Compresibilidad en medios confinados: micelas inversas y protenas en funcin de una hidratacin controlada. Responsable: Donato Valdez Prez.

Objetivo: El objetivo es estudiar los cambios conformacionales de micelas inversas en presencia de protenas encapsuladas. Introduccin y antecedentes: Los sistemas biolgicos tienen una necesidad primordial de agua. Las interacciones de las molculas del agua con los grupos funcionales de los pptidos[1] y de las protenas[2] juegan un papel crucial en sus estabilidades, su dinmica y en las proporciones esenciales entre la estructura y la funcin. Estos mecanismos implican tambin las diversas etapas del doblado de las protenas (glbulo suave) y de su desnaturacin, sus interacciones con los ligandos (medicamentos) o aun con las membranas biolgicas (receptoras). El problema fundamental es medir exactamente la cantidad de agua suficiente y necesaria para esos efectos. En el caso de las protenas membranaras hidrfobas esta pregunta aun es ms crtica. Un sistema tpico lo constituyen las micelas inversas [3, 5]: una solucin de nanogotas de agua encapsulados por una monocapa molecular de tensoactivo y dispersados en un solvente orgnico, como se muestra en la figura.

Figura: Esquema de una micela Esquema del principio de una molcula de tensoactivo, formado de una parte polar hidrosoluble (hidrfilo) y de una cadena carbonada liposoluble (hidrfoba) de largo L. Cuando estn en solucin en presencia de agua, los tensoactivos se agrupan para formar micelas inversas esfricas, el radio R y el nmero de molculas de tensoactivo por micela depende del nmero de molculas de agua. 1

Este tipo de sistema es interesante y puede ser utilizado en el estudio de protenas netamente membranarias [6]. Es posible estudiar protenas en un medio heterogneo e istropo, ms prximo al de las estructuras biolgicas, dado que se pueden controlar algunas caractersticas estructurales de las micelas inversas como son: el tamao de la micela, radio hidrodinmico, porcentaje de agua, entre otras [5]. La estructura micelar ha sido estudiada en el pasado con tcnicas como la resonancia magntica nuclear (RMN) y rayos X (SAXS). Sin embargo estas tcnicas presentan desventajas: a) con SAXS podemos tener informacin de la talla interior de la micela y la g(r) que nos da informacin acerca de las distancias promedio entre primeros, segundos y terceros vecinos; b) la RMN solo nos da informacin acerca del intercambio rpido de agua libre y ligada ya que esta tcnica es sensible a estos eventos. Metodologa: Dada la limitacin de estas tcnicas, se busc alguna otra que pudiera dar mas informacin. Se encontr que mediciones de comprensibilidad adiabtica son sensibles a los cambios de conformacin y de estructura de protenas inducidas por hidratacin de las mismas; esto se consigue encapsulando a las protenas en micelas inversas que permiten un control preciso del agua disponible [4, 6]. La comprensibilidad se puede deducir de mediciones de velocidad del sonido y de densidad, si se usa la tcnica de densimetra de tubo vibrante, que tiene lata resolucin. El velocmetro ultra sonoro con que se cuenta en el laboratorio de termodinmica es capaz de medir la velocidad del sonido con una precisin suficiente (del orden de 100 ppm). La celda electroacstica de medicin tiene una capacidad de 200 cm3 y ha sido diseada para el estudio de lquidos simple. Este volumen es demasiado grande pues los materiales orgnicos para la preparacin de los sistemas a estudias suelen ser costosos. Por ello se adaptaran a la celda electroacstica compartimientos de menor volumen (del orden de 3 cm3) diseados de tal manera que no deteriore la precisin con que se mide la velocidad del sonido. Una vez construidos los compartimientos, se llevara a cabo los experimentos de medicin de la velocidad del sonido en las micelas inversas sin y con protenas encapsuladas como funcin de la concentracin de protenas. Para tal efecto utilizaremos dos compartimientos, uno al que llamaremos compartimiento de referencia donde introduciremos solamente el solvente y el otro que llamaremos compartimiento de medida donde colocaremos la solucin. Mientras se lleva a cabo la medicin mantendremos siempre el compartimiento de referencia fijo y slo variaremos el compartimiento de medida en donde iremos cambiando la concentracin del soluto en la solucin micelar. La medida de la diferencia de velocidad entre los dos compartimientos permitir poner en evidencia la variacin de la velocidad inducida por la presencia nica del soluto (ya sea micelas y/o protenas encapsuladas) en el solvente con una precisin muy alta (mejor que 10-5). Adems, estamos interesados en correlacionar los cambios en la compresibilidad con la forma de las micelas (arreglo geomtrico de las molculas que conforman las micelas). Una manera de conseguir lo anterior es usar la microscopia de fuerza atmica (AFM). Con el AFM es posible visualizar las micelas con y sin protenas confinadas a escala 2

nanomtrica utilizando la variante de los modos dinmicos (tapping mode) [7]. Con esta tcnica es posible mapear la superficie de un sustrato solido sobre el cual se depositara una muestra de solucin micelar para poder medir la distribucin de tamaos (radio hidrodinmico) de las micelas. De esta manera se obtiene la polidispersidad y tambin podramos ver cambios en el arreglo geomtrico de las molculas como funcin de diversos parmetros como la hidratacin, la concentracin de protenas, su naturaleza qumica, etc. Finalmente toda esta informacin puede ser de utilidad para la caracterizacin de potenciales efectivos de interaccin entre las protenas y las molculas de agua. Conviene hacer notar que el presente proyecto es de corte multidisciplinario ya que los sistemas que se van a estudiar son de inters en otras disciplinas cono en la biofsica, biologa y en la qumica. Calendarizacin del trabajo: En los siguientes dos aos se planea realizar las siguientes actividades: Primer ao: 1. Construir los compartimientos de acero inoxidable para volmenes pequeos (del orden de 3 cm3) y adaptarlo al sistema experimental existente en el laboratorio de termodinmica. 2. Calibracin del sistema experimental con agua y solventes orgnicos.

Comparar los resultados obtenidos en el laboratorio de termodinmica con resultados existentes en la literatura. 3. Llevar a cabo experimentos de ultra sonido y densidad considerando el estudio de las micelas inversas para estudiar los efectos de la hidratacin en estos pequeos agregados [5]. 4. Estudiar estos sistemas por otras tcnicas experimentales para su corroboracin y dems anlisis necesarios para su comprensin, seran rayos X (SAXS) resonancia magntica nuclear (RMN) microscopia de fuerza atmica (AFM). 5. Preparar una publicacin sobre el tema. Segundo ao: 1. Encapsular macromolculas como serian protenas en micelas inversas y llevar a cabo experimentos de densidad y velocidad del sonido, para as obtener su comprensibilidad [4, 6]. 2. Estudiar estos sistemas por otras tcnicas experimentales para su corroboracin y dems anlisis necesarios para su comprensin, como serian rayos X (SAXS) resonancia magntica nuclear (RMN) y microscopia de fuerza atmica (AFM).

3. Estudiar los fenmenos inducidos por la hidratacin en la conformacin y la funcin biolgica de las protenas estudiadas. 4. Preparar una publicacin sobre el tema. Bibliografa: [1] M. M. Teeter, Water-protein interactions. Theory and experiment, Annual Rev. of Biophysics and Biophysical Chem., Vol. 20, pp. 577-600, (1991). [2] W. Saenger, Structure and dynamics of water surrounding biomolecules, Annual Rev. of Biophysics and Biophysical Chem., Vol. 16, pp. 93-114, (1987). [3] C. Nicot, and M. Waks, Proteins as inverted guests of reverse micelles; Conformational effects, significance, applications, Biotechnology & Genetic Engineering Rev., Vol. 13, pp. 267-314, (1995). [4] G, Otting, E. Liepinsh, K. Wthrich, Protein Hydration in Aqueus Solution, Science, Vol. 254, pp. 974-988, (1991). [5] A. Amararene, M. Gindre, J.-Y. Le Hurou, W. Urbach. D. Valdez, and M. Waks. Adiabatic compressibility of AOT [sodium bis(2-ethylhexyl)sulfosuccinate] reverse micelles: Analysis of a simple model based on micellar size and volumetric measurements. Physical Review E. pp. 682-689. Vol. 61, issue1, (2000). [6] D. Valdez, J Y. Le Hurou, M. Gindre, W. Urbach, and M. Waks. Hydration and Protein Folding in Water and in Reverse Micelles: Compressibility and Volume Changes Biophys J. pp. 2751-2760. Vol. 80, No. 6, (2001). [7] R. Garcia and R. Perez. Dynamic atomic force microscopy methods. Surf. Sci. Rep. 47, No 197, (2002).