UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO

PRACTICA: CUANTIFICACION DE PROTEINAS

LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR DE LA CELULA I

PROFESORA: Katya Dafne Guadarrama Orozco

GRUPO: 5219

EQUIPO: Jessica Murgua Cervantes Mrida Vzquez Alejandra ngel Echeverra Lorena Garibay Georgina Luna

 INTRODUCCION
-Mtodos de cuantificacin de protenas: Mtodo de Biuret: Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. Un Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la relacin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y solo se recomienda para la cuantificacin de protena en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero). Mtodo de Bradford: Se basa en la unin de un colorante Comassie Blue G-250 (o Serva Blue) a las protenas. El colorante, en solucin acida, existe en dos formas, una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre

-Casena:

La leche contiene vitaminas (principalmente tiamina, riboflavina, cido pantoteico y vitaminas A, D y k), minerales (calcio, potasio, sodio, fosforo y metales en pequeas cantidades), protenas (incluyendo todos los aminocidos esenciales), carbohidratos (lactosa) y lpidos. Las protenas se pueden clasificar de manera general en protenas globulares y fibrosas. Las protenas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y no establecen interacciones intermoleculares como son los puentes de hidrogeno (caracterstico de las protenas fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones coloidales En LA leche hay tres clases de protenas: casena, lactato albuminas y lactato globulinas (todas globulares). La casena es una protena conjugada de la leche del tipo fosfoprotena que se separa de la leche por acidificacin y forma una masa blanca. Las fosfoprotenas son un grupo de protenas que estn qumicamente unidas a una sustancia que

contiene cido fosfrico, en la casena la mayora de los grupos fosfato estn unidos por los grupos hidroxilo de los aminocidos serina y treonina. La casena en la leche se encuentra en forma de sal clcica (caseinato clcico). La casena representa cerca del 77% al 82% de las protenas presentes en la leche y el 2.7 % en composicin de la leche lquida. La casena est formada por , casena y kappa- casena formando una micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta casena son solubles en la leche, solas o combinadas. Si se aade la kappa casena a las dos anteriores o a cada una de ellas por separado se forma un complejo de casena que es solubilizado en forma de micela. Esta micela esta solubilizada por la kappa casena mientras que las alfas y betas son fosfoprotenas que precipitan de iones calcio. La propiedad caracterstica de la casena es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la casena cargada negativamente y solubilizada como sal clcica. Se aade acido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la protena neutra precipita La conformacin de la casena es similar a las protenas desnaturalizadas globulares. El alto nmero de residuos de prolina en la casena causa un especial plegamiento en la cadena de protena e inhibe la formacin de una fuerte y ordenada estructura secundaria. La casena no contiene puentes di sulfuro. De igual manera la falta de estructura secundaria es importante para la estabilidad de la casena frente a la desnaturalizacin por calor. La carencia de estructura terciaria facilita la situacin al exterior de los residuos hifrofbicos lo que facilita la unin entre unidades proteicas y la convierte en prcticamente insolubles en agua.

Para cualquier mtodo colorimtrico es necesario realizar una curva estndar que sirva de apoyo en la cuantificacin de la concentracin de la protena de una o varias muestras problema. La curva se elabora con una solucin de protena cuya concentracin es conocida como la casena.

-Mtodo Espectrofotomtrico: El anlisis cuantitativo es la aplicacin simple ms frecuente de la espectrofotometra ultravioleta y visible. Muchas substancias que no absorben en esta regin pueden a menudo determinarse en forma de un derivado adecuado, como por ejemplo, la combinacin de un compuesto orgnico con un ion metlico en disolucin. En general, los picos anchos de absorcin que aparecen en esta

regin contribuyen a la exactitud del anlisis, y la intensidad de las bandas de absorcin contribuye a la sensibilidad del mtodo de anlisis. Tiene mayor sensibilidad y rapidez que los mtodos gravimtricos y volumtricos, aunque menor exactitud. La exactitud de un mtodo espectrofotomtrico vara segn el instrumento utilizado, si bien suele ser de +-1% hasta +-.2%. Un requisito previo al anlisis cuantitativo de la muestra es disponer del espectro correspondiente a cada una de las sustancias puras. El espectro de una mezcla ha de considerarse en su totalidad, en funcin de las bandas de los componentes puros.

OBJETIVOS:

Conocer la tcnica de Biuret para la determinacin de la cantidad de protena en una muestra biolgica. Determinar el rendimiento y pureza de una protena purificada: la casena. Apreciar el uso de las tcnicas espectrofotomtricas para cuantificar productos biolgicos. HIPOTESIS:

Se obtendr una curva estndar para ejemplificar los resultados obtenidos en la cuantificacin de la concentracin de la protena de las muestras. Los datos obtenidos por medio del mtodo de Biuret, mostraran la cantidad de protena contenida en cada una de las muestras, concordando con la cantidad colocada. Se realizar una liberalizacin de la curva patrn obtenida.

Preparacin de las muestras.

Metodologa.

1. Pesar 100 mg de la casena obtenida en la prctica anterior y colocarla en un vaso de precipitados de 50 mL.

2. Aadir 15 mL de la solucin de NaCl al 1% 3. Agregar gota a gota la solucin de NaOH 1N hasta que se disuelva toda la casena, agitar constantemente en la parrilla de agitacin 4. Pasar la solucin anterior a un matraz volumtrico y aforar a 25 mL. Esta es la solucin problema de casena y de ella se tomaran las alcuotas para los tubos 9 y10. 5. Diluir el sobrenadante 1:100. En un microtubo poner 20 m L 6. Encender el espectrofotmetro PREPARACIN DE LA CURVA ESTNDAR.

7. Numerar tubos de ensaye del 1 al 8 y aadirles 20 m L de cada una de las distintas concentraciones de BSA proporcionadas por el profesor y agua en las cantidades indicadas en la siguiente tabla:
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 20 m L BSA (mg) 1 (-) 2 (1 m g) 3 (2.50 m g) 4 (5.00 m g) 5 (7.50m g) 6 (10.0 m g) 7 (12.50 m g) 8 (15.00 m g) Agua destilada 1600 m L 1580 m L 1580 m L 1580 m L 1580 m L 1580 m L 1580 m L 1580 m L

Mezclar MUY bien. 8. Aadir 400 ml de reactivo de Bradford a cada tubo, agitando muy bien en el vrtex. Dejar a temperatura ambiente al menos 10 minutos. 9. Leer la absorbancia a 595 nm, utilizando el tubo 1 como blanco. Llenar la siguiente tabla:

Tubo *1 2 3 4 5 6 7 8

Muestra 0 Std 1.0 mg Std 2.5 mg Std 5 mg Std 7.5 mg Std 10 mg Std 12.5 mg Std 15 mg

A595nm 0.000 0.983 0.729 1.033 1.343 1.983 0.964 0.735

*IMPORTANTE: Guardar el blanco para utilizarlo para ajustar la lectura de las muestras. CUANTIFICACIN MUESTRAS. 10. Numerar los tubos del 9 al 14 11. Colocar las muestras de acuerdo a la siguiente tabla:
Tubo 9 10 11 12 13 14 Muestra Casena Casena Sobrenadante Sobrenadante Leche diluida Leche diluida Alcuota 5mL 10 m L 5mL 10 m L 1:4 2 m L 1:4 5 m L Agua destilada 1595 m L 1590 m L 1595m L 1590 m L 1598 m L 1595m L

DEL

CONTENIDO

DE

PROTENAS

DE

LAS

Mezclar MUY bien. Nota: Las muestras de casena son las obtenidas en la practica 2 que fueron guardadas a 4oC Leche diluida 1:4

Sobrenadante (SN) Casena aislada y que se disolvi en el paso 3 con NaCl al 1% y NaOH 1N (Estas muestras se volvern a guardar a 4 C para utilizarlas en la prctica de electroforesis) 12. Aadir 400 m L de reactivo de Bradford a cada tubo, agitando muy bien en el vrtex. Dejar a temperatura ambiente al menos 10 minutos. 13. Leer la absorbancia a 595 nm, utilizando el tubo 1 como blanco. Llenar la siguiente tabla: Tubo 1 9 10 Muestra 0 Casena Casena A595nm 0.000 0.415nm 0.901nm

11 12 13 14

Sobrenadante Sobrenadante Leche diluida 1:4 Leche diluida 1:4

0.083nm 0.067nm 0.154nm 0.117nm

RESULTADOS.

1. Anotar los resultados obtenidos en la siguiente tabla # Tubo Estndar de albmina (BSA), m L Albmina Absorbancia (m g/tubo) (595 nm) Muestras problema (mL) Absorbancia de muestras problema (595 nm) Casena obtenida (mg/mL)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

0 10 m L 10 m L 10 m L 10 m L 10 m L 10 m L 10 m L -

0 1.0 m g 2.5 m g 5m g 7.5m g 10 m g 12.5 m g 15 m g -

0.005 ml 0.01 ml 0.005 ml 0.01 ml

13 14

CLCULOS.

0.002 ml 0.005 ml

1. Graficar la curva estndar con la concentracin de la sustancia conocida, en este caso la albmina (m g), como variable independiente (en el eje de las X) y la absorbancia (540 nm) como variable dependiente (en el eje de las Y). 2. Linealizar la curva usando el mtodo de regresin lineal 3. Calcular los resultados de cada una de las muestras (incluir en el reporte la forma detallada de los clculos realizados), obteniendo los valores en miligramos de protena por mililitro de cultivo, tomando en cuenta alcuotas, diluciones etc., anota los resultados en la tabla. 4. Calcular la cantidad de protena en el volumen de leche inicialmente empleado. 5. Calcular la cantidad total de casena obtenida en los gramos totales de materia seca aislada. 6. Calcular la cantidad total de protena restante en el sobrenadante. 7. Calcular el porcentaje de protena en materia seca. Protena mg/mL Factor de 1:4 (mg) Protena Protena en el inicial de leche (mg) total de materia seca aislada (mg) Protena restante en el sobrenadant e (mg) Porcentaje Rendimiento de casena en la materia seca (%) de la extraccin de casena

dilucin volumen

8. En funcin de los resultados, calcular el rendimiento de la extraccin. 9. Analizar y discutir los resultados de manera grupal y confrontar los resultados con lo que indica la literatura. 10. Elaborar las conclusiones.

CONCLUSION:

Los datos obtenidos y graficados en la curva patrn no son los esperados, en comparacin con la curva patrn conocida de la casena, ni en comparacin con las concentraciones presentes en las muestras analizadas. Esto se debe a errores de especificidad de cantidad deseada en la colocacin de la casena en las diluciones. Por lo que no se obtuvieron los resultados planteados en la hiptesis.

BIBLIOGRAFA.

Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254 Layne, E. 1957. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Methods in Enzymology 10: 447-455. Manual Bio-Rad Protein Assay. E.D. Olsen, Mtodos pticos de Anlisis, Ed. Mc Graw Hill, Barcelona, 1990.