entre el conjunto de clones o fagos recombinantes, a aquel que contenga el inserto deseado. Deteccin y aislamiento del clon que nos interesa. Tres estrategias fundamentales: Hibridacin con una sonda marcada. Es la ms utilizada y la ms general. Nos permite analizar cualquier genoteca. No requiere que el gen a identificar se encuentre completo en el mismo clon ni que se exprese la protena codificada en el ADN.

55 Anlisis con anticuerpos (inmunoscreening). Solo en genotecas de expresin, dado que el anticuerpo reacciona con la protena no con el ADN. Dependiendo del tipo de anticuerpo utilizado requiere que la protena se exprese entera o no. Anlisis por deteccin de la actividad del producto codificado (Anlisis fenotpico). Slo en genotecas de expresin, y en casos concretos. Se requiere que la protena se exprese completa y /o que retenga su actividad.

Anlisis por hibridacin con sondas marcadas Suele ser el mtodo ms utilizado y es el ms fiable. Detectamos la presencia de una secuencia concreta, por lo que no necesitamos que la genoteca sea de expresin Sonda: Hebra de cido nucleico (ADN ARN) monocatenaria y de secuencia complementaria a la que estamos buscando 9 Sondas de ADN Si tenemos la secuencia de inters clonada en un vector, la podemos cortar con enzimas y purificar. Necesitaremos desnaturalizar antes de usar Podemos amplificar la secuencia que buscamos (o parte de ella) por PCR. Si realizamos PCR asimtrica, ya la tenemos en forma de monohebra y no necesita desnaturalizacin Sondas sintticas (oligonucletidos). Si no conocemos la secuencia del gen de inters, pero s la de la protena podemos disear sondas degeneradas. Las sondas degeneradas son una coleccin de sondas obtenidas a partir de una secuencia de aminocidos con todas las combinaciones de tripletes posibles. Tambin podemos incorporar inosina en los residuos que puedan variar. Este residuo puede aparear con cualquiera de las cuatro bases; se reduce el nmero de molculas a sintetizar y se puede alargar su longitud.
Secuencia protena

9 Sondas de ARN Tambin llamadas ribosondas. Transcripcin del inserto de inters, clonado en un vector especial. La secuencia buscada, con promotor, se expresa y se utiliza el ARN.

56 Marcaje de las sondas Empleo de radiactividad, es el mtodo ms sensible. 32 35 El istopo ms usado es el P , aunque tambin pueden usarse otros como S . podemos marcar las sondas de diferentes maneras: - Incorporando dNTPs radiactivos a la reaccin de PCR o de sntesis de oligos - Traslado de mella: creamos mellas en el ADN utilizando la DNasa I. Empleamos las actividades exonucleasa 5 3 y polimerasa de la ADN polimerasa I (de E.coli) para sustituir parte de las bases por dNTPs radiactivos. Ligasa para unir la mella que queda detrs. Se obtiene las misma molcula pero marcada radiactivamente. - Relleno de extremos: Si la sonda tiene extremos cohesivos, podemos rellenarlos con Klenow utilizando dNTPs radiactivos. - Empleo de la tranferasa terminal o la poliA (solo ATP) polimerasa para incorporar dNTPs radiactivos a los extremos de la sonda. 32 - Adicin de grupos fosfato con P en los extremos 5 usando la polinucletido quinasa. Primero se utiliza una fosfatasa para quitar fosfatos, luego se utiliza la quinasa que aade fosfatos. Detectamos la presencia de la sonda realizando una autorradiografa. Otros marcajes: - dNTPs marcados con fluorocromos. Detectamos con: Fluorimetra - Biotina: Aadimos protena detectora (avidina) conjugada con fluorocromo o enzima. la biotina es la sonda en el ADN, la avidina es afn a la biotina. Detectamos con: Fluorimetra o reaccin colorimtrica de la enzima. - Digoxigenina: Aadimos anticuerpo especfico conjugado con fluorocromo o enzima. Detectamos con: Fluorimetra o reaccin colorimtrica de la enzima Ensayo de hibridacin de la genoteca en soporte slido Cultivo de E.coli y fagos en placa. Cada calva corresponde a un clon diferente de la genoteca. Transferimos las calvas /colonias a un filtro de nitrocelulosa Tratamos con lcali para lisar las colonias y /o desnaturalizar el ADN Podemos fijar el ADN al filtro con luz UV. El ADN se queda pegado a la nitrocelulosa. Incubamos con la sonda marcada, solo se unir a las secuencias complementarias de la genoteca. Lavamos el exceso de sonda que no ha hibridado. Revelamos el filtro para detectar en que calva /colonia ha hibridado la sonda. Rescatamos la calva /colonia de la placa original para aislar el inserto.

57 Hibridacin Southern Combina la separacin de fragmentos de ADN (genmico total) mediante electroforesis con su transferencia a una membrana y su hibridacin con una sonda. Es una de las tcnicas de anlisis de ADN ms usada a partir de muestras biolgicas (sangre, esputo, tejidos, etc). Las bandas del gel (agarosa) se transfieren a una membrana de nailon. El ADN se queda pegado a la membrana.

La transferencia del ADN desde el gel a la membrana puede realizarse por capilaridad o por electrotransferencia.

Se obtienen bandas, la sonda hbrida con la banda complementaria. La banda nos da relacin del tamao del ADN, no de la sonda. Las condiciones en las que se realice la hibridacin determinar si la sonda se puede unir slo a su secuencia completamente complementaria o puede unirse a secuencias parcialmente complementarias. La temperatura es importante para que la sonda se una solamente a la hebra complementaria; si la temperatura es inferior a la ptima la sonda se hbrida a secuencias parcialmente complementarias. Tcnicas relacionadas con la hibridacin Southern Hibridacin Northern Tcnica similar a la anterior, pero en este caso transferimos ARN. Permite estudiar la transcripcin de un gen, ya que podemos usarla para detectar /cuantificar un ARNm concreto. Se separa por electroforesis, se transfiere a una membrana de nailon y se hbrida con la sonda. Hibridacin Western En este caso lo que transferimos y detectamos son protenas. No usamos sondas, sino anticuerpos especficos contra la protena que pretendemos estudiar. El gel utilizado en la electroforesis es de acrilamida. Combinando las tres tcnicas podemos estudiar un gen/ protena a varios niveles: Southern Secuencia ADN Presencia del gen Northern ARNm Transcripcin Western Protena Traduccin

En eucariotas un gen se puede estar transcribiendo pero no traduciendo, se puede detectar ADN, ARN pero no la protena. Pueden dar pistas sobre la regulacin de un gen.

58 Anlisis con anticuerpos (inmunoscreening) Tcnica similar a la hibridacin con sondas, pero usamos un anticuerpo contra la protena que queremos detectar. Necesitamos que la genoteca sea de expresin. Tras la siembra de clulas transformadas, el material de las placas es transferido a un soporte slido para fijar las protenas en l. El filtro es tratado con un anticuerpo contra la protena codificada por el recombinante buscado. La identificacin de una reaccin positiva se consigue mediante tratamiento con un segundo anticuerpo, dirigido contra los eptopos especficos del primero; este segundo anticuerpo va unido a una enzima cuya actividad se detecta con facilidad.

Los anticuerpos primarios pueden ser: - Ac. policlonal: no necesitamos que la protena est completa ni que retenga su actividad. Mayor ruido de fondo. Reconoce varios eptopos, aumenta la posibilidad de que reconozca un clon que exprese tan slo un fragmento de la protena, aunque produce un fondo muy alto debido a las reacciones contra otros antgenos. - Ac. monoclonal: Menor ruido de fondo. Podemos perder la deteccin de algunos clones. El nmero de recombinantes que reconoce es menor. Slo reconocen una secuencia de la protena. No se pueden detectar protenas fragmentadas. Anlisis por deteccin de la actividad del producto codificado Slo en casos en que la protena que buscamos tenga una actividad de fcil ensayo. Requiere que la protena se exprese y que est completa y /o retenga su actividad. Complementacin de mutantes bacterianos, aislamiento de genes de resistencia, protenas que podamos medir mediante ensayos colorimtricos 9 Aislamiento de genes por complementacin de mutantes bacterianos. El uso de una extirpe auxtrofa, mutante deficitaria en alguna actividad implicada en una ruta biosinttica, como hospedadora para la construccin de una genoteca obliga a utilizar un medio de cultivo complementado con el producto que no puede sintetizar. La genoteca no crece cuando se siembra en placas con medio mnimo, pero si el recombinante de alguna de sus clulas portara un pasajero capaz de expresar una actividad que complementara el defecto de la cepa hospedadora, sta s crecera en ese medio dando lugar a una colonia detectable. Se trata de una seleccin. El procedimiento requiere que el inserto se exprese utilizando una genoteca de expresin o trabajando con una que contenga fragmentos de tamao suficiente para que contenga completo el gen y las seales activas responsables de su expresin.

59

Tema 2 Mapas genticos y fsicos

Mapa de un genoma: Representacin grfica de la ordenacin y la posicin de genes y marcadores genticos dentro del genoma. Estas representaciones, sobretodo en genomas de gran tamao y alto contenido en secuencias repetidas, son de gran ayuda para el posterior ensamblaje de las secuencias obtenidas en los Proyectos Genoma.

La obtencin de mapas previos al inicio de un proyecto de secuenciacin nos sirve como gua para situar correctamente los fragmentos que se van secuenciando. Dependiendo de la estrategia utilizada para posicionar los diferentes marcadores, se pueden obtener mapas fsicos o genticos. Secuencia de un genoma: mapa del genoma realizado al nivel ms detallado. Obtencin de mapas: - Dependientes de la disponibilidad de marcadores genticos (alelos) - Dos tipos de mapas dependiendo de cmo se obtienen y se miden las distancias Tipos de mapas Mapas genticos (clsicos) Basados en frecuencias de recombinacin de alelos (frecuencias fenotpicas). Basados en la frecuencia de recombinacin entre los marcadores utilizados, por lo que la medida de la distancia entre marcadores se expresa en forma de distancias genticas (unidades de mapa). Los primeros marcadores utilizados fueron los propios genes. El empleo exclusivo de marcadores genticos da lugar a la obtencin de mapas pocos precisos, dada la baja proporcin de genes en los diferentes organismos cuyos fenotipos asociados son distinguibles visual o bioqumicamente.

60 Mapas fsicos: se obtienen mediante tcnicas de biologa molecular (restriccin con enzimas, tcnicas de hibridacin, PCR) y son ms precisos que los genticos. La utilizacin de paneles de lneas celulares somticas hbridas o lneas celulares hbridas por radiacin permite asignar marcadores a un cromosoma o regin cromosmica concreta. Las diferentes variantes de hibridacin in situ (FISH) permite posicionar marcadores con resoluciones que varan entre 1Mb (baja resolucin) y 10 kb (alta resolucin). Los mapas de restriccin permiten posicionar dianas de reconocimiento para diferentes endonucleasas, y pueden aplicarse a diferentes tipos de fragmentos de ADN , desde insertos clonados a fragmentos genmicos o cromosomas bacterianos completos. Basados en la secuencia, obtenidos con tcnicas de ingeniera gentica. Medido en pares de bases. Marcadores polimrficos: implican un polimorfismo poblacional (ocurrencia en un locus de numerosos alelos alternativos identificables)

Mapas genticos y fsicos Los mapas fsicos son ms precisos En el cromosoma hay puntos calientes donde la recombinacin es ms frecuente, se cree que los marcadores estn ms alejados. Hay zonas (telmeros) donde apenas ocurre recombinacin, se cree que los marcadores estn muy juntos.

Distancias fsicas

Distancias genticas

Secuencia de bases entre los marcadores moleculares

Entrecruzamientos entre los marcadores genticos

Mapas genticos - Medida de distancia: unidades de mapa - Medimos la frecuencia de recombinacin entre los loci: analizamos la herencia de los marcadores seleccionados Marcadores que podemos usar: Marcadores gnicos: los propios genes. Debe tener dos formas (alelos) alternativos que proporcionen fenotipos distinguibles - Genes que producen fenotipos visualizables - Genes que producen fenotipos distinguibles de forma bioqumica Marcadores no gnicos: marcadores moleculares - Son secuencias de ADN - Deben tener al menos dos alelos distinguibles - En el caso de humanos, cuanto ms polimrficos sean, mejor

61 Marcadores moleculares de ADN Se basa en la existencia de variacin a nivel molecular entre diferentes individuos (polimorfismos moleculares), que permiten su uso como marcadores genticos POLIMRFICOS - RFLP: Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restriccin. Pueden formar parte de una secuencia codificante. - SSLP: Polimorfismo de Longitud de Secuencia Sencilla. Repeticiones de secuencias. No son codificantes. Es interesante que tengan muchos alelos. La diferencia entre alelos es el nmero de repeticiones. VNTR: Repeticiones en Tndem de Nmero Variable. Entre 25-40 pb. Minisatlites. SSR /STR: Repeticin de Secuencia Sencilla /Repeticin en Tndem corta (Short). Pocos pb. Microsatlites. - SNP: Polimorfismo de Nucletido Sencillo. Variacin de un nucletido dado dentro de la poblacin. Pueden ser secuencias codificantes o no. NO POLIMRFICOS, utilizados para mapeo fsico, diagnstico. - STS: Sitio etiquetado (Tagged) por Secuencia. Secuencias nicas y conservadas, slo hay un alelo. Mediante este tipo de tcnicas se `puede establecer ligamiento entre marcadores moleculares y genes asociados con enfermedades humanas, tiene inters para la clonacin del gen y para el diagnstico molecular de la enfermedad correspondiente. Marcadores moleculares polimrficos y aplicaciones: Mapeo de genes por ligamiento Diagnstico presintomtico y prenatal de enfermedades genticas (indirectamente) Deteccin de portadores heterozigticos de alelos de enfermedades Marcadores de riesgo incrementado o reducido de algunas enfermedades - Diabetes - Alzheimer - Cncer Para algunos loci, comprobacin de donantes de rganos Aplicaciones forenses: Pruebas de identidad, parentesco RFLP: Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restriccin En una regin del cromosoma puede aparecer o no una diana de restriccin para una enzima concreta. Los polimorfismos en las dianas de restriccin permiten el anlisis RFLP.

ACAGCAGAATTCAACTAC Ejemplo: diana de restriccin

No muy polimrficos: slo dos alelos para cada RFLP Se pueden distinguir diferentes alelos.

62 Deteccin de RFLPs 9 Transferencia Southern: Se extrae todo el ADN, se corta con enzima de restriccin. Se hace electroforesis y se traspasa a la membrana de nailon. Una sonda que hibride en el sitio de corte. Se hace autorradiografa, el nmero de bandas depende de donde hibride la sonda. PCR Se trata el ADN con enzima de restriccin y se realiza PCR con cebadores. Se realiza electroforesis en gel de agarosa, aparecern bandas dependiendo de los alelos que haya. Es un proceso ms rpido.

SSLP: Polimorfismo de Longitud de Secuencia Sencilla Altamente polimrficos. Secuencias repetidas, tantas repeticiones como alelos 9 STR o microsatlites: se encuentran a lo largo de todo el cromosoma. Se usan ms como marcadores. nRepeticiones de 2-3 pb 9 VNTR o minisatlites: se usa menos porque el tamao de la repeticin es muy grande y difcil de ampliar por PCR. Suelen estar en los telmeros. nRepeticiones de unas 25-60 pb. Deteccin de SSLPs por PCR Los minisatlites se usan menos, dado que aparecen ms frecuentemente cerca de los telmeros y su tamao mayor hacen ms difcil su deteccin por PCR. Los oligos se fabrican antes y despus de las repeticiones.

SNP: Polimorfismo de Nucletido Sencillo Sitios donde vara una nica base que no pertenece a una diana de restriccin (sera un RFLP). En unos individuos aparece una base, en otros otra. En teora puede haber 4 alelos, pero en realidad solo existen 2, de cada SNP.

63 Los SNP se generan por mutacin y se fijan, no tienen efecto drstico en el organismo, se mantienen y se heredan. Para que aparezca un tercer alelo debera existir una segunda mutacin en el mismo sitio. Deteccin de SNPs Basados en la secuencia del SNP. Es una estrategia de discriminacin. Hibridacin con oligonucletidos especficos. - Deteccin mediante hibridacin con sonda: especificidad de la hibridacin Ajustando las condiciones de la hibridacin y /o el lavado podemos ajustar el nmero y tipo de secuencias que detectamos. Variando la concentracin de sales o la temperatura hacemos las condiciones ms o menos restrictivas a la hibridacin. La temperatura de hibridacin depende de la longitud y porcentaje de G/ C de la sonda. a 65C se hbrida la hebra 100% complementaria a 50C reconoce secuencias que varan en 1-3 bases a 35C la sonda se une a secuencias que se parecen pero no son 100% complementarias. Se disean oligos 100% complementarios a uno de los alelos y se somete a condiciones restrictivas. Se preparan los dos oligos y se hace un ensayo por separado.

+ Restrictivas Slo queda unida a la secuencia idntica

- Restrictivas Se une a ms bandas que poseen cierta homologa

9 Hibridacin en solucin Se aade en un extremo del oligonucletido una sustancia fluorescente y en el otro extremo un quenching (apagador, no emite fluorescencia); se aaden los SNP y cuando Hibridan al 100% emiten fluorescencia.

64 9 Chip de ADN Cristal donde tenemos unidos diferentes oligos. El cristal tiene muchas celdillas Marcamos el ADN que queremos detectar, con fluorescencia o radiactividad. Se aade la mezcla de ADN al chip. Se lava el chip y se detecta la hibridacin. Podemos analizar al mismo tiempo diferentes SNPs con la misma muestra de ADN. Obtencin de mapas genticos Basados en el anlisis de ligamiento entre dos loci. Dos genes /marcadores localizados en el mismo cromosoma se heredan juntos: estn ligados. A veces durante la meiosis ocurren entrecruzamientos que hacen que los alelos ya no se hereden juntos. El porcentaje de veces que se produce recombinacin entre dos loci depende de la distancia entre ambos loci: nos permite establecer distancias genticas entre ambos

Tres situaciones /estrategias: Cruces dirigidos: en organismos donde podemos realizarlos, parentales con genotipos conocidos. rboles genealgicos: en humanos y otros eucariotas con ciclo de vida largo donde no podemos realizar cruces dirigidos. Otro sistema de estudiar la recombinacin: en bacterias, donde no tenemos meiosis. Organismos donde podemos realizar cruces dirigidos La mayor parte de los eucariotas: mosca, levaduras, roedores... Analizamos la descendencia obtenida en cruces entre parentales de genotipo conocido para los loci a estudiar. En levaduras y otros eucariotas inferiores, podemos crecer los gametos producidos como clulas haploides, lo que facilita el anlisis. En otros casos, podemos analizar los gametos (esperma), que son haploides. Si analizamos la descendencia diploide, hay que tener en cuenta que proceden de dos meiosis independientes

65 Mapas genticos humanos: anlisis de rboles genealgicos No podemos realizar cruces programados con parentales de genotipo conocido. Este mtodo es tambin aplicable a organismos con ciclos reproductivos muy largos (algunas plantas y animales). Se estudia la familia hacia atrs, si existen muestras de ADN se analizan y se establece el rbol genealgico. Usamos marcadores moleculares conocidos y mapeados en humanos, se analiza la herencia de un gen con esos marcadores: 105 RFLPs 6,5 x 105 microsatlites >106 SNPs Mi: datos del genotipo del marcador seleccionado, alelos para el marcador polimrfico. stos pueden ser STR o VNTR.

Hiptesis 1: alelo M1 ligado a la enfermedad, alelo M2 ligado a individuo sano. Hiptesis 2: alelo M2 ligado a enfermedad, alelo M1 ligado a individuo enfermo. Si la hiptesis 1 es correcta, todos los afectados tienen que tener el alelo M1 y los que lo heredan son parentales, si est afectado y no tiene el alelo M1 ese es el recombinante. Tenemos 5 individuos con combinacin parental, frecuencia de recombinacin 1/6 = 167%, el alelo y el gen estn ligados entre s. En la hiptesis 2 apareceran 5 recombinantes y un solo parental. Frecuencia de recombinacin 5/6= 833%, no estn ligados. El marcador no produce la enfermedad, la produce el gen, pero establece el ligamiento. Nos faltan datos para establecer la hiptesis correcta, pero si se rescata el genotipo de la abuela muerta, nos permite establecer que la hiptesis 1 es la correcta. Presenta el alelo M1 y adems un quinto alelo M5. est claro que el alelo ligado a la enfermedad es M1, porque ningn descendiente presenta el alelo M5.

66 Ejemplo 2: la diana de corte corta al alelo 1, pero no al 2

Marcador RFLP

Establecemos ligamiento entre gen D y RFLP Naranja: enfermos Padre homocigoto d/d y homocigoto del alelo 2 Madre heterocigoto D/d heterocigoto tiene alelos La hija 8, padece la enfermedad y es homocigoto para alelo 2, es recombinante. Las frecuencias de recombinacin confirman el ligamiento entre D y 1.

Alelo D ligado a RFLP-1

A partir de la hija 8 se pierde la pista del alelo 1, puesto que no lo tiene y sus descendientes que padezcan la enfermedad no se sabr que alelo tiene ligado al gen.

Recombinacin materna en el hijo 8 Alelo D ligado a RFLP-2

Mapas genticos en Bacterias Las bacterias no realizan meiosis. Inducimos cruzamiento entre fragmentos homlogos: - Copia cromosmica - Copia introducida Podemos introducir esa copia extra por diferentes mtodos. Usamos siempre marcadores bioqumicos El alelo silvestre o dominante confiere una caracterstica bioqumica a la clula: - Resistencia a antibiticos, compuestos txicos, - Sntesis de algn compuesto esencial - Uso de diversas fuentes de carbono

67

La clula donadora es portadora del alelo silvestre

La clula receptora tiene el alelo recesivo

Detectamos la adquisicin del alelo silvestre

9 Uso de conjugacin Medimos la distancia en funcin de los minutos que tardan en transferirse los marcadores. La conjugacin se puede parar a diferentes tiempos. El mapa est medido en minutos.

9 Uso de transduccin o transformacin Los marcadores deben estar muy prximos El ADN lineal se integra en el genoma. Se mide en funcin de la frecuencia con la que se cotransducen o se cotransforman.

Limitaciones de los mapas genticos - Resolucin: distancia mnima o mxima para detectar el ligamiento, depende de: del nmero de marcadores que tengamos localizados para cada organismo nmero de datos disponibles para calcular la frecuencia de recombinacin E. coli: 1400 marcadores, 1 marcador cada 3,3 kb. Tamao del genoma 4 Mb Humanos: Difcil detectar, frecuencias de recombinacin muy bajas, las familias no son muy largas. Los marcadores lejanos pueden mapear en la misma posicin. 1% = 1 cM = 1 MB - Exactitud: existencia de puntos calientes de recombinacin.

68 Mapas fsicos Nos permiten obtener las distancias fsicas entre marcadores (en pb) o localizar fsicamente los marcadores en la secuencia de ADN. Diversas estrategias o mtodos con los que obtenemos mapas de diferente escala o nivel de resolucin: Mtodos /mapas de baja resolucin: Nos permiten asignar un marcador /gen a un cromosoma o regin cromosmica (varias Mb) Mtodos /mapas de alta resolucin: Nos permiten localizar el marcador en una regin de hasta unas 25 kb Mtodos /mapas de mxima resolucin: Secuencia de nucletidos Mapas fsicos de baja resolucin - Paneles de lneas celulares somticas hbridas: Fusionamos in vitro clulas de diferentes especies, por ejemplo clulas humanas y de ratn/ hamster. Se consiguen heterocariontes. Los heterocariontes son inestables, pierden cromosomas. El resultado son lneas celulares estables que contienen todos los cromosomas de ratn y algunos humanos. Realizamos cariotipo para determinar que cromosomas humanos tenemos en cada lnea celular.

Ensayamos presencia/ ausencia del marcador

Clon 1 Crom. 1 Crom. 2 Crom. 3 Crom. 4 Crom. 5

NO SI NO NO NO

Clon 2
SI NO NO SI NO

Clon 3
NO NO SI SI NO

Clon 4
NO NO SI NO SI

Nos permite asignar el marcador a un cromosoma concreto

Paneles de lneas celulares somticas hbridas Podemos obtener hbridos monocromosmicos. Obtenemos microclulas que contienen un cromosoma aislado cada una. Fusionamos cada microclula a una clula de ratn para obtener los hbridos. Para aumentar la resolucin podemos trabajar con hbridos que contengan fragmentos de cromosomas en lugar de cromosomas completos. Usamos colecciones de cromosomas con deleciones o traslocaciones. Podemos asignar el marcador a una regin cromosmica ms reducida

69 Paneles de lneas hbridas obtenidas por radiacin Para obtener clulas hbridas que contengan regiones ms reducidas de los cromosomas usamos radiacin. A mayor radiacin, fragmentos ms pequeos. Tratamos con rayos X las clulas humanas y despus las fusionamos con las clulas de hamster sin irradiar. Los fragmentos se integran en los cromosomas de hamster al azar. Se constituyen diferentes lneas celulares. Se detectan los marcadores que hay en cada hbrido y se ensaya la presencia /ausencia del gen de inters en cada hbrido. Las distancias frente a un marcador se calculan en funcin de la probabilidad de que la rotura se produzca entre el marcador y el gen. Cuanto ms cerca estn marcador y gen, menor probabilidad de que estn en fragmentos (hbridos) diferentes. A ms frecuencia mismo cromosoma; a menor frecuencia mismo hbrido diferente cromosoma.

Hibridacin in situ (FISH) Observamos directamente donde se encuentra el marcador dentro del cromosoma gracias al empleo de una sonda marcada con un fluorocromo. Preparacin de clulas en metafase (cromosomas condensados), ADN parcialmente desnaturalizado. Aadimos la sonda marcada. Observamos al microscopio de fluorescencia. Identificamos previamente los crosomomas mediante cariotipado. Podemos detectar varios marcadores usando sondas marcadas con diferentes fluorocromos. Detectamos marcadores /sondas separadas en algo ms de 1 Mb. Si dos seales se solapan emiten un color diferente de los fluorocromos usados, estn mezclados, se suponen muy cerca en el cromosoma a menos de 1 Mb.

70 Si la sonda es demasiado grande, puede tener secuencias repetidas. Hibridacin inespecfica con secuencias repetidas. Bloqueamos con una pre-hibridacin: - Se purifica el ADN de secuencias repetidas con columna de cloruro de sodio - Se Hibridan las secuencias repetidas, se desnaturaliza el ADN y se ponen oligos con las secuencias repetidas, se quedan como bicadena - Las secuencias nicas estn en monocadena, pueden hibridar con la sonda

Tambin podemos realizar hibridaciones con muestras de cromosomas aislados mediante citometra de flujo

Mapas fsicos de alta resolucin Hibridacin in situ (FISH) de alta resolucin - Uso de cromosomas metafsicos extendidos artificialmente. Tienen unas 20 veces su tamao normal en metafase y an son reconocibles, estn parcialmente descondensados. La resolucin aumenta y permite detectar seales separadas en 200-300 kb. - Uso de cromosomas interfsicos. Cromosomas no empaquetados. Permite discriminar seales separadas unas 25 kb. Problema: la conformacin al azar de los cromosomas nos impide determinar el orden de los marcadores en la secuencia de ADN. - Uso de fragmentos de cromosomas purificados y extendidos artificialmente. Resolucin de unas 10 kb, si las sondas estn juntas, ms de 10 kb; si se solapan, menos de 10 kb. Mantiene el orden de los marcadores.

Mapas de restriccin Relacin ordenada de los sitios de corte para enzimas de restriccin concretas, indicando las distancias entre ellas en pb. Es un esquema lineal en el que figuran las posiciones relativas de las dianas de ciertas enzimas de restriccin. Proceso de obtencin: - Digestin con la/ s enzima /s de restriccin. - Anlisis de los fragmentos obtenidos mediante electroforesis y /o Southern Ser ms informativo cuantas ms dianas para enzimas diferentes podamos posicionar en el mapa. Estrategias: - Uso de digestiones dobles - Uso de digestiones parciales

71 Uso de nucleasa Bal31 para localizar sitios de restriccin Empleo de sondas para discriminar fragmentos

Uso de digestiones dobles

Comparamos los resultados obtenidos en las digestiones simples con el obtenido en la digestin doble para ir posicionando los sitios de corte. EcoRI: tiene diana interna en BamHI Truco: reconocer que fragmentos de la digestin con una enzima han sido cortados por la otra

Con los datos que tenemos no podemos discriminar cual de los dos mapas sera el correcto. Para ello se hacen digestiones parciales, sin cortar al 100%, se consiguen diferentes trozos de diferentes tamaos. Con estos nuevos datos sabemos que el mapa correcto es el II

Uso de digestiones parciales

En las digestiones parciales veremos bandas de diferentes intensidades en el gel. En una digestin total los fragmentos ms grandes tiene bandas de mayor intensidad. En la digestin parcial las bandas de mayor tamao tienen menos intesidad. Ejemplo: un ADN lineal es digerido parcialmente con BamHI. Las alcuotas retiradas a distintos tiempos se analizan en gel de agarosa, obtenindose un patrn de bandas.

72 0 minutos: fragmento intacto de 65 kb 5 minuto: mezcla compleja - pieza original, 65 kb - piezas de rotura parcial - piezas de rotura total - bandas de distinta intensidad 20 minutos: - fragmentos de digestin total - bandas de idntica densidad - la suma es 65 kb - 2 dianas Se puede concluir que el tamao del ADN lineal es de 65 Kb, y que presenta dos dianas BamHI cuya rotura produce tras fragmentos de 30 kb, 20 kb y 15 kb, nicos productos obtenidos tras digestin total a los 20 minutos de incubacin. De los 3 posibles mapas (a, b y c), slo el que coloca el fragmento de 2 kb en el centro (mapa a) puede explicar la ausencia en la imagen del gel de un producto de digestin parcial de 45 kb. Esa disposicin permite explicar la presencia de todas las bandas electroforticas que se visualizan: - el fragmento de digestin parcial de 5 kb abarca los fragmentos de 3 y de 2 kb - el parcial de 35 kb abarca a los de 2 y 15 kb.

Vale tanto ese mapa como el simtrico.

Digestiones progresivas con Bal31

Bal31 es una exonucleasa que degrada ADN2C, en un proceso que comienza por ambos extremos y avanza hacia el centro. La nucleasa va eliminando las posibles dianas de restriccin que vaya encontrando. La toma de alcuotas a distintos tiempos de incubacin con Bal31, la posterior digestin de stas con una enzima de restriccin y la comparacin de las bandas electroforticas permitirn descubrir la posicin de los sitios de restriccin reconocidos por la enzima usada. Los resultados son ms fcilmente interpretados si el anlisis se realiza sobre un ADN que incorpora una regin mapeada en un extremo (vector de clonaje, por ejemplo); as se pueden distinguir los fragmentos de restriccin que proceden de cada extremo y deducir el mapa de la regin desconocida. Se incuba un ADN lineal de doble cadena con la enzima Bal31, tomndose alcuotas a los 0, 3, 10 y 20 minutos. Tras detener la incubacin con esa enzima, cada alcuota es incubada con la endonucleasa de restriccin HindIII en condiciones de digestin total, tras lo cual se analizan los fragmentos resultantes mediante electroforesis, obtenindose ese patrn de bandas. - A tiempo 0 el ADN no ha sido cortado por Bal31, por lo que las bandas de restriccin que aparecen tras la digestin con HindIII son las que proceden de la molcula original intacta. Se deduce la longitud del ADN, 15 kb. - A los 3 minutos, el ADN ha sido degradado en algn grado por los extremos, al comparar las bandas con las del tiempo 0, se observa que la banda correspondiente al fragmento menor ha desaparecido, que la inmediata superior se ha desplazado, que la siguiente en tamao se ha desplazado ligeramente y que el resto de bandas mantiene su posicin.

73 Esto indica que los fragmentos pequeos de 1 y 2 kb proceden de los extremos del ADN original. Los fragmentos terminales aparecen con menor longitud e incluso uno ha desparecido. Esto permite localizar dos dianas HindIII a 1 y a 2 kb de cada uno de los extremos. Se observa un desplazamiento de la banda que originalmente tena 3 kb y como los restos del fragmento de 2 kb an se ven, se puede concluir que el de 3 kb se encuentra contiguo al de 1 kb en el ADN de partida. En las otras alcuotas se pueden encontrar variaciones en las posiciones de algunos fragmentos que deben interpretarse como recortes de los mismos debidos a la accin de la nucleasa Bal31; as el desplazamiento de la banda de 4 kKb permite localizarlo en posicin contigua al de 2 kb y al fragmento de 5 kb en la posicin central, ms interna.

De esta manera se puede completar el mapa de los sitios HindIII en el ADN.

Digestiones parciales con ADN marcado en un extremo

Es el proceso ms directo, pero tambin el ms laborioso y ms costoso. Marcamos el ADN a digerir en el extremo 5 de una de las cadenas mediante un istopo radiactivo (32P). Realizamos digestin parcial, electroforesis y autorradiografa. Se obtienen una mezcla compleja en la que los fragmentos marcados comparten el mismo origen y acaban en alguno de los diferentes sitios de restriccin por los que la endonucleasa ha roto. El revelado de las bandas y la estimacin del tamao de cada fragmento marcado permite localizar un punto de rotura en el ADN original. Un ADN lineal bicatenario es marcado en su extremo 5 de una de las hebras, es sometido a digestin parcial con HpaI. Los fragmentos son separados en gel de agarosa y se revelan con autorradiografa. La autorradiografa presenta 5 fragmentos, cada uno de ellos contiene el extremo 5 marcado y terminan en una diana de restriccin de HpaI.

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Solapamiento de fragmentos por hibridacin

Supone el aislamiento de un fragmento interno obtenido mediante restriccin con una enzima, su separacin en gel y su extraccin a partir de la banda electrofortica. Lo marcamos y lo usamos como sonda frente a los fragmentos obtenidos en la digestin con un segundo enzima, tras su separacin y transferencia a papel (Southern blotting). La sonda reconocer aquellos fragmentos de la segunda digestin que solapen con l en el mapa del ADN de partida. De esta manera se puede ir colocando el conjunto de fragmentos resultantes de una digestin, apoyndose en el conjunto obtenido tras una segunda, y viceversa.
E 0 1 2 E 3 4 5 E 6

En el proceso de construccin del mapa de restriccin de un ADN lineal de 6 kb, se han colocado las tres dianas EcoRI. Cuando se digiere con BamHI se obtienen tres bandas de 1, 2 y 3 kb. Para definir la posicin de sus dianas, se realiza una digestin doble BamHI /SalI, apareciendo slo dos bandas de 1 y 2 kb. La desaparicin de la banda de 3 Kb, en la digestin con las dos enzimas, indica que la diana SalI rompe ese fragmento para producir uno de 1 kb y otro de 2 kb. Conocida la posicin del sitio SalI (3 Kb), puede decirse que el fragmento BamHI de 3 kb proviene de la parte central del ADN original y est flanqueado por los otros dos fragmentos; as puede haber dos posibles mapas.

Las bandas obtenidas tras la digestin con BamHI y electroforesis son transferidas a un filtro de celulosa y sometidas a hibridacin con una sonda radiactiva construida a partir de fragmentos de EcoRI de 3 kb, preparado mediante digestin del ADN con esta enzima, separacin en gel y aislamiento en banda. Tras la hibridacin, el filtro se revela con autorradiografa, apareciendo dos bandas positivas de 3 y 2 kb.

Segn el primero de los dos mapas posibles, la sonda solapara, y por tanto hibridara, con los fragmentos BamHI de 3 y 2 kb. Segn el segundo mapa, la sonda reconocera a los fragmentos BamHI de 3 y 1 kb, sobre los que solapara. El resultado de la autorradiografa sustenta la primera posibilidad.

75 Problemas que nos podemos encontrar: - Presencia de dos dianas muy prximas: Dara lugar a fragmentos de restriccin muy pequeos que podramos perder en la electroforesis. Podemos trabajar cargando las digestiones en dos geles con diferente concentracin de agarosa/ acrilamida, los geles de acrilamida discriminan tamaos ms pequeos - Aparicin de dos o ms fragmentos de tamao similar: Los veramos en el gel como una nica banda. La intensidad de las bandas puede darnos una pista de que esto est pasando. Mapas de restriccin de genomas completos Limitaciones de tamao. Podemos obtener fcilmente los mapas de restriccin de fragmentos de hasta 50 kb cortando con enzimas que tengan dianas de reconocimiento de 6 pb Puede aplicarse el anlisis de restriccin a molculas /genomas /cromosomas de mayor tamao? SI. Tenemos requerimientos /aproximaciones especiales 9 Uso de enzimas de corte raro en el ADN: - Dianas de 7-8 pb, cortan cada 16-65 kb. - Dianas que contengan motivos raros en el ADN de estudio, motivo CG en humanos es raro, porque es un sitio de metilacin y sufre mutaciones, cortar fragmentos muy grandes: Sma I CCCGGG Not I GCGGCCGC 9 Uso de tcnicas especiales de electroforesis: - Electroforesis en campo ortogonal alterno. Campo pulsado. La reorientacin alterna a la que se someten las molculas permite separar mejor las molculas grandes. Intercambia el campo elctrico, las molculas grandes se mueven en zig-zag.

Electroforesis normal

Electroforesis campo pulsado

Mapas fsicos de alta resolucin 9 Caractersticas de un mapa fsico til: - Alto nmero de marcadores localizados. - Fcil y rpido de obtener

Mapas de restriccin
De fcil obtencin. Contienen mucha informacin. No pueden aplicarse a genomas eucariotas completos

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FISH de alta resolucin

Pueden aplicarse a genomas completos. Metodologa compleja y de lenta obtencin de datos No eficiente para mapas fsicos de eucariotas superiores

Mapas fsicos de STS STS: Sequence tagged site. Sitio de secuencia marcada; sitios marcados nicos; secuencias de referencia; secuencia corta y nica. Se detecta por PCR; se disean oligos. 9 Obtencin de un mapa de STS Partimos de una coleccin de fragmentos de ADN solapantes que representan al genoma a estudiar Detectamos en cada fragmento de ADN la presencia /ausencia de diversas STS. Calculamos distancias entre STS en funcin de la frecuencia con la que estos STS no aparecen juntos en un mismo fragmento. Si la frecuencia es muy alta se encuentran en el mismo cromosoma. Frecuencia de que haya rotura entre ambos STS

9 Secuencias que pueden ser un STS Un STS es una secuencia corta de ADN (50-500 pb) que aparece en una nica posicin en el ADN de estudio. Deben cumplir dos criterios: - De secuencia conocida: Detectamos los STS mediante PCR. Tenemos que disear cebadores especficos para detectar su presencia - Debe ser secuencia nica en el genoma: No debe incluir secuencias de ADN repetitivo Secuencias de diversos tipos /orgenes pueden usarse como STS: ETS: Etiquetas de secuencias expresadas. - Secuencias obtenidas del anlisis de ADNc. - Corresponden a secuencias codificantes. - Representativas de los genes que se estaban expresando en las clulas de las cuales se obtuvo el ADNc. - Pueden usarse como STS si corresponden a secuencias de genes nicos SSLPs: - Los microsatlites pueden usarse como STS en mapeo fsico. - En la mayora de los casos conocemos la secuencia del microsatlite Secuencias genmicas al azar: - Obtenidas al secuenciar aleatoriamente fragmentos de ADN genmico clonado. - Tambin de secuencias previamente depositadas en las bases de datos 9 Qu podemos usar como coleccin de fragmentos de ADN Paneles de clulas hbridas obtenidas por radiacin - Detectamos la presencia de los STS en los diferentes hbridos - Importante: el STS no debe corresponder a secuencias homlogas presentes en las clulas sin irradiar.

77 Genotecas genmicas - Sobretodo las obtenidas en vectores para fragmentos grandes (>100 kb). - Anlisis por PCR de cada clon - Obtenemos el mapa de STS para cada fragmento

Uso de los STS para reconstruir el mapa del genoma. El solapamiento de los mapas de STS para cada fragmento nos permite obtener el mapa de la regin genmica que representan. Las genotecas pueden usarse directamente para secuenciar

El solapamiento nos permite reconstruir el mapa de un genoma y posicionar los STS en el cromosoma completo

78

Tema 3 Genmica, transcriptmica y protemica

Ensamblaje de fragmentos genmicos y Proyectos Genoma Organizacin de los genomas Genomas procariotas Genomas eucariotas. Genomas de orgnulos Tipos de secuencias Genmica funcional Expresin de los genes Funcin de los genes Transcriptmica y protemica

Proyecto genoma: secuenciacin de genomas Objetivo: obtencin de la secuencia completa del genoma de un organismo y la integracin de los datos de los mapas genticos y fsicos en dicha secuencia. Construccin de una genoteca de fragmentos solapantes: es importante construir una genoteca, lo primero que hay que hacer es clonarlo en un vector, y conseguir el solapamiento de los fragmentos. Las reacciones de secuenciacin nos permiten leer unas 500800 bp cada vez. Solapamiento permite ensamblar las secuencias obtenidas. Tener los fragmentos clonados facilita la secuenciacin. Se precisa de un cebador, se necesita conocer parte de la secuencia, conocemos la secuencia del vector. Estrategias de secuenciacin Mtodo del shotgun-aleatorio o secuencia aleatoria Vlido para genomas pequeos y con poco contenido de ADN repetitivo. Podemos aplicarlo a genomas de los que no dispongamos de mapas genticos /fsicos. Pasos: - Se fragmenta el genoma (500-700 pb) y se clona. - Se secuencian todos los fragmentos - Usamos un programa informtico para ensamblar las secuencias Problemas: - En genomas eucariotas el nmero de secuencias a analizar es muy grande: problemas con los programas informticos. No suele usarse en eucariotas porque el genoma tiene muchas secuencias repetidas. - Las secuencias repetidas provocan errores en el ensamblaje. Cuando hay minisatlites con la misma secuencia en lugares diferentes, el ADN que queda entre ellos suele perderse.

79 9 Aplicacin del shotgun: el genoma de Haemophilus influenza Tras la sonicacin, para fragmentar el ADN, se purifican 16 kb y se clonan en un vector adecuado, y se secuencia. Se procura que la secuenciacin sea 2-3 veces mayor que el tamao real del genoma. El genoma entero no se ha ensamblado, sino que Sonicacin del ADN se han generado 140 contigs. Contig: serie de ensamblajes de las secuencias que estn solapadas. Problema al construir la genoteca: - no se ha clonado todo el genoma - las enzimas de restriccin han cortado por el mismo sitio - fragmentos grandes, por tanto la secuenciacin no es completa.
Clonacin: Genoteca

Relleno de los huecos de secuencia Bsqueda de clones que contienen extremos de dos contigs diferentes (PCR), que hibriden hacia fuera y se hace PCR en la genoteca original. Secuenciacin del clon correspondiente Relleno de los huecos fsicos Secuencias que no estn en la genoteca. Diseamos cebadores complementarios a los extremos de los contigs y se buscan las secuencis que faltan en otra genoteca distinta. Bsqueda en una segunda genoteca PCRs en el genoma original

80 Mtodo del ensamblaje de clones contiguos: primero ensamblar, despus secuenciar. Partimos de una genoteca de YACs o BACs (insertos de hasta 1,5Mb). Se establece como esos clones solapan entre s. 9 Paseo cromosmico (chromosome walking)

Se subclona un fragmento del inserto grande, se usa como sonda y se hibrida con el resto de la genoteca. Se consigue otro clon que comparte secuencia con el anterior pero ms largo. Se repite varias veces. Variantes: - Uso de fragmentos completos como sondas. Un inserto no muy grande se hibrida con toda la genoteca, se avanza en las dos direcciones.

- Uso de PCR: dos cebadores que hibriden y amplifiquen un pequeo trozo de ese fragmento, se compara con la genoteca. Los productos de PCR encajan con el fragmento, se debe de conocer parte de la secuencia.

81 - Uso de mapas fsicos. Podemos usar los mapas de restriccin o de STS para establecer que clones solapan entre s. Si dos mapas de restriccin solapan entre s, los fragmentos solapan entre s. Si dos fragmentos comparten STS, solapan entre s.

A cada fragmento se aplica entonces el mtodo de shotgun para obtener su secuencia

Mtodo del shotgun en genoma completo Combina el mtodo del shotgun con el empleo de mapas fsicos /genticos Con los fragmentos que tienen informacin en el mapa, se aplica el shotgun y se ensamblan. De las regiones que no se conoce mucho, se obtienen muchas secuencias, se ensamblan y se busca algn marcador del que tengamos informacin.

82 Se debe trabajar con unas caractersticas especiales Trabajamos con dos genotecas distintas Cmo evitamos los problemas de las secuencias repetidas? Una de las genotecas usadas tiene tamao de fragmentos mayor que el tamao mximo de las repeticiones del genoma. Aseguran que las secuencias repetidas son secuencias adyacentes y estn en algn inserto.

En la primera fase no secuenciamos los fragmentos de las genotecas completos, son muy grandes, slo los extremos. Se obtienen secuencias pre-ensambladas o andamios. Luego se rellenan los huecos de secuencia y a continuacin los huecos fsicos.

Utilizamos los marcadores presentes en estas secuencias pre-ensambladas para: - Posicionar estas secuencias en el genoma - Detectar posibles errores de ensamblaje - Posteriormente vamos completando los huecos con las tcnicas que ya hemos visto Esta tcnica es la que se est aplicando a los genomas de Drosophila y humano Problema: Determinar el grado de exactitud de la secuencia generada. La fragmentacin y secuenciacin al azar de fragmentos producen que hay regiones ms secuenciadas que otras. Qu nos permite hacer la secuencia completa de un genoma? - Identificar nuevos genes - Identificar regiones reguladoras - Comparar la estructura y organizacin de genomas completos Genmica comparativa Estudios de evolucin

83 Organizacin de los Genomas Genoma eucaritico nCromosomas nucleares nCromosomas de los orgnulos

Genoma procaritico nCromosoma (nucleoide) nPlsmidos Genoma vrico nCromosoma Tamaos genmicos y complejidad morfolgica. La paradoja del valor de C El tamao mnimo del genoma incrementa con el filum, aumenta conforme se sube en la escala evolutiva. Se corresponde mayor tamao del genoma con mayor complejidad morfolgica?

Es proporcional el tamao del genoma al nmero de genes que contiene? La respuesta es no, no existe correlacin entre nmero de genes y tamao del genoma.

El tamao del genoma no es proporcional al nmero de genes que contiene: - S. cerevisiae: 12,1 Mb, 5800 genes - Humanos: 3200 Mb, 30000-40000 genes

84 Estructura y concepto de gen Gen: unidad de funcin. Segmento de ADN que se transcribe, produciendo un ARN funcional (ARNm, ARNr, ARNt u otros) - Inicio de la transcripcin (+1), es importante. Partes del gen: Zona codificante: - Pauta abierta de lectura Zona no codificante: Estructura gnica - Promotor y zonas reguladoras. (aguas arriba) - Terminador (aguas abajo) Los genes eucariticos son discontinuos, por tanto ms grandes. El ARN necesita madurar Los genes aumentan de tamao en eucariotas superiores El nmero de genes interrumpidos en eucariotas superiores es mayor. El aumento de tamao de los genes es debido principalmente a los intrones, son stos los que aumentan de tamao; en humanos hay una media de 2 kb de intrones.

Identificacin de genes

Un segmento de ADN tiene 6 fases de lectura potenciales

_ El anlisis de ORFs (pautas abiertas de lectura) es una tcnica efectiva para identificar genes en procariotas. Se analiza las posibles ORFs, simpre empiezan con un codon de inicio y acaban en uno de terminacin.

La lnea roja es la pauta de lectura adecuada, las lneas azules son demasiado pequeas para ser una ORF.

85 En eucariotas, la presencia de intrones complica la identificacin de ORFs.

_ Los genes relacionados presentan una misma organizacin, los exones son similares tienen una secuencia conservada. Los intrones varan en secuencia y en tamao. Los genes de la dihidrofolato reductasa de mamferos varan mucho en la longitud de los intrones, pero mantienen la estructura.

Los genes de las globinas pueden tener intrones de diferentes tamaos, pero tienen la misma estructura

Intrones: modularidad evolutiva y funcional

Un exn es un dominio completo de una protena, en muchos casos.

86 _ Rastreo zoogico: Zoo-blot: Una secuencia exnica (o cDNA) importante estar presente en especies relacionadas

Origen de los intrones Modelo de los intrones tempranos: Los genes se originaron como estructuras discontnuas, y han ido eliminando los intrones. Modelo de los intrones tardos: Los genes se originaron sin intrones, los intrones se insertaron despus. Evolucin de exones e intrones

Qu estructura E /I /E.. es anterior?

Genes que codifican ms de una protena - Procesamiento alternativo de intrones, es un proceso regulado dependiendo del tipo celular Eliminacin de exones Incorporacin de distintos exones

87 Protenas que varan en su extremo N-terminal C-terminal Sitios de inicio o terminacin alternativos, dependiendo donde empiece

- Genes solapantes La traduccin se inicia en sitios diferentes, tienen ms de una pauta de lectura. Cada pauta de lectura codifica para una protena diferente. Tpico de genomas compactados (virus, bacterias).

Genes codificados en el interior de intrones, tpico de eucariotas. En el ejemplo, en el interior del intrn 27 hay 3 genes.

Tamaos, genes y tipos de secuencias Tambin aumenta el nmero de secuencias de ADN repetitivo a medida que se sube en la escala evolutiva.

88 Tipos de secuencias 9 Estructura Unicas: genes Repetidas: ADN altamente y moderadamente repetido 9 Funcin Genes - Copia nica - Agrupamiento de genes idnticos - Familias gnicas Seudogenes: familias gnicas. Otros Estructuras nicas: genes - Genes idnticos: Genes ARN ribosmico: Se agrupan en cluster, en eucariotas, tienen copias en tndem. Se estn expresando continuamente porque son necesarios. Contienen intercalados una regin que se transcribe y un espaciador que no se transcribe. Las regiones que se transcriben son exactamente iguales, se consigue ms producto. La transcripcin se puede observar al microscopio, es una imagen como un abeto.

Familias gnicas: genes parecidos por duplicacin en un principio, y evolucin distinta. Cumplen casi la misma funcin pero en momentos diferentes. Genes de globinas: Cada uno de los agrupamientos de las familias de genes de las globinas ( y ) contiene genes y pseudogenes (). Aparecen en cluster, agrupamiento de genes similares.

Agrupamientos de -globina en distintos vertebrados. No se conserva el agrupamiento, pero si las globinas.

89 - Seudogenes: copia de genes pero con mutaciones, no son funcionales; ni se transcriben ni se traducen. ADN moderada y altamente repetitivo 9 Repeticiones en tndem: ADN satlite. Se identificaron por separacin por densidades en cloruro de cesio, tiene en cuenta el porcentaje G/ C. Se aprecian bandas pequeas fuera de la banda central del ADN, se llamaron bandas satlite. stas correspondan a las repeticiones en tndem. Al tener distinto contenido en G/ C se separan de la banda principal.

Centrmeros y telmeros (satlites /minisatlites). Tienen una funcin estructural, aparecen cerca de los telmeros y centrmeros, estn implicados en la estabilidad del cromosoma, no se conoce su funcin. Repeticiones de unas 25-200 bp ocupando regiones de hasta 20 kb. Funcin estructural (replicacin y estabilidad de los cromosomas) Microsatlites: aparecen en cualquier punto del cromosoma, no se conoce su funcin. Repeticiones de unas 2-10 bp que ocupan regiones de 150-200 bp. Polimorfismo: uso en identificacin Se generan por errores en la replicacin o fenmenos de recombinacin Distintos tipos de satlites

Satlites de Drosophila: repeticiones cortas idnticas. Son cortos y ocupan mucho espacio.

Satlites de mamferos: unidades de repeticin mayores y ms complejas

ADN moderadamente repetitivo. Tipos de secuencias: Repeticiones dispersas (la mayora seudogenes) - Retroelementos: relacionados con retrotransposones y retrovirus Elementos LTR Retroposones: no tienen LTR LINE (elementos nucleares dispersos grandes) SINE (elementos nucleares dispersos pequeos) - Transposones de ADN: Se generan por un mecanismo distinto: transposicin. Dos mecanismos de transposicin: Intermediario de ARN: retrotransposicin Sin intermediario de ARN

90 Retroelementos Comparte similitud de estructura con los retrovirus. Contienen genes LTR-gag-pol-env-LTR. Aparecen en genomas eucariotas, pero no en los procariotas. Utilizan un mecanismo de retrotransposicin para integrarse en el ADN. Primero hacen una copia de ARN, y luego mediante transcripcin reversa hacen una cadena de ADNds y se intercala al azar en el ADN, originndose as una duplicacin del retroelemento eriginal. Transcripcin reversa de ARN.

Elementos LTR: Retrovirus endgenos: En vertebrados Retrotransposones: Ms frecuentes en plantas. Pueden aparecer en forma de clusters
Retrotransposones

Retroposones: No contienen secuencias LTR, pero si los genes que les permite saltar en el ADN. LINE (elementos nucleares dispersos grandes): Retroposones Conservan secuencias similares a las enzimas de los retrovirus que les permite transponerse. LINE LINE-1: 6 kb 516.000 copias en el genoma humano. SINE (elementos nucleares dispersos pequeos): Utilizan las enzimas de otras secuencias para transponerse. SINE Alu: 1.000.000 copias en el genoma humano Ocurre por insercin de un retrovirus original que se ha ido duplicando y perdiendo genes. Transposones de ADN No requieren intermediario de ARN. Son ms frecuentes en procariotas. Pueden transponerse de grafa: - Replicativa: se crea una copia que se integra en otro punto del genoma, quedando duplicado. - Conservativa: se escinde de la cadena y se integra en otro punto del ADN, no se replica. Tipos: (secuencias de insercin o IS): dos secuencias ITR, y en medio la trasposasa Compuestos: dos secuencias de insercin (IS) y en medio suelen tener un gen de resistencia a antibiticos.
Simples

91 Genomas de orgnulos Tenemos genomas propios en mitocondrias y cloroplastos. Suelen ser genomas circulares, aunque se han detectado algunos de tipo lineal. 9 Genomas mitocondriales: Variables en cuanto a tamao y nmero de genes que contienen. No se corresponde el tamao del genoma mitocondrial con la complejidad del organismo. Contienen genes de ARNr y ARNt y algunos de los genes de los componentes de la cadena respiratoria. Las mitocondrias humanas tienen ms genes, genoma es ms pequeo y ms compactado, poco interrumpido. 9 Genomas de cloroplastos: De tamao y contenido en genes mas similar de una especie a otra. Contienen genes de ARNr, ARNt y genes de protenas implicadas en fotosntesis. Es ms grande el genoma y tienen ms genes.

Mitocondria humana Mitocondria de S. cerevisiae

Cloroplasto del arroz

Zonas genmicas representativas

Humano

Saccharomyces cerevisiae

Drosophila melanogaster

Maiz

92 50 kb representativas del genoma humano

- Organizacin de los genomas procariticos Modelo clsico. Nucleoide: protenas + ADN Cromosoma nico superenrrollado organizado en el nucleoide, anclado a la membrana. Superenrrollamiento permite ms compactacin, ocupa menos espacio. El superenrolamiento se mantiene por la ADN girasa y la ADN polimersa I, tambin intervienen en el desenrollamiento necesario para la transcripcin. El empaquetamiento del ADN se mantiene mediante protenas tipo HU Variaciones al modelo: - Cromosomas lineales - Presencia de plsmidos lineales o circulares - En arqueas tenemos protenas tipo histonas que mantienen el empaquetamiento del ADN. Tienen una estructura como los procariotas, pero utiliza histonas como los eucariotas. Operones bacterianos: Los genes bacterianos se organizan en operones. Opern: conjunto de genes contiguos en el genoma y que se expresan como una nica unidad. ARN mensajero policistrnico En muchos casos los genes del opern estn funcionalmente relacionados. Tambin hay operones con genes no relacionados, se necesitan los producto gnicos para respuestas al medio.
Opern lac

Opern trp

Pero no siempre los genes presentes en un opern tienen relacin funcional

93 Estudio funcional de los genes 9 Anlisis gentico clsico - Observacin de un fenotipo - Bsqueda u obtencin de mutantes afectados en dicho fenotipo - Identificacin del gen causante del fenotipo Aplicado a multitud de organismos, incluido organismos modelo como E. coli o S. cerevisiae. 9 Proyectos Genoma: Comparacin nmero de genes en el genoma con los genes previamente identificados mediante anlisis gentico clsico. E. coli: 4288 genes secuenciados. 1853 identificados previamente (43%) S. cerevisiae: 30% Diseo de estrategias que permitan determinar la funcin de un gen partiendo de la secuencia 9 Anlisis informtico: bsqueda de homlogos Genes homlogos, comparten un ancestro comn, pueden ser identificados por su similitud de secuencia. Tipos de genes homlogos: - Ortlogos: homlogos presentes en diferentes organismos - Parlogos: homlogos presentes en un mismo organismo. Ej: familias gnicas Se introduce la secuencia en un programa informtico que alinea secuencias: identifica las similitudes entre las secuencias. Hace una bsqueda en las bases de datos

Si tienen elevada similitud de secuencia derivan de un ancestro comn. Los genes homlogos poseen /cumplen la misma funcin. Programas ms usados: BLAST y FASTA. Comparan nuestra secuencia con todas las existentes en las bases de datos. Nos indica cual es la ms parecida a la nuestra indicando el porcentaje de similitud. La existencia de deleciones y /o inserciones puede dar lugar a la posibilidad de ms de un alineamiento A nivel de ADN se encuentran secuencias homlogas muy parecidas. Las diferencias se hacen ms aparentes si alineamos secuencias de aminocidos

En los alineamientos de protenas, se analiza tambin la existencia de cambios conservativos de aas. El residuo de aminocido ha de ser el mismo. El cambio de un aminocido puede ser conservativo o drstico. El conservativo es a favor de la homologa.

94
Identificacin de dominios En algunos casos no encontramos homologa a lo largo de toda la secuencia. Pero podemos encontrar la presencia de dominios que aparecen en diferentes protenas. La identificacin de dominios en nuestra protena no nos dice la funcin, pero puede darnos pistas del tipo de proceso en que est implicada. Un dominio de una protena siempre tiene la misma funcin, si dos protenas comparten dominios homlogos, ambas participan en la misma funcin. Si una protena tiene varios dominios homlogos, participa en la misma funcin. Ejemplo: el gen tudor de Drosophila

10 repeticiones de un mismo dominio

Transporte de ARN

Metabolismo de ARN No sabemos la funcin exacta de tudor, pero si podemos sospechar que estar relacionada con el ARN. En humanos se busc homologa, y se encontr que tenan funciones relacionadas con el ARN. Identificacin de homlogos: aplicacin al genoma de S. cerevisiae Solo el 30% de los genes identificados en el genoma tenan funcin asignada por estudios previos. Bsqueda de homlogos para el 70% restante, para asignarles una funcin homloga: 7% de ORFs dudosas 23% de genes que no poseen homlogos en otros organismos 10% de genes con homlogos identificados, pero de funcin desconocida 30% de funcin asignada por estudios previos 30% de funcin /categora asignada por identificacin de homlogos 9 Anlisis experimental: Bsqueda de la funcin del gen Anlisis gentico clsico. Observacin de un fenotipo. Bsqueda u obtencin de mutantes afectados en dicho fenotipo. Identificacin del gen causante del fenotipo. Secuencia de un gen inactivacin/ mutagnesis, se puede saber en que procesos est implicado. Identificacin /estudio del fenotipo. Mtodos para la inactivacin de genes: Recombinacin homloga: - Transposones - ARN interferente Sobreexpresin del gen Mutagnesis puntual: - Al azar - Dirigida Inactivacin de genes mediante recombinacin homloga El mtodo ms simple de inactivar un gen es insertarle un fragmento de ADN. Construccin de un vector que contenga trozos (fragmento inicial y final) del gen a inactivar flanqueando la regin de ADN que queremos insertar, normalmente un marcador. Ejemplo: inactivacin de genes en levaduras mediante recombinacin homloga. Al introducirlo en la clula hay

genR

95 recombinacin homloga, el gen original es sustituido por el inserto, la secuencia de alrededor no se modifica. Lo que insertamos es una cassette con un gen de resistencia a Kam de E. coli. En la levadura confiere resistencia a geneticina. Obtencin de ratones knockout Ratn es organismo modelo para el estudio de enfermedades humanas. La inactivacin y estudio de genes implicados en enfermedades humanas se realiza en ratn. Un knockout es un ratn en el que se han inactivado las dos copias para un gen concreto. A nivel molecular, la estrategia es similar a la aplicada en levaduras. La diferencia es que hay que conseguir un organismo pluricelular completo a partir de unas pocas clulas manipuladas in vitro. Solamente se activa una copia del gen pero no las dos. Se manipulan clulas madre, a partir de un blastocito. Estas clulas tienen una copia del gen silvestre y otra modificada. Se implantan en una hembra pseudopreada, tratada hormonalmente para producirle un embarazo, esta hembra tendr ratones quimera. Los ratones quimera se cruzan con ratones normales y se obtienen heterocigotos, donde todas sus clulas tienen una copia del gen insertado. Estos heterocigotos se cruzan entre s, se obtienen homocigotos.

Clulas en cultivo que contienen el gen inactivado

Manipulamos clulas madre embrionarias (totipotentes)

Implantamos las clulas ES manipuladas en un embrin

Cruzamos este ratn quimera hasta obtener progenie homocigota para la copia inactivada del gen Ratn quimera, donde algunas de sus clulas contendrn una copia del gen inactivado

Knockout Quimera Anlisis del fenotipo

96 Problema: si la inactivacin de las dos copias del gen es letal, el homocigoto no nace. Se buscan formas de conseguir ratones donde la inactivacin se produzca especficamente en ciertos tejidos o tipos celulares. Inactivacin de genes mediante insercin de elementos mviles Retrotransposones Transposones de ADN

En los retrotransposones con promotor inducible, el gen se transcribe cuando es inducido por un producto. Podemos usar estos elementos para transponerlos e inactivar genes. Transposicin en respuesta a estmulos externos. Usamos promotor inducible. Problema: la transposicin es aleatoria. Se usa ms frecuentemente para la obtencin de colecciones de mutantes. Podemos hacer la transposicin in vitro sobre gen clonado o PCR y luego sustituirlo mediante recombinacin homloga; se incuba el vector con el transposn, el transposn con el gen es integrado en el organismo por recombinacin homloga. Inactivacin de genes mediante ARN interferente Hay una nucleasa que degrada el ARN bicatenario, producto de un gen que no se expresa normalmente, se producen varios fragmentos que son complementarios al mensajero, se produce un mensajero de dos cadenas, las nucleasas lo degradan y el gen no se expresa. No interrumpimos el gen. Destruimos selectivamente su ARNm. Introducimos un ARN bicatenario copia del gen a inactivar. Ej: aplicacin en Caenorhabditis elegans: se hace un inserto con dos promotores (T7), se transcriben tanto la cadena codificante como la complementaria formndose dos ARNm complementarios que se acoplan y son degradados por la nucleasa. Se descubri en plantas que desencadenan un mecanismo de ARN interferente para destruir las protenas vricas.

Transcripcin desde los promotores de T7

Introduccin en E. coli que expresa la polimerasa de T7 Este mecanismo funciona en mltiples organismos Mamferos aparece un problema con mecanismo de respuesta paralela a la presencia de ARN 2c: - Disminucin de sntesis de protenas - Muerte celular

97 Podemos usar liposomas para introducir el ARN 2c, slo se modifican las clulas en las que se ha introducido el ARN interferente. Una vez que se ha inactivado el gen hay que averiguar que cambio se ha producido. No permite trabajar con organismos completos, dado que no produce cambios estables que se hereden. Problemas del anlisis de la funcin mediante inactivacin de genes. Lo difcil no es inactivar el gen sino determinar el cambio de fenotipo que produce. Categoras donde podemos asignar un gen /protena:

Sntesis de ADN y ciclo celular Sntesis de protenas Sntesis de la pared celular y morfognesis Metabolismo de carbohidratos (energa) Desarrollo Meiosis Arquitectura celular

Sntesis y procesamiento de ARN Respuesta a estrs Transporte de metabolitos Metabolismo de lpidos Reparacin de ADN y recombinacin Estructura del cromosoma Secrecin y transporte de protenas

En animales tenemos que contar tambin con los fenotipos relacionados con el comportamiento o encontrarnos cambios sutiles que no se detectan en condiciones normales.

Anlisis de la funcin de un gen mediante sobreexpresin Inactivacin : Prdida de funcin Sobreexpresin: Ganancia de funcin La ganancia de funcin normalmente es un fenotipoo funcin contraria al de prdida de funcin. Se deben tener en cuenta todos los controles posibles para conocer qu produce. Vector de expresin Multicopia Promotor fuerte (muy activo) Podemos usar un promotor especfico de un tipo celular. Debemos distinguir si el efecto est determinado por la sobreexpresin de nuestra protena o por el efecto general de la sobreexpresin de una protena o la expresin en un tejido donde normalmente no est. Anlisis de la funcin de un gen mediante mutagnesis Se precisa informacin detallada sobre la actividad y posible regulacin del gen. - Inactivacin /sobreexpresin. - Funcin general del gen. 9 Mutagnesis Aplicacin de la mutagnesis in vitro o dirigida. - Estudio de la relacin estructura/ funcin.

98 Ingeniera de protenas. Con la ingeniera de protenas se obtienen mutantes que funcionan mejor que la silvestre. Aplicaciones industriales Diferentes estrategias que nos permiten eliminar, aadir o modificar uno o varios residuos del ADN: - Al azar: Colecciones de mutantes - Dirigida al sitio: Cambios en residuos seleccionados Mutagnesis al azar Obtenemos una coleccin de mutantes puntuales en diferentes posiciones en el gen a estudio. Mtodo qumico: Tenemos nuestro gen clonado en un vector en E.coli. Sometemos la clula que lo contiene a tratamiento con mutgeno Extraemos los plsmidos y los analizamos Mediante PCR: Usamos la tasa de error normal de la Taq polimerasa. Podemos aumentar la tasa de error aadiendo ciertas sales a la reaccin o alterando las proporciones de los nucletidos -

Mutagnesis dirigida al sitio Introducimos mutaciones en sitios /secuencias especficas de la protena que nos resulten de inters, aprovechando los sitios de restriccin. Se puede realizar mediante: - Cambio de casete: se realizan dos cortes, uno a cada lado de la mutacin que queremos introducir, se quita el fragmento silvestre y se coloca el fragmento con la mutacin. - Deleciones: se puede realizar de dos formas, cuando se conoce la secuencia del gen. Cortando en dos sitios, sacamos el fragmento de ADN relizamos la delecin y lo colocamos de nuevo Cortando en un sitio, se trata con una nucleasa para que destruya bases, se bloquea por la otra parte para que no se degrade, pretendemos degradar slo por un lado, y luego se unen

Cambio de casete

Deleciones

99

Uso de oligonucletidos Estrategia 1: Uso de la PCR. Diseamos dos oligonucletidos, solapantes y complementarios, que contengan la mutacin y los usamos como cebadores para la PCR. a) 1er paso: dos PCR con los oligos mutagnicos. Amplificamos el gen en dos trozos b) 2 paso: PCR usando los productos de las PCR anteriores como molde y los oligos de los extremos. Obtenemos el gen completo con la mutacin diseada.

Plsmido parental (metilado)

amplificacin

Digestin con DpnI

Estrategia 2: Mutagnesis Quick-change El gen clnado est en un vector de E.coli. Hay enzimas que slo cortan el ADN cuando se encuentra metilado. Nos basamos en el diferente estado de metilacin de la copia silvestre y mutante para seleccionar la mutante. El plsmido parental sale de E.coli metilado. Utilizamos dos cebadores con la mutacin, para amplificar las dos cadenas e introducir la mutacin. Los cebadores Hibridan con el parental, la polimerasa copia todo el plsmido. Digerimos con una enzima que slo corta el ADN metilado (DpnI) Transformamos en E. coli: slo se conserva la copia mutante no metilada. La ligasa es capaz de sellar las mellas. El ADN silvestre se ha degradado, se utiliza el mismo plsmido.

Transformacin en E. coli

100 Podemos introducir diferentes tipos de cambios en el ADN /protena, con pocos pares de bases en deleciones e inserciones, porque si no se forman bucles.

Sustitucin de bases

Insercin de bases

Delecin de bases

Introduccin de las variantes mutantes en el organismo original Una vez construido el mutante, tenemos que introducirlo en el organismo original para estudiar su efecto en el fenotipo. Se hace mediante recombinacin homloga. Estrategia de sustitucin en dos pasos:
1er paso 2 paso

Sustitucin marcador por mutante Sustitucin gen silvestre por marcador Seleccionamos clulas que adquieren el marcador Seleccionamos clulas que pierden el marcador

Determinacin del patrn de expresin de un gen Saber dnde y cuando se expresa un gen nos aporta datos sobre la funcin del gen. Uso de genes testigo (reporter): Sustituimos la copia del gen por un gen cuyo producto podamos detectar fcilmente, se clona detrs del promotor del gen. Este gen se expresa donde y cuando lo hara el gen original (est regulado por su promotor y secuencias reguladoras)

101 Ejemplos: lac Z se puede expresar en cualquier clula, se ha utilizado en embriones. GFP (protena verde fluorescente), tambin se usan otros colores de fluorocromos.

Tcnicas de hibridacin - Northern Blot Extraemos ARN total de diferentes tejidos e hibridamos con el ADNc del gen a estudiar. En cada carril de la electroforesis se coloca un ARN de un tipo celular diferente, se traspasa a membrana, se hbrida con una sonda marcada y se observa donde ha habido hibridacin. La sonda ha hibridado con el ARN que nosotros queremos. Vemos en que tejidos aparece el ARNm de nuestro gen.

Nos da informacin del tamao del mensajero. Nos da informacin de la presencia de isoformas, por procesamiento alternativo, aparece ms de una banda en carriles diferentes o en el mismo carril.

- Hibridacin in situ Utilizamos sondas, marcadas con enzimas, de ARN antisentido u oligonucletidos en preparaciones para microscopio. Si hay pocas copias no se detectan Podemos detectar cambios en la distribucin del ARNm en diferentes momentos del desarrollo Uso de la RT-PCR Se amplifica ADN pero usando ARN como molde. Si hay producto es porque hay ARNm en la muestra, si no hay producto de PCR no hay ARNm. Nos permite detectar el ARNm en muestras con poco material (ms sensible). Tambin nos permite cuantificar el nivel de expresin.

Determinacin del inicio de transcripcin de un gen Experimentos dirigidos para conocer el sitio exacto del inicio de la transcripcin y averiguar cuantos promotores hay. Primer extension (extensin del cebador) Aislamos fragmento de restriccin que contenga la zona del promotor del gen y ORF Marcamos el oligo en el extremo 5

102

Hibridamos con ARNm total y aadimos transcriptasa reversa y dNTPs Se amplifica

Electroforesis desnaturalizante y autorradiografa Distancia entre el extremo 3 del fragmento de ADN cebador y el inicio de la transcripcin

Si secuenciamos al mismo tiempo, podemos saber el punto exacto de inicio de transcripcin. Se compara la secuencia con el tamao del primer.

Nos sirve tambin para estudiar regulacin del promotor y /o la presencia de varios inicios de transcripcin/ promotores. Los distintos promotores hacen que un mismo gen se exprese en unos tejidos y no en otros. Tambin puede haber el mismo gen en distintos tejidos pero con promotores distintos. Esta tcnica de primer extensin sirve para detectar el inicio de la transcripcin, encontrar promotores y averiguar la regulacin de los promotores. Localizacin /deteccin de la protena dentro de la clula No todos los ARNm se expresan en todo momento La localizacin subcelular de la protena viene determinada por su secuencia de aminocidos
Western Blot Tcnica equivalente al Northern Utilizamos anticuerpos contra la protena en cuestin

Inmunocitoqumica Equivalente a la hibridacin in situ Podemos aumentar la resolucin marcando el anticuerpo con fluorocromos u oro coloidal. Las partes marcadas son los lugares donde se est usando la protena.

103 Identificacin de interacciones con otras protenas Sistema del doble hbrido en levaduras Basado en la naturaleza modular de los reguladores eucariticos. Detecta las protenas in vivo. Dos dominios: - AD: Dominio de activacin - BD: Dominio de unin a ADN, reconoce y se une al promotor. Se separan ambos dominios, se clona la protena X en un vector con dominio BD, se produce una protena de fusin. Se hace lo mismo con Y y el dominio AD. Ninguna de las dos clonaciones es funcional. X: reconoce al promotor pero no interacciona con la polimerasa Protenas de fusin a los dominios de Y: reconoce la polimerasa pero no se une al promotor. GAL4 Si las dos protenas no interaccionan no se produce la funcin, cuando ambas interaccionan se reconstruye la funcin de la protena. Clonamos los genes de inters en forma de fusiones traduccionales. Sistema del doble hbrido La reconstruccin del activador mediante la interaccin entre las dos protenas permite la activacin transcripcional de genes testigo

Detectamos interaccin mediante diferentes genes testigo

Colonias que crecen His Ade y son azules en X-gal

Estudios globales de la expresin gnica (transcriptmica) El uso de chips de ADN permite detectar y estudiar la expresin de todos los genes de una clula al mismo tiempo.

104 Se amplifican todos los genes por PCR, se obtiene ADNc, y se fijan a la superficie del cristal del chip. El chip tiene productos de todos los genes, el ADNc hbrida con el chip. Si hay hibridacin es que hay mensajero en la muestra, por tanto hay expresin. Podemos cuantificar el nivel de expresin en funcin de la seal de hibridacin que nos produce cada punto. Los diferentes colores indican intensidad de la seal, por tanto cantidad del ADNc del gen en cuestin presente en la muestra original. Podemos comparar los datos obtenidos para dos transcriptomas

Hibridamos un mismo chip con dos muestras de ADNc Hibridamos dos chips idnticos con dos marcadas con diferente fluorocromo. Los diferentes muestras de ADNc y comparamos resultados colores indican si estn en una muestra o en las dos Aplicaciones: - Expresin inducible de genes - Expresin especfica de tejido o tipo celular - Expresin a lo largo del desarrollo - Expresin a lo largo de los procesos de diferenciacin - Expresin de genes durante la formacin de tumores. Puede servir para efectuar pronsticos. Se puede discriminar el estadio del tumor y decidir mejor tratamiento. Estudio del proteoma Protemica: Une dos tcnicas: eletroforesis de protenas y espectrometria de masas
Electroforesis bidimensional

Los picos del espectro de masas nos sirven para identificar la protena en cuestin