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MEDIOS DE FERMENTACION

La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Como ya se explic, los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza qumica que desempean un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y adems suministrar energa para la sntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular. No obstante que los microorganismos varan considerablemente respecto de los nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distincin de las siguientes categoras de componentes:

a. Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que estn


representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg; b. Micronutrientes o elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o microgramos por litro; y c. Factores de crecimiento, que estn constitudos generalmente por componentes orgnicos suministrados en baja concentracin y que no son sintetizados ni metabolizados por las clulas, sino incorporados a estructuras celulares y de funcin metablica especfica, como vitaminas, algunos aminocidos, cidos grasos no saturados, etc.. Los medios pueden clasificarse, considerndo la naturaleza qumica de los componentes, en

1. medios sintticos o medios qumicamente definidos, y 2. medios complejos en cuya composicin intervienen sustancias de origen
animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maz, harina de soja, etc. que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas, pero que son qumicamente indefinidas y de composicin variable. En el estudio de los medios de cultivo es conveniente considerar en primer lugar el diseo para tratar a continuacin la formulacin y optimizacin de los mismos. Diseo

El diseo de un medio de fermentacin tiene como finalidad la eleccin de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formacin de productos correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se debe tener en cuenta todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, el proceso y los sustratos a ser empleados como son los requerimientos nutricionales del microorganismo y algunos especficos del proceso, la disponibilidad real de los componentes y consideraciones sobre las materias primas. Otros aspectos que son tambin importantes se refieren a todos los procesos y operaciones previos y posteriores a la etapa de fermentacin y al conocimiento de los mecanismos bioqumicos que regulan la formacin de algunos productos, como es el caso de la importancia del anin PO4 , segn ya se explic. Trataremos especialmente de los tres primeros. Requerimientos nutricionales

Los requerimientos nutricionales estn determinados por el tipo de metabolismo celular, ya sea autotrfico, que corresponde a los microorganismos que obtienen el carbono del CO2 como las algas y algunas bacterias, y los heterotrficosque necesitan compuestos orgnicos como fuente de carbono. Otro factor esencial est determinado por las condiciones del cultivo, si es aerobio o anaerobio. El O2 es uno de los oxidantes ms comunes en el metabolsmo energtico. En la ausencia del O2 , el NO3 o SO4 son utilizados como aceptores de electrones por algunas bacterias. Las bacterias metanognicas son auxtrofos anaerobios que utilizan H2 para reducir el CO2 a CH4para obtener energa. Otras protistas obtienen su energa, en condiciones anaerobias por reaccin de xido-reduccin realizadas sobre compuestos orgnicos. Las fuentes de carbono cumplen tambin el rol de ser fuente de energa. Otro requerimiento nutricional est constituido por las fuentes de nitrgeno que pueden ser de naturaleza inorgnica u orgnica. El nitrgeno es utilizado para la biosntesis de protenas, cidos nucleicos y polmeros de la pared celular. Para la sntesis de protena se requieren en general L-aminocidos, aunque tambin son necesarios algunos aminocidos de la serie D como D-alanina y Dasprtico para su incorporacin a la pared de la clulas. En algunos casos se requieren tambin pptidos de histidina. Los requerimientos de otros macronutrientes como el P y el S son suministrados en forma de PO4 H y SO4 (o aminocidos azufrados). El fsforo se incorpora en cidos nucleicos, y polmeros celulares. El S es asimilado para la sntesis de aminocidos azufrados, y adems se necesita para la biotina, coenzima A, tiamina y otros componentes. Los requerimientos de K y Mg son tambin esenciales. Una parte importante del primero est unida al RNA de manera que los requerimientos de K aumentan con

los factores que influyen en el aumento del RNA de las clulas, como la velocidad de crecimiento. El in K actua como coenzima y probablemente acta como catin en la estructura aninica de varios componentes celulares. El in Mg es esencial para la estabilidad de los ribosomas y actua como cofactor en numerosas reacciones del metabolismo. Tanto el K como el Mg se incorporan a los medios en forma de sales como fosfato y sulfato. Con respecto a los micronutrientes se distinguen 2 categoras:

a. Los que sonfrecuentemente esenciales para el crecimiento como Ca, Mn,


Fe, Co, Cu y Zn y b. Los que son raramente esenciales como B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo,Sn, e I. En general los requerimientos de trazas de elementos son conocidas cualitativamente. A veces es difcil demostrar un requerimiento de un micronutriente porque generalmente est presente en suficiente cantidad como impureza de los componentes principales. Los requerimientos de stos compuestos pueden aumentar varias veces cuando el cultivo ha estado sujeto a "stres", como por ejemplo por aumento de temperatura por encima de un valor ptimo. Los requerimientos de factores de crecimiento comprenden ciertos aminocidos y vitaminas del grupo B como tiamina, riboflavina, cido pantottico, niacina,etc., que representan para muchas bacterias y levaduras factores esenciales en los medios sin los cuales no se produce crecimiento celular. La mayor parte de las vitaminas son constituyentes de co-enzimas. Otros factores de crecimiento son las purinas, poliaminas, putrescinas, cte.. En algunos procesos existe la necesidad de efectuar otros agregados, aparte de los nutrientes requeridos por los microorganismos y que representan los requerimientos especficos del proceso considerado. Un ejemplo es el caso de los precursores que constituye la base de una molcula que debe ser sintetizada por el microorganismo, como el cido fenil actico para la penicilina. Otro ejemplo es el agregado de ciclo dextrinas en procesos de produccin deBordetella pertussis que puede actuar como complejante de inhibidores de crecimiento celular. El agregado de cloruros o bromuros en el caso de algunos antibiticos como cloro y bromotetraciclinas, tetraciclidas producidas por el Streptomyces aureofaciens,responde tambin a requerimientos especficos para inhibir la sntesis de productos no deseados, como ocurre tambin con el agregado de mananos y barbitricos en la produccin de estreptomicina por S. griseus. El agregado de sulfato, en el proceso de fermentacin alcohlica, que favorece la formacin de glicerol, es otro ejemplo de un requerimiento especfico. El diseo correcto tiene que ver con las caractersticas bioqumicas propias y evolucin de los parmetros de cada proceso. Por ejemplo, un proceso caracterizado por un descenso continuo de pH, debido al uso de una sal de

amonio como fuente de nitrgeno, obliga a considerar en su diseo algn agregado que no corresponda a una exigencia nutricional, como es el caso del control de pH del mismo. Este puede efectuarse por agregados al medio de agentes "buffer" como mezclas de fosfatos o de carbonato de calcio o como ms generalmente se hace, con agregados peridicos de soluciones alcalinas que pueden efectuarse en forma ms conveniente mediante un control automtico de pH. El diseo de un medio especfico para la produccin de cido ctrico debe considerar la influencia negativa que para el proceso tiene un exceso de hierro en su composicin; por lo tanto dicho medio debe disearse de manera tal que su preparacin (a partir de diversas materias primas) considere una eliminacin total del hierro y posterior agregado del mismo en cantidades controladas. Disponibilidad de los componentes

Aparte de su presencia en el medio de cultivo, los nutrientes deben estar disponibles para ser usados por la clula. Es importante mencionar la disponibilidad correspondiente a iones metlicos cuya concentracin es modificada por quelacin, ya que muchos constituyentes del medio y productos del metabolismo actan como agentes complejantes o precipitantes, por ejemplo aminocidos, hidroxicidos, hidrxidos, y los aniones PO4 y CO3-2 . Por lo tanto, con el objeto de controlar su concentracin y prevenir la precipitacin de los iones metlicos, es necesario o esencial quelar el ion mediante algn agente quelante agregado, como el EDTA (Acido Etilendiaminotetraactico). En medios complejos de uso industrial la situacin es an ms complicada ya que existe una gran variedad de sustancias orgnicas, las cuales pueden quelar, secuestrar o absorber iones metlicos reduciendo la concentracin inica disponible. Entre dichos compuestos podemos citar: aminocidos, protenas, cidos orgnicos, polifenoles, polifosfatos y materiales coloidales. En general se puede decir que todo material insoluble presente en el medio de cultivo va a tener una determinada capacidad de unin a elementos metlicos disminuyendo su concentracin efectiva, como ocurre tambin con los aminocidos y protenas que tienen los grupos reactivos R-COO - , RHN- , RS- , RO , que son los ms importantes. La dinmica de formacin del complejo est determinadapor la constante de equilibrio de formacin del complejo metalligando, y por la velocidad a la cual el equilibrio es obtenido. La constante de equilibrio para la formacin del complejo del in metlico (M) con el ligando (L) se expresa de la siguiente forma:

El valor de K es prcticamente independiente de la naturaleza del ligando, ya que depende particularmente del ion metlico. Se puede hacer una lista de trminos de valores decrecientes de la constante de equilibrio como sigue: Fe+3 >Pb2 + > Cu2+ > Ni2+> Co3 + > Zn2+ > Co2+ > Cd2+ > Fe2+ > Mn2+ > Mg2+> Ca2+ >Sr2+ > Ba2+ > Na+ > K+ > y de la cual se puede deducir, por ejemplo, que el ion Cu2+ estar fundamentalmente como complejo mientras que Ca2+, Na+ y K+ estarn en forma de iones metlicos libres. Por otro lado la velocidad a la cual se alcanza el equilibrio tiene tambin una serie de orden decreciente de velocidades de acuerdo al ion: Sr2 + > Ca2 + > Zn2+ >Mn2+ > Fe2+> Co2+> Mg2+> Ni2+. De ambas consideraciones surge por ejemplo que cuando se alcanza el equilibrio el ion Ca2+ estar casi siempre libre para ser utilizado y si est complejado se har rpidamente disponible, en cambio el Mg2+ estar generalmente libre pero si est complejado se har disponible muy lentamente. En la misma forma se puede deducir que el Co2+ estar fundamentalmente en forma complejada siendo disponible adems a muy baja velocidad. Por esa razn ese elemento es potencialmente limitante. En conclusin, es importante tener en cuenta la naturaleza de los compuestos orgnicos que tienen capacidad para actuar como ligandos, y sobre todo el ion metlico considerado, ya que la concentracin libre de ste es lo que interesa. Materias primas fundamentales

Los componentes empleados en la industrias de fermentacin son generalmente complejos, siendo importante considerar diferentes aspectos como el costo de los mismos, la disponibilidad y la estabilidad en su composicin qumica. Si tenemos en cuenta que el costo de los nutrientes representa entre al 10 y el 60% del costo total de mucho productos obtenidos por fermentacin, se hace prioritario disminuir el costo de los medios. Las materias primas ms importantes corresponden a fuentes de carbono y de nitrgeno. Las fuentes de carbono pueden ser:

1. Hidratos de carbono como glucosa o dextrosa, sacarosa, lactosa, almidn,


dextrina; 2. Alcoholes como el glicerol y manitol; y 3. Hidrocarburos como hexadecano, octadecano y otros.

Son muy importantes tambin por su disponibilidad y costo reducido otras materias primas que contienen hidratos de carbono como granos, melazas, celulosas, suero de queso, etc. Tambin se pueden emplear otros subproductos o efluentes de industrias que por su contenido en fuentes de carbono son interesantes para algunos procesos como las vinazas de destilera, alpechn y residuos sulfiticos, que son sin embargo solamente tiles para procesos de produccin de biomasa destinados al consumo animal, ya que si bien contienen hidratos de carbono y otras fuentes de carbono asimilables por los microorganismos, tambin contienen muchas impurezas que impiden su utilizacin en otros procesos por las dificultades y costo elevado que presentan las operaciones de separacin y purificacin de los productos. Las fuentes de nitrgeno de naturaleza inorgnica ms comunes son el amonaco o las sales de amonio. Las orgnicas estn representadas por varios productos, como ser:

1. Hidrolizados de protenas (Peptonas) que son obtenidas por hidrlisis


cida o enzimtica de distintas fuentes proteicas como carne de diferentes rganos y animales, pescado, casena, gelatina, harina de soja, algodn, girasol, etc.. Mediante ajuste de la relacin enzima-sustrato y variando tiempo de hidrlisis es posible variar el tamao de la cadena de polipptidos. Aparte de su funcin como fuente nitrogenada, las peptonas aportan algunas vitaminas y sales inorgnicas como fosfatos y suministran tambin algunos micronutrientes como Ca, Zn, Fe y Cu. Extracto de carne, que se obtiene por extraccin acuosa y concentracin posterior variando su tipo de acuerdo a la calidad de carne, tiempo de extraccin y temperatura de la misma. Extracto de levadura, que es disponible en forma de pasta o polvo, y puede ser obtenida mediante autlisis o plasmlisis de la levadura, es bsicamente una mezcla de aminocidos, pptidos, vitaminas solubles en H2O y carbohidratos. Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de la malta de la cebada y "Cornsteep", el agua de maceracin de la industria del maz tiene mucha importancia por su utilizacin como componente esencial de los medios para la produccin de varios antibiticos y enzimas.

2. 3.

4. 5.

Es muy importante tambin la correcta eleccin de una determinada fuente cuando se presentan varias alternativas posibles. En este sentido deben considerarse los costos, la disponibilidad y el problema de impurezas que puede acompaar a las distintas materias primas utilizadas. Formulacin

La formulacin tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios, es decir debe establecer las concentraciones de cada componente a ser utilizadas. Una primera aproximacin con respecto a las cantidades a utilizar de las diversas fuentes lo da el conocimiento de la composicin de biomasa del microorganismo a ser empleado. Una composicin elemental y tpica de la biomasa es (en % de peso seco): Carbono, 46-48; Nitrgeno, 7-12; Fsforo, 1-3; Azufre, 0.5-1.0; Mg, 0.5-1%. Es decir, que si queremos formular un medio para producir una determinada cantidad de biomasa debemos proveer las distintas fuentes que aseguren como mnimo las cantidades de elementos que deben ser suministrados. La composicin de un medio mnimo basado en este principio, que adems tiene en cuenta los requerimientos de las fuentes de energa, figura el la tabla 3, que ha sido calculada por Pirt para la produccin de Klebsiella aerogenes en concentracin de 10 gl-1 . Tabla 3. Composicin de un medio mnimo para Klebsiella aerogens (Adaptado de Pirt)

Por el conocimiento de la estequiometra de crecimiento y de formacin del producto, es posible formular adecuadamente un medio. Aunque este tema se tratar en el captulo 5 es conveniente adelantar aqu algunos aspectos necesarios. En general podemos escribir para cualquier proceso de fermentacin: Fuente de C + fuente de N + O2 + minerales + nutrientes especficos biomasa + productos + CO2 + H2O.

Supongamos que queremos formular un medio para la produccin de biomasa de levadura de panificacin. En este caso se puede establecer la siguiente ecuacin basada en la estequiometra:
0,585 C12H22O12 + 3,205 O2 + 0,61 NH3
(Sacarosa)

---->

C3,72H6,11O1,95N0,61+ 3,3 CO2 +


(Biomasa)
4,29 H2O

+ 387 Kcal.

La ecuacin anterior representa as la formacin de 100 g de biomasa a partir de 200 g de sacarosa. Debe aclararse que en la "frmula" de la levadura que representa la composicin centesimal de la misma faltan los elementos menores como el P, el S y el Mg por lo cual la suma no da 100 g sino 90.46. Ms adelante veremos que es conveniente utilizar en lugar de la frmula centesimal la correspondiente a la frmula mnima que resulta de dividir el porcentaje de cada elemento por 3.72, o sea haciendo uno al carbono. La ecuacin mencionada fue establecida por Harrison y se ha comprobado que responde muy satisfactoriamente en la prctica. En este caso se considera que toda la fuente de carbono se emplea para la formacin de biomasa y de CO2 , que se desprende sin formacin de otros productos. En la misma forma se pueden establecer balances de materia para otras reacciones que incluyan productos y deducir de las mismas la cantidades de biomasa y productos que se pueden obtener a partir de una determinada cantidad de fuentes de carbono y de nitrgeno. Las otras fuentes de elementos menores y factores no son necesarios de incluir en las ecuaciones. Aplicando este criterio podemos establecer entonces que para obtener una determinada concentracin de biomasa, por ejemplo 30 gl -1 , debemos formular el medio como mnimo con 60 gl -1 de fuentes de carbono asimilable, que es en el caso anterior la sacarosa. Con respecto a las fuentes de nitrgeno, sta debe estar en concentracin tal como para satisfacer la ecuacin anterior, que es 0.61 moles de NH3 o sea 10.37 g de amonaco, lo que representa 8.54 g de N2. Ya tenemos por lo tanto la cantidad de la otra fuente fundamental a ser agregada. Del conocimiento de la composicin centesimal de otros componentes menores podemos establecer as las cantidades a agregar. Ahora bien, sabemos por otra parte que la levadura necesita para crecer algunas vitaminas del grupo B como la biotina, tiamina, cido pantotnico, etc. Esas vitaminas deben estar por lo tanto presentes en el medio. Como el proceso de produccin de levadura es un proceso industrial que interesa desarrollar con costos de produccin mnimos, es conveniente estudiar las fuentes de carbono, nitrgeno y de vitaminas y minerales ms econmicos y disponibles que podamos encontrar. Surge as la eleccin lgica de las melazas de caa de azcar o de remolacha que reunen la mayor parte de las condiciones. Del conocimiento del efecto Crabtree ya comentado y para evitar la formacin de alcohol y maximizar la produccin de biomasa surge la necesidad de implementar una alimentacin

programada empleando melaza como sustrato limitante, de lo cual resulta la eleccin de un sistema de "batch" alimentado para la produccin. Mayores detalles de este proceso se darn en el captulo 8relacionado con produccin de levadura. Mediante el conocimiento de los coeficientes de rendimiento para la formacin de biomasa y producto y los valores de la energa de mantenimiento (aspectos a tratar en elcaptulo 5) ser posible establecer tambin los requerimientos de las fuentes de carbono necesarios para formular un medio. Optimizacin

Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativo la optimizacin de los medios de cultivo. Entre ellas podemos mencionar las siguientes:

1. No existencia de informacin respecto a coeficientes de rendimiento de 2. 3. 4. 5.


macro y micro elementos para el cultivo del microorganismo determinado. Existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente de microelementos y factores de crecimiento. Uso de medios de cultivo conteniendo elementos en exceso respecto de los requerimientos nutricionales del microorganismo en cuestin, que pueden causar inhibicin del crecimiento. Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del crecimiento y formacin del producto. Empleo de fuentes nutricionales no convencionales.

La metodologa ms elemental consiste en realizar experimentos, en los cuales se vara la concentracin del componente a ensayar mantenindose constante las concentraciones de los dems ingredientes. Para organismos aerobios generalmente se utiliza como sistema de cultivo erlenmeyers agitados. En este caso, se analiza el efecto de la variable escogida sobre la velocidad de crecimiento y la concentracin de biomasa obtenida. Si bien el procedimiento anterior es simple, es evidente que hace falta una gran cantidad de trabajo preliminar ya que el operador no conoce de antemano que nutriente es el limitante del crecimiento. Cuando son varios los posibles nutrientes limitantes el mtodo resulta poco prctico. Por otra parte puede ocurrir que la respuesta obtenida al variar la concentracin de un componente depender de los niveles de los otros,

o sea, se produzca interaccin entre componentes. Se puede mejorar mucho la optimizacin en batch empleando tcnicas estadsticas o utilizando sistemas continuos con pulsos de componentes. Utilizando cultivos continuos (tema que se ver en el captulo 6) es posible obtener un cultivo limitado por un slo factor o sustrato a lo largo de todo el experimento, pudindose conocer por lo tanto el efecto que su variacin ejerce sobre el cultivo al mantenerse los dems componentes constantes. En la fig. 8 se muestra la optimizacin de un medio lograda por el mtodo de los pulsos trabajando con un cultivo continuo y en el cual se grfica la variacin de la concentracin de biomasa en funcin del tiempo despus del pulso de un componente dado. Figura 8. Optimizacin de medios de fermentacin. 1. Nutriente no limitante.2. Nutriente limitante. 3. Nutriente limitante a mayor concentracin. Esterilizacin

Es conveniente, al tratar este tema, dar una definicin clara del trmino y de otros relacionados, ya que a veces suelen producirse confusiones.

Esterilizacin significa la eliminacin de toda forma de vida de un medio o material, lo que se lleva a cabo generalmente por medios fsicos, por ejemplo, filtracin, o por muerte de los organismos por calor, productos qumicos u otra va. Esta definicin excluye por lo tanto cualquier tcnica que resulte solamente en un dao a los microorganismos o atenuacin de la actividad de cualquier tipo. La palabra desinfeccin se aplica a la remocin o destruccin por cualquier va de organismos vivos que pueden causar dao particular o infeccin. No significa por lo tanto la destruccin de todos los microorganismos, sino solamente de aquellos que pueden producir un resultado no deseado. Un antisptico es un desinfectante, o sea un agente qumico usado para destruir microorganismos dainos. Se utiliza en general para agentes a ser aplicados en animales o humanos.

Asepsia es la exclusin continuada de microorganismos contaminantes. As por ejemplo el cultivo de microorganismos en el laboratorio es llevado a cabo aspticamente como en muchas fermentaciones industriales. El medio de cultivo es esterilizado para remover toda forma de vida y luego inoculado con el cultivo requerido. Se dice entonces que el sistema se mantiene en condiciones aspticas. Pasteurizacin es el trmino aplicado al proceso que se utiliza para la destruccinde algunos de los microorganismos posiblemente presentes en materiales sensibles al calor como la leche y cerveza. Consiste en calentar la leche, por ejemplo a 62 C, mantenerla a esta temperatura 30 minutos y despus enfriarla lo ms rpidamente posible. Esta tcnica no es de ninguna manera un procedimiento de esterilizacin. Es solamente un mtodo para destruir organismos patgenosy al mismo tiempo disminuir el nivel de aquellos organismos que ms pueden deteriorar la leche.

La razn fundamental para efectuar la esterilizacin en Microbiologa Industrial es para evitar la competicin por los nutrientes en medios de cultivo y permitir as que el cultivo de microorganismos especficos que se utilizan en un proceso de fermentacin de los rendimientos esperados en biomasa y/o metabolitos especficos. Mtodos de esterilizacin

Los mtodos de esterilizacin pueden ser de 3 tipos:

a. Por destruccin total de microorganismos; b. Por muerte o inactivacin; y c. Por eliminacin con medios fsicos.
Por destruccin total se entiende un proceso muy violento, que casi siempre implica calentamiento apreciable del material, como ocurre con la aplicacin de una llama, que es lo que hacemos en el laboratorio cuando flameamos un ansa de platino o las bocas de tubo de ensayo o erlenmeyers. Otra manera de destruir contaminantes es con el uso de poderosos agentes oxidantes. Por supuesto sta metodologa, aunque es efectiva, est muy restringida en su empleo. La muerte o inactivacin significa la eliminacin de microorganismos sin que exista necesariamente desintegracin de las clulas. Se puede efectuar por calentamiento, seco o hmedo, por radiaciones o por agentes qumicos. El calor hmedo, generalmente en forma de vapor bajo presin, es muy til y de gran valor en la esterilizacin en el laboratorio, que se efecta en autoclave, o en la industria cuando se esterilizan los medios de cultivo y los equipos de fermentacin. En el caso de los autoclaves, se pueden alcanzar presiones de 1 a 3 atmsferas. En escala grande el equipo de produccin es esterilizado con vapor saturado bajo

presin, y la presin requerida debe ser alcanzada en todas las partes del equipo y el aire debe ser purgado totalmente del sistema (como ocurre tambin en el caso de los autoclaves) porque la transferencia de calor disminuye mucho en ese caso. Despus de la esterilizacin se mantienen las condiciones aspticas, haciendo pasar vapor por las vlvulas y sellos. La eliminacin fsica est restringida a la esterilizacin de gases lquidos, y es fundamentalmente llevada a cabo por filtracin mediante filtros absolutos o filtros fibrosos. Los filtros absolutos son de materiales cermicos, de vidrio o de metal sinterizado con poros tan pequeos que la penetracin de los microorganismos no es posible. Los filtros fibrosos no son absolutos y el material filtrante puede ser lana de vidrio, amianto y esteres de celulosa, siendo las fibras de un dimetro variable de 0.5 a 15 micrones. Cintica de la esterilizacin por calor

La cintica de la esterilizacin por calor hmedo, que es la nica que consideraremos en sta monografa por su aplicacin a la esterilizacin de medios de fermentacin, est caracterizada bastante aproximadamente por una reaccin cintica de primer orden. Si No es el nmero de organismos viables presentes inicialmente y N es nmero viable al final tendremos que la ecuacin de velocidad de muerte ser:

es la fraccin de organismos viables que sobreviven despus del tratamiento por calor durante el tiempo t y K = constante de velocidad de destruccin, que depende de la temperatura segn la clsica ecuacin de Arrhenius:

donde

A = constante E = energa de activacin R = Constante general de los gases T = Temperatura en grados Kelvin

Si se grfica el In k en funcin de 1/T se obtendr una lnea recta, siendo la inclinacin igual a -E/R y la interseccin de la recta con la ordenada, el valor de la constante de Arrtherius. La ecuacin de velocidad de muerte necesita una aclaracin, ya que la misma no admite una disminucin del nmero de organismos a cero, porque si N es cero, t debera ser infinito. Para resolver este problema supongamos que N = 0.1 y calculemos el valor correspondiente de t. No podemos decir que despus de ese tiempo sobrevivir una dcima parte de un microorganismo, pero si podemos decir que habr slo una probabilidad de 1 en 10 de que sobreviva un microorganismo.Ya veremos que por razones de seguridad podemos fijar el valor de N = 0.001 o sea fijar una probabilidad de 1 en 1000 de sobrevivencia.

La figura 9 muestra una curva tpica de la esterilizacin en "batch" de un medio en un fermentador. La curva AB represen ta la etapa de calentamiento, la parte BC corresponde a la etapa de mantenimiento y CD es la etapa de enfriamiento. Durante la primera y ltima etapa ocurre parte de la destruccin trmica de organismos presentes en el medio debido a que se alcanza temperatura elevada sobre todo en la ltima parte de la curva AB y la primera parte de la curva CD. Se considera que la temperatura a partir de la cual se produce destruccin de esporos es 100 C. Por lo tanto tendremos eliminacin de esporos de 100 a 120 C durante la etapa de calentamiento y de 120 a 100 C durante la correspondienteal enfriamiento. Los tiempos de calentamiento y enfriamiento varan de acuerdo al volumen del equipo. En fermentadores industriales de 60.000 1 por ejemplo esos tiempos estn en elorden de 28-30 min. y 11-14 min. para los perodos de calentamiento y enfriamiento respectivamente. En la prctica de la esterilizacin es necesario tener presente que la calidad nutriente del medio debe ser preservada todo lo posible, razn por la cual, es imprescindibledisear un ciclo de esterilizacin lo ms efectivo posible pero al mismo tiempo lo ms corto posible. Podremos definir un trmino (V) que representa la magnitud de la disminucin del nmero de organismos viables de manera que:

para el perodo de calentamiento y de enfriamiento con el fin de calcular la cantidadde esporos que se eliminan durante ambos perodos. Conociendo el valor inicial de esporos presentes en el volumen de medio considerado es posible calcular el tiempo de mantenimiento a 120 C para la esterilizacin completa del mismo. Existen datos, en bibliografa, de clculo de tiempo de mantenimiento para la esterilizacin de 45.000 l de medio (con un valor de No = 2 x 107 esp/ml) que demuestra que son necesarios solamente 8.8 min como tiempo de mantenimiento a 120 C. Debe tenerse en cuenta que estas consideraciones son vlidas para el clculo del tiempo de esterilizacin mnimo, a 120 C, en fermentadores industriales del volumen considerado. En el caso del laboratorio cuando utilizamos un autoclave y deseamos esterilizar distintos recipientes con volmenes diversos de medio, el tiempo de calentamiento y de enfriamiento no son generalmente considerados, salvo en el caso de equipos que tengan un perodo de calentamiento y de enfriamiento prolongado, los que por otra parte no son recomendados para su uso en el laboratorio. Lo que es importante en este caso es el tipo de recipiente, su geometra y el volumen de medio a esterilizar. El tiempo de esterilizacin (o sea el tiempo de mantenimiento a 120 C) requerido por ejemplo para tubos de ensayo de 18 x 50 mm es de 12-14 min y para tubos de 38 x 200 mm, de 15-20 min. Erlenmeyers de 2000 ml requieren de 30-35 min mientras que si son de 125 ml el tiempo es de 12-14 min. En cambio un frasco pyrex cuadrado de 1000 ml requiere 30-35 min y una botella de suero de 9000 ml

50-55 min. Estos tiempos aseguran la eliminacin de esporos bacterianos de las especies ms resistentes. Conservacin de la calidad nutriente

Como ya dijimos anteriormente, los medios de fermentacin utilizados en la industria son casi siempre complejos y a menudo con slidos en suspensin, de manera tal que los cambios que se producen durante la esterilizacin pueden ser importantes. A veces puede haber modificaciones beneficiosas o perjudiciales dependiendo del tiempo de esterilizacin. Existen casos en los cuales si se prolonga la esterilizacin 50 a 60 min se producen prdidas de rendimiento que llegan hasta el 65% con respecto al medio normal. En ciertos casos cuando el tiempo es solamente de 15-20 min se puede producir un efecto beneficioso. La naturaleza de las interacciones que tienen lugar entre los componentes de un medio, durante la esterilizacin por calor, depender no solamente de la naturaleza de los componentes sino tambin de la temperatura, duracin del calentamiento, pH del medio, y de la agitacin. Un ejemplo tpico de interaccin es la reaccin de Maillard que tiene lugar entre los grupos carbonilos de los azcares con los grupos amino de protenas, aminocidos, etc. Se forman as productos de condensacin con lo cual se inactivan significativas cantidades de carbohidratos y nitrgeno amnico. Por ese motivo es necesario que los carbohidratos se esterilicen por separado de los compuestos nitrogenados orgnicos. Las sales de NH4+ se deben autoclavar a pH 7 o menor, si no el amonio se volatiliza. En medios qumicamente definidos se puede observar prdida importante de magnesio, potasio, amonio, sodio y fosfatos por precipitacin de sales poco solubles como MgNH4PO4 , MgKP04 y MgNaP04. Es importante por lo tanto autoclavar las sales de calcio y magnesio aparte de los fosfatos. Los aminocidos y factores de crecimiento son muy lbiles al calor. Entre los aminocidos, el triptofano, glutamina, asparagina, y entre las vitaminas hidrosolubles, la tiamina, riboflavina y piridoxina son las ms susceptibles de sufrir descomposicin. En todos estos casos es aconsejable disolverlas separadamente en pequeos volmenes de H2O y luego esterilizarlas por filtracin.

Como ya dijimos es fundamental, adems de esterilizar correctamente los medios, conservar al mximo la calidad nutriente de los mismos. En la misma forma que la inactivacin de microorganismos puede ser considerada una reaccin cintica de primer orden, tambin la destruccin de algunos compuestos sensibles al calor puede ser tratada en la misma forma. La energa de activacin de tales reacciones est generalmente en el rango de 10.000-30.000 cal.mol-1 mientras que la correspondiente a la destruccin trmica de esporos es superior (65.000-85.000 cal.mol-1 ). Una representacin grfica dara una lnea recta para ambos casos con valores distintos de pendientes segn se aprecia en la Fig. 10. La figura muestra que a medida que la temperatura aumenta, el valor de k para la reaccin con baja E (curva A) aumenta ms lentamente que en el otro caso. Esto significa que un aumento de la temperatura acelera la destruccin de esporos ms que la degradacin de nutrientes. Recordando la ecuacin anterior:

vemos que el tiempo requerido para la destruccin de esporos decrece en proporcin al aumento de k. Por lo tanto si se emplea alta temperatura para la

esterilizacin se requiere un tiempo menor, por lo cual se concluye que la esterilizacin llamada de alta temperatura-corto tiempo favorece la conservacin de la calidad nutriente al mismo tiempo que produce la destruccin efectiva de los esporos. Es necesario aclarar que el uso de alta temperatura con tiempos cortos en escala grande implica necesariamente el empleo de un sistema de calentamiento y enfriamiento continuo en lugar de proceso de esterilizacin en batch. En los prximos tres captulos trataremos los aspectos bsicos correspondientes a estequiometra, cintica de crecimiento y formacin de productos, sistemas de cultivo y aspectos generales de biorreactores. CRECIMIENTO MICROBIANO

Cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los mismos comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo para "fabricar" nuevos microorganismos. Este proceso contina hasta que algn nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se detiene. Tambin puede detenerse el crecimiento por acumulacinde alguna substancia inhibidora formada por los mismos microorganismos, pero supngase por ahora que ste no es el caso y que la primera alternativa es la vlida. Luego hay dos aspectos claramente diferenciables que hacen al crecimiento microbiano: uno estequiomtrico, por el cual la concentracin final demicroorganismos obtenidos depender de la concentracin y composicin del medio de cultivo, y el otro cintico, el que dir con qu velocidad se lleva a cabo elproceso. Estequiometra del crecimiento microbiano

La aplicacin de la estequiometra requiere conocer los rendimientos. Estos se definen como la relacin entre el producto obtenido y el sustrato consumido (usualmente la fuente de carbono y energa). Por ejemplo el rendimiento celular se define como:

X y S representan la concentracin de biomasa y sustrato respectivamente. En la prctica, para el clculo del Yx/s se emplea la expresin:

En el captulo 4 se vio que para obtener 30 gl-1 de levadura para panificacin, se consuman 60 gl-1 de fuente carbonada, luego el rendimiento ser

Si adems de microorganismos se forma algn producto en particular, el rendimiento en producto estar dado por:

Antes de avanzar en el tema, convendr hacer algunas consideraciones sobre la composicin elemental de los microorganismos con respecto a los elementos mayoritarios (C, N, H, O) ya que la misma ser el punto de partida para realizar los clculos estequiomtricos. Adems, y antes de aplicar los balances estequiomtricos deberemos responder a esta pregunta: qu peso de clulas (o biomasa) corresponde a "un mol"?. Se ha encontrado que la composicin elemental de un microorganismo dado durante un cultivo no se modifica mayormente y, lo que es ms, las composiciones elementales de distintos tipos de microorganismos (bacterias y hongos) son semejantes. De este modo se puede definir un "microorganismo promedio" como aqul cuya composicin es (% p/p): C = 46.5; H = 6.49; 0 = 31.0; N = 10.85, siendo el contenido de sales aproximadamente 5%. Es importante recalcar que si bien la composicin elemental de la biomasa se mantiene constante durante el cultivo, no ocurre lo mismo con la composicin macromolecular, esto es: protenas, cidos nucleicos, cte., la cual puede variar sensiblemente. Teniendo en cuenta la composicin media anterior, es posible escribir la "frmula mnima" de un microorganismo promedio como: CH1.79O0.5N0.2 (en la que est

representado el 95% p/p de la biomasa) y con fines netamente prcticos definir "un C-mol de biomasa" como la cantidad de biomasa que contiene un tomo gramo de Carbono.

Por tanto una concentracin de X en gl -1 de biomasa es equivalente a X / 25.8 Cmol de biomasa l -1, o bien Xox / 12 C-mol de biomasa l -1 . Donde ox es la fraccinde Carbono de la biomasa (0.465 para el "microorganismo promedio"). Esta ltima forma de calcular los C-moles de biomasa es ventajosa ya que slo requiere conocer ox ; un dato que se puede obtener fcilmente de la bibliografa. En caso de no existir datos disponibles, se puede suponer ox = 0.465 sin temor a cometer errores groseros. De forma anloga a la anterior se definen 1 C-mol de fuente de Carbono y energa, y tambin 1 C-mol de producto. Por ejemplo para la glucosa (C6H12O6) 1 C-mol de glucosa estar representado por CH20 y pesar 30 g, mientras que 1 C-mol de etanol (C 2H60) estar representado por CH 300.5 y pesar 23 g. En general para un compuesto de la formaC n H 1 Oq Nm , 1 C-mol estar representado por C H1/n Oq/nNm/n. En base a lo anterior, el crecimiento puede representarse mediante la siguiente"reaccin qumica", en la que supondremos que el NH 3 (o alguna sal de amonio) es la fuente de nitrgeno:

Debe notarse que en esta ecuacin todos los coeficientes estequiomtricos estnreferidos a 1 C-mol de fuente de Carbono y energa (fuente C y E). El valor de yx/s representa los C-moles de biomasa formada por cada C-mol de fuente de C y E consumida, el de b los moles de 02 consumido por cada C-mol de fuente de C y E consumida, etc. Ya se ha visto que Yx/s e Yp/s son los rendimientos en biomasa y en productorespectivamente. Son parmetros de importancia fundamental dentro de la microbiologa industrial, pues dan una medida de la eficiencia del proceso de

produccin. De este modo en un proceso destinado a la produccin de biomasa, el objetivo ser maximizar Y x/s y minimizar Yp/s . Si lo que interesa es el producto, setendr el caso inverso. Los valores de yx/s e yp/s se calculan a partir de Yx/s e Yp/smediante las expresiones:

Antes de efectuar los balances de materia y energa, introduciremos un nuevoconcepto que nos permitir simplificar los clculos: el "grado de reduccin" al que denotaremos con la letra y. Un par de ejemplos servirn para aclarar el significado de y. En la tabla 4 pueden observarse los valores de y para la oxidacin de 1 C-mol de distintos compuestosorgnicos a C02 y H2O, como as tambin el calor de reaccin.

De la tabla 4 surge que: 1) El valor de y corresponde al nmero de electrones que fueron transferidos desde el compuesto a oxidar, al O2 , tomando como base 1 C-mol. Por tanto expresa el nmero de "electrones disponibles" por cada C-mol.

2) La cantidad de calor liberado por cada mol de electrones transferidos al oxgeno (q/y), se mantiene prcticamente constante. Del anlisis de un gran nmero de compuestos resulta un valor promedio de qo = 27.5 k cal (mol electrones transferidos al O2)-1 De la conjuncin de ambos puntos resulta que el valor de y es una medida de la energa contenida en un compuesto. As, por ejemplo, 1 C-mol de etanol brinda ms energa que 1 C-mol de glucosa. En general para calcular el grado de reduccin de un compuesto se plantea laecuacin de oxidacin del mismo a C02 y H2O, y el valor de y se obtiene multiplicando por 4 el coeficiente estequiomtrico del O2 (ver tabla 4). Si el compuesto contiene nitrgeno, deber especificarse cul ser el estado de oxidacin final de ste. Por ejemplo, supongamos un compuesto dado por CH aObNc, y deseamos calcular el valor de y con respecto al nivel de referencia dado por C02, H2O y NH3 . La ecuacin de oxidacin ser:

La ecuacin (7) es muy til ya que permite calcular y sin necesidad de plantear la ecuacin de oxidacin. Debe quedar claro que tanto para el CO2, como el H2O y el NH3 es y = 0 (no tienen electrones disponibles) por ser ste el nivel de referencia elegido. Si en lugar de NH3 , hubisemos elegido N2 , se demuestra fcilmente que para ese caso y = 4 + a - 2b. La eleccin del nivel de referencia es tan slo una cuestin de conveniencia. Con todos estos elementos estamos en condiciones de aplicar balances de materiay energa a la "reaccin qumica" que representa al cultivo. Para simplificar el tratamiento supondremos que la fuente de C y E no contienenitrgeno (es lo usual) y que la fuente de nitrgeno es una sal de amonio, por lo que y estar dado por la ecuacin (7).

I Balance de Carbono:

Puesto que los rendimientos estn referidos a 1 C-mol de fuente de Carbono y energa, resulta

II. Balance de grado de reduccin: Los electrones disponibles a la izquierda y a la derecha de la reaccin debern ser iguales, luego:

Debe recordarse que para el NH3 , H2O y C02 es y = 0. Adems el grado dereduccin del O2 es -4. Reordenando la ecuacin (9) queda:

representan la fraccin de energa (de la fuente de carbono y energa)transferida a la biomasa, al producto y al oxgeno respectivamente. Puesto que por cada mol de electrones transferidos al O2 se liberan qo = 27.5 k cal, el calorproducido estar dado por: q = 4 b qo (k cal / C-mol fuente de C y E) (15) De acuerdo con esto, e representa la fraccin de energa disipada como calor.Mediante las ecuaciones (8) y (10) es posible analizar los resultados experimentalesy verificar si las determinaciones han sido correctas. Medidas realizadas en ellaboratorio debern encontrarse dentro de los siguientes intervalos:

Cuando se tiene certeza en las determinaciones, es posible aplicar las ecuacionespara calcular algn rendimiento que no ha sido medido, por ejemplo yp/s en base a los dems. Veremos seguidamente algunos ejemplos:

Ejemplo 1: Se cultiv la levadura Candida utilis en un medio conteniendo glucosa, SO4(NH4) 2 y sales. La concentracin inicial de microorganismos fue de 0.53 g l 1 (Xo) y la glucosa 15.2 g l -1 (So ). Al cabo de 9.5 horas, se consumi totalmente la glucosa (Sf = 0), se consumieron 0.123 mol de O2 l-1 , se produjeron 0.179 mol de C02 l -1 y la biomasa alcanz un valor de 6.07 g l -1 (Xf). Se desea averiguar si, adems de biomasa, se form algn producto. Como no se dispone de datos relativos a la composicin elemental de C. utilis,se supone que sta es cercana a la del "microorganismo promedio".

Del mismo modo se tiene que yco2/s = 0.354. Puesto que la suma de ambosrendimientos es muy inferior a 1, es evidente que se ha formado algn producto cuyo rendimiento ser:

Para aplicar la ecuacin (10) se requiere antes calcular el grado de reduccin de la biomasa (y.) y de la glucosa (v s), para lo cual se emplea la ecuacin (7).

Adems el valor de b ser: b = 0.243 mol 02 . C - mol-1 Luego se calcula

Nuevamente la suma es inferior a 1 y de la ecuacin (10) resulta:

Este resultado confirma que se ha formado algn producto, pero adems se puede estimar cul es el valor de yp .

Tratndose de una levadura es probable que el producto formado sea etanol, cuyo gpes 6, y si bien el valor obtenido es inferior a ste, debe tenerse en cuenta que para los clculos se emple la frmula mnima del "microorganismo promedio" y no la deCandida utilis en particular. Ejemplo 2: Calcular la cantidad de calor generado cuando se producen 100 g de levadura para panificacin. De acuerdo a la estequiometra vista en el Captulo 4, por cada 100 g de levaduraformada se consumen 3.1 mol O2 . Luego el calor generado en ste caso ser 3.1 x 4 x 27.5 = 342 k cal, valor muy cercano al dado por la ecuacin de Harrison. Cintica de crecimiento

Debido a la naturaleza autocataltica del crecimiento microbiano, es lgico suponer que la concentracin de microorganismos, X, influye en la velocidad con que aumenta la poblacin, rx As:

En esta ecuacin, p es la velocidad especfica de crecimiento, la cual para un tipo de microorganismo dado depende principalmente de la composicin y concentracindel medio de cultivo, presencia de inhibidores, temperatura y pH. Existen diversas expresiones para p: la ms difundida es la ecuacin de Monod, que relaciona el valor de m con la concentracin de un componente del medio de cultivo que est en defecto respecto de los requerimientos del microorganismo: el sustrato limitante.

donde S es la concentracin de sustrato limitante, um es la velocidad de crecimientoespecfica mxima, y Ks se conoce como constante de saturacin. El valor de Ksest inversamente relacionado con la afinidad del microorganismo por el sustrato. Cuando S Ks, m toma el valor de mm y rx slo depende de X. En general Ks tiene valore muy bajos, del orden de los mg l -1 , por tanto concentraciones relativamente bajas de S son suficientes para hacer que m=mm . Enpromedio las bacterias poseen valores de mm cercanos a 0.9 h-1 , las levaduras0.45 h-1 y los hongos filamentosos 0.25 h-1 ; de todos modos mm debe ser determinado experimentalmente para cada caso en particular. La presencia de inhibidores del crecimiento en el medio de cultivo causa disminucin en el valor de p. La substancia inhibidora puede ser algn componentedel medio de cultivo o algn producto formado por los microorganismos. El tipo de inhibicin, al igual que en cintica enzimtica, puede ser competitiva o nocompetitiva. Para el primer caso:

siendo I la concentracin de inhibidor. El valor de K I est inversamente relacionadocon la afinidad del microorganismo por el inhibidor. En la inhibicin competitiva, se modifica en valor de Ks . Puesto que a > 1 si existe inhibidor (ecuacin (22)), resulta que la afinidad del microorganismo por el sustrato se ve disminuda. En la inhibicin no competitiva, es el valor de mm el que resulta afectado. En ocasiones algn componente del medio de cultivo puede ser inhibidor delcrecimiento, sobre todo cuando se encuentra en concentraciones relativamenteelevadas. Esto es factible que ocurra con la fuente de carbono y energa por ser elcomponente que se encuentra en mayor proporcin en los medios. Suele emplearsela siguiente expresin para considerar ste efecto:

El hecho de que una concentracin de sutrato elevada pueda inhibir el crecimiento,impone una restriccin a la concentracin de los medios de cultivo que se pueden emplear en la prctica, y con esto a la concentracin final de biomasa que se puede obtener. En el captulo 7 se ver cmo, empleando un sistema de cultivo adecuado, es posible sortear esta dificultad. Consumo de sustrato

Si reordenamos la ecuacin (1) y derivamos respecto del tiempo se obtiene:

o bien:

Introduciendo la ecuacin (18) en la (25):

Tambin puede expresarse la velocidad de consumo de sustrato como:

donde qs es la velocidad especfica de consumo de sustrato. Comparando las ecuaciones (26) y (27) surge que

Si m=mm se tendr qs=qsm es decir que ambos parmetros estn directamente relacionados. Por lo expuesto hasta aqu es evidente que el crecimiento puede ser caracterizadomediante tres parmetros: KS , mm e Yx/s. Estos dependen tanto del

microorganismocomo del medio de cultivo empleado, por lo que su evaluacin debe realizarse para cada caso en particular. Mantenimiento celular

La ecuacin (25) establece que el consumo de sustrato slo es posible cuando hay crecimiento, sin embargo cuando el sustrato considerado es la fuente de carbono y energa, puede darse el caso en que el crecimiento es nulo (r x = 0) y el consumo de sustrato no. A este consumo de sustrato que no redunda en aumento de biomasa se lo asocia con el mantenimiento de funciones vitales tales como recambio de material celular, mantenimiento de gradientes de concentracin y movilidad. Pirt ha propuesto la siguiente ecuacin para la velocidad de consumo de la fuente de carbono y energa:

donde ms es el coeficiente de mantenimiento e Y'x/s es el rendimiento que se obtendra si el mantenimiento fuese nulo. El valor de Y x/s es, oviamente, inferior al de Y'x/s, la relacin entre ambos se obtiene dividiendo la ecuacin (29) por r x, eintroduciendo las ecuaciones (25) y (18).

De la ecuacin (30) surge claramente que cuando Debe destacarse que Yx/s es el rendimiento observable, mientras que Y' x/s slopuede ser evaluado indirectamente mediante la ecuacin (30), aspecto que se discutir en el captulo 7. Valores de ms de 0.01 a 0.04 gg h-1 son frecuentes de hallar, pero se incrementancon la temperatura y con la presin osmtica del medio de cultivo. Por ejemplo paraSaccharomyces cerevisiae creciendo en anaerobiosis se

encuentra un valor de m 8=0.036 gg h-1 , mientras que es diez veces superior si el medio contiene una concentracin de NaCl 1 M, lo cual da cuenta del trabajo osmtico que deben realizar las clulas. De este modo el mantenimiento celular posee una implicancia tecnolgica directa, ya que un proceso destinado a la produccin de biomasa debe conducirse de modo tal que el valor de ms sea pequeo. Requerimiento de oxgeno

En los microorganismos aerobios la obtencin de energa est ligada a la presenciade oxgeno. En efecto, ste es aceptor final de los electrones provenientes de la cadena de citocromos donde se genera abundante ATP (adenosina trifosfato). Las molculas de ATP aportarn luego la energa necesaria para las reacciones de sntesis con las que el organismo se "fabricar" a s mismo, y la requerida para el mantenimiento celular. Por analoga con la ecuacin (29) se puede expresar la velocidad de consumo de oxgeno (r o2) como:

donde mo es el coeficiente de mantenimiento en base al O2 e Y'x/o es el rendimiento,en base al O2 consumido, que se obtendra cuando mo = 0. Dividiendo ambos miembros de la ecuacin anterior por x, se obtiene:

donde qo2 es la velocidad especfica de consumo de O2 . En un cultivo en medio lquido los microorganismos utilizan substancialmente el O2 que est disuelto, y elvalor de qo2 depende de cual sea esta concentracin. Por analoga con la ecuacinde Monod, y cuando el O2 es el sustrato limitante, se suele representar esta dependencia como:

donde C es la concentracin de O2 disuelto, Ko es la constante de saturacin y qo2mes la velocidad especfica mxima de consumo de O2 , la cual se obtiene cuando C Ko. En la prctica se utiliza principalmente el concepto de concentracin crtica de oxgeno disuelto, Cc, entendindose por tal al valor por encima del cual qo2 esindependiente de la concentracin de O2 disuelto y por lo tanto el crecimiento no est limitado por oxgeno. En estas condiciones el valor qo2 depende de cul sea el valor se p, el cual ser funcin del sustrato que limita el crecimiento. Si la concentracin de este es saturante, ser m=mm, y qo2=qo2m Los valores de Cc para la mayora de los organismos estn en el orden de 0.1 a 1 mg l -1, valores relativamente bajos si se compara con el de la solubilidad del 02, que a 30 C y 0.21 atmsferas en medios acuosos diludos es de 7.8 mg l -1 . Esto podra conducir al error de suponer que no constituye un problema satisfacer los requerimientos de O2 en los cultivos, pero el siguiente ejemplo demostrar todo lo contrario. Supongamos que tenemos una concentracin celular de 10 g l -1 creciendo activamente en un medio de cultivo con un valor de p = 0.15 h -1 . Suponiendo que mo= 2.6 mg g -1 h-1 , Yx/o=1 g g-1 y que inicialmente es C = 7.8 mg l-1, calcular el tiempo transcurrido hasta que la concentracin de O 2 se hace crtica e igual a 0.5 mg l-1 . La velocidad de crecimiento ser (ec. 18)

Por tanto en escasos 17 segundos el crecimiento comenzar a estar limitado por O2, y eventualmente llegar a detenerse cuando la concentracin sea nula, a menos que sea repuesto continuamente y a una velocidad comparable a la de consumo. Este aspecto es fundamental en el diseo de biorreactores destinados a cultivos aerobios, ya que debern ser capaces de suministrar O2 a altas velocidades a fin de satisfacer la demanda. Efecto del pH y la temperatura sobre el crecimiento

Los microorganismos pueden crecer en una variada gama de pH que va desde pH = 2 para los acidfilos hasta pH = 11 para alcalfilos. En general los microorganismosque toleran pH cidos no toleran pH alcalinos y viceversa. Independientemente del pH que pueda soportar un microorganismo, es importante conocer cul es el pH ptimo para el crecimiento. En la fig. 11 est representada en forma general la variacin de um con el pH para hongos y bacterias. De la misma surge claramente que en general los hongos tienen un pH ptimo cercano a 5 mientras que para bacterias se da alrededor de pH = 7; adems debido a la forma "achatada" de las curvas, variaciones de 0.5 unidades de pH alrededor del ptimo no tienen mayor influencia. Durante el crecimiento los microorganismos modifican el pH del medio de cultivo, normalmente hacindolo disminuir; por tal motivo es frecuente incluir en el medio substancias que acten como tampon (buffer) a fin de evitar que el pH se aleje del ptimo. El efecto de la temperatura sobre el crecimiento es complejo. Por un lado cadareaccin qumica individual, de todas las que conforman el metabolismo, es afectada por la temperatura, por lo que un incremento de sta resulta en una mayor velocidad de reaccin. Esto se traduce en un aumento de pm con la temperatura (ver Fig. 12).

Por otra parte, aumentos posteriores de temperatura inactivan las enzimas que catalizan las reacciones, con lo que el valor de um decrece rpidamente. La temperatura ptima resulta de la interaccin de estos dos efectos. Como regla general, los microorganismos psicrofilos poseen temperatura ptimaentre 10 y 20 C, los mesfilos entre 30 y 40 C y, finalmente, los termfilos entre 50 y 60 C. La necesidad de mantener la temperatura de cultivo en el valor ptimo, hace que los biorreactores (fermentadores) cuenten con dispositivos apropiados para tal fin. La diversidad de productos formados por los distintos tipos de microorganismos es sumamente amplia, desde molculas muy simples como el etanol hastan las muy complejas como pueden serlo una enzima o un antgeno. Formalmente se puede entonces clasificar los productos como:

1. Productos de bajo peso molecular. Estos incluyen a alcoholes, cidos


carboxlicos, aminocidos, nucletidos, antibiticos, etc. 2. Productoosn de alto peso molecular. Los que a su vez pueden dividirse en: 1. 2.1. Componentes estructurales: Polisacridos, protenas, antgenos, etc 2. 2.2. Enzimas: Pudiendo ser stas intra o extracelulares. La industria qumica "compite con los microorganismos" tan slo en la obtencin de algunos productos de bajo peso molecular como por ejemplo el etanol o el butanol, siendo los dems de dominio exclusivo de los microorganismos y, por otra parte, la nica fuente disponible para el hombre. Cualquiera sea el producto que se desee obtener, son varios los aspectos que deben considerarse. Estos segn Pirt, pueden resumirse como:

I. II.

III. IV.

Seleccin de una cepa microbiana apropiada. Determinacin de los valores ptimos de temperatura, pH, presin osmtica. En procesos aerobios, adems, es de fundamental importancia conocer el requerimiento de oxgeno a fin de poder satisfacerlo (ver captulo 7). Determinacin y optimizacin de los requerimientos nutricionales y de laconcentracin de biomasa. Modificacin del genoma tendiente a incrementar la formacin del producto deseado.

En el captulo anterior se vio que la formacin de biomasa y de producto son procesos contrapuestos, lo cual, si bien es cierto, podra conducir al error de suponer que el nico objetivo en la formacin de un producto es maximizar Y Por otra parte el producto es una consecuencia de la actividad de los microorganismos; luego la presencia de stos tambin es importante. Este concepto puede resumirse del siguiente modo: si qp es la velocidad especfica de formacin de producto podemos poner:

p/s.

La ec. (2) indica que tanto la concentracin celular como la capacidad biosinttica de la misma (qp) son importantes en la obtencin de un producto. El concepto que resume ambos aspectos el es de productividad, esto es la cantidad de producto obtenido dividido el tiempo necesario para obtenerlo, la que puede ser mejorada entonces aumentando X, qp o ambos. Puede ocurrir que un aumento de X cause disminucin de qp, siendo necesario en tal caso encontrar una solucin de compromiso; es decir una combinacin que haga mxima la productividad. La clasificacin dada al comienzo de este captulo, no pasa de ser una mera enunciacin de todos los productos que se pueden obtener de los microorganismos. Es ms til, al menos para los productos de bajo peso molecular, clasificar los segn que funcin cumplan dentro del metabolismo. Se pueden distinguir as tres grupos:

I. II. III.

Productos finales del metabolismo energtico. Productos intermedios de metabolismo primario. Productos de metabolismo secundario.

I. Productos finales del metabolismo energtico

Son ejemplos de este grupo el etanol, cido lctico, actico, butrico, butanol, y otros compuestos asociados a procesos anaerobios. Su formacin es consecuencia directa de la degradacin de la fuente de carbono para obtener energa. Hemos visto en el captulo anterior que la energa se emplea tanto para crecimiento como para mantenimiento celular, por lo que en este tipo de productos la velocidad de formacin tendr dos contribuciones:

El primer trmino del segundo miembro expresa la velocidad de formacin de producto debida al crecimiento, y el segundo la debida al mantenimiento. La estrategia para la obtencin de estos productos consiste en contar con una concentracin celular elevada sometida a condiciones tales que el mantenimiento sea grande, lo cual puede lograrse, como hemos visto, aumentando la tonicidad del medio y tambin modificando la temperatura. Existe otra alternativa que consiste en limitar el cultivo en nitrgeno de modo tal que las clulas se vean impedidas de duplicarse al no poder sintetizar ms componentes estructurales, y la fuente de carbono se derive, principalmente va mantenimiento, hacia la formacin de producto. Por ejemplo la obtencin del etanol por levadura puede dividirse en dos etapas: en la primera el proceso es aerobio y el medio de cultivo contiene una relacin de fuente de carbono a fuente de nitrgeno apropiada para obtener un buen crecimiento. La segunda etapa se realiza en condiciones anaerobias y en un medio con escasa concentracin de fuente de nitrgeno y elevada concentracin de fuente de carbono, la cual es convertida prcticamente en un 90% en etanol y CO2 . En este caso la tolerancia de la levadura al etanol es un aspecto importante a considerar.

II. Productos intermedios de metabolismo primario

Pertenecen a este grupo los aminocidos, los nucletidos, las vitaminas, los cidos orgnicos, y pueden incluirse tambin biopolmeros como enzimas. Los procesos de obtencin son aerobios y la formacin de estos productos ocurre principalmente en organismos que han sido sometidos a mutaciones o que se los hace crecer en medios deficientes. En cualquier caso lo que se pretende es lograr una regulacin anormal del metabolismo tal que la fuente de carbono y energa se derive hacia la formacin del producto deseado. Por ejemplo, para la obtencin de lisina se emplean cepas de Corynebacteriuin glutamicum que carecen de la enzima Homoserina deshidrogenasa, de este modo resulta ser auxotrofo para metionina y treonina (ver fig. 13). Adems la enzima deshidroxipicolinato sintetasa no es inhibida por lisina. Esta conjuntamente con la treonina ejercen inhibicin concentrada sobe la Aspartatoquinasa de modo tal que an en este mutante no se acumular lisina si en el medio de cultivo hay treonina libre. La estrategia para obtener lisina consiste en realizar el cultivo en condiciones tales que la concentracin de treonina libre sea mnima, lo cual se consigue alimentando el cultivo con este aminocido y tratando de mantener su concentracin en valores muy pequeos. As se evita la inhibicin concertada, con lo cual la lisina, al no ejercer retroinhibicin sobre la dihidroxipicolinato sintetasa, se acumula en el medio de cultivo. El ejemplo visto es demostrativo de la importancia que tiene el conocimiento del metabolismo y su regulacin en el momento de seleccionar los mutantes

apropiados, como as tambin la eleccin de una tcnica de cultivo adecuada en el momento de la produccin. En general, y a diferencia de los productos pertenecientes al primer grupo, no existe una relacin directa entre la generacin de energa y la sntesis de los productos de este grupo. Volviendo al ejemplo de la lisina, por cada mol formado se forman cuatro de NADH y se consume uno de ATP, por lo que la formacin de lisina est asociada en una formacin neta de ATP si se tiene en cuenta el poder reductor acumulado. La cintica de formacin de estos productos es ms compleja que los del grupo 1, y no existe hasta el momento ninguna expresin simple que abarque a todos, si bien Roels y Kossen han propuesto la siguiente ecuacin para ser ensayada con este tipo de productos.

La misma posee gran flexibilidad ya que e puede tomar cualquier valor mayor que cero, lo que permite ajustar distintas relaciones entre q p y m. Por ejemplo si e = 1, la relacin entre qp y p es directa; sie = 100 se tiene que qp alcanza valores cercanos al mximo an a valores pequeos de m/mm. En general, y cualquiera sea el producto, se trata siempre de encontrar que tipo de relacin existe entre qp y m, ya que ste es uno de los factores a tener en cuenta en el momento de planear la estrategia d produccin. III. Productos de metabolismo secundario Pertenecen a este grupo los antibiticos, las toxinas, los alcaloides y las giberelinas. Histricamente se ha considerado a los metabolitos secundarios como aquellos que no son indispensables para las funciones vitales del microorganismo, a diferencia de los metabolitos primarios, aunque tal afirmacin se encuentre actualmente en revisin. Cualquiera sea el caso, existen algunas caractersticas que diferencian a este grupo del anterior. Frecuentemente los precursores especficos para la biosntesis de estos productos son obtenidos por modificacin de metabolitos primarios. As muchos antibiticos contienen en su molcula aminocidos infrecuentes como D-aminocidos, N-metil aminocidos, b-aminocidos o iminocidos; o azucares modificados, bajo la forma de dimetil aminoazcares. Por otra parte estos precursores suelen ser limitantes de la biosntesis. Por ejemplo la adicin al medio de cultivo de cido fenil actico estimula la produccin de Bencil penicilina, los cidos a-aminobutrico ya,g-diaminobutrico son limitantes

de la biosntesis de colistina. En estos casos la supresin de los mecanismos de regulacin de la sntesis de los precursores puede resultar en un incremento en la produccin. Otra caracterstica interesante es que algunas enzimas del metabolismo secundario no posee alta especificidad por el sustrato. Un ejemplo bien conocido es el de la penicilina aciltransferasa del Penicillium chrysogenum, que cataliza el intercambio del resto a-aminoadipil de la penicilina N (amino adipil penicilina), por restos acdicos hidrofbicos (ver Fig. 14). La enzima es especfica para uno de los sustratos, el cido 6-amino-penicilnico, mientras que es relativamente inespecfica para el precursor de la cadena lateral, el cual debe poseer el grupo CH2 - COOH terminal para ser incorporado. Finalmente, y ya en relacin a la produccin, la mayora de los productos de este grupo comparten la propiedad de formarse cuando los microorganismos crecen a bajos valores de m. Se cree que una de las causas sera el fenmeno conocido como represin catablica ya comentado, por el cual estara reprimida la biosntesis de las enzimas asociadas al metabolismo secundario cuando el crecimiento ocurre a valores de m altos, mientras que se desreprimira a valores dem bajos. Durante aos, se utiliz lactosa como fuente carbonada para la obtencin de penicilina porque daba mejores rendimientos que la glucosa. La diferencia radicaba en que la lactosa era metabolizada lentamente por el hongo, y la glucosa rpidamente. En la actualidad se emplea esta ltima como fuente carbonada, pero suministrndola lentamente al cultivo a fin de regular m a valores compatibles con la sntesis de penicilina. El cultivo continuo y el bath alimentado, ya mencionados en el captulo 2 y que se estudiarn en el captulo 7, son sistemas de cultivo que permiten regular la velocidad de crecimiento, y por tanto muy apropiados para obtener este tipo de productos.

Los productos de este grupo comparten con el anterior la necesidad de un adecuado suministro de oxgeno para su formacin. Cuando este requisito no es satisfecho los rendimientos disminuyen.