DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN MEDIA SUPERIOR MANUAL DE PRCTICAS ANLISIS CLNICOS III Elaborado por: QFB.

EMILIA ELIZABETH BOLIO SALAZAR Aprobado por la Academia Estatal de Anlisis Clnicos III QFB. ISABEL RUIZ SANCHEZ Q FB. ALBERTO RODRIGUEZ MOYA QFB. MYRNA FATIMA RAMIREZ GARCIA QFB. EMILIA ELIZABET H BOLIO SALAZAR SUPERVISADO POR: LICDA. LAURA ARACELI JIMNEZ COBIN LICDA. SILVIA LUZ LPEZ ALCARAZ FEBRERO DEL 2009 1

INDICE Prctica 1 Prctica 2 Prctica 3 Prctica 4 Prctica 5 Prctica 6 Prctica 7 Prctica 8 Prct Prctica 10. Prctica 11. Conocimiento y esterilizacin de los medios de cultivo tivo..8 Cultivo farngeo. Pruebas bioqumicas (IMVIC)......39 Prctica 12. Prctica o, tcnica de concentracin de Faust....63 2

REGLAMENTO GENERAL DE LABORATORIO ANTES DE INICIAR SU PRCTICA: I. La asistencia a la prctica es obligatoria. II. La tolerancia para entrar al laboratorio ser la que rige el reglamento escolar. III. Acatar las instrucciones indicadas en el Reglamento General de Laboratorios de los Planteles del Nivel Medio Superior de la Universidad de Colima. IV. No dejar abrigos, carpetas u otros objetos sobre las mesas de trabajo. Cuando ms despejad o este el lugar de trabajo mejor se desarrollar el experimento y menos peligro ex istir para nosotros y para nuestras cosas. V. Es obligatorio llevar bata para evi tar manchas y quemaduras. Tambin es aconsejable traer un trapo de algodn para pode r agarrar los recipientes calientes o limpiarlos y secarlos. VI. Se deben seguir a todo momento las indicaciones del profesor. No se comenzara a trabajar hasta haber recibido las instrucciones necesarias. Consultar las dudas y dificultades. VII. Es imprescindible leer por lo menos una vez la prctica antes de comenzar. V III. Comprobar que esta todo el material necesario y en las condiciones adecuada s de conservacin y limpieza. Comunicar cualquier anomala al profesor. Cada grupo s er responsable de material asignado. IX. Por seguridad est terminantemente prohibi do fumar dentro del laboratorio, as como ingerir alimentos y bebidas. DURANTE EL TRABAJO: I. No debe probarse ninguna sustancia y debe evitarse el contacto con l a piel. En caso de que algn producto corrosivo caiga en la piel, se eliminar con a bundante agua fra. II. Extremar los cuidados al trabajar con sustancias inflamabl es, txicas o corrosivas. III. Comunicar cualquier accidente, quemadura o corte, a tu profesor de laboratorio. IV. La manipulacin de productos slidos se har con ayud a de una esptula o cucharilla y para transvasar lquidos se utilizara una varilla d e vidrio en los casos que sean necesarios. V. Nunca viertas el cido sulfrico conce ntrado al agua, debes hacerlo de manera inversa pero con cuidado. VI. Tener cuid ado al manejar cidos y bases principalmente concentrados. VII. Para oler algn prod ucto no debe acercarse la cara al recipiente, si no que se arrastrar el vaso haci a la nariz pasando la mano por encima de l. VIII. Con el fin de evitar contaminac iones, nunca se devolver al frasco los restos de productos no utilizados. IX. El material de vidrio es muy frgil, por lo que se evitara los golpes y cambios brusc os de temperatura. Se deber anotar en una hoja o cuaderno el material que se romp a y comunicarlo al profesor de laboratorio. 3

X. Cualquier experimento en el que se desprenda gas txico o inflamables en el que se utilicen reactivos potencialmente nocivos deber llevarse a cabo en las campan as extractoras del laboratorio. XI. Los restos slidos no metlicos deben tirarse en cestos de basura, nunca en las fregaderas. Los residuos metlicos se almacenarn en un recipiente especial. Los residuos acuosos se vertern en los fregaderos grande s, con abundante agua antes, durante y despus del vertido. En cuanto a los lquidos y disolventes orgnicos, se echaran en un recipiente de plstico, para su posterior eliminacin. AL TERMINAR: I. El lugar y el material de trabajo debe quedar limpio y ordenado, tambin se deben apagar y desenchufar los aparatos. II. Lavarse las m anos perfectamente para evitar intoxicaciones con algunos reactivos. III. Entreg ar para su revisin el reporte de la prctica elaborada. IV. Hasta que el profesor n o de su autorizacin no se considerara finalizada la prctica y por lo tanto, no pod rs salir de laboratorio. Recomendaciones generales. 4

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis clnicos III Prctica no.1 NOMBRE DE LA PRCTICA: Conocimiento y esterilizacin de los medios de cultivo. COMPETENCIA: Conoc e el uso y aplicacin de algunos medios de cultivo tiles para el cultivo de microor ganismos, as como la tcnica para su esterilizacin. MATERIAL: Diversos medios de cul tivo. Esptulas Vidrio de reloj Cinta testigo Agua destilada Mechero fisher Aro me tlico Guantes con asbesto Matraces erlenmeyer de 500 ml. Balanza granataria o analtica Algodn Papel aluminio o de estraza Olla de presin para esterilizar Tripie o soporte universal Tela de alambre con asbesto INTRODUCCIN Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimi ento y otros componentes que crean las condiciones nutritivas necesarias para el desarrollo de los microorganismos. La diversidad metablica de los microorganismo s es enorme; por ello, la variedad de medios de cultivo es tambin grande, no exis tiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. En la actualidad , la mayora de los medios de cultivo se encuentran comercializados, normalmente b ajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar. En general, la preparacin de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del mi smo y redisolverla en agua destilada siguiendo las instrucciones del fabricante para posteriormente esterilizarlos. Antes de su esterilizacin, los medios de cult ivo ya hidratados se distribuyen en los recipientes adecuados (tubos o matraces; segn se trate de caldos o agares). Existen diferentes medios de cultivo. De acue rdo a su consistencia tenemos: 1.- Medios lquidos: habitualmente nombrados caldos , y que estn contenidos en tubos de cultivo. 2.- Medios slidos o generalmente llam ados agares; precisamente por contener este componente que se utiliza como agent e gelificante (alrededor del 5%), para dar la solidez a ese tipo de medios de cu ltivo. Generalmente contenidos en cajas de petri. 3.- Medios semislidos: que cont ienen tambin agar (alrededor del 1%), y este les da una consistencia como natilla . Generalmente contenidos en tubos de cultivo. 5

De acuerdo a su utilidad tenemos: 1.- Medios generales: permiten el desarrollo d e una gran variedad de microorganismos. 2.- Medios de enriquecimiento: favorecen el crecimiento de un determinado tipo de microorganismo, sin llegar a inhibir t otalmente el crecimiento del resto. 3.- Medios selectivos: permiten el crecimien to de un tipo de microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los de ms. 4.- Medios diferenciales: son aquellos en los que se ponen de relieve propied ades que un determinado tipo de microorganismos posee. DESARROLLO 1.- Proporcion arle a los alumnos diversos medios de cultivo para que primero anoten los siguie ntes datos: Nombre del medio de cultivo, tipo de medio de cultivo de acuerdo a s u consistencia y utilidad, para qu tipo de microorganismos se utiliza o qu pruebas se pueden realizar en el etc. 2.- Posteriormente que procedan a preparar alguno s de los medios de cultivo que necesitaran para las siguientes prcticas de labora torio: a.- Pesar la cantidad necesaria del medio de cultivo y disolverlo en el v olumen adecuado de agua destilada, en un matraz erlenmeyer (en el frasco del med io de cultivo viene la relacin de polvo a pesar segn la cantidad de medio que se q uiera preparar). b.- Calentar cuidadosamente el medio de cultivo hasta su disolu cin completa, tener cuidado de agitar constantemente para evitar que se forme dem asiadas burbujas que provoquen derrames y puedan producir quemaduras. c.- Si el medio de cultivo es un caldo, se distribuye en tubos de cultivo con tapn de rosca (baquelita) o tubos de ensaye grandes a los que les fabriques tapones de algodn (deben quedar bien fijos) para estilizarlos luego. Una vez esterilizados y fros s e guardan a temperatura ambiente en un lugar fresco y seco o en el refrigerador; segn sea lo adecuado al medio preparado. d.- Si el medio de cultivo es un agar, se puede dejar en el matraz erlenmeyer, se le fabrica un tapn con algodn bien apre tado en la boca del matraz y se cubre con un pedazo de papel aluminio o de papel de estraza. (Tu maestro te indicar la manera de hacerlo) y est listo para ser est erilizado. Si requieren medios para tcnicas de tubo inclinado o para picadura, el agar se distribuye en tubos. Se esterilizan con calor hmedo (15lb de presin/121C/1 5-20 minutos). e.- Una vez esterilizados y no muy calientes, los medios de agar se vacan (en condiciones estriles) a cajas de petri estriles y una vez que solidifi quen y enfren se guardan en refrigeracin (en posicin invertida de preferencia) para su posterior uso. Si el agar es para tubo inclinado se coloca en esa posicin has ta que solidifique y una vez fros se almacenan en un lugar fresco y seco o en el refrigerador. 6

NOTAS: + No olvides rotular los medios de cultivo con su nombre o siglas para po der identificarlos y de preferencia tambin la fecha de elaboracin. + Colocar un ti ra pequea de cinta testigo a los tubos y matraces de los medios, antes de meter a esterilizar. CUESTIONARIO 1.- Por qu se deben almacenar los medios de cultivo en posicin invertida? ______________________________________________________________ ____ __________________________________________________________________ ________ __________________________________________________________ 2.- Para qu sirve la ci nta testigo? __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ _____________ _____________________________________________________ 3.- Por qu se tapan los tubo s y matraces que contienen los medios para esterilizar? ________________________ __________________________________________ _____________________________________ _____________________________ __________________________________________________ ________________ 4.- Cmo creas rea estril para vaciar los medios de cultivo ya ester ilizados a las cajas de petri? Y por qu es necesario? ____________________________ ______________________________________ _________________________________________ _________________________ ______________________________________________________ ____________ __________________________________________________________________ Conclusiones. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________ ______________________________________________________ _________________________ _________________________________________ ______________________________________ ____________________________ Nombre del alumno:___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de r ealizacin:__________________________________ _________________________________ Vo.Bo. del maestro 7

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no.2 NOMBRE DE LA PRCTICA: Tcnicas de cultivo. COMPETENCIA: Realiza algunas de las tcnicas de cultivo utilizadas en el laborator io de bacteriologa: estras, picadura y agitacin. MATERIAL: Cultivos bacterianos en agares y caldos (pueden ser cultivos mixtos o de alguna especie bacteriana en pa rticular, que hayan aislado previamente). Medios de cultivo estriles (en placa, t ubo inclinado, caldo y tubo vertical). Asa bacteriana y aguja de inoculacin. Mech ero Fisher. INTRODUCCIN La utilizacin de cultivos es fundamental para determinar l as caractersticas fsicas, qumicas y bioqumicas de los microorganismos; en este caso, principalmente de las bacterias. Para ellos contamos con un gran nmero y tipo de ellos, as como diversas tcnicas de cultivo que nos facilitan el trabajo. El mdico, con base en un examen cuidadoso del paciente, puede sospechar que hay una enfer medad infecciosa. Entonces se recolectan muestras de los tejidos o de los lquidos infectados para anlisis microbiolgico entre otros estudios. Hay un gran inters en la importancia de identificar con precisin el patgeno, para el tratamiento apropia do de la enfermedad infecciosa. Generalmente los laboratorios clnicos son capaces de aislar, identificar y determinar la sensibilidad a antibiticos de la mayor pa rte de las bacterias patgenas encontradas rutinariamente dentro de las 48 horas d e haber tomado la muestra. DESARROLLO 1.- Prende el mechero fisher para crear un rea estril y as evitar que te contamines o se contaminen los medios de cultivo. Co loca las placas en posicin invertida sobre la mesa de trabajo para que se facilit e manipularlas mejor. TECNICA POR ESTRAS EN PLACA 2.- Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cul tivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfre el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 3.- Ahora, toma una placa con agar estr il (donde vayas a sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la muestr a en un extremo de la placa y con el asa en posicin ligeramente horizontal realiz a las estras (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porcin pequea del agar; mediante un balanceo sucesivo y rpido de la mueca. 8

4.- Esteriliza el asa de nuevo y djala enfriar. Rozar una vez con el asa de siemb ra las estras sembradas la primera vez y realiza sobre una porcin virgen del agar una segunda tanda de estras que no toque la primera. 5.- Repetir exactamente la o peracin descrita en el punto anterior, pero rozando al empezar la segunda tanda d e estras, hasta completar 3 o 4. No hagas ms presin sobre el agar que la debida al propio peso del asa y su mango. Es importante emplear un asa de siembra en buen estado, pues una rota o deteriorada rasgar el agar. 6.- Lleva a la incubadora y d eja en posicin invertida 24 horas al trmino de las cuales se puede observar ya el desarrollo de colonias aisladas. SEMBRADO POR ESTRAS EN TUBO INCLINADO 1.- Esteri liza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de petri que con tiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfre el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 2.- Ahora toma el tubo de agar en pico de flauta (agar inclinado) y cerca del mechero retira el t apn de algodn ayudndote con los dedos meique y anular y flamea la boca del tubo. 3.Introduce el asa con la muestra (cuidando de no tocar las paredes del tubo) y e mpezando en el rea del fondo del agar realiza una estra hacia fuera hasta terminar en la punta del agar. Retira el asa. 4.- Flamea la boca del tubo de nuevo y col oca el tapn de algodn bien firme. Esteriliza el asa y djala enfriar. 5.- Lleva a in cubar y observa el desarrollo a las 24 o 48 horas despus de la siembra. SEMBRADO POR AGITACIN EN CALDO 1.- Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la pa rte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mec hero espera que se enfre el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 2.- Ahora toma el tubo con el caldo estril y cerca del mechero reti ra el tapn de algodn ayudndote con los dedos meique y anular, flamea la boca del tub o. 3.- Introduce el asa con la muestra (cuidando de no tocar las paredes del tub o) y por agitacin dentro del caldo, siembra el inculo. Retira el asa y flamea de n uevo la boca del tubo y coloca el tapn de algodn firmemente. Esteriliza el asa y dj ala enfriar. 4.- Lleva a incubar y observa el desarrollo a las 24 o 48 horas des pus de la siembra. SEMBRADO EN PICADURA EN TUBO VERTICAL 1.- Esteriliza el filame nto de la aguja de inoculacin y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfre la aguja de ino culacin y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 9

2.- Ahora toma el tubo con el medio de cultivo y cerca del mechero retira el tapn de algodn ayudndote con los dedos meique y anular, flamea la boca del tubo. 3.- In troduce la aguja con el inculo y sin tocar las paredes del tubo, inocula en el ce ntro del medio de cultivo sin llegar hasta el fondo del tubo. Retira la aguja de inoculacin en la misma direccin de la siembra. Retira el asa y flamea de nuevo la boca del tubo y coloca el tapn de algodn firmemente. Esteriliza el asa y djala enf riar. 4.- Lleva a incubar y observa las caractersticas del desarrollo a las 24 o 48 horas despus de la siembra. CUESTIONARIO 1.- Menciona en qu casos se utilizan cada una de las tcnicas que desa rrollaste e indica las ventajas y desventajas de cada uno de los cultivos. _____ _____________________________________________________________ __________________ ________________________________________________ _______________________________ ___________________________________ ____________________________________________ ______________________ _________________________________________________________ _________ __________________________________________________________________ ___ _______________________________________________________________ ________________ __________________________________________________ 2.- Cules son las medidas de seguridad que debes manejar durante el proceso de ste tipo de tcnicas? ________________________________________________________________ __ __________________________________________________________________ __________ ________________________________________________________ _______________________ ___________________________________________ ____________________________________ ______________________________ _________________________________________________ _________________ Conclusiones: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________ ______________________________________________________ _________________________ _________________________________________ ______________________________________ ____________________________ 10

Nombre del alumno:___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de r ealizacin:__________________________________ _____________________________ Vo.Bo. del maestro 11

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no.3 NOMBRE DE LA PRCTICA: Cultivo farngeo COMPETENCIA: Identifica algunas especies que conforman la flora patgena que se pueden desarrollar en la regin farngea. MATERIAL: Placa de ag ar sangre Placas de agar salado manitol Asa bacteriolgica Abate lenguas estriles I NTRODUCCIN Los cultivos de garganta se obtienen principalmente para detectar estr eptococos beta-hemolticos del grupo A. Clnicamente puede sospecharse una faringiti s estreptoccica si se observa una mucosa difusamente enrojecida en un paciente qu e experimenta dolor y dificultad para deglutir. La flora comensal est compuesta p or una variedad de bacterias facultativas y ciertas levaduras. Normalmente, en l a orofaringe se hallan combinaciones y concentraciones variables de estreptococo s alfa-hemolticos, especies de Neisserias (no N. gonorrhoeae), estafilococos coag ulasa negativos, ciertas enterobacterias etc. DESARROLLO 1.- Prende el mechero f isher para crear un rea estril y as evitar que se contaminen los medios de cultivo. Coloca las placas de agares estriles en posicin invertida sobre la mesa de trabaj o para que se te facilite manipularlas. 2.- Es muy importante el mtodo apropiado para obtener garganta: una muestra de la Placa de agar eosina azul de metileno H isopos estriles Mechero fisher 3.- Con una luz brillante desde por encima del hombro de la persona que obtiene la muestra debe enfocarse en la cavidad oral abierta para guiar el hisopo hacia la parte posterior de la faringe. Se instruye al paciente para que respire profu ndamente y se deprime la lengua con suavidad con un abate lenguas. 4.- Luego se extiende el hisopo entre los pilares amigdalinos y detrs de la vula. Debe tenerse la precaucin de no tocar las paredes laterales de la cavidad oral. 12

5.- Hacer que el paciente diga ah sirve para levantar la vula y ayudar a reducir el reflejo de arcadas (asco). El hisopo debe moverse hacia atrs y hacia delante a t ravs de la parte posterior de la faringe para obtener una muestra adecuada. 6.- T omar un segundo hisopo siguiendo las mismas instrucciones y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo. 7.- Inocula en un extremo de cad a uno de los medios de cultivo (AS, EMB y ASM) con los hisopos impregnados con l a muestra farngea (recuerda hacer todo el proceso cercas de la llama del mechero) y coloca los hisopos en un medio de transporte como caldo estreptocel o Stuart, y resrvalo. 8.- Esteriliza el filamento del asa de siembra en la llama del meche ro y djala enfriar. Con el asa en posicin ligeramente horizontal realiza las estras (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porcin pequ ea del agar; mediante un balanceo sucesivo y rpido de la mueca. 9.- Esteriliza el a sa de nuevo y djala enfriar. Rozar una vez con el asa de siembra las estras sembra das la primera vez y realiza sobre una porcin virgen del agar una segunda tanda d e estras que no toque la primera. 10.- Repetir exactamente la operacin descrita en el punto anterior, pero rozando al empezar la segunda tanda de estras, hasta com pletar 3 o 4. No hagas ms presin sobre el agar que la debida al propio peso del as a y su mango. Es importante emplear un asa de siembra en buen estado, pues una r ota o deteriorada rasgar el agar. 11.- Lleva a la incubadora y deja en posicin inv ertida 24 horas al trmino de las cuales se puede observar ya el desarrollo de col onias aisladas. Con ayuda de tu profesor trata de identificar las colonias bacte rianas desarrolladas en cada uno de los medios de cultivo. CUESTIONARIO 1.- Por q u es tan importante la deteccin de estreptococos beta-hemolticos en cultivos farngeo s? __________________________________________________________________ __________ ________________________________________________________ _______________________ ___________________________________________ ____________________________________ ______________________________ 2.- Escribe los nombres de las bacterias de la fl ora normal de la garganta, as como de la flora patgena, indicando en este ltimo cas o el tipo de enfermedad o complicacin para el paciente infectado. _______________ ___________________________________________________ ____________________________ ______________________________________ _________________________________________ _________________________ 13

__________________________________________________________________ _____________ _____________________________________________________ Conclusiones. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________ ______________________________________________________ _________________________ _________________________________________ ______________________________________ ____________________________ Nombre del alumno:___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de r ealizacin:__________________________________ _________________________________ Vo.Bo. del maestro 14

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no.4 NOMBRE DE LA PRCTICA: Tincin de Gram COMPETENCIA: Realiza la tcnica de tincin de Gram para clasif icar las bacterias. MATERIAL: Cultivo bacteriano de 24 horas Asa bacteriana Colo rante cristal violeta o violeta de genciana Solucin de yodo-lugol o yodo gram Alc ohol-acetona (1:1) Colorante de safranina INTRODUCCIN Esta coloracin, ideada por H ans Chistian Gram a fines del siglo XIX, permite dividir a las especies bacteria nas en dos grandes grupos: aquellas que toman el colorante bsico, cristal violeta (gram positivas) y aquellas que son decoloradas por el alcohol-acetona (gramneg ativas). El procedimiento clsico de la coloracin de Gram incluye la fijacin del mat erial, ya sea por calor en la llama del mechero o por accin del alcohol. Luego de la fijacin, el primer paso de la coloracin de Gram es la aplicacin del cristal vio leta; a continuacin se agrega como mordiente la solucin de yodo de Gram que fija q umicamente el colorante alcalino a la pared bacteriana. La etapa de decoloracin pe rmite distinguir los grmenes Gram positivos de los Gram negativos. Es probable qu e por el mayor contenido en lpidos de las paredes celulares de las bacterias gram negativas, el alcohol o la acetona aumenten la permeabilidad de la pared y el c olorante sea eliminado. Adems, la presencia de un mayor nmero de residuos de cido t eicoco con uniones cruzadas en las bacterias Gram positivas es posible que aument e la fijacin del cristal violeta. Los microorganismos gram positivos que han perd ido la integridad de su pared celular debido a un tratamiento con antibiticos, en vejecimiento o accin de enzimas auto lticas tambin permiten el escape del cristal v ioleta en la etapa de la decoloracin. A esta altura de la coloracin, los organismo s gram positivos retienen el cristal violeta mientras que las gram negativas per manecen sin teir. El agregado de un colorante de contraste como safranina teir a es tos microorganismos y clulas (leucocitos y eritrocitos) de un color rosado o rojo . Las levaduras tambin son gram positivas, aunque el micelio de los hongos toma l a coloracin de Gram en forma variable. DESARROLLO 1.- Sobre un portaobjetos limpi o y seco, se coloca una gota de solucin salina fisiolgica o una gota de agua. 15

2.- Se esteriliza el filamento del asa de siembra a la llama del mechero y se de ja enfriar. Se toma una pequea cantidad de un cultivo bacteriano y se resuspende en la gota de agua o solucin salina del portaobjetos. Tambin puede ser utilizada u na aguja de inoculacin estril para tomar la muestra bacteriana. 3.- Se deja secar al aire y luego se fija a la llama del mechero, pasndolo de 4 a 5 veces sobre est a; teniendo cuidado de no calentar demasiado pues el portaobjetos puede romperse (no es vidrio pyrex). Tener cuidado al fijar el frotis para evitar quemaduras. 4.- Tambin se pueden realizar frotis del material directo de las muestras clnicas (exudados farngeos, heridas). Se hace rodar el hisopo con que se tom la muestra so bre el portaobjetos limpio y se fija con calor para proceder a la tincin. a.- Cub rir el frotis bacteriano con cristal violeta durante 1 minuto. Enjuagar con agua . b.- Aplicar el yodo gram y dejarlo reaccionar durante 1 minuto. Escurrir. c.Ahora, decolorar con la solucin de alcohol-acetona, agregando gota a gota en el p ortaobjetos inclinado sobre el fregador (o tarja), hasta que deje de salir color ante. Enjuague. d.- Finalmente cubrir el frotis con la solucin de safranina y dej arla actuar durante 1 minuto. Lavar el exceso de colorante y dejar secar al aire . e.- Coloca aceite de inmersin al frotis seco y teido para observarlo al microsco pio, con el objetivo de 100X. f.- Realiza esquemas de lo observado e indica la f orma, agrupacin y caracterstica tintorial de los microorganismos observados. CUESTIONARIO 1.- Por qu es necesario fijar el frotis antes de teirlo? _____________ _____________________________________________________ __________________________ ________________________________________ _______________________________________ ___________________________ ____________________________________________________ ______________ 2.- Puede una bacteria Gram positiva teirse de Gram negativa? Por qu? __________________________________________________________________ ____________ ______________________________________________________ _________________________ _________________________________________ ______________________________________ ____________________________ 3.- Qu otras tcnicas de tincin son utilizadas comnmente en el laboratorio de bacteriologa? En qu casos se utilizan? _______________________ ___________________________________________ ____________________________________ ______________________________ _________________________________________________ _________________ ______________________________________________________________ ____ __________________________________________________________________ 16

Conclusiones. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________ ______________________________________________________ _________________________ _________________________________________ ______________________________________ ____________________________ ___________________________________________________ _______________ Nombre del alumno:___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de r ealizacin:__________________________________ _________________________________ Vo.Bo. del maestro 17

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no. 5 NOMBRE DE LA PRCTICA: Identificacin de Staphylococcus aureus COMPETENCIA: Aplica las pruebas b ioqumicas de la Coagulasa y Catalasa como medios para la identificacin de S. aureu s. MATERIAL: Portaobjetos Aplicadores de madera Tubos de ensaye de 13x100 Pipeta s graduadas Pipetas pasteur Bao mara a 37C Mechero Fisher o Bunsen Cultivo de S. au reus en placa o en tubo reciente. INTRODUCCIN Catalasa: la catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno (H2O2) en oxgeno y agua. Qumicamente la catal asa es una hemoprotena de estructura similar a la de la hemoglobina, excepto que los 4 tomos de hierro de la molcula estn en estado oxidado (Fe+++) en lugar de redu cido (Fe++). Excluyendo los estreptococos, la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad de catalasa. La mayora de las bacterias anaerobias descomponen el H2O2 con peroxidasas semejantes a la catalasa, salvo q ue cada molcula contiene un solo in frrico. El perxido de hidrgeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo o aerbico de los hidratos de c arbono. Si se deja acumular, el perxido de hidrgeno es letal para las clulas bacter ianas. La catalasa transforma al perxido de hidrgeno en agua y oxgeno, como lo demu estra la siguiente reaccin: H2O2 H2O + O2 (burbujas de gas) SUSTANCIAS: perxido de hidrgeno al 30% Agua destilada Solucin salina estril plasma de conejo o humano Asa bacteriolgica La prueba de la catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es muy comnm ente utilizada para diferenciar estreptococos (negativos) de estafilococos (posi tivos). Coagulasa: la coagulasa es una enzima proteca de composicin qumica desconoc ida, con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibringeno en fibrina, provocando la formacin de un coagulo visible en un sistema analtico a decuado. Se cree que la coagulasa funciona in vivo produciendo una barrera en el sitio de la infeccin estafiloccica. Esto puede servir para localizar los organism os in vivo, en abscesos. En el laboratorio, la prueba de 18

la coagulasa se utiliza ms comnmente para diferenciar al S. aureus (coagulasa posi tivo) de otros estafilococos y micrococos. La coagulasa se halla en 2 formas, lib re y fija, cada una de las cuales posee diferentes propiedades que requieren el uso de tcnicas separadas: 1.- Coagulasa fija (prueba en portaobjetos): la coagulasa fija, conocida como factor de aglutinacin, est unida a la pared celular bacteriana y no est presenten los filtrados de cultivos. Los hilos de fibrina formados entre las clulas bacterianas suspendidas en plasma (fibringeno) provocan su aglutinacin, indicada por la presencia de agregados visibles en el portaobjetos. La actividad de la coagulasa fija no es inhibida por los anticuerpos formados contra la coag ulasa libre. 2.- Coagulasa libre (prueba en tubos): la coagulasa libre es una su stancia semejante a la trombina, que se haya presente en los filtrados de cultiv os. Cuando una suspensin de bacterias productoras de coagulasa se mezclan en part es iguales con una pequea cantidad de plasma en un tubo de ensayo, se forma un co agulo visible como consecuencia de la utilizacin de los factores de la coagulacin del plasma de manera similar a cuando se aade trombina. DESARROLLO a).- CATALASA: Prueba en portaobjetos: 1.- Con una aguja de puncin o un aplicador de madera con la punta aguzada transferir clulas del centro de una colonia bien aislada a la s uperficie de un portaobjetos. 2.- Aadir 1 o 2 gotas de perxido de hidrgeno al 3% (d iluir la solucin al 30% con agua destilada). Se recomienda no aadir el organismo a l reactivo (invirtiendo el orden), especialmente si se utilizan agujas o asas qu e contienen hiero, ya que se pueden producir resultados falsos positivos. Prueba en tubos o placas de agar: 1.- Diluir 1:10 el perxido de hidrgeno al 30% en agua destilada para obtener una solucin al 3% 2.- Aadir unas gotas (aproximadamen te 1 ml) del perxido de hidrgeno al 3% directamente sobre la superficie del desarr ollo de una placa o pico de agar. INTERPRETACIN: La rpida aparicin y produccin soste nida de burbujas de gas o efervescencia indica una reaccin positiva. Dado que alg unas bacterias pueden poseer enzimas distintas de la catalasa, capaces de descom poner el perxido de hidrgeno, unas pocas burbujas diminutas formadas a los 20 a 30 segundos no se consideran una prueba positiva. 19

Nota: es recomendable que el perxido de hidrgeno se pruebe con organismos de contr ol positivo y negativo, para garantizar su eficacia. b).-COAGULASA: Prueba en po rtaobjetos (coagulasa fija): 1.- Coloca una gota de agua destilada o solucin sali na fisiolgica estril sobre un portaobjetos. 2.- Emulsionar suavemente una suspensin del organismo en estudio en la gota de agua utilizando un asa o una varilla. 3. - Coloca una gota del plasma junto a la gota de la suspensin bacteriana. Mezclarl as bien. 4.- Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado, observando la forma cin inmediata de un precipitado granular o de grumos blancos. INTERPRETACIN: Una r eaccin positiva se detecta usualmente en 15 a 20 segundos por la aparicin de un pr ecipitado granular o la formacin de grumos blancos. La prueba se considera negati va si no se observa aglutinacin en 2 o 3 minutos. Esta prueba solo se considera p resuntiva y todos los cultivos que den resultados negativos o positivos tardos de ben verificarse mediante la prueba en tubos debido a que algunas cepas de S. aur eus producen coagulasa libre que no reacciona en la prueba en portaobjetos. Prue ba en tubos (coagulasa libre): 1.- Colocar aspticamente 0.5 ml de plasma de conej o reconstituido en el fondo de un tubo estril. 2.- Aadir 0.5 ml de un cultivo puro de 18 a 24 horas en caldo del organismo por investigar (caldo BHI). 3.- Mezclar por rotacin suave del tubo, evitando remover o agitar el contenido. 4.- Colocar el tubo en un bao de agua a 37C. Observar la formacin de un coagulo visible. INTERP RETACIN: La reaccin se considera positiva ante cualquier grado de coagulacin visibl e dentro del tubo. La reaccin se observa mejor inclinando el tubo. Si es positiva , el coagulo o gel permanece en el fondo del tubo. Las bacterias fuertemente coa gulasa positivas pueden producir un coagulo en 1 a 4 horas; por lo tanto, se rec omienda observar el tubo a intervalos de 30 minutos durante las primeras 4 horas de la prueba. Algunas cepas de S. aureus pueden formar fuertes fibrinolisinas q ue disuelven el coagulo recin formado. Por consiguiente, pruebas positivas pueden pasar inadvertidas si no se observa el tubo a intervalos frecuentes. Otras cepa s de S. aureus pueden producir slo suficiente coagulasa como para dar una reaccin positiva tarda luego de 18 a 24 horas de incubacin; por lo tanto, todas las prueba s negativas a las 4 horas, deben observarse despus de las 18 a 24 horas de incuba cin. 20

Nota: la coagubilidad del plasma utilizado puede comprobarse aadiendo 1 gota de c loruro de calcio al 5% a 0.5 ml de plasma de conejo reconstituido. Se debe forma r un coagulo en 10 o 15 seg. Cada ampolleta de plasma reconstituida debe ensayar se con organismos de control positivo (S. aureus coagulasa positiva) y una cepa coagulasa negativo (S. epidermidis). CUESTIONARIO 1.- Por qu en la prueba de la ca talasa es recomendable manipular la muestra con un aplicador de madera y no con un asa metlica? _________________________________________________________________ _ __________________________________________________________________ ___________ _______________________________________________________ ________________________ __________________________________________ _____________________________________ _____________________________ 2.- Por qu en la prueba de la coagulasa no se recomi enda utilizar plasma citratado? ________________________________________________ __________________ _____________________________________________________________ _____ __________________________________________________________________ _______ ___________________________________________________________ ____________________ ______________________________________________ 3.- Indica 3 pruebas ms que nos permitan la identificacin plena de Staphylococcus aureus __________________________________________________________________ ______ ____________________________________________________________ ___________________ _______________________________________________ ________________________________ __________________________________ _____________________________________________ _____________________ Conclusiones:_____________________________________________ _________ __________________________________________________________________ ___ _______________________________________________________________ ________________ __________________________________________________ _____________________________ _____________________________________ Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo______ Fecha de re alizacin:_______________________________ ___________________________ Vo.Bo. del maestro 21

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no. 6 NOMBRE DE LA PRCTICA: Antiestreptolisinas COMPETENCIA: Determina los ttulos de Antiestreptolis inas en el suero de un paciente, para detectar infecciones por estreptococos -hem olticos del grupo A. MATERIAL: Equipo de estreptolisina O de Beli Termmetro Centrfuga Pipetas graduadas de 2, 5 y 10 ml. Tubos de ensaye de 12x75 Suspensin de glbulos rojos lavados al 5% Sangre sin anticoagulante del paciente Bao mara a 37C Sol. Amortiguadora de pH (6.5-6.7) Pipetas pasteur Solucin salina fis iolgica Gradilla INTRODUCCIN Es importante que el estreptococo - hemoltico del grupo A sea identific ado correctamente en el laboratorio porque es necesario implementar un rpido trat amiento del paciente infectado, no slo para controlar la infeccin primaria (faring itis aguda, Hypoderma, escarlatina, erisipela o celulitis), sino tambin para prev enir las complicaciones potenciales serias, como fiebre reumtica, endocarditis y valvulitas reumtica y glomerulonefritis aguda o crnica. Entre las pruebas para su deteccin tenemos el cultivo en agar sangre con la manifestacin de la -hemlisis, sens ibilidad a la bacitracina, determinacin serolgica de Antiestreptolisinas, entre ot ras muchas. El estreptococo pyogenes (grupo A) produce diversas sustancias y tox inas extracelulares. Las dos hemolisinas, estreptolisina O y estreptolisina S, lb il y estable frente al oxgeno respectivamente, pueden lisar eritrocitos humanos y de otras especies as como las membranas celulares de los PMNS, plaquetas y otras clulas. La estreptolisina O es antignica; es decir, estimula al paciente infectad o la produccin de anticuerpos, las Antiestreptolisinas, que determinadas en el la boratorio pueden ser de utilidad para diagnosticar infecciones por este microorg anismo. DESARROLLO 1.- Extraer una muestra de sangre del paciente, recolectndola en un tubo seco (sin anticoagulante) y una vez bien coagulada la sangre, centrif ugar para separar el suero. Es importante que evites que se hemolice la muestra. 2.- Obtener una muestra de sangre con anticoagulante (EDTA) y preparar la suspe nsin de glbulos rojos lavados al 5% en sol. Amortiguadora. La sangre humana y la d el conejo son igualmente satisfactorias. Una cantidad apropiada de sangre (desfi brinada o con anticoagulante) se centrifuga a 2000 rpm durante 5 min., el sobren adante es descartado y el paquete de glbulos se lava agregando solucin salina al 0 .85 %, centrifugndose nuevamente. 22

Este procedimiento es repetido 3 veces, debiendo ser claro el sobrenadante en el ltimo lavado. Lo contrario indicara que los glbulos rojos estn frgiles y no deben se r usados. Los glbulos rojos se suspenden en solucin amortiguadora a una concentrac in final de 5 %. 3.- La estreptolisina O BELI se presenta en forma oxidada que es e stable, pero no es activa MODO DE ACTIVARLA: a) Se reconstituye con agua destila da con el volumen indicado en la etiqueta del frasco. b) Para cada 5 ml. De estr eptolisina se adiciona el hidrosulfito de sodio contenido en uno de los tubos ca pilares que se adjuntan. c) Se agita por inversin hasta que se disuelva, encontrnd ose ahora en su forma activa. Una vez aadida el hidrosulfito de sodio la estrepto lisina debe ser empleada se inmediato, ya que al reoxidarse esta se inactiva. La estreptolisina reconstituida mientras no sea reducida puede conservarse en cong elacin sin que su potencia se altere por periodos hasta de un mes. 4.- Las diluci ones del suero problema y la suspensin de glbulos rojos deben ser preparadas con s olucin amortiguadora de pH 6.5-6.7. La solucin amortiguadora puede prepararse diso lviendo 7.4 grs. de NaCl, 3.7 grs. De KH2PO4 y 1.81 grs. De Na2HPO4 en 1000 ml d e agua destilada ajustndose el pH a 6.5-6.7 con solucin de NaOH 0.1 N. Diluciones del suero: las soluciones siguientes se hacen usando solucin amortigua dora como diluyente: 1:10 0.5ml de la solucin 1:10 + 4.5 ml de solucin amortiguado ra 1:100 1.0 ml de suero + 9 ml de solucin amortiguadora 1:500 2.0 ml de dilucin 1 :100 + 8.0 ml de solucin amortiguadora 1. La prueba se monta de acuerdo con el si guiente protocolo: DILUCIONES DEL SUERO PROBLEMA Tubos Volumen de la disolucin en ml Volumen de la solucin salina amortiguada en ml 1:10 1 2 0.8 0.2 0.2 0.8 3 1. 0.0 4 0.8 0.2 1:100 5 0.6 0.4 6 0.4 0.6 7 0.3 0.7 8 1.0 0.0 9 0.8 0.2 10 0.6 0.4 1:500 11 12 0.4 0.2 0.6 0.8 13 0 1.5 14 0 1.0 AGITAR LOS TUBOS 23

Volumen de estreptolisina en ml Volumen de la suspensin de glbulos rojos en ml. 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.0 0.5 0.5 AGITAR E INCUBAR A 37 C DURANTE 15 MINUTOS 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 AGITAR E INCUBAR A37 C DURANTE 45 MIN TENIENDO CUIDADO DE AGITAR LOS TUBOS DURANT E ESTE TIEMPO CADA 15 MINUTOS. CENTRIFUGAR LOS TUBOS DURANTE 1 MINUTO A 1500 RPM Titulo en unidades Todd 12 50 100 125 166 250 333 500 625 833 1250 2500 INTERPRETACION: el ttulo de Antiestreptolisinas O, se expresa en unidades Todd. Est as unidades son la recproca de la dilucin ms alta del suero que neutraliza completa mente la estreptolisina O. As, un suero que no representa hemlisis de los tubos 1 a 4, huellas de hemlisis en el tubo 5 hemlisis completa en todos los dems, es reporta do como 125 unidades Todd. Patrn de Antiestreptolisinas.- el patrn de Antiestrepto lisinas es suero o gama globulina estandarizada para ser usada como control. Des pus de haber sido diluida 1:5 con solucin amortiguadora, debe ser usado como la di

lucin 1: 100 del suero, en el rango de 100 a 333 en tubos 3 a 7 como se muestra e n el cuadro. Debe ser un punto final equivalente a 166 unidades Todd por ml., o sea, ausencia de hemlisis en los tubos 3, 4 y 5 y hemlisis en los tubos 6 y 7. Des pus de reconstituido el producto debe ser usado el mismo da. CUESTIONARIO 1.- Elab ora un diagrama de flujo donde indiques el proceso completo (tcnicas y pruebas) n ecesario para la identificacin de una infeccin de estreptococo hemolticos desde que el paciente se presenta al laboratorio. ________________________________________ __________________________ _____________________________________________________ _____________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________ ______________________________________________________ _________________________ _________________________________________ ______________________________________ ____________________________ 2.- Explica por qu cuando se requiere aislar estrepto coco pyogenes -hemoltico en agar sangre, es necesario ranurar el medio? __________ ________________________________________________________ _______________________ ___________________________________________ ____________________________________ ______________________________ _________________________________________________ _________________ ______________________________________________________________ ____ 24

3.- Explica en qu consiste la enfermedad de la fiebre reumtica y cules pueden ser su s complicaciones si no se controla? ____________________________________________ ______________________ _________________________________________________________ _________ __________________________________________________________________ ___ _______________________________________________________________ ________________ __________________________________________________ Conclusiones:______________________________________________________ ____________ ______________________________________________________ _________________________ _________________________________________ ______________________________________ ____________________________ ___________________________________________________ _______________ Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo______ Fecha de re alizacin:_______________________________ ____________________________ Vo.Bo. del maestro 25

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos Prctica no. 7 NOMBRE DE LA PRCT ICA: Determinacin de Factor Reumatoide COMPETENCIA: Realiza la determinacin del Fa ctor Reumatoide, como una prueba ms para la deteccin de infecciones reumticas, como la artritis reumatoide. MATERIAL: Un equipo de Reumaclin de sanofi o similar qu e contiene los siguientes reactivos: REACTIVOS: 1 Reactivo de ltex sensibilizado (almacenar a Temp. De +2 a +8 C) 2 Frascos con 60 ml de solucin amortiguadora 1 Fr asco con suero control positivo 1 Frasco con reactivo control negativo Laminilla s con 3 reas marcadas, con fondo negro para realizar la prueba. Aplicadores de ma dera Jeringa, torundas con alcohol y torniquete Tubo rojo o con gel para la toma de sangre. Rotor Reloj o cronmetro INTRODUCCIN FACTOR REUMATOIDE Definicin: Inmuno globulina presente en el suero del 50-95 por ciento de los adultos que tienen ar tritis reumatoide y que sirve para diagnosticar e investigar la enfermedad. El f actor reumatoide (FR) es una prueba que mide la presencia y nivel de la IgM espe cfica contra las inmunoglobulinas IgG anormales, producidas por los linfocitos de la membrana sinovial, de las articulaciones de personas afectadas por la artrit is reumatoide. La artritis reumatoide es una enfermedad crnica, que produce la in flamacin de las articulaciones principalmente de manos y pies. Cuando se originan estas inmunoglobulinas IgG y se fija la IgM, se forman inmunocomplejos IgG-IgM que activan el complemento y otros factores inflamatorios que producen secundari amente la destruccin de las articulaciones afectadas. Por ello se le llama una en fermedad autoinmune, ya que es el sistema inmunitario del individuo el que destr uye tejidos del propio cuerpo. Varias pruebas para ponerlos en evidencia se basa n en provocar la reaccin antigeno-anticuerpo, de modo que el suero del enfermo ag lutine partculas 26

hemates, ltex, bentonita, etc. A las que se ha fijado una capa de globulina gamma No es un anlisis especfico de esta enfermedad, aparece positivo en el 80% de los p acientes con artritis reumatoide, pero puede aparecer negativo. Inclusive puede aparecer positivo en otras enfermedades no relacionadas (Lupus Eritematoso Sistmi co, Leucemia, Sndrome Nefrtico etc.) En personas de la tercera edad pueden aparece r niveles elevados sin repercusin clnica. DESARROLLO METODO CUALITATIVO EN PLACA 1 . Dejar que los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente. 2. Prepar ar una dilucin 1:20 del suero problema; diluyendo 0.1 ml del suero con 1.9 ml de solucin amortiguadora. 3. Poner 1 gota (aproximada mente 0.05 ml) del suero dilui do en las reas marcadas en la laminilla 4. Colocar una gota del suero control (+) y (-) en las reas marcadas del la laminilla. 5. Mezclar el reactivo de ltex Reuma clin hasta obtener una suspensin homognea y aadir 1 gota de reactivo de ltex a cada uno de los sueros controles. 6. Mezclar con aplicadores diferentes por cada rea 7 . Mover en un ngulo de 45 la laminilla por 2 minutos 8. Observar inmediatamente la aglutinacin utilizando una fuente de luz directa, comparar las reacciones del su ero y de los controles. INTERPRETACION La aglutinacin de las partculas de ltex indica una reaccin positiva ( +). Si es as, realizar la prueba cuantitativa. La no aglutinacin o una ligera apar icin de granulosidad que no exceda a la observada en el control (-), indica un re sultado (-). Nota: la sensibilidad del reactivo de ltex es 3UI/ml. CUESTIONARIO 1. Define qu es el factor reumatoide: ______________________________ _________________________________ ______________________________________________ _________________ ______________________________________________________________ _ _______________________________________________________________ 27

2. Por qu no es aconsejable trabajar con sueros con alto contenido de lpidos, o que el plasma tenga fibrina? ______________________________________________________ _________ _______________________________________________________________ ______ _________________________________________________________ ______________________ _________________________________________ 3. Por qu la artritis reumatoide se considera una enfermedad autoinmune?. ________ __________________________________________________________ _____________________ _____________________________________________ __________________________________ ________________________________ _______________________________________________ ___________________ ___________________________________________________ CONCLUSI ONES:___________________________________________________ _______________________ ___________________________________________ ____________________________________ ______________________________ _________________________________________________ _________________ ______________________________________________________________ ____ Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo______ Fecha de re alizacin:_______________________________ ____________________________ Vo.Bo. del maestro 28

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos Prctica no. 8 NOMBRE DE LA PRCT ICA: Protena C reactiva COMPETENCIA: Determina y cuantifica la protena C reactiva en suero sanguneo humano que cursa con un proceso inflamatorio o necrtico. REACTIV OS: Un equipo para PCR que contiene los siguientes reactivos: un Ltex anti protena C reactiva (conservar entre 2 y 8 C) un Suero control positivo Un Suero control negativo MATERIAL: Laminillas con 3 reas marcadas, con fondo negro par la prueba. Aplicadores de madera Jeringa, torundas con alcohol y torniquete Tubo rojo o con gel para la toma de sangre. Rotor Reloj o cronmetro Centrfuga Pipeta p asteur Pipetas graduadas de 5 ml Pipetas pistn de 100 y 500 micro litros Perilla de tres vas INTRODUCCIN La protena C-reactiva es un tipo especial de protena producida por el hg ado que slo est presente durante episodios de inflamacin aguda. El aspecto ms import ante de la PCR es su interaccin con el sistema del complemento, el cual es uno de los mecanismos de defensa contra elementos extraos. A pesar de que ste no es un e xamen especfico, s advierte de forma general sobre la presencia de un proceso infl amatorio agudo. El mdico puede utilizar este examen para evaluar una exacerbacin d e artritis reumatoide o de fiebre reumtica. El examen tambin puede ser til para eva luar la respuesta a la terapia. La protena C reactiva no se eleva de forma habitu al en enfermedades producidas por virus. La protena C reactiva se eleva ante un p roblema infeccioso o inflamatorio antes que la VSG y comienza a disminuir ante l a recuperacin de la enfermedad. 29

Si se trata la enfermedad con aspirina o antiinflamatorios desaparece su elevacin . La protena C reactiva aparece elevada en el infarto de miocardio. Tambin puede s er de ayuda tras una intervencin de ciruga, ya que aparece elevada durante 3 4 das, para luego disminuir, si persiste elevada es que hay alguna infeccin o complicac in post-quirrgica. PROCEDIMIENTO PRUEBA CUALITATIVA 1. Extraiga sangre sin anticoa gulante, Centrifuga durante 5 minutos a 2000 rpm y separe el suero. 2. Diluya el suero a probar (1:40) con solucin salina amortiguadora: 2 gotas (0.1 ml) del sue ro en 3.9 ml de solucin salina amortiguadora. 3. Coloque una gota de la solucin an terior en una de las divisiones de la placa de vidrio, en las otras reas coloca u na gota de suero control negativo y suero control positivo. 4. Aada una gota de lt ex anti protena C reactiva a cada una de las muestras. 5. Oscile suavemente la pl aca durante 2 minutos y observe si se presenta aglutinacin macroscpica. INTERPRETA CION Positivo: Aglutinacin visible con formacin de grandes agregados y fondo claro comparable al control positivo. Si la prueba de suero sale positiva se deber rea lizar la prueba cuantitativa. Negativo: Suspensin uniforme sin aglutinacin visible , comparable al control negativo. En ocasiones se pueden apreciar finas granulac iones que no exceden a las observadas con el control negativo, por lo que este f enmeno no deber interpretarse como aglutinacin. PRUEBA CUANTITATIVA: 1. Prepare dil uciones del suero problema en solucin salina de la siguiente manera: Coloque 5 tu bos de ensayo en una gradilla, deposite 0.5 ml de solucin salina en cada uno de l os tubos. Aada0.5 ml del suero diluido1:40 (ver prueba cualitativo) al primer tub o. mezcle bien y transfiera 0.5 ml de la dilucin anterior al segundo tubo. Contine efectuando la misma operacin hasta terminar con el tubo No.5. TUBO 1 1/80 2 1/16 0 30

3 1/320 4 1/640 5 1/1280 2. Utilizando un capilar o gotero, ponga una gota de ca da dilucin en las divisiones de la placa de vidrio previamente marcadas. 3. Aada u na gota de ltex anti protena C reactiva a cada divisin. 4. Mezcle con un aplicador, desde la dilucin ms elevada hasta la ms baja y extienda por toda el rea del ovalo 5 . Oscile suavemente la placa durante 2 minutos y observe si se presenta aglutina cin macroscpica. INTERPRETACION La dilucin ms elevada del suero que muestre aglutina cin visible, se considera como el titulo de protena C reactiva en el suero plasma. CUESTIONARIO 1.- Para qu se realiza la determinacin de la protena C reactiva? ______ ____________________________________________________________ ___________________ _______________________________________________ ________________________________ __________________________________ _____________________________________________ _____________________ __________________________________________________________ ________ 2.- En qu casos pueden elevarse los niveles de PCR?: ____________________ ______________________________________________ _________________________________ _________________________________ ______________________________________________ ____________________ ___________________________________________________________ _______ 3.- Cules son los niveles normales de PCR?: ______________________________ ____________________________________ ___________________________________________ _______________________ ________________________________________________________ __________ __________________________________________________________________ CO NCLUSIONES:___________________________________________________ _________________ _________________________________________________ ______________________________ ____________________________________ ___________________________________________ _______________________ Nombre del alumno:________________________________6to se m. gpo______ Fecha de realizacin:_______________________________ ____________________________ Vo.Bo. del maestro 31

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos Prctica no. 9 NOMBRE DE LA PRCT ICA: Reacciones febriles COMPETENCIA: Determina y cuantifica a travs de pruebas s erolgicas, los ttulos de anticuerpos contra antgenos bacterianos para evaluar la pr esencia de enfermedades como fiebre tifoidea, brucelosis, entre otras; que se ca racterizan por provocar en el paciente un sndrome febril. REACTIVOS: Un equipo pa ra Reacciones Febriles que contiene los siguientes antgenos: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. MATERIAL: Placa de vidrio con excavaciones para serologa. Aplicadores ra. Jeringa, torundas con alcohol y torniquete. Tubo rojo o con gel para la toma de sangre. Rotor. Reloj o cronmetro. Centrfuga. Pipeta pasteur. Pipeta pistn de 40 , 20, 10 y 5 micro litros. Tfico O (antgeno somtico) Tfico H (antgeno flagelar) Para (antgeno flagelar) Paratfico B (antgeno flagelar) Brucella abortus Proteus OX-19 Suer o control positivo Suero control negativo INTRODUCCIN Esta prueba representa un mtodo de laboratorio til para seguir la secue ncia de ciertas infecciones con acceso febril, causadas por bacterias. Son reacc iones de aglutinacin entre los antgenos de Salmonella, Brucella y Proteus y los an ticuerpos contra estos antgenos presentes en el suero del paciente. La tcnica comprende: 32

1. - Reaccin de Widal para diagnstico de la fiebre tifoidea, entrica y ondulante. L a reaccin mide el ttulo de anticuerpos (aglutininas) en el suero contra una suspen sin de antgenos conocidos de Salmonella typi, S.paratyphi A y S.paratyphi B. 2.- R eaccin de Huddleson para la brucelosis (Brucella abortus, B.suis o B. melitensis) . 3.- Reaccin de Weil-Felix para el tifo. Las especies de Rickettsias que causan tifo, tienen componentes antignicos idnticos a Proteus (cepas OX-19, OX-2 y OXK). En esta prueba se utilizan antgenos de Proteus para diagnstico de tifo. PROCEDIMIE NTO 1. Extraiga sangre sin anticoagulante y una vez que se coagule bien, centrif ugar 5 minutos a 3000 rev/ minuto. 2. Con ayuda de una pipeta pasteur transfiera el suero a un tubo limpio y procede de la siguiente manera: EXCAVACIN 1 2 3 4 5 6 7 8 SUERO (ml) 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 0.08 0.02 0.02 ANTIGENO (1 gota ) Tfico O Tfico H Paratfico A Paratfico B Brucella abortus Proteus OX-19 Suero control po ero control negativo Ttulos 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20

3. Mezclar con aplicadores de madera y poner en el rotor por 7 min. Verificar qu e prueba te da positiva; es decir cual prueba manifiesta franca glutinacin. Reali za la observacin al microscopio con objetivo seco dbil para determinar la aglutina cin. 4. Una vez que establezcas que antgenos dan positivo, solo a estos les realiz aras las pruebas con los siguientes volmenes de suero. Por ejemplo, si te dieron positivo los antgenos O y H : SUERO Tfico O SUERO (ml) Tfico H TITULOS 0.04 1 gota ota 1:40 0.02 1 gota 0.02 1 gota 1:80 0.01 1 gota 0.01 1 gota 1:160 0.005 1 gota 0.005 1 gota 1:320 5. Mezclar con aplicadores de madera, agitar por 7 minutos en el rotor y verific ar hasta que ttulos manifiesta franca aglutinacin, para que reportes 33

el resultado final de cada prueba. Recuerda verificar la aglutinacin al microscop io con objetivo seco dbil. 6. La siguiente tabla te ayudara a realizar la interpr etacin de los resultados y los controles precisamente te ayudaran para verificar el equipo y adems, como se debe ver una prueba positiva (aglutinada) de una negat iva (no aglutinada). SUERO PROBLEMA (ml) 0.08 0.04 0.02 0.02 0.005 0.02 de suero control positivo 0.0 2 de suero control negativo ANTGENO 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota TTULOS 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:80 NO AGLUTINA CUESTIONARIO 1. Describe brevemente las enfermedades: fiebre tifoidea, paratifoi dea, brucelosis, infeccin por Rickettsias. ______________________________________ ______________________ _________________________________________________________ ___ ____________________________________________________________ _______________ _____________________________________________ __________________________________ __________________________ _____________________________________________________ _______ ____________________________________________________________ ___________ _________________________________________________ ______________________________ ______________________________ _________________________________________________ ___________ 2. Por qu se dice que las reacciones febriles son poco especficas? ____ ________________________________________________________ _______________________ _____________________________________ __________________________________________ __________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ___________________ _________________________________________ 3. Cmo podemos determinar si la infeccin esta activa o es por la presencia de anticuerpos de memoria? 34

__________________________________________________________________ _____________ _____________________________________________________ __________________________ ________________________________________ _______________________________________ ___________________________ ____________________________________________________ ______________ 4. Qu resultados se espera en las pruebas si un paciente? a. Padeci anteriormente una infeccin por tifoidea, ________________________________________ __________________________ _____________________________________________________ _____________ __________________________________________________________________ b. Recibi tratamiento con antibiticos ___________________________________________ _______________________ ________________________________________________________ __________ __________________________________________________________________ __ ________________________________________________________________ c. O fue vacuna do anteriormente. ______________________________________________________________ ____ __________________________________________________________________ ________ __________________________________________________________ _____________________ _____________________________________________ __________________________________ _______________________________ 5. Qu otras pruebas se puede realizar en el pacien te para verificar estas enfermedades, y que adems sean pruebas ms especficas? _____ _____________________________________________________________ __________________ ________________________________________________ _______________________________ ___________________________________ ____________________________________________ ______________________ CONCLUSIONES:___________________________________________________ _______________ ___________________________________________________ ____________________________ ______________________________________ _________________________________________ _________________________ Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo_______ Fecha de r ealizacin:_______________________________ ____________________________ Vo.Bo. del maestro 35

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos Prctica no. 10 NOMBRE DE LA PRC TICA: Coprocultivo COMPETENCIA: Identifica Enterobacterias por medio del coprocu ltivo. MATERIAL: Asa bacteriolgica Mechero Fisher Estufa de incubacin a 37C Agares estriles de SS, EMB, Mc Conkey, Caldo tetrationato, agar sulfito bismuto Agar ver de brillante. Una muestra de heces recolectada en frasco estril Hisopos estriles I NTRODUCCIN Las Enterobacterias representan la mayor parte de la flora microbiana del tracto intestinal del hombre. En ella se incluyen grmenes comensales (Proteus y bacilos coliformes), as como patgenos del gnero Salmonella y Shigella. El vibrin colrico puede ser aislado de casos de clera. Durante las infecciones entricas, cuan do se presentan patgenos tales como Salmonella y Shigella, el bacterilogo debe dis tinguir entre los habitantes normales del intestino y los agentes etiolgicos de e nfermedad. Es importante destacar que las bacterias intestinales toman parte en los procesos digestivos tanto del hombre como de los animales. Ellos ayudan a la sntesis de vitaminas del complejo B y de la vitamina K. La materia fecal evacuad a debe ser reciente y deben cultivarse lo ms pronto posible despus de haber sido r ecolectada. Las muestras debern obtenerse al inicio del cuadro clnico, antes de in iciar el tratamiento antimicrobiano. Las muestras de heces se pueden tomar direc tamente en un frasco limpio de boca ancha y con tapa hermtica, de preferencia estr il. Si la muestra se toma en el mismo laboratorio donde se va a realizar el aisl amiento, no es necesario usar medio de transporte y hay que sembrar de inmediato . En estudios de campo o cuando el laboratorio no est cercano, la muestra se toma con un hisopo, el cual debe quedar bien impregnado de materia fecal. El hisopo se coloca en un medio de transporte como el Cary-blair. PROCEDIMIENTO 1. Introdu cir un hisopo estril en varios puntos de la muestra. 2. Descargar la muestra en u n rea pequea de los medios de cultivo: SS, Mc Conkey y EMB y realizar el estriado. 3. Incubar las cajas a 37C durante 24 o 48 horas 4. Observar las caractersticas m orfolgicas de las colonias desarrolladas indicando si existen cambios en el medio , pigmentos en la colonia etc. 36

5. Tratar de identificar si existe crecimiento de Salmonella o Shigella que se m anifiestan como colonias de color blanco en Mc Conkey e incoloras en EMB. 6. Al mismo tiempo que las placas, con la muestra fecal se inocula un medio de enrique cimiento como el caldo tetrationato, colocando el hisopo impregnado con la muest ra en el caldo al cual se le agreg previamente 0.2 ml de yodo por gramo de materi a fecal. 7. Incubar este medio de enriquecimiento por 12 o 18 horas a 37C 8. A pa rtir del caldo tetrationato se siembran placas con medios inhibitorios como el a gar verde brillante y el agar sulfito de bismuto, este ltimo si se est buscando S. typhi. Despus de incubar a 37C durante 24 horas la placa de verde brillante y 48 horas la de sulfito bismuto, se revisan cuidadosamente en busca de colonias sosp echosas. En el verde brillante Salmonella crece como colonias rojas y en sulfito de bismuto como colonias negras. 9. Para mayor seguridad en la identificacin de Enterobacterias es necesario realizar pruebas bioqumicas a las cepas aisladas en los medios de cultivo. Las ms comunes son IMVIC En el siguiente cuadro indica las caractersticas morfolgicas de las diferentes bacterias en cada uno de los medios de cultivo: MEDIO DE CULTIVO EMB Escherichia coli Salmonella Shigella Agar SS Agar sulfito bismuto Agar verde brillante 37

CUESTIONARIO 1.- Cules son las principales bacterias patgenas que pueden ser aislad as por medio del coprocultivo? Qu enfermedades producen cada una de stas? _________ _________________________________________________________ ______________________ ____________________________________________ ___________________________________ _______________________________ ________________________________________________ __________________ _____________________________________________________________ _____ 2.- Investiga el protocolo para el aislamiento e identificacin del vibrin ch olerae: __________________________________________________________________ _____ _____________________________________________________________ __________________ ________________________________________________ _______________________________ ___________________________________ ____________________________________________ ______________________ 3.- Explica brevemente en qu consisten las pruebas de Indo l, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer y Citrato (IMVIC): __________________________ ________________________________________ _______________________________________ ___________________________ ____________________________________________________ ______________ _________________________________________________________________ _ __________________________________________________________________ ___________ _______________________________________________________ ________________________ __________________________________________ _____________________________________ _____________________________ __________________________________________________ ________________ _______________________________________________________________ ___ __________________________________________________________________ _________ _________________________________________________________ CONCLUSIONES:_________ __________________________________________ _____________________________________ _____________________________ __________________________________________________ ________________ _______________________________________________________________ ___ Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo______ Fecha d e realizacin:_______________________________ ____________________________ Vo. Bo. del maestro 38

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no. 11 NOMBRE DE L A PRCTICA: Identifica Enterobacterias a travs de pruebas bioqumicas (IMVIC) COMPETE NCIA: Realiza la prueba bioqumica del Indol, rojo de metilo, voguesproskauer y ci trato para la diferenciacin de Enterobacterias, especialmente de Escherichia coli . MATERIAL: Caldo triptfano (MIO o SIM) Reactivo de Kovac Cepa reciente del organ ismo en estudio. Caldo RM/VP Medio de Citrato Simmons Reactivo de alfa-naftol al 5% Tubos de ensaye de 13x100 Pipetas pasteur Reactivo de Ehrlich Indicador de pH de rojo de metilo Cloroformo KOH al 40% Pipe tas graduadas de 5 ml Incubadora INTRODUCCIN El indol, es un bencilpirrol, es uno de los productos de degradacin me tablica del aminocido triptfano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa so n capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano con produccin de indol, cido pirvic o y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identifi cacin de muchas especies de microorganismos, siendo especialmente til para diferen ciar Escherichia coli (positiva) de miembros del grupo KlebsiellaEnterobacter (l a mayora negativos). La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenz aldehdo. Este es el principio activo de los reactivos de Kovac y ehrlich. Se debe utilizar un medio rico en triptfano. En la prctica se emplean medios combinados t ales como sulfuro-indol-movilidad (SIM), movilidad-indol-ornitina (MIO) o indolnitrato. La prueba de rojo de metilo es cuantitativa para la produccin de cido y r equiere organismos positivos que produzcan cidos fuertes (lctico, actico, frmico) a partir de glucosa, por la va de la fermentacin cida mixta. Dado que son muchas las especies de Enterobacterias que pueden producir cantidades suficientes de cidos f uertes detectables con el indicador rojo de metilo durante la fase inicial de la incubacin, slo se consideran rojo de metilo positivos aquellos organismos que pue den mantener este pH bajo luego de una incubacin prolongada (48 a 72 horas), cont rarrestando el sistema estabilizador de pH del medio. 39

La reaccin de Voges-proskauer: el cido pirvico, componente fundamental formado en l a degradacin fermentativa de la glucosa, es metabolizado luego a travs de varias va s, de acuerdo con los sistemas enzimticos que poseen las diferentes bacterias. Un a de dichas vas lleva a la produccin de acetona (acetilmetilcarbinol), un subproduc to de reaccin neutra. Los organismos tales como los miembros del grupo Klebsiella -Enterobacter producen acetona como principal subproducto del metabolismo de la g lucosa y forman cantidades menores de cidos mixtos. En presencia de oxgeno atmosfrico y de hidrxido de potasio al 40%, la acetona se convierte en diacetil y el alfa-na ftol acta como catalizador para revelar un complejo color rojo. Citrato: la utili zacin de citrato por una bacteria se detecta en un medio con citrato mediante la formacin de subproductos alcalinos. El medio incluye citrato de sodio, un anin com o nica fuente de carbono y fosfato de amonio como nica fuente de nitrgeno. Las bact erias que pueden utilizar citrato tambin pueden extraer nitrgeno de la + sal de am onio, con produccin de amonaco (NH3 ) alcalinizando el medio por conversin del amon iaco en hidrxido de amonio (NH4OH). El azul de bromotimol, amarillo a pH menor a 6 y azul a pH mayor de 7.6 es el indicador. DESARROLLO a.- Prueba de Indol 1.- I nocular caldo triptfano (u otro medio con indol) con el organismo en estudio e in cubar a 35-37C. 2.- Al finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo por la pare d interior del tubo. Si se emplea reactivo de Ehrlich, este paso debe ser preced ido por la adicin de 1 ml de cloroformo. Esto no es necesario con el reactivo de Kovac. INTERPRETACIN El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase d el reactivo y el caldo (o en la capa de cloroformo) segundos despus de aadir el re activo indica la presencia de indol y una prueba positiva. NOTA: Es aconsejable probar los reactivos con controles positivos (Escherichia coli) y negativos (Kle bsiella pneumoniae). b.- Prueba de Rojo de Metilo 1.- Inocular el caldo RM/VP co n un cultivo puro del organismo en estudio. Incubar a 35C durante 48 a 72 horas ( no menos de 48 horas). Finalizado este perodo, aadir directamente al caldo 5 gotas de reactivo de rojo de metilo. 40

INTERPRETACIN: El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica que la produccin de cido es suficiente como para bajar el pH a 4.4 y es una prueba positiva. Dado que otros organismos pueden producir cantidades menores d e cido a partir del sustrato, es posible el desarrollo de un color naranja interm edio entre el amarillo y el rojo. Esto no indica una prueba positiva. Nota: no o lvidar probar medios y reactivos con controles positivos y negativos. c.- Prueba de Voges-proskauer 1.- Inocular un tubo de caldo RM/VP con un cultivo puro del organismo en estudio. Incubar durante 24 horas a 35C. Al finalizar este periodo, transferir 1 ml de caldo a un tubo de ensayo limpio. Aadir 0.6 ml de alfa-naftol al 5% y 0.2 ml de KOH al 40%. Es esencial adicionar los reactivos en ese orden. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxgeno atmosfrico y dejarlo reposar durante 10 o 15 minutos. INTERPRETACIN: Una prueba positiva est indicada por el desarrollo de un color rojo a los 15 minutos de aadir los reactivos, revel ando la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona. Las pruebas no deben leerse luego de ms de 1 hora, ya que cultivos de voges-proskauer negativos pueden producir un color cobrizo, con la consecuente posibilidad de una interpr etacin falsa positiva. d.- Prueba de Citrato 1.- Tomar una colonia bien aislada d e la superficie de un medio de aislamiento primario e inocularla en una sola est ra en el pico de agar citrato de Simmons. Incubar a 35C durante 24 a 48 horas. INT ERPRETACIN: El desarrollo de un color azul intenso en 24 a 48 horas indica una pr ueba positiva y revela que el organismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con la formacin de productos alcalinos. CUESTIONAR IO 1. Por qu es importante que las cepas de los organismos en estudio sean recient es para estas pruebas? _________________________________________________________ _________ __________________________________________________________________ ___ _______________________________________________________________ ________________ __________________________________________________ _____________________________ _____________________________________ __________________________________________ ________________________ 41

2.- En la prueba de Indol, por qu utilizas cloroformo cuando usas el reactivo de E hrlich? __________________________________________________________________ _____ _____________________________________________________________ __________________ ________________________________________________ _______________________________ ___________________________________ ____________________________________________ ______________________ 3.- Por qu se recomienda la utilizacin de controles para cada una de las pruebas? _ _________________________________________________________________ ______________ ____________________________________________________ ___________________________ _______________________________________ ________________________________________ __________________________ Conclusiones:______________________________________________________ ____________ ______________________________________________________ _________________________ _________________________________________ ______________________________________ ____________________________ ___________________________________________________ _______________ ________________________________________________________________ __ Nombre del alumno:______________________________ 6to sem. Gpo._______ Fecha de r ealizacin:______________________________________ ____________________________ Vo.Bo. del maestro 42

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no.12 NOMBRE DE LA PRCTICA: Urocultivo COMPETENCIA: Identifica la diferente flora patgena que puede desarrollarse en el tracto urinario. MATERIAL: SUSTANCIAS: Muestra de orina toma da en frasco estril Agar EMB Agar sangre Agar Mc Conkey Agar Salado manitol Agar nutritivo Asa bacteriolgica Porta objetos Cubre objetos Centrfuga Microscopio Incubadora Mec hero Fisher Cajas de Petri estriles Pipetas de 1ml estriles Tubos de ensayo conten iendo 9 ml de agua peptonada, estriles INTRODUCCIN Las infecciones urinarias pertenecen al grupo de los procesos infecci osos ms frecuentes de la patologa mdica. Su importancia radica en el dao que pueden ocasionar sobre la funcin renal. Las vas urinarias normalmente son estriles por enc ima del nivel de la uretra distal. Los microorganismos que infectan las vas urina rias altas son comensales localizados en reas vecinas. En esta colonizacin intervi enen varios factores predisponentes que pueden ser de origen local o general. Lo s primeros incluyen la contaminacin fecal del meato urinario, el cateterismo, la patologa urinaria congnita o adquirida y el reflujo vesical. Entre los factores ge nerales estn la diabetes mellitus, el embarazo y la terapia con frmacos de amplio espectro. Las bacterias que con mayor frecuencia se aslan de la orina de paciente s ambulatorios con infeccin urinaria son: Escherichia coli, Staphylococcus saprop hyticcus, Proteus sp, Klebsiella sp, Enterococcus faecalis etc. Para lograr que el cultivo de orina realmente sea veraz, requiere que las muestras sean obtenida s en condiciones ptimas. PROCEDIMIENTO El Urocultivo incluye: 1) Aislamiento e id entificacin de microorganismos 2) Cuenta viable 3) Antibiograma para los grmenes p atgenos aislados e identificados 43

1) Aislamiento e identificacin de los microorganismos a) Mezclar perfectamente el frasco con la muestra de orina y depositar aproximadamente entre 5 y 10 ml de o rina en un tubo. b) Centrifugarla durante 5 minutos a 3500 r.p.m. c) Se desecha el sobrenadante dejando solo unas gotas de orina residual para emulsionar el sed imento. d) Con la suspensin del sedimento se lleva a cabo el estudio microscpico d irecto, tomando una gota del sedimento que se deposita en un portaobjetos, colocn dole un cubreobjetos. e) Observarlo al microscopio con el objetivo seco fuerte, e identificar lo observado. f) Mediante un asa de platino se hacen siembras por aislamiento en estras del sedimento, obtenido al centrifugar una muestra de la or ina colocada en tubo estril y centrifugada. La siembra se realiza en los siguient es medios de cultivo. AS, Mc Conkey, ASM y EMB g) Los medios inoculados se incub an a 37C entre 24 y 48 horas. h) Observar las caractersticas de cultivo de las col onias desarrolladas en los diversos medios. Si es necesario, realizar pruebas bi oqumicas para confirmacin de la especie bacteriana. i) Preparar frotis para realiz ar una tincin de Gram para el estudio de morfologa microscpica. 2) Cuenta viable a) Realizar diluciones de la orina de la siguiente manera: Colocar 5 tubos estriles conteniendo 9 ml. de agua peptonada. La cantidad de tubos utilizada depender de la carga bacteriana observada en el examen microscpico del sedimento urinario Tom ar 1ml. de la orina problema con una pipeta estril, y agregarlo al tubo No.1. (di l. 1:10), agitar el tubo y tomar de este 1ml. para pasarlo al tubo No.2, (dil 1: 100) realizar el mismo paso las veces que sea necesario rotulando el tubo con la dilucin correspondiente. Recuerda que el nmero de diluciones depender de la carga bacteriana. b) Colocar 1ml de cada dilucin en diferentes cajas de Petri estriles y rotularlas con la correspondiente dilucin. c) Vaciar en estas cajas de 15 a 20 m l de Agar nutritivo fundido a Bao Mara previamente enfriado hasta que alcance una temperatura que soporte la piel de tu mano (debes evitar que solidifique). d) Me zclar perfectamente por rotacin suave este agar con la dilucin y dejar que solidif ique. Incubar las cajas a 37C durante 24 a 48 horas e) Contar el nmero de colonias desarrolladas, para esto seleccionar para su lectura, la placa que muestre entr e 30 a 300 colonias. 44

f) Reportar la cuenta bacteriana de la siguiente manera: Nmero de colonias contad as X el factor de dilucin de la caja en la que se observa y cuentan las colonias bacterianas = Unidades Formadoras de Colonias por ml. (UFC/ml). CUESTIONARIO 1.- Realiza un diagrama de flujo que indique los pasos a seguir par a el Urocultivo: _______________________________________________________________ ___ __________________________________________________________________ _________ _________________________________________________________ ______________________ ____________________________________________ 2.- Cules son las principales bacteri as que pueden presentarse infectando las vas urinarias? Por qu? ___________________ _______________________________________________ ________________________________ __________________________________ _____________________________________________ _____________________ __________________________________________________________ ________ 3.- Explica detalladamente las tcnicas de recoleccin de muestras de orina s para Urocultivo, tanto en adultos como en lactantes. _________________________ _________________________________________ ______________________________________ ____________________________ ___________________________________________________ _______________ ________________________________________________________________ __ CONCLUSIONES:___________________________________________________ ____________ ______________________________________________________ _________________________ _________________________________________ Nombre del alumno:________________________________6to sem. gpo______ Fecha de re alizacin:_______________________________ ___________________________ Vo.Bo. del maestro 45

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no.13 NOMBRE DE LA PRCTICA: Tincin de Ziehl- Neelsen COMPETENCIA: Identifica las Bacterias Alcohol A cido resistentes (BAAR), como las del Gnero Mycobacterium, utilizando la tincin de Ziehl-Neelsen. MATERIAL: Aplicadores de madera Mechero Fisher Papel de estraza Portaobjetos nuevos Muestra de expectoracin Colorante de carbolfucsina o Fucsina fenicada Alcohol cido Colorante de azul de m etileno Fenol INTRODUCCIN La propiedad tintorial que presentan numerosas bacterias de resistir la decoloracin con cidos fuertes, despus de teirlas con soluciones de fucsina calien te, permite reunirlas bajo la denominacin general de bacterias acidorresistentes o alcohol acidorresistentes. Es caracterstica del gnero Mycobacterium, junto con s u tamao y forma caracterstica, constituyen una ayuda valiosa para la deteccin tempr ana de infecciones y para el control del tratamiento de enfermedades micobacteri anas. La presencia de bacilos cido-alcohol resistentes en el esputo, en combinacin con antecedentes de tos, prdida de peso y una radiografa de trax que muestra un in filtrado pulmonar, todava es evidencia presuntiva de tuberculosis. Se ha estimado que cuando se emplean las tcnicas de concentracin estndar, se necesitan aproximada mente 10,000 bacilos cido-alcohol-resistentes por mililitro de esputo para ser de tectados microscpicamente. Los pacientes con enfermedad extensa albergan gran nmer o de micobacterias con una buena correlacin entre frotis positivos y cultivos pos itivos puede ser slo de 25% a 40%. Los extendidos con esta coloracin tambin son tile s para seguir la respuesta del paciente al tratamiento. Despus de comenzar con la s drogas antimicobacterianas, los cultivos se tornan negativos antes que los ext endidos, lo que sugiere que los microorganismos no son capaces de replicarse per o pueden unirse al colorante. Con tratamiento continuado, ms microorganismos son destruidos y muy pocos permanecen de modo que evaluando el nmero de microorganism os en el esputo durante el tratamiento se puede tener una medida objetiva de la respuesta. Si despus de iniciado el tratamiento el nmero de microorganismos no dis minuyera, deber considerarse la posibilidad de resistencia a la droga, caso en el cual habr que realizar cultivos adicionales y estudios de susceptibilidad. 46

PROCEDIMIENTO 1.- Colocar papel de estraza sobre la mesa para trabajar. Colocar un frasco con fenol al 5% para desechar aplicadores usados. 2.- Usar guantes y c ubre bocas 3.- Prender el mechero Fisher y tomar el frasco que contiene la muest ra. Abrir el frasco y pasar la boca por la llama del mechero. Es importante trab ajar siempre atrs de la llama del mechero. 4.- Romper la punta de un aplicador de madera y con la punta aguzada tomar muestra del esputo. 5.- Descargar la muestr a sobre un portaobjetos nuevo, realizando un frotis cuyas dimensiones sean de 20 mm de largo por 10 mm de ancho. Preferentemente en el centro del portaobjetos. 6.- Desechar el aplicador contaminado en el frasco con fenol al 5%. Recuerda la importancia de trabajar por atrs del mechero. 7.- Dejar secar el frotis al aire y fijar con la llama del mechero. Proceder a teir con la tcnica de Ziehl-Neelsen de acuerdo al siguiente protocolo: a. Cubrir el frotis con fucsina fenicada y cale ntar 5 minutos a emisin de vapores con ayuda de hisopos de algodn y gasa con alcoh ol. b. Agregar ms colorante si este empieza a secarse. Es importante evitar la eb ullicin c. En forma inclinada lavar con agua destilada el frotis y decolorar agre gando alcohol cido de 1 a 2 minutos, dependiendo del grueso del frotis. d. Lavar nuevamente, y quitar el exceso de agua e. Colorear con azul de metileno por 1 mi nuto. f. Volver a lavar y dejar secar a temperatura ambiente. g. Leer con objeti vo de inmersin, en el sentido de las manecillas del reloj 100 campos y contar los BAAR por campo. h. Los bacilos aparecen como bastoncillos delgados, ligeramente curvos, teidos de rojo, generalmente con grnulos ms coloreados en su interior, ais lados, en parejas o en grupos, sobre el azul claro de la tincin de contraste. REPORTE DE RESULTADOS No se encontraron bacilos cido-alcohol resistentes en 100 c ampos observados 1-9 BAAR Informar el nmero de bacilos observados en 100 campos P OSITIVO (+) Menos de 1 bacilo por campo en promedio, en 100 campos observados PO SITIVO (++) MS DE 100 De 1 a 10 bacilos por campo en promedio, en 50 campos obser vados POSITIVO (+++) Ms de 10 bacilos por campo en 20 campos observados NEGATIVO 47

CUESTIONARIO 1. Qu microorganismos pueden ser detectados por la tcnica de tincin de Ziehl-Neelsen? Qu enfermedades producen? _________________________________________ _________________________ ______________________________________________________ ____________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ 2. Por qu es im portante trabajar atrs del mechero durante todo el proceso? _____________________ _____________________________________________ __________________________________ ________________________________ _______________________________________________ ___________________ ____________________________________________________________ ______ __________________________________________________________________ 3. Por qu es poco prctico el aislamiento y cultivo del bacilo de la tuberculosis? _______ ___________________________________________________________ ____________________ ______________________________________________ _________________________________ _________________________________ ______________________________________________ ____________________ ___________________________________________________________ _______ Conclusiones. __________________________________________________________ ________ __________________________________________________________________ ____ ______________________________________________________________ _________________ _________________________________________________ Nombre del alumno:___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de r ealizacin:__________________________________ ___________________ Vo.Bo. del maestro 48

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no.14 NOMBRE DE LA PRCTICA: Diagnstico de Paludismo COMPETENCIA: Realiza las tcnicas de gota gruesa y frotis delgado de sangre para bsqueda e identificacin de parsitos sanguneos, como e l Plasmodium, que causa el paludismo en el hombre. MATERIAL: Lancetas estriles Po rtaobjetos nuevos Agua tamponada a pH de 7.2 Portaobjetos nuevos Piseta Colorant e de Giemsa al 10% Alcohol metlico Microscopio Aceite de inmersin INTRODUCCIN El paludismo, tambin conocido como malaria, es la principal enfermedad parasitaria causante de anemia en el hombre, la ms frecuente dentro de las enfer medades transmitidas por artrpodos y un constante flagelo del hombre en su histor ia. En Mxico, principalmente el agente etiolgico del paludismo es P. vivax y alred edor del 1% es causada por P. falciparum. El diagnstico por el laboratorio no es una tarea fcil, ya que las parasitemias que se alcanzan son pobres, lo que dificu lta su hallazgo. Sin embargo, existen metodologas como la gota gruesa que favorec en su hallazgo. La diferenciacin de las dos especies ms frecuentes en Mxico se basa en la presencia de granulaciones, alteraciones al eritrocito parasitado y carac tersticas morfolgicas. ANTECEDENTES HISTRICOS Malaria, paludismo, fiebres paldicas, fiebres intermitentes, fiebres veraniegas, son nombres distintos para una misma enfermedad. El nombre de Malaria fue dado en Italia en 1847 por Torti, porque se crea que era causada por el aire malo (en italiano, mal aria) o miasmas que se despr endan de las aguas estancadas y de los terrenos pantanosos; y el de Paludismo o f iebres paldicas, porque las fiebres predominaban entre los pobladores de las zona s cercanas a pantanos, cuyo nombre en italiano es palude y en latn palus. Livio, Gale no, Celso, Varrn, Vitrubio y Columela describieron perfectamente la enfermedad de sde la ms remota antigedad, e Hipcrates se refiere en sus escritos a las fiebres pa ldicas (an no se le conocan con este nombre) clasificndolas en tres grupos: cotidian as, ternarias y cuaternarias, reconociendo la influencia de las estaciones, las lluvias y las aguas estancadas en la proximidad de los pueblos. Platn, 184 aos A.C ., hace referencia del bazo abultado de los 49

enfermos de malaria. El parsito productor del paludismo fue descubierto con la ay uda del microscopio por el mdico francs Charles Louis Alphonse Lavern en el hospita l militar de Constantine (Argelia) el da 6 de noviembre de 1880. Al principio cre y que se trataba de un alga a la que llam Oscillaria malariae, sin embargo rectifi c luego denominando al parsito hematozoario. Lavern march a Italia y convenci de su d escubrimiento a los malarilogos Marchiafava y Celli, quienes erigieron el gnero Pl asmodium. En 1897, Welch descubri el Plasmodium falciparum productor de la forma tropical y en 1922, Stephens encontr el Plasmodium ovale en el frica Oriental. El ciclo evolutivo se descubri gracias a Sir Ronald Ross (1857-1932) mdico ingls quien en 1898 demostr el papel del mosquito intermediario (no lo ubic taxonmicamente) en el ciclo del paludismo en aves (gorriones y alondras), obteniendo el premio Nbel en 1902 por sus descubrimientos; sin embargo fue el zologo italiano Gian Batista Grassi quien demostr el papel del mosquito como transmisor de la malaria en los humanos, sealando que el insecto del gnero Anopheles es el nico vector del paludism o. Anopheles PROCEDIMIENTO La gota gruesa permite analizar una mayor cantidad de sangre, faci litando la deteccin de parasitemias bajas y un ahorro de tiempo en el examen, aun que al romperse los eritrocitos resulta difcil la identificacin de la especie. 1.Realizacin del frotis y de la gota gruesa. La toma de muestra se realiza mediant e la puncin con una lanceta estril, normalmente en la yema del dedo. Se recoge una gota de sangre en un portaobjetos y con otro se realiza la extensin en capa fina . 50

2.- Para la gota gruesa se recogen 3 o 4 gotas sobre un portaobjetos y con la es quina de otro de unen en movimientos rpidos, extendindose en una capa gruesa y uni forme; hasta formar una gota gruesa de 1 cm de lado o de dimetro. La sangre no de be ser excesivamente revuelta, es suficiente con 3 a 6 movimientos. De preferenc ia, realizar el homogeneizado de la muestra en una sola direccin, en forma concntr ica (de adentro hacia fuera o viceversa). 3.- Secar la lmina con la gota gruesa en una superficie plana y protegida de polv o, calor e insectos. COLORACIN DE LAS MUESTRAS Antes de proceder a la coloracin de la gota gruesa, fije el frotis sumergindolo en metanol, por tres segundos y djelo secar, la gota gruesa no la fijes con metanol. Secas ambas preparaciones procedes a teirlas PROCEDIMIEN TO a. Coloque las varillas de vidrio sobre un lavatorio o recipiente de tal form a que facilite la eliminacin de los lquidos que se usarn en la coloracin y coloque l as lminas que debe colorear sobre las varillas, espacindola de tal forma que pueda manipularlas con seguridad. b. Vierta colorante de Giemsa al 10% sobre ambas pr eparaciones (gota gruesa y frotis delgado), cubrindolas por completo. Haga esto s uavemente, a una distancia corta de la lmina y deje actuar el colorante por 30 mi nutos. La experiencia le puede indicar la necesidad de modificar este tiempo de espera. c. Descarte el exceso de colorante diluido y lave la lmina con agua corri ente, usando una piseta, hasta que el agua no desprenda colorante. Se recomienda utilizar agua tamponada a pH de 7.2 (tanto en la dilucin del colorante como en l os lavados) para facilitar la observacin de los grnulos de Schuffner, tan importan tes para la diferenciacin de especies 51

d. Acomode las lminas en una gradilla, de modo que queden inclinadas y con la got a gruesa hacia abajo. Deje secar las lminas en esta posicin. EXAMEN DE RUTINA DE LA GOTA GRUESA Y DEL FROTIS El examen de la gota gruesa es recomendable para detectar la presencia de los pa rsitos de malaria, mientras que el frotis sirve como herramienta auxiliar para de terminar la especie de Plasmodium en caso de que no sea posible hacerlo en la go ta gruesa. Examen de la gota gruesa El examen de rutina de la gota gruesa requiere observar 100 campos microscpicos pt imos a un aumento final de 1000x, con lente de inmersin. Una lmina puede declarars e como negativa, slo despus de observar 100 campos microscpicos sin haber encontrad o parsitos. Si se encuentran parsitos, deben examinarse tambin los 100 campos micro scpicos; esto asegura detectar la posibilidad de infeccin mixta (ms de una especie presente en una muestra de sangre). En lo posible, debe identificarse la(s) espe cie(s) a la(s) que pertenecen los parsitos. RECORRIDO DE LA GOTA GRUESA DURANTE SU OBSERVACIN AL MICROSCOPIO Examen del frotis de sangre Este examen requiere mayor tiempo de observacin en co mparacin con la gota gruesa, debido a que la concentracin de los elementos sanguneo s es mucho menor. Examinar el mayor nmero de campos microscpicos (300) para determ inar si la muestra de sangre es positiva o negativa para malaria. Si el diagnstic o es dudoso deber examinar de 400 a 500 campos microscpicos 52

RECORRIDO DEL FROTIS DURANTE SU OBSERVACIN AL MICROSCOPIO 4.- Realiza dibujos de lo observado FROTIS DE SANGRE PARASITADO CON PLASMODIUM 53

CUESTIONARIO 1.- Adems de el diagnostico del Plasmodium, qu otros parsitos pueden se r diagnosticados con estas tcnicas? Indica adems del parsito, la enfermedad que pro ducen. __________________________________________________________________ ______ ____________________________________________________________ ___________________ _______________________________________________ ________________________________ __________________________________ _____________________________________________ _____________________ 2.- Qu ventajas y desventajas tienen las tcnicas de gota gruesa y frotis delgado pa ra el diagnostico de parsitos hemticos? Explica. _________________________________ _________________________________ ______________________________________________ ____________________ ___________________________________________________________ _______ __________________________________________________________________ _____ _____________________________________________________________ __________________ ________________________________________________ 3.- Por qu se sugiere utilizar ag ua tamponada con pH 7.2 en vez de agua de la llave al preparar la dilucin del col orante de Giemsa y lavar las preparaciones al teirlas? __________________________ ________________________________________ _______________________________________ ___________________________ ____________________________________________________ ______________ _________________________________________________________________ _ 4.- Qu otras tinciones pueden ser utilizadas con el mismo fin? _________________ _________________________________________________ ______________________________ ____________________________________ ___________________________________________ _______________________ ________________________________________________________ __________ Conclusiones. __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ ____________ ______________________________________________________ _________________________ _________________________________________ ______________________________________ ____________________________ 54

Nombre del alumno:___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de r ealizacin:__________________________________ _________________________________ Vo.Bo. del maestro 55

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no.15 NOMBRE DE LA PRCTICA: Examen Coproparasitoscpico, tcnica directa COMPETENCIA: Realiza un examen Coproparasitoscpico (cps), a una muestra de heces con el fin de buscar e identif icar formas parasitarias. MATERIAL: Aplicadores de madera Portaobjetos Solucin de lugol Microscopio Papel de estraza cubreobjetos tubos de ensaye de 13x100 sol. Salina fisiolgica INTRODUCCIN Un examen Coproparasitoscpico es el estudio de la materia fecal para l a bsqueda e identificacin de formas parasitarias. Los mtodos Coproparasitoscpico, se pueden dividir en: cualitativos y cuantitativos; los primeros se usan para sabe r que formas parasitarias existen y los segundos en qu numero se encuentran; esto s ltimos se utilizan sobre todo en las helmintiasis Los mtodos cualitativos pueden ser de dos tipos: los mtodos de concentracin y el examen directo. El examen direc to es el ms antiguo que se conoce por los datos histricos que se tienen en relacin a los primeros microscopios, probablemente Antonio Van Leewenhoek en el siglo XV III, fue de los primeros en utilizarlo, al encontrar y observar en sus propias h eces fecales trofozotos de Giardia lamblia. El mtodo tiene entre sus caractersticas , la sencillez y rapidez para llevarlo a cabo, adems de lo econmico que resulta re alizarlo, pues es el que requiere menos material Ha sido el mtodo indicado como e xcelente para la bsqueda de trofozotos. En la prctica ha demostrado su eficacia cua ndo se utiliza lugol, para la bsqueda e identificacin de quistes, huevecillos y la rvas. Pero tiene una limitante: la muestra utilizada es tan pequea, que es poco r epresentativa. PROCEDIMIENTO 1. En un portaobjetos se colocan, separadamente (en cada extremo), una gota de solucin salina fisiolgica y otra de lugol. 2. Con uno o dos aplicadores de madera, se toma una muestra de 1 a 4 mg de heces y se mezcl a con la solucin salina, haciendo una suspensin homognea. 56

3. Con el mismo aplicador se retiran las fibras y otros fragmentos gruesos. 4. S e coloca el cubreobjetos. 5. Se efecta la misma operacin en la gota de lugol. 6. S e observa al microscopio, primero con objetivo seco dbil y despus con el seco fuer te. 7. La preparacin con solucin salina, sirve para identificar y reportar el hall azgo de trofozotos. La preparacin con lugol sirve para reportar el hallazgo de qui stes, huevos y larvas. 8. Realiza el dibujo de lo observado. 9. RECUERDA: la mat eria fecal es potencialmente infectante, por lo que se tendrn los cuidados necesa rios para su manejo que garanticen la correspondiente bioseguridad. 57

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CUESTIONARIO 1. Explica que son los protozoarios, estadios que presentan y cules son las especies patgenas ms comunes para el hombre ______________________________ __________________________________ _____________________________________________ ___________________ ____________________________________________________________ ____ ________________________________________________________________ __________ ______________________________________________________ _________________________ _______________________________________ ________________________________________ ________________________ 2. Indica la clasificacin de los helmintos, sus caracters ticas principales y los que parasitan con ms frecuencia al hombre _______________ _________________________________________________ ______________________________ __________________________________ _____________________________________________ ___________________ ____________________________________________________________ ____ ________________________________________________________________ 3. Por qu se dice que la preparacin con solucin salina fisiolgica sirve para identificar trofoz otos de los parsitos? ____________________________________________________________ ____ ________________________________________________________________ __________ ______________________________________________________ _________________________ _______________________________________ 4. Adems del intestino, donde ms pueden los parsitos infectar al hombre? Da algunos ejemplos _______________________________ _________________________________ ______________________________________________ __________________ _____________________________________________________________ ___ ________________________________________________________________ 5. A qu se re fiere cuando decimos que el inconveniente de esta tcnica es que es poco represent ativa? Explica e indica cmo podemos disminuirla _________________________________ _______________________________ ________________________________________________ ________________ _______________________________________________________________ _ ________________________________________________________________ 61

Conclusiones. ________________________________________________________________ _ _______________________________________________________________ ________________ ________________________________________________ _______________________________ _________________________________ ______________________________________________ __________________ Nombre del alumno:___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de realizacin:__________________________________ ___________________ Vo.Bo. del maestro 62

Universidad de Colima Laboratorio de Anlisis Clnicos III Prctica no.16 NOMBRE DE LA PRCTICA: Examen Coproparasitoscpico, tcnica de concentracin de Faust COMPETENCIA: R ealiza un examen Coproparasitoscpico (cps), de concentracin utilizando la tcnica de Faust; con el fin de buscar e identificar formas parasitarias, en una muestra d e heces. MATERIAL: Aplicadores de madera Papel de estraza Portaobjetos cubreobje tos Solucin de lugol tubos de ensaye de 13x100 Microscopio agua de la llave Asa b acteriolgica vaso de precipitados de 100 ml Gasas gradilla Centrifuga mechero bun sen o Fisher Embudo densmetro de 1.100 a 1.200 Sulfato de zinc con densidad 1.18 (aprox. 33%) INTRODUCCIN Desde 1938 cuando fue descrito este mtodo, fue bien recibido, es uno d e los ms utilizados en todo el mundo. Es parecido al que describi Lane en 1924, au nque l utiliz solucin saturada de cloruro de sodio, como este mtodo es poco eficaz p ara quistes; se utiliza ms el de Faust que es muy eficaz para estas formas parasi tarias. La tcnica de Faust, hace una buena concentracin de quistes, huevos y larva s; es la tcnica preferida por la generalidad de los laboratorios. Las formas para sitarias son encontradas con facilidad pues las preparaciones quedan con pocos a rtefactos. Su limitacin es que es poco eficaz para huevos pesados como los de Tae nia spp; Faciola heptica y de Ascaris lumbricoides. Este mtodo se utiliza solucin d e Zinc, cuya densidad especfica es de 1.180g/ml (33%), que conforma un medio de d ensidad ms alta que la de los huevos: Necator 1.055 g/ml, Tricocfalo 1.150 g/ml, A scaris frtil 1.110 g/ml y facilita que los huevos livianos de estos helmintos, co n menor peso especfico que la solucin, se concentren y floten. 63

La concentracin adecuada aconsejada es la que usa como reactivo una solucin acuosa de sulfato Zinc al 33% con una densidad al 1.180 g/ml. El agua utilizada diluye y lava la materia fecal. El filtrado con gasa doblada y evita que los detritos gruesos traspasen las paredes, la centrifugacin enriquece en delgada pelcula la su perficie del lquido centrifugado con los huevos livianos de algunos helmintos. PROCEDIMIENTO 1) Mezclar bien una porcin de materia fecal para preparar una suspe nsin homognea con 1 a 2 g de materia fecal en 10 ml de agua destilada. 2) Filtrar la suspensin a travs de una gasa doblada en cuatro, sobre un tubo de centrfuga, ayu dndose con un embudo pequeo. 3) Centrifugar el filtrado a 2500 rpm por 1 min. 4) Decantar el lquido sobrenadante y completar con agua hasta igualar la medida a nterior, centrifugar nuevamente. Resuspender el sedimento. 5) Repetir el procedi miento 2 veces hasta que el lquido sobrenadante est listo. 6) Decantar nuevamente el lquido sobrenadante reemplazndolo por igual cantidad de solucin de sulfato de Zi nc al 33%. Mezclar bien la solucin con el sedimento. Centrifugar durante 1 minuto a 1500 rpm. 7) Tomar 3 a 4 gotas de las partculas que flotan en la superficie de l lquido. Colocarlas en portaobjeto y mezclarla con 1-2 gotas de lugol, colocar c ubreobjeto. (Te puedes ayudar con el asa limpia o flameada, para recoge la muest ra de la pelcula superficial, durante 2 o 3 ocasiones sucesivas y se deposita en el portaobjetos) 8) Examinar al microscopio y reporte sus resultados. 9) Realiza el dibujo de lo observado. 10) Para ayudarte a identificar a los parsitos que pu edas encontrar; recurre a los dibujos de los diversos parsitos mostrados en las g rficas de la practica anterior. NOTA: Recuerda, la materia fecal es potencialment e infectante, por lo que se tendrn los cuidados necesarios para su manejo, que ga ranticen la correspondiente bioseguridad. 64

CUESTIONARIO 1.- Por qu es importante cuidar la preparacin del sulfato de zinc y ch ecar su densidad cada vez que se utilice? ______________________________________ ____________________________ ___________________________________________________ _______________ ________________________________________________________________ __ 2.- Esta tcnica de flotacin me permite ver a todos los huevos de helmintos? Y a los trofozotos de amibas? Por qu? _________________________________________________ _________________ ______________________________________________________________ ____ __________________________________________________________________ ________ __________________________________________________________ 3.- En todo examen de heces es importante realizar una evaluacin fsica de la muestra. Qu fin tiene este? _ _________________________________________________________________ ______________ ____________________________________________________ ___________________________ _______________________________________ ________________________________________ __________________________ Conclusiones: _______________________________________ ___________________________ ____________________________________________________ ______________ _________________________________________________________________ _ __________________________________________________________________ ___________ _______________________________________________________ Nombre del alumno: ___________________________________6to sem.gpo.____ Fecha de realizacin: __________________________________ ___________________ Vo.Bo. del maestro 65

Manual de Prcticas de laboratorio de Anlisis Clnicos III, fue aprobado por la Acade mia Estatal de Anlisis Clnicos III, con la participacin de los profesores titulares de la materia: QFB. Isabel Ruiz Snchez, QFB. Emilia Elizabeth Bolio Salazar, QFB . Myrna Ftima Ramrez Garca y QFB. Alberto Rodrguez Moya. Supervisado por la Licda. S ilvia Luz Lpez Alcaraz y Licda. Laura Araceli Jimnez Cobin. Vigente a partir de feb rero de 2009. 66