PROCEDIMIENTO DETECCIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS POR MTODO CONVENCIONAL Seccin Microbiologa de Alimentos 1. OBJETIVO PRT-712.

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Detectar la presencia de Salmonella en los alimentos mediante mtodo cualitativo recomendados por organismos internacionales 2. CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE

Aplicar este procedimiento a todas las muestras de alimentos que de acuerdo a las normativas vigentes en el pas requieran este anlisis. 3. FUNDAMENTO

De acuerdo con las normas internacionales y al reglamento sanitario de los alimentos la sola presencia de Salmonella en un alimento es considerada como causa de rechazo. La tcnica permite realizar compsitos de muestras y segn el nmero de unidades que componen el compsito agregar el caldo de preenriquecimiento manteniendo la proporcin 1:9 a no ser que no est indicado. Para muestras no analizadas sobre una base de peso exacto, referirse a instrucciones para el mtodo especfico. El fundamento del mtodo para la deteccin en alimentos se basa en que la presencia de Salmonella est en menor nmero que el de la flora acompaante especialmente en alimentos sin tratamiento previo o bien que los microorganismos se encuentran estresados por los procesos tecnolgicos a que son sometidos (calor, radiacin, congelacin etc.) En el laboratorio los mtodos convencionales para su recuperacin consideran todos estos factores permitiendo recuperar Salmonella mediante procesos de preenriquecimiento y enriquecimiento en las etapas preliminares y posterior siembra en agares selectivos, realizacin de pruebas bioqumicas y Serotipificacin.

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La etapa de preenriquecimiento recomendada en alimentos para el aislamiento de Salmonella difiere del mtodo empleado en muestras clnicas debido a varios factores entre los cuales estaran: a) El N de clulas es usualmente ms bajo que en muestras clnicas. b) Los procesos tecnolgicos que se aplican a los alimentos debilitan a la bacteria. c) La constitucin propia del alimento: nutrientes, pH, aw, etc. influye en la sobrevivencia o en su multiplicacin. La presencia de substancias txicas para las bacterias presentes en el alimento 4. 4.1 4.2 REFERENCIAS Bacteriological Analytical Methods On line, Diciembre 2007. A.P.H.A. Asociacin Americana de Salud Pblica.-1992. Formules antigeniques des serovars de Salmonella. WHO colaborating centre for reference and research on Salmonella.-Michel y. Popoff and Leon le Minor, Institute Pasteur.28 rue du Dr.Roux 75724. Paris cedex 15, France.1992. Tablas T.L.M. Instituto de Salud Pblica de Chile. 1991. M.E.Valenzuela y J. Astorga. AOAC International. 2000. Official methods of analysis, 18th ed., Methods 967.25, 967.26, 967.27, 967.28, 978.24, 989.12, 991.13, 994.04, and 995.20. A.O.A.C, md. International, Gaithersburg. TERMINOLOGA

4.3 4.4

5.

No Aplica 6. 6.1 MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS EQUIPOS

6.1.1 Bao termoregulado a 42 y 43 0,2C. 6.1.2 Incubadora a 35C +/- 2C. 6.1.3 Vortex mixer

6.2

MATERIAL DE LABORATORIO

PROCEDIMIENTO DETECCIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS POR MTODO CONVENCIONAL Seccin Microbiologa de Alimentos 6.2.1 Placas Petri de 15x100mm 6.2.2 Pipetas estriles de 5m con 0.1vol, 1mL con 0.01 vol L 6.2.3 Asa de nicrn (aprox. de 3mm de dimetro). 6.2.4 Tubos estriles de 16x160 mm. 6.2.5 Mondadientes de madera o asa de vidrio 6.2.6 Mecheros Bunsen 6.2.7 Frascos de capacidad 300 mL. 6.3 6.3.1 6.3.2 6.3.3 6.3.4 6.3.5 6.3.6 6.3.7 6.3.8 6.3.9 6.3.10 6.3.11 6.3.12 6.3.13 6.3.14 6.3.15 6.3.16 6.3.17 6.3.18 6.3.19 MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS Caldo Rappaport Vassiliadis (RV) Caldo base Tetrationato (T.T) Agar Xilosa Lisina-Desoxicolato (XLD agar) Agar Bismuto Sulfito(B.S.) Agar Hektoen (HK) Agar Triple azcar (TSI) Lisina Iron Agar (LIA) Agar Movilidad Indol Ornitina (MIO) Agar citrato Simmon's Caldo Urea Caldo malonato PRT-712.03-012

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Caldo con indicador para carbohidratos (Glucosado ,Lactosado Sacarosado) Solucin de verde brillante al 1% Solucin de yodo yodurada Etanol 70% Novobiocina al 1% esterilizada por filtracin Reactivo Kovac's Control positivo: Cepa Salmonella enteritidis ATCC 13076 Control atpico: Cepa Salmonella typhimurium H2S negativa Salmonella enteritidis subespecie diarizonae Lactosa positiva y H2S positiva.

PROCEDIMIENTO DETECCIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS POR MTODO CONVENCIONAL Seccin Microbiologa de Alimentos 6.3.20 6.4 PRT-712.03-012

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Cepa Control negativo: S. aureus

DISTRIBUCIN DEL ENVASADO DE LOS MEDIOS Caldo Base Tetrationato (T.T) que se prepara a partir del medio base comercial en tubos tapa rosca (10ml) al que se le agrega por tubo al momento de ser usado 0,2 mL de solucin de yodo yodurado y 0,1 mL de solucin de verde brillante al 1%. Caldo Rappaport Vassiliadis Modificado (CRV.) Se prepara a partir del medio comercial en tubos tapa rosca (10 mL).

6.4.1 CALDO DE ENRIQUECIMIENTO 6.4.1.1

6.4.1.2

6.4.2 MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS SLIDOS 6.4.2.1 6.4.2.2 6.4.2.3 Agar Hektoen Agar Xilosa Lisina Dexocicolato (X.L.D) (1,2 mL de novobiocina al 1% x litro). Agar Bismuto Sulfito comercial y distribuido en 20 mL en placas Petri.

6.4.3 MEDIOS DIFERENCIALES SLIDOS 6.4.3.1 6.4.3.2 6.4.3.3 6.4.3.4 Triple Sugar Agar (TSI) distribuir 4 mL en tubos tapa rosca. Lisina Iron Agar (LIA) distribuir 4,5 mL en tubos tapa rosca. Agar Movilidad Indol Ornitina (MIO) distribuir 3 a 4 mL en tubos tapa rosca. Agar Citrato Simmon's distribuir 3 mL en tubos semitendido.

6.4.4 MEDIOS DIFERENCIALES LQUIDOS 6.4.4.1 6.4.4.2 Caldo malonato de Na, distribuir 2,5 ml en tubo tapa rosca. Caldos base para carbohidratos: distribuir 5 ml en tubos y agregar el carbohidrato mantenido en soluciones al 10 %: glucosa, lactosa, sacarosa, y eventualmente otros azcares como sorbitol. Caldo Urea, distribuir 1,5 a 3,0 mL en tubos tapa rosca de 13 x 10 mm.

6.4.4.3

6.4.5 SUEROS 6.4.5.1 6.4.5.2 Suero Polivalente Somtico para Salmonella Poly A-I (DIFCO) Suero polivalente flagelar.

PROCEDIMIENTO DETECCIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS POR MTODO CONVENCIONAL Seccin Microbiologa de Alimentos 7. 7.1 7.1.1 7.1.2 DESARROLLO PRT-712.03-012

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En el laboratorio Enterobacteriaceae se reciben las muestras homogeneizadas desde el laboratorio Recepcin de muestras. Anotar en cuaderno de Inscripcin del laboratorio de Enterobacteriaceae la clave y nmero de las muestras. Someter a incubacin la muestra en caldo de preenriquecimiento a 35 C por 18-24 horas para continuar con el proceso. * Nota: En el caso de las muestras que deben traspasarse a caldo de enriquecimiento previo a un da feriado, el caldo de preenriquecimiento incubado se guarda en refrigeracin hasta por 72 horas.

7.1.3

Despus de la incubacin por 18 horas a 35C sembrar el caldo de preenrequecimiento en los medios lquidos de enriquecimiento distribuidos en cantidades de 10 mL en tubos de 16x160mm con tapa rosca e identificados con el nmero y la clave correspondiente antes de ser inoculados. Sellar la bolsa con calor. Eliminar para su incineracin en bolsas rojas. Inocular 1 mL en caldo Tetrationato reconstituido al momento de usarse agregando 0,2 por 10 mL de solucin de yodo y 0,1 por 10 mL de verde brillante al 1%. Inocular 0,1 mL en caldo Rappaport Vassiliadis (C.R.V.)

7.1.4 7.1.5 7.1.6

7.2 7.2.1

INCUBACIN DE LOS MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO Alimentos con una carga microbiana alta. Incubar el caldo RV 24 2 horas a 42 0,2 C en bao de agua con agitacin. Incubar el caldo TT 24 2 horas a 43 0,2 C, en bao de agua con agitacin. Alimentos con una carga microbiana baja. Incubar el medio RV 24 2 horas a 42 0,2 C en bao de agua con agitacin. Incubar el caldo TT 24 2 horas a 35 2C.

7.2.2

7.3 7.3.1

SIEMBRA EN AGARES SELECTIVOS Con lpiz azul, marcar las placas en que se siembra a partir de caldo Tetrationato y con lpiz negro marcar las placas en que se siembra a partir de caldo Rappaport.

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Sembrar cada uno de los caldos con los cultivos en: una placa de Agar X.L.D/N (xilosa-lisina-dexocicolato/novobiocina); una placa de Agar Bismuto Sulfito (plaqueado el da antes y guardadas en oscuro a la temperatura ambiente) y una placa de Agar Hektoen. Cada tubo de caldo de enriquecimiento se debe vortear y con asa de 3 mm (inculo10 l) extraer una asada e inocular las placas identificadas con negro y azul segn caldo a sembrar. Inocular el Agar Hecktoen en forma de estras y sin flamear el asa, agotar el inculo en el agar X.L.D./N; extraer otro inculo con el asa y sembrar el Agar Bismuto sulfito. Incubar las placas invertidas con la parte inferior hacia arriba a 35C .0,5 por 24 horas y realizar la lectura. Si las placas de agar Bismuto sulfito no presentan desarrollo o este es escaso incubar por 24 horas ms. Ordenar segn clave y nmero consecutivo para su lectura. Anotar resultados en registro RG-712.00-072.

7.3.3

7.3.4 7.3.5 7.3.6 7.3.7 7.3.8

7.4

INTERPRETACIN DE LA LECTURA DE AGARES SELECTIVOS

7.4.1

Agar Hektoen (HK.) Colonias azul-verdes a colonias azules con o sin centros negros. Muchos cultivos de Salmonella pueden producir colonias con centros grandes, brillantes negros o pueden aparecer como colonias casi completamente negras Algunos cultivos atpicos de Salmonella producen colonias amarillas con o sin centros negros.

PROCEDIMIENTO DETECCIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS POR MTODO CONVENCIONAL Seccin Microbiologa de Alimentos 7.4.2 PRT-712.03-012

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Agar Xilosa Lisina Desoxicolato/novobiocina (XLD). Colonias rosadas con o sin centros negros. Muchos cultivos de Salmonella pueden producir colonias con centros grandes, brillantes negros o pueden aparecer como colonias casi completamente negras. Excepciones: serotipos S. paratyphi A y S. choleraesuis, pueden dar colonias transparentes sin centro negro; algunos cultivos atpicos de Salmonella producen colonias amarillas con o sin centros negros. Agar Bismuto Sulfito (B.S) Colonias marrn, color gris, o colonias negras; a veces tienen un brillo metlico y el medio circundante es por lo general marrn al principio, pero puede virar a negro con el tiempo que la incubacin aumenta, produciendo el efecto de halo supuesto. Atpicamente algunas veces se producen colonias verdes con oscurecimiento pequeo o ninguno del medio circundante. Si las colonias tpicas o sospechosas no se detectan sobre el agar B.S despus de 24 2 horas, entonces, no escoja ninguna colonia y reincubar de nuevo por 24 2 horas. Si hay colonias tpicas presentes sobre el agar despus de 24 2 horas de incubacin, entonces escoger 2 o ms colonias y reincubar de nuevo el agar por 24 2 horas. repicar 2 colonias o ms tpicas del agar B.S, solamente si las colonias escogidas incubadas por 24 2 horas dan reacciones atpicas en hierro triple de azcar agar (TSI) y agar lisina (LIA) y que ocasione que el cultivo halla sido desechado como Salmonella.

7.4.3

7.4.4

CONTROLES: Salmonella enterica subespecie enterica y control negativo (S aureus). En BAM on line 2007 se recomienda incorporar cepas control de Salmonella atpicas como: Salmonella diarizonae ATCC 12325, lactosa positiva y H2S positiva, Salmonella abortus equi ATCC 9842, lactosa negativa y H2S negativa, Salmonella diarizonae ATCC 29934 lactosa positiva y H2S negativa. La Seccin de Microbiologa de Alimentos del ISP, dispone de Salmonella typhimurium H2S negativa, Salmonella enteritidis subespecie diarizonae Lactosa positiva y H2S positiva, para ser usadas como control atpico.

7.5 7.5.1

IDENTIFICACION BIOQUMICA Traspasar 2 a 3 colonias por placa, con un mximo de 5 colonias a cada uno de los tres medios de cultivo: Agar TSI, semi-inclinados (fondo de unos 3 cm y superficie de 2 cm.),

7.5.1.1

PROCEDIMIENTO DETECCIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS POR MTODO CONVENCIONAL Seccin Microbiologa de Alimentos 7.5.1.2 7.5.1.3 7.5.2 7.5.3 PRT-712.03-012

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Agar LIA semi inclinados (fondo de 4 cm de alto debido a que la descarboxilacin de la lisina es estrictamente anaerobio) y Agar MIO Marcar los tubos identificando la procedencia del caldo de aislamiento (lpiz azul caldo Tetrationato y lpiz negro caldo Rappaport). Toque ligeramente el centro de la colonia escogida con la aguja estril de inocular e inocule el TSI rayando la inclinacin y picando el fondo; sin quemar, inocule el LIA por picado del fondo dos veces y luego rayando la inclinacin. Incubar los tubos con las tapas sin apretar para mantener condiciones aerbicas en la incubacin y as prevenir la produccin excesiva de H2S. En el caso del TSI, incubar un poco inclinado para evitar la produccin excesiva de gas. Sembrar en picadura con asa aguja los tubos de agar Movilidad Indol Ornitina (M.I.O) cuidando no mover la aguja del asa para no romper el agar y poder leer bien la movilidad. Guardar las placas de agar selectivo a 5-8 C. Incubar TSI, LIA y MIO a 35 C +/- 1C por 24 +/- 2 horas. Alternativamente se pueden utilizar kit bioqumicos comerciales aprobados por AOAC como API 20 E, Enterotubo II, Enterobacteriaceae, Micro-ID o Vitek GNI, para identificacin presuntiva. Los kit comerciales no deben ser utilizados como sustituto de los test serolgicos.

7.5.4

7.5.5 7.5.6 7.5.7

7.6 7.6.1 7.6.2 7.6.3 7.6.4 7.6.5 7.6.6

LECTURA. Y BASE DE LAS REACCIONES BIOQUIMICAS Salmonella tpica en agar TSI produce la inclinacin alcalina (roja) y el fondo cido (amarillo), con o sin la produccin de H2S (ennegrecimiento de agar). En LIA, produce la reaccin alcalina (prpura) en el fondo del tubo. Considere el amarillo en el fondo de tubo como la reaccin cida (negativa). No eliminar cultivos en los que se produce la decoloracin en el fondo del tubo nicamente. La mayor parte de los cultivos de Salmonella producen H2S en LIA. Algunos cultivos que no son Salmonella producen una reaccin roja ladrillo en inclinaciones de LIA (Deaminacin de la lisina). Todos los cultivos que dan el fondo alcalino (azul) en LIA, independientemente de la reaccin de TSI, deberan ser considerados como potencial Salmonella. Aislar y someter a bioqumica y pruebas de serolgicas.

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Las cultivos que dan el fondo cido en LIA (Amarillo) y una inclinacin alcalina (azul) y el fondo cido en TSI, tambin deberan ser consideradas como potencial Salmonella y debera ser subcultivada. Pruebas de cultivos positivos en TSI proseguir para determinar si ellos son de la especie de Salmonella, incluyendo S. Arizonae. Si los cultivos de TSI no logran dar reacciones tpicas para la Salmonella (inclinacin alcalina y fondo cido) escoger colonias adicionales sospechosas de placas de medio de cultivos selectivo de supuestas-positivas e inocular TSI y LIA Aplicar pruebas de identificacin bioqumicas y serolgicas. Examinar un mnimo de 6 cultivos de TSI por cada 25 g de la unidad analtica o cada 375 g del compuesto, provenientes de ambos caldos de enriquecimiento. Si los cultivos en TSI son mixtos, se recomienda reaislar en agar XLD, Hecktoen o Mac Conkey, en este ltimo las colonias tpicas se observan, transparentes incoloras, con o sin centro negro y pueden presentar un halo de precipitacin biliar causado por otros microorganismos.

7.6.8 7.6.9

7.6.10 7.6.11

7.7 7.7.1

INTERPRETACION DE ACUERDO A LOS CAMBIOS DE LOS TRES MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS AGAR TSI La lectura empleada universalmente es la siguiente: K= Cambio debido a alcalinizacin (rojo) A= Cambio debido a la produccin de cido Lectura: Fermentacin de la Glucosa: fondo amarillo y tendido rojo. Informar K/A Fermentacin de la Lactosa y/o Sacarosa: Tendido Amarillo.informar A/A K Produccin de Gas: Ruptura del agar. Informar la produccin de gas de 1 a 3 cruces (+). Produccin de H2S: Ennegrecimiento del medio que puede ser de intensidad variable. Informar la presencia de 1 a 3 cruces (+)

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Ejemplo registro de informe de laboratorio: K/A +,+++

N del tubo TSI Fermentacin de glucosa Fermentacin Lactosa/o sacarosa Produccin de H 2S Ejemplos tpicos

1 -

2 + -

3 + +
Citrobacter Salmonella Edwarsiella Proteus

4 -4A + + E.coli Enterobacter Klebsiella

5 + + +++
E. coli H2S + Salmonella lactosa positiva

Pseudomonas Morganella Providencia Shigella

Tubo 4

Abundante gas evidenciado por ruptura de agar

7.7.2

AGAR LISINA IRON AGAR (L.I.A) Interpretacin de los cambios decarboxilacin de la lisina: Positivo: Fondo color morado (Descarboxilacin) el tubo azul. Informar K / K. Se forma amino cadaverina la cual causa que el indicador de pH prpura de bromocresol cambie a

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color violeta. Como la decarboxilacin solamente ocurre en medio cido (bajo pH 6) el cultivo es acidificado por la fermentacin de la glucosa. Negativo: el fondo amarillo. Informar K/ A Desaminacin de la lisina: positivo: el tendido rojo. Informa R/A. La deaminacin de la lisina produce -cido ketocarboxlico compuesto que reacciona con la sal de yodo presente en el medio, bajo la influencia del oxgeno y forma compuestos caf rojizo.

Correspondencia por numero Desaminacin de la lisina(rojo oscuro en tendido) Decarboxilacin de Lisina Fermentacin de glucosa Ejemplos tpicos

1 -

2 +

3 -

4* -

+ + + + + Citrobacter Proteus E.coli. Salmonella Providencia Enterobacter Edwarsiella Morganella *H2S positivo usualmente positivas en Salmonella y Edwarsiella se muestra en el tubo 4. El LIA no es un indicador de la produccin de H2S como TSI o Kligler

7.7.3

AGAR MIO Se usa para identificacin de Enterobacterias sobre la base de: MOVILIDAD, actividad de ORNITINA DESCARBOXILASA y la produccin de INDOL.

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Movilidad: se demuestra por un enturbamiento del medio o por un crecimiento en que el cultivo difunde desde la lnea de inoculacin. Los cultivos no mviles crecen solo a lo largo de la lnea de inoculacin. Ornitina: Los cultivos negativos a Ornitina se mantienen amarillos y a veces en la parte superior pueden ser prpura. Produccin de Indol a partir del triptofano se detecta con el aldehdo presente en el reactivo de Kovacs, que se aade despus de la lectura de Ornitina y Movilidad.

Numero Correspondiente en Pares Deaminacin de la ornitina (alcalino en aerobiosis) Movilidad Decarboxilacin de ornitina Produccin de indol Fermentacin de la glucosa Ejemplos tpicos

1 + + + Klebsiella oxytoca

2 + + + + Enterobacter aerogenes

3 + + + + + Escherichia coli

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7.7.4

Tabla TLM INTERPRETACIN DEL GNERO SALMONELLA BASADO EN TRES MEDIOS DE CULTIVOS: AGA TSI, LIA y MIO. (M.E. Valenzuela, J. Astorga, ISP 1991. L.I.A GAS H2S K/K + K/K K/K K/K K/A + + + + + + + + Mov IndolOrnitina. + + + + + + + + + + + + + + + + Microorganismo Salmonella subespecie I Otras Salmonella Salmonella choleraesuis. Otras Salmonella Salmonella thyphi. Salmonella .typhi Salmonella sp. Salmonella.Paratyphi A Salmonella.Paratyphi A Salmonella.typhi (excepcin) Salmonella subg.3 (Arizona) Salmonella sub-especie I y Salmonella .sub especie III (Arizona) Salmonella. sp. y Citrobacter freundi

T.S.I GAS H2S K/A K/A + K/A +

K/A K/A +

K/A K/A + A/A, +, + K/A + + K/A + +

K/A K/A K/K, + K/ K + K/A +

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7.7.5

PRUEBAS BIOQUMICAS COMPLEMENTARIAS

7.7.5.1 En casos de duda se puede ampliar la batera con las pruebas sealadas en el Anexo N 2. 7.7.5.2 Si la combinacin de los tres medios corresponde al Gnero Salmonella, inocular 2 tubos de agar base sangre triptosa sin sangre, tendido en estra e incubar 18 hrs. para realizar estudio serolgico. 7.8 7.8.1 7.8.2 SEROLOGA Confirmar con suero polivalente somtico y suero polivalente flagelar (Anexo N 5) Enviar para confirmacin serolgica al "Centro de Referencia de Enterobacterias del I.S.P. INFORME DE RESULTADOS En caso de no detectar Salmonella se informa Negativo en 25 o 50 g. En caso de deteccin de Salmonella, informar el Gnero y grupo somtico o Serotipo y/o por el biotipo, s la cepa autoaglutina. REGISTROS Tiempo retencin y disposicin Almacenar por 5 aos y luego eliminar en la basura picado en trozos Almacenar por 5 aos y luego eliminar en la basura picado en trozos

7.9 7.9.1 7.9.2

8.

Identificacin Almacenamiento Proteccin Recuperacin del registro RG-712.00-072 Archivador Registro Libre Papel Registro de resultados de lectura e informe acceso anlisis de Coliformes, de resultados. personal de E. coli y Salmonella en Laboratorio 348 Microbiolog muestras de alimentos a de Alimentos RG-712.00-050 Archivador registro Libre Papel Registro control de cepas control acceso ambiente Laboratorio incubadoras personal de Enterobacterias laboratorio 348 Microbiolog a de Alimentos

PROCEDIMIENTO DETECCIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS POR MTODO CONVENCIONAL Seccin Microbiologa de Alimentos 9. TABLA DE MODIFICACIONES Pg. Modificada 1 3 3 3 3 4 5 5 5 5 7 7 7 8 8 8 8 9 9 9 9 9 9 10 14 Motivo del cambio Cambio formato actual Se agrega d) Se elimina la palabra REFERENCIA por estar repetida Se actualiza referencia AOAC Se incluye baos termoregulados a 42 y 43 C. Se cambia agar base Urea por Caldo Urea Se elimina letra y entre 6.4.2.2 y 6.4.2.3 Se agrega recomendacin Se elimina 6.4.3.5 Se agrega 6.4.4.3 Se corrige indicaciones de incubacin de agares selectivos. Se corrige N de registro. Se escribe Salmonella en cursiva Se incluye recomendacin de uso de cepas atpicas. Se cambia redaccin en 7.5.1, 7.5.2, 7.5.3, 7.5.4 y 7.5.5, quedando como 7.5.1, alterndose la numeracin siguiente Se corrige condiciones de tendido de agar TSI Se cambia H2S por H2S En 7.5.7 se agrega recomendacin Se corrige tiempo de incubacin. Se cambia H2S por H2S Se escribe Salmonella en cursiva En 7.6.10, se agrega frase. Se agrega 7.6.11 Se cambia H2S por H2S Se elimina item 9.0 PRT-712.03-012

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Revisin N 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Fecha Aprobacin 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009

PROCEDIMIENTO DETECCIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS POR MTODO CONVENCIONAL Seccin Microbiologa de Alimentos Revisin N 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Pg. Modificada 14 14 16 17 17 17 17 17 17 17, 18 y 19 PRT-712.03-012 Motivo del cambio Em 7.8.1 se agrega Ver anexo 5 Se cambia indicacin del medio a usar. Corrige tiempo de incubacin en el esquema. Se cambia agar por caldo. Se agrega temperatura de incubacin. Se agrega una observacin Se agrega una opcin para el test de urea. Se cambia redaccin Se escribe Salmonella en cursiva Se corrige anexo 2 dando a las pruebas el orden establecido por el BAM. En el punto b) Rojo fenol, c) pruebas derivadas de caldo triptona en VP, rojo metilo y citrato se hacen algunas correcciones de contenido y de redaccin. Se escribe Salmonella en cursiva Se hacen correcciones en los puntos 2, 3 y 5 de la letra a) Se escribe Salmonella en cursiva Se eliminan tabla 1, esta repetida la informacin en la tabla 1 del BAM On line Se agrega referencia a la tabla Se agrega referencia a la tabla Se realiza correccin en punto 2 y cambio de redaccin en puntos 3 y 5. Se agrega una instruccin despus del primer prrafo.

Fecha emisin: 23-08-2002 Revisin: 5 Fecha revisin: 30-03-2009 Pgina 16 de 26 Fecha Aprobacin 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009

5 5 5 5 5 5 5 5

18 y 19 25 26 21 22 23 25 26

30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009 30-03-2009

PROCEDIMIENTO DETECCIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS POR MTODO CONVENCIONAL Seccin Microbiologa de Alimentos 10. ANEXOS PRT-712.03-012

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Anexo N 1 Esquema de trabajo Anexo N 2 Pruebas complementarias para la identificacin de Salmonella Anexo N 3 Tabla 1 BAM On line Diciembre 2007 reacciones bioqumicas y serolgicas de Salmonella y Tabla 2 BAM On line Criterios parta descartar las cepas que no sean Salmonella. Anexo N 4 Caracteres diferenciales de especies de Salmonella y Subespecies. Anexo N 5 Serologa de Salmonella (BAM online 2007)

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ANEXO N 1 Pesar y agregar caldo prenriquecimiento (25 g +225 mL (o 50g + 450 mL ) Homogeneizar 2 minutos. Dejar reposar 60 5 min. Tomar PH y ajustar. Incubar la bolsa a 35C por 18-24 horas. Inocular 1 mL Caldo Tetrationato Verde brillante Incubar18-20 hrs a 42C 1C (Marcar Las Placas Con Azul) 0,1 mL Caldo Rappaport modificado Incubar 24-48 hrs. a 42- 1C ( Marcar Las Placas Con Negro.)

Incubar 24 a 48 horas a 35 C.

Incubar por 24 horas a 35 C

Lectura de placas Inocular colonias sospechosas en agar T.S.I., L.I.A y M.I.O Incubar 24 h a 35C Lectura tubos Pruebas diferenciales Confirmacin serolgica Informe de resultado

PROCEDIMIENTO DETECCIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS POR MTODO CONVENCIONAL Seccin Microbiologa de Alimentos PRT-712.03-012 ANEXO N2

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PRUEBAS COMPLEMENTARIAS PARA LA IDENTIFICACION DE SALMONELLA (CULTIVOS PUROS) PRUEBA DE UREASA (CONVENCIONAL). Con la aguja estril, inocule el crecimiento de cada cultivo de la inclinacin de TSI positiva en los tubos de caldo urea. Si los tubos inoculados de agar urea viran a prpuras (la prueba es positiva); incluir tubos no inoculados de este agar como control, a veces este medio vira a prpura sin ser inoculado. Incubar 24 2 h a 35C. Opcionalmente se puede realizar el test de Caldo Urea Rpido, se siembra 2 asadas de cultivo, con asa de 3 mm y se incuba 2 horas en bao de agua a 37C +/- 0,4 C. Deseche todos los cultivos que dan la prueba positiva. Conserve para el estudio posterior todos los cultivos que dan la prueba negativa (ningn cambio en color en el medio). Los cultivos puros que resulten urea negativos pueden ser sometidos a las siguientes pruebas: a) Caldo lisina descarboxilasa: Si los resultados en LIA fueron satisfactorios no necesita ser repetido, si por el contrario los resultados en LIA han sido dudosos, inocular el caldo Lisina con cultivo proveniente de TSI e incube por 48 +/- 2 horas a 35C, pero examinar a las 24 horas. La especie de Salmonella causa la reaccin alcalina indicada por el color prpura en todas partes del medio. La prueba negativa es indicada por el color amarillo en todas partes del medio. Si el medio no aparece decolorado (ni prpura ni amarillo) aadir unas gotas de prpura bromocresol 0.2 % y releer las reacciones del tubo. b) Caldo rojo fenol dulcitol al 0.5 %. Inocular el caldo con cultivo de TSI. Incubar 48 2 h en 35C, examinar despus de 24 h. La mayor parte de especies de Salmonella da la prueba positiva, indicada por la formacin de gas en el interior del tubo de fermentacin y pH cido (amarillo) del medio. La produccin de cido puede interpretarse como reaccin positiva. El test negativo esta indicado por ninguna formacin de gas en el interior del tubo de fermentacin, y no hay variacin en el color rojo (con el fenol rojo como indicador) o prpura (con bromocresol prpura como el indicador).

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c) Caldo Triptona (o triptofano). Inocule el caldo con inoculo proveniente del agar TSI. Incube 24 2 h en 35C. Prueba de Indol: Transfiera 5 mL de cultivo a un tubo de ensayo limpio y estril. Aada 0.2-0.3 mL el reactivo de Kovacs. Los cultivos de Salmonella dan la prueba negativa (la carencia de color profundo rojo en la superficie de caldo). Registre los tonos intermedios de naranja y rosado como +/-. Caldo Malonato. Transfiera una asada de 3 mm del cultivo proveniente de caldo triptona a caldo malonato. Incluir un tubo no inoculado como control debido a que ocasionalmente los tubos no inoculados de caldo malonato viran azules (prueba positiva). Incube 48 2 h en 35C, examinar a las 24 h. La mayor parte de los cultivos de especie de Salmonella dan la prueba negativa (verde o inalterado). Caldo Cianuro de Potasio (KCN). Transfiera una asada de 3 mm del cultivo proveniente de caldo triptona a caldo KCN. Incube 48 2 h en 35C, examinar a las 24 h. Interprete el crecimiento (indicado por la turbiedad) como positivo. La mayor parte especie de Salmonella no crece en este medio, indicado por la carencia de turbiedad.

Si hasta ahora no se ha realizado las pruebas serolgicas, estas deben ser realizadas en este punto. (Ver anexo 5) Pruebas complementarias en caso de reacciones no tpicas de Salmonella. Realice las siguientes pruebas adicionales sobre cultivos que no dan reacciones tpicas de Salmonella para pruebas descritas en la Tabla 1 (ver anexo 3) y que por consiguiente no clasifica como Salmonella. a) Caldo de Lactosa Rojo Fenol o Caldo de lactosa prpura bromo cresol: Del TSI, inocular el caldo con una pequea cantidad de cultivo. Incubar 48 2 h en 35C, examinar despus de 24 h. Positivo - produccin cida (amarillo) y produccin de gas en tubo de fermentacin interior. Considerar la sola produccin de cido como reaccin positiva. La mayor parte de cultivos de Salmonella dan resultado negativo de prueba, indicado por ninguna formacin de gas en el interior del tubo de fermentacin y rojo (cuando el rojo fenol es el indicador) o prpura (con prpura bromocresol como indicador) en todas partes del medio. b) Caldo Rojo Fenol o prpura bromo cresol sacarosa: Descartar como no Salmonella, los cultivos que dan pruebas de sacarosa positivas, excepto aquellos que dan cido en la inclinacin del TSI y reacciones positivas en el LIA

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c) Caldo MR-VP. Inocular el medio con la pequea cantidad de crecimiento de cada inclinacin de TSI clasificada sospechosa de Salmonella. Incube 48 2 h en 35C. Vogues-Proskauer (VP) Realizar a temperatura ambiente de la siguiente manera: Transfiera 1 mL de 48 h de cultivo un tubo de ensayo limpio e incube el resto del caldo un tiempo adicional de 48 h en 35C. Agregar 0,6 mL alfa-naftol y agitar bien. Agregue 0,2 mL de solucin KOH al 40 % y agitar bien. Para intensificar y apresurar la reaccin, agregue unos cristales de creatina. Resultados ledos despus de 4 h; el desarrollo de color rosado- rojo en todas partes del medio es la prueba positiva. La mayor parte cultivos de Salmonella son VP Negativas, indicadas por la ausencia de desarrollo de color rosado-rojo en todas partes del caldo. Rojo metilo: A 5 mL de cultivo de 96 horas del caldo VP, agregue 5-6 gotas del indicador rojo metilo. La mayor parte cultivos de Salmonella da la prueba positiva, indicada por el color rojo difuso en el medio. Un color distinto, como el amarillo es la prueba negativa. Descartar, como Salmonella, los cultivos que no dan positivo:

d) Agar Citrato Simmon's: Inocular este agar usando aguja de inoculacin con cultivo proveniente de agar TSI no clasificado. Inocular rayando la inclinacin y picando el extremo. Incubar 96 2 h en 35C. Lectura: Positivo - presencia de crecimiento, por lo general acompaado por cambio en color de verde a azul. La mayor parte cultivos de Salmonella son citrato - positivas. Negativo - ningn crecimiento o muy poco crecimiento y ningn cambio en color. Descartar por no pertenecer a Salmonella, los cultivos que dan pruebas de lactosa positivas, excepto los cultivos que presentan inclinaciones cidas TSI y reacciones positivas en LIA, o los cultivos que dan reacciones positivas al caldo malonato. Realice posteriormente ms pruebas sobre estos cultivos para determinar si ellos son S. arizonae. Clasificar como Salmonella a los cultivos que tienen el modelo de reaccin de la Tabla1 (ver anexo 3). Descartar, como no perteneciente a Salmonella, los cultivos que den cualquiera de los resultados presentados en la Tabla 2 (ver anexo 3). Cultivos que no han sido claramente clasificados, pueden ser sometidos a pruebas adicionales de clasificacin de enterobacterias de Edwards y de Ewing.

PROCEDIMIENTO DETECCIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS POR MTODO CONVENCIONAL Seccin Microbiologa de Alimentos PRT-712.03-012 ANEXO N 3

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Tabla 1. Reacciones bioqumicas y serolgicas Salmonella BAM on line Diciembre 2007 Test o substrato Resultado Salmonella especies Positivo Negativo reaccin(a) 1. Glucosa (TSI) Fondo amarillo Fondo rojo + 2. Lisina decarboxilasa Fondo prpura Fondo amarillo + (LIA) 3. H2S (TSI y LIA) ennegrecimiento Sin ennegrecimiento + 4. Ureasa Color rojo prpura Sin cambio de color 5. Caldo Lisina Color prpura Color amarillo + decarboxilasa 6. Caldo Rojo fenol Color amarillo y/o Sin gas; sin cambio +(b) dulcitol gas de color 7. KCN caldo desarrollo Sin desarrollo (c) 8 Caldo. Malonato Color azul Sin cambio de color 9. Indol test Color rojo en Color amarillo en superficie superficie 10. test Polivalente aglutinacin Sin aglutinacin + flagelar 11 test. Polivalente aglutinacin Sin aglutinacin + somtico 12. Caldo lactosa rojo Color amarillo y/o Sin gas; sin cambio -(c) fenol gas de color 13. Caldo sacarosa rojo Color amarillo y/o Sin gas; sin cambio fenol gas de color 14. Test VogesColor Rosado a rojo Sin cambio de color Proskauer 15. Rojo metilo test Color rojo difuso Color amarillo difuso + 16. Citrato Simmons Crecimiento ; Color No crece ; no cambia v azul de color a +, 90% mas positivo en 1 o 2 das; -, 90% o mas negativo en 1 o 2 das; v, variable. b Mayora de cultivos de S. arizonae son negativos c Mayora de cultivos de S. arizonae son positivos.

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Table 2. Criterios para descartar las cepas que no son Salmonella BAM online Diciembre 2007 Test o substrato Resultados 1. Ureasa positivo (color prpura ) 2. Test Indol positivo (color rojo en superficie) y Polyvalente flagelar (H) test; negativo (no aglutina) O Test Indol positivo (rojo en superficie) y Spicer-Edwards flagelar test negativo (no aglutina) 3. Lisina decarboxilasa y caldo KCN 4. Caldo lactosa Rojo fenol 5. Caldo sacarosa Rojo fenol negativo (amarillo) positivo (crecimiento) positivo(amarillo y/o gas)(a), (b) positivo(amarillo y/o gas)(b)

positivo (crecimiento)) 6. Caldo KCN positivo (rosado a rojo) test Voges-Proskauer, negativo (color amarillo difuso) y test Rojo metilo Caldo de cultivo malonato positivo es necesario determinar si no es S. arizonae. b No descartar los caldos de cultivo positivos, si los cultivos correspondientes a LIA y que dan reacciones tpicas de Salmonella; realizar test adicionales para determinar si hay Salmonella especies.

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ANEXO N 4 Caracteres diferenciales de especies de Salmonella y Subespecies* SALMONELLA ENTRICA SUBESPECIE entrica salamae arizonae diarizonae houtenae indica S. BONGORI

Dulcitol + + d + ONPG(2h) + + d + Malonato + + + Gelatinasa + + + + + Sorbitol + + + + + + Cultivo en + + KCN L(+)-tartrato(a) + Galaturonate + + + + + (*) + + + + + + Yglutamyltrans ferasa Bd d + d glucoronidasa Mucato + + + - (70%) + + Salicina + Lactosa - (75%) + (75%) d Lisis por fago + + + + d O1 Habitat usual Animales de Animales de sangre fra y ambientales sangre caliente (a) d-tartrato (*) Typhimurium d, Dublin + 90% o ms reacciones positivas - 90% o ms negativas d Diferentes reacciones dadas por distintas serovariedades *Formules antigeniques des serovars de salmonella 1997 Michel Popoff et L .LeMinor pag 12

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ANEXO N 5 SEROLOGIA DE Salmonella (BAM online 2007) Antgeno Somtico. (O) a) Prueba (O) polivalente somtica. 1) Usar lpiz de cera, separar 2 secciones aproximadamente de 1 x 2 cm cada una sobre el interior lamina o placa Petri (15 x 100 milmetro). Hay diapositivas en el comercio que pueden ser usadas. 2) Emulsionar 3 milmetros de cultivo de 24-48 h de la inclinacin de TSI, o preferentemente, de agar base triptosa sangre sin sangre diluida en 2 mL de solucin salina al 0.85 %. 3) Colocar 1 gota de suspensin del cultivo en la parte superior de cada seccin rectangular marcada con barra de lpiz y una gota de solucin salina en la parte inferior de una seccin, 1 gota de antisuero Salmonella polivalente somtico (O) en otra seccin aislada. 4) Con mondadientes o asa limpia y estril, mezclar la suspensin de cultivo con la solucin salina en una seccin y repetir para la otra seccin que contiene el antisuero. 5) Mezclar en vaivn de atrs y adelante durante 1 minuto y observar contra el fondo oscuro con buena iluminacin. Considerar cualquier grado de aglutinacin una reaccin positiva. 6) Clasificar resultados de la prueba con polivalentes somticos: Positivo: aglutinacin en mezcla de prueba; ninguna aglutinacin en control de salina. Negativo: ninguna aglutinacin en mezcla de prueba; ninguna aglutinacin en control de salina. No especfico: aglutinacin en prueba y en mezclas de control. b) Pruebas de grupo somticas (O). Ensayar usando grupos individuales de antisueros somticos(O) con inclusin de antgeno Vi, si esta disponible, en lugar de Salmonella antisuero polivalente somtico (O). Para el tratamiento especial de cultivos que dan la reaccin de aglutinacin positiva Vi, refirase al seg.. 967.28B en los Mtodos Oficiales de Anlisis (FDA). Los cultivos que dan la aglutinacin positiva con el antisuero individual somtico (O) se registra como positivo para aquel grupo. Las cultivos que no reaccionan con el antisuero individual somtico (O) se registran negativo para aquel grupo.

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Los cultivos que contienen antgenos de Salmonella demostrables como el test flagelar (H) positivo, pero que no tienen las caractersticas bioqumicas de Salmonella deberan ser purificadas y probadas de nuevo.

Antgeno flagelar polivalente (H). Inocule el crecimiento de cada TSI ureasa negativo en Caldo BHI e incubar 4-6 h en 35C antes de que el crecimiento visible ocurra (para probar el mismo da); o en Caldo tripticasa e incubar 24 2 h a 35C. Agregar 2,5 mL de de solucin salina fisiolgica formalizada a cada uno de los caldos incubados. a. Seleccionar 2 cultivos de caldo formalizado y realizar prueba con antisuero Salmonella flagelar polivalente (H). Si la aglutinacin se va ha realizar al da siguiente, se puede guardar el cultivo formalizado en refrigeracin. b. Colocar 0.5 mL de la Salmonella diluida en forma apropiada con antisuero flagelar polivalente (H) en tubos de ensayo serolgicos de 10 x 75 mm o de 13 x 100 mm. c. Agregar 0.5 mL del antgeno para ser probado. d. Control: Preparar con solucin salina mezclando 0.5 mL formalinizada con 0.5 mL antgeno formalinizado. solucin de salina fisiolgica

Incubar las mezclas en el bao de agua termorregulado a 48-50C. Observe en intervalos de 15 minutos y lea el final. Lectura: Positivo - aglutinacin en mezcla de prueba y ninguna aglutinacin en control. Negativo - ninguna aglutinacin en mezcla de prueba y ninguna aglutinacin en control. No especfico - aglutinacin en mezcla de prueba y en control. Ensayar los cultivos que dan a tales resultados con antisueros Spicer-Edwards. 1. Prueba serolgica de Spicer-Edwards Use esta prueba como una alternativa a la prueba de flagelar polivalente (H). Esto tambin puede ser usado con cultivos que presentan la aglutinacin no especfica flagelar polivalente (H). Realice la prueba de Spicer Edwards de la misma forma que con antisuero flagelar (H). 2. Realice pruebas bioqumicas adicionales sobre cultivos que dan resultados de prueba de flagelar positivos. Si ambos cultivos formalinizados de caldo son negativos, realizar pruebas serolgicas sobre los 4 cultivos de caldo adicionales.