Protenas de membrana externa en cepas patgenas aviares de Escherichia coli adherentes al colgeno tipo IV.

Luz Elena Vidales Rodrguez, Laura Libier Salazar Serrano, Rosa Mara Ramrez Santoyo*, Yolanda Almanza Mrquez*. Departamento de Enfermedades Infecciosas de la Unidad Acadmica de Biologa Experimental de la Universidad Autnoma de Zacatecas. Calzada de la revolucin mexicana s/n Col. Tierra y Libertad. Guadalupe, Zacatecas, C.P. 98600, Tel. y Fax: (014)92-1-13-26. *Correspondencia: Email: colv21@hotmail.com y romaras@hotmail.com

Resumen: Las protenas de membrana externa (Omp) de las bacterias patgenas

Gram negativas adems de participar en el transporte y como receptoras de fagos y colicinas, tambin pueden desempear junto con otros factores de virulencia un papel importante en la patogenicidad. En el presente trabajo se estudiaron los patrones electroforticos con PAGE-SDS y Western blot de las Omp de cepas deEscherichia coli aviares patgenas y de flora indgena adherentes y no adherentes al colgeno tipo IV. En las cepas adherentes, 3 de ellas patgenas y una de flora indgena, slo en las patgenas se detect una banda de peso aproximado de 92 kDa, lo que es indicativo de que se requiere de caractersticas adicionales presentes en las cepas patgenas, pero no en las indgenas. Por otro lado, dentro del grupo de cepas no adherentes probadas, se usaron dos cepas APEC y la cepa del laboratorio K12 711, as como las cepas indgenas CA2 y CA5, ninguna present la banda mencionada. Estos hallazgos nos permiten proponer que la Omp de peso aproximado de 92 kDa est asociada a la capacidad de adherencia al colgeno tipo IV de las cepas APEC. Tambin se detect una banda de peso aproximado de 39 kDa nicamente en las cepas patgenas.

Antecedentes
La membrana externa es un componente importante de la pared celular de las bacterias Gram negativas. Se encuentra externamente al peptidoglicano y est constituida principalmente por fosfolpidos, lipoprotena mureina llamada de Braun, lipopolisacrido (LPS) y protenas a las que se les denomina protenas de membrana externa (Omp). Las Omp han sido ampliamente estudiadas para entender su papel en la estructura y funcin de la clula bacteriana. Aproximadamente el 50% de la masa seca de la membrana externa de las bacterias Gram negativas son protenas (1, 2). En la bicapa de fosfolpidos de la membrana externa flotan ms de 100,000 canales protenicos individuales. que se clasifican en tres grandes grupos (1, 2): 1.- Las porinas, llamadas tambin protenas de matriz o protenas principales de membrana por ser las mas abundantes (en trminos de masa, ellas representan hasta el 2% del total de las protenas de la clula), forman canales de gran tamao que permiten la difusin pasiva de iones y molculas hidroflicas = 600 daltons a travs de la membrana. Las porinas mas conocidas de E. coli son el trmero PhoE (38,782 Da), OmpF (38,306 Da) y OmpC (37,683); cada subunidad produce un canal, por lo que el trmero tiene tres canales. La protena PhoE se expresa nicamente en condiciones de estarvacin de fosfato . En medio de cultivo usual solamente la OmpF y la OmpC se producen .

Cuando el complejo pptidoglicano-membrana externa se extraen con SDS a temperaturas inferiores a 60C, la mayora de las protenas se rezagan en la fraccin insoluble. Las porinas pueden ser solubilizadas con sus trmeros fuertemente asociados incluyendo 1M NaCl en la solucin de SDS. Se requiere calentar en SDS a una temperatura superior a los 70C para desnaturalizar a las porinas y disociarlas en subunidades monmericas. Cuando E. coli se encuentra en el aparato digestivo, a 37C y en ambiente de osmolaridad alta, sintetza sobre todo OmpC (la porina mas pequea). Se cree que la OmpC protege a la bacteria de los efectos txicos de las sales biliares, pero permiten que los nutrientes penetren en la clula. Cuando E. coli se encuentra en el agua, donde se desarrolla a temperaturas inferiores, en un ambiente de baja osmolaridad y y con escasez de nutrientes, sintetza sobre todo OmpF. 2.- Las protenas similares a las porinas, la mas estudiada es la Lam, que es receptora del fago lambda y que facilita la difusin pasiva especfica de la maltosa y otros solutos pequeos. 3.-Receptores Ton dependientes, son porinas inducibles en pequeas cantidades que se caracterizan porque los receptores estn enlazados a una protena dependiente de energa llamada TonB localizada en la membrana citoplasmtica.. Los receptores TonB se enlazan con molculas de gran tamao y escasas como la vitamina B12 y los complejos quelantes de Fe+ facilitando su desplazamiento hacia el periplasma.

Algunas cepas de E. coli producen porinas alternativas o adicionales como la protena 2 o Lc, codificada por un profago. Las cepas encapsuladas de E. coli frecuentemente producen una porina caracterstica, la protena K (184,210). Algunos ejemplos de Omp asociadas a transporte especfico se muestran en el cuadro 1 (1, 2). Otras protena muy estudiada de la membrana externa es la OmpA (35,159), monmero cuya funcin est asociada a la integridad estructural y forma de la clula. Puede ser extrada por SDS a baja temperatura, sin embargo, su movilidad en PAGESDS disminuye a 100C por su desnaturalizacin, por lo que se conoce como modificable al calor. Hay aproximadamente 105 molculas de OmpA per clula; es receptora de fagos y de pelo sexual y est involucrada en la captacin de aminocidos y pptidos (1, 2). Prcticamente todas las protenas de membrana externa son hidroflicas y tienen una estructura de barriles una vez que han sido completamente ensambladas, requisito para que pasen del espacio periplsmico a su lugar en la membrana externa. Esta es una diferencia marcada con las protenas de la membrana citoplasmtica, la mayora de conformacin a hlices que pueden insertarse sucesivamente de una por una (2). Las Omp en la patogenicidad La estructura y funcin de las Omp estn siendo ampliamente estudiadas y en aos recientes se han relacionado algunas de estas protenas con los mecanismos de patogenicidad bacteriana. Asi, las protenas OmpC y Omp F de E. coli pueden actuar como modulinas al estimular la sntesis de citosinas (3, 4).

Algunas protenas se pueden asociar al lpido A (LAP) del LPS y tener actividades biolgicas diferentes del LPS slo. El complejo LAP es muy estable, ya que al calentarlo a 100C durante 30 minutos y someterlo a tripsina durante dos horas, no se disminuye su actividad biolgica. El efecto modulador o simulador de citocinas vara segn la especie bacteriana, en E. coli pueden inducir la formacin de colonias de granulocitos/macrfagos y este efecto puede ser bloqueado por neutralizacin con antisuero anti-IL-1 . La protena activa en la preparacin LAP tiene una masa molecular de 17 kDa (3, 4).
Cuadro1.- Algunas protenas de membrana externa asociadas a transporte Especfico (2).

Los pesos moleculares se calcularon de las secuencias nucleotdicas. Los valores con asteriscos son el peso molecular aparente, deducido de la movilidad en PAGE-SDS. La expresin de Omp25 de Brucella suis, una bacteria intracelular facultativa, inhibe la produccin de FNT-a durante su infeccin a macrfagos, como una estrategia para sobrevivir y multiplicarse intracelularmente en el husped . El FNT-a es una citocina

pro-inflamatoria que estimula a las clulas presentadoras de antgeno y participa en la iniciacin de la respuesta inmune (5). E. coli es la bacteria Gram negativa ms comn de casos de meningitis neonatal en humanos, su principal va de entrada es la hematgena, aunque no est claro su neurotropismo el principal blanco de estas cepas son las clulas endoteliales de la microvascularizacin cerebral (no as en las clulas endoteliales sistmicas). La expresin de OmpA y de Ibe 10 son necesarias para la invasin bacteriana y para inducir la acumulacin de actina, probablemente mediante la activacin de seales de transduccin. La OmpA se une a eptopes GlcNAc 1-4GlcNAc de las glicoprotenas de las clulas endoteliales de la microvascularizacin, disparando seales para la polimerizacin de la actina. (nov 99). OmpA tambin participa en la resistencia a la accin bactericida del suero (6-9). La interaccin entre las bacterias patgenas y sus productos con los tejidos o protenas solubles del husped es crucial durante las enfermedades infecciosas. Una gran variedad de bacterias se pueden unir a protena del husped, en especial a protenas de la matriz extracelular como el colgeno, la laminina y la fibronectina. La protena YadA de Yersinia est asociada a diversas funciones de virulencia como son la resistencia a la accin ltica del complemento, resistencia a la fagocitosis, adherencia a clulas mamferas y ms recientemente se ha demostrado que media la unin especfica a los colgenos tipo I, II, III, IV, V y IX as como a la fibronectina celular. Esta interaccin podra ser la adhesin inicial a la membrana basal del husped. (10, 11). Efectos similares producidos por la Omp YopE de Yersinia pseudotuberculosis se han reportado (12). Se ha propuesto que la protena EspD de E. coli enterohemorrgica participa en el ensamble de un apndice que le permite a las bacterias adherirse a la clula blanco y participa en la traslocacin de molculas efectoras mediante el sistema de secrecin III (13) Molculas de superficie asociadas a la patogenicidad de E. coli aviar En el estudio de la patogenicidad bacteriana de la enfermedad respiratoria y la colisepticemia causadas por cepas patgenas aviares de E. coli(APEC), es de gran inters detectar las molculas de superficie que pudieran actuar como mediadoras en la adherencia a los tejidos o protenas solubles del husped, dado que la adherencia y colonizacin son el primer paso para que se presente la enfermedad. Aunque en E. coli se han detectado 171 antgenos de superficie somticos O (constituyentes del LPS), 103 antgenos capsulares K y ms de 56 antgenos flagelares H, apenas algunos serotipos y serogrupos se presentan en las cepas APEC, y su papel en la patogenicidad parece ser ms importante durante la diseminacin de la bacteria en el husped, ya que se han asociado a las resistencias al complemento y a la fagocitosis. Otras protenas de superficie cuya participacin en la patogenicidad de las cepas APEC llaman la atencin son los apndices fimbriales Tipo 1, curli y P, as como la protena Tsh, hemoaglutinina sensible al calor, cuya fraccin de 33 kDa se queda anclada transmembranalmente, mientras que la fraccin de 106 kDa es secretada (14-17).

El papel de la fimbria tipo 1 en la adherencia al epitelio traqueal es controversial, pero no se descarta que esta fimbria pudiera participar en la colonizacin de los pulmones. Aunque se reporta que es muy frecuente en cepas APEC, nosotros encontramos que tambin es muy frecuente en cepas de E. coli de pollos sanos (18).Las adhesinas fimbriales P se han detectado en algunas cepas APEC y se ha correlacionado con algunos serogrupos y serotipos, as, Van den Bosh et al encontraron que el 92% de 203 aislamientos de E. coli de pollos con septicemia expresaron esta fimbria cuando los serotipos fueron O1:K1, O2:K1 y O78:K80. Fuertes evidencias sugieren que las cepas expresan esta fimbria al colonizar pulmones pero no al colonizar traquea . La participacin de curli en procesos patognicos no es claro, pero se ha propuesto que estas estructuras filamentosas median la unin bacteriana a protenas de la matriz extracelular y a protenas del suero como a la fibronectina, laminina, plasmingeno y protena activadora del plasmingeno. Algunos investigadores han reportado que el gen csgA que codifica para la subunidad principal de curli se encuentra tanto en cepas de E. coli aislada de aves enfermas como de E. coli comensal aislada de pollos sanos. En cambio, llama la atencin que Tsh, se detecta frecuentemente en cepas APEC, pero no en E. coli de aves clnicamente sanas. Se ha propuesto que el gen tsh se encuentra localizado en el plsmido relacionado con la virulencia ColV. Tsh se ha asociado con la resistencia a la accin bactericida del suero y con lesiones en sacos areos (14-17). An cuando existe cierta uniformidad en los serogrupos que causan colisepticmia, los estudios de polimorfismo en las protenas de membrana externa, fimbria y enzimas metablicas revelan una variacin gentica sustancial. En los estudios de los patrones de las Omp de cepas APEC se han encontrado divergencias entre varios autores, por lo que proponen que probablemente se debe a que usaron diferentes condiciones de cultivo y procedimientos para su aislamiento. Aunque algunas Omp como la OmpA se ha demostrado que participa en la virulencia, la contribucin de la variacin entre las otras Omp para diferencias en la virulencia y en la patognesis de la colisepticemia aviar se desconoce (19). Recientemente en nuestro laboratorio se encontr que de 6 cepas APEC aisladas de septicemia, 4 mostraron una alta adherencia al colgeno tipo IV, en contraste, de las cinco cepas de E. coli de la flora indgena slo una mostr adherencia significativa a este componente de la matriz extracelular (19). Con la finalidad de determinar si haba diferencias entre los patrones electroforticos con PAGE-SDS y Western blot de las Omp de cepas de Escherichia coli aviares patgenas y de flora indgena adherentes y no adherentes al colgeno tipo IV se realiz el presente trabajo.

Material y Mtodos:

Cuadro 2.- Calendario de inmunizacin a conejos N.Z. para obtener anticuerpos Policlonales anti-Omp.La fuente de Omp fue la cepa YA21 adherente al colgeno. ACF = Adyuvante completo de Freund; SC = Subcutneo; IM = intramuscular. Microorganismos: Se utilizaron 4 cepas de E. coli que de acuerdo a estudios previos presentaron adherencia positiva al colgeno tipo IV: YA26, EI35, CA4,YA2114; y 3 cepas de E. coli que presentaron adherencia negativa al colgeno tipo IV: YA4, K12711 y YA2106. Para ensayos comparativos entre bacterias patgenas y de flora normal se utilizaron adems las cepas:CA2,CA3 y CA5 aisladas de aves clnicamente sanas (18). Obtencin de Protenas de Membrana Externa (Omp): Las bacterias se crecieron en 5 ml de caldo infusin cerebro corazn (CICC) a 37C toda la noche, en condiciones estticas. El cultivo bacteriano se concentr por centrifugacin a 10,000 rpm y se lav dos veces con Na2HPO4 10mM pH 7.2, el paquete celular mantenido en cama de hielo fue sonicado por pulsos de 30 segundos hasta que la muestra se clarific; la cual se centrifug por 2 minutos a 12000 rpm a 4C; se separ el sobrenadante en el cual estn contenidos los fragmentos de membrana externa y nuevamente se centrifug por 30 minutos a 12000 rpm a 4C, el botn obtenido se resuspendi en Na2HPO4 10 mM pH 7.2/tritn X-100 al 2% y enseguida se incub por media hora a 37C y centrifug nuevamente por media hora a 4C y 12000 rpm, pasado este tiempo se realiz un lavado con Na2HPO4 10mM pH 7.2 para finalmente resuspender las protenas obtenidas en PBS pH 7.4. Se le adicion PMSF 0.2mM como inhibidor de proteasas y se congel hasta su uso. Produccin de anticuerpos anti-Omp: Se utilizaron conejos machos Nueva Zelanda de 6 meses de edad. El calendario de inmunizacin se describe en el cuadro 2. Descomplementacin y adsorcin de suero hiperinmune anti-Omp: El suero hiperinmune fue descomplementado a 56C durante 30 min. Para la adsorcin del suero hiperimune anti-Omp contra la fimbria tipo 1, se utiliz la cepa YA11 de E. coli que por ensayos de aglutinacin con Candida albicans ha mostrado ser positiva para la expresin de esta estructura (20). Se cultiv la cepa YA11 en 50 ml de caldo infusin cerebro corazn (CICC) en condiciones estticas a 37C; las bacterias se concentraron mediante centrifugacin a 3000 rpm a 4C por 10 minutos y el paquete bacteriano se lav dos veces con PBS; posteriormente se ajust D.O.620nm hasta 1.5 de absorbancia con PBS-gel para obtener una cantidad de bacterias de 109 UFC/ml y se hicieron diluciones decimales en PBS hasta 10-2 en la cual se obtiene una poblacin bacteriana de 107 UFC/ml. Esta suspensin bacteriana se mezcl 1:1 (vol/vol) con el suero de conejo hiperinmune descomplementado y se someti a incubacin a temperatura ambiente con oscilacin suave por 15 minutos; enseguida se centrifug a 10000 rpm a 4C por 10 minutos y se recuper el sobrenadante. El suero hiperinmune fue sometido a una segunda absorcin contra las protenas de membrana externa de la cepa YA21-6 de E. coli que previamente a mostrado negativa a la adherencia al colgeno tipo IV. El suero se mezcl con las Omp obtenidas de la manera ya descrita de la cepa YA21-6 durante 15 minutos a temperatura ambiente y en oscilacin suave, posteriormente se centrifug y se filtr (poro de 0.45mm) y se congel hasta su uso.

PAGE- SDS y electrotransferencia (21): Las Omp se sometieron a una electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones reductoras (). Se utiliz un gel separador de gradientes de 8% y 18% de acrilamida y un gel concentrador de 4%. Para los ensayos comparativos entre cepas adherentes y no adherentes al colgeno tipo IV se corrieron 35ml de Omp de las cepas adherencia positiva: YA26, EI35, CA4 y YA21-14; y 70ml de las cepas adherencia negativa: YA4, K12-711 y YA21-6; por carril, en tanto que para los ensayos comparativos entre el grupo de cepas patgenas: YA26, EI35 y YA21-14; y el de cepas aisladas de aves clnicamente sanas: CA2, CA4, CA5 y CA1 se corrieron 35ml de Omp por carril. Como estandar de peso molecular se utilizaron: miosina (200 kDa), b-galactosidasa (116 kDa), fosforilasa B (97 kDa), ASB (66.2 kDa), ovolbumina (45 kDa), anhidrasa (31 kDa), inhibidor de la tripsina (21.5 kDa Bio-Rad). La electroforsis se corri a 150 volts por aproximadamente 8 horas Al terminar el corrimiento uno de los geles fue teido con azul de Coomassie R-250 y a partir de los geles no teidos las protenas fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa, utilizando una cmara de sistema semi-seco (Bio-Rad) a 15 volts durante 15 minutos a temperatura ambiente; al trmino de la transferencia las bandas fueron reveladas con el colorante verde rpido, luego fueron lavadas con agua destilada. Western Blot (21):. La membrana de nitrocelulosa se bloque en PBS-leche al 3% toda la noche, posteriormente se le realizaron dos lavados con PBS-Tween 20 al 0.5% seguido de tres lavados con PBS, luego se incub con el suero hiperinmune descomplementado y adsorbido a una dilucin 1:200 en PBS leche al 3% por 1 hora en agitacin suave, pasado este tiempo se realizaron nuevamente tres lavados con PBSleche 3%, dos lavados con PBS-Tween 20 al 0.5% y tres con PBS de 5 minutos cada uno en agitacin suave, para enseguida incubar por 1 hora con el segundo anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa a una dilucin 1:1000 en PBS-leche 3%, se hicieron tres lavados con PBS, dos lavados con PBS-Tween 20 0.5% y tres con PBS. La bandas inmunorreactivas de las cepas de E. coli adherentes y no adherentes al colgeno tipo IV se revelaron utilizando como sustrato diaminobencidina (Sigma) (0.25 g de diaminobencidina en 50ml de PBS y 7.5 ml de H2O2) y el inmunoblot del grupo de cepas patgenas y de cepas aisladas de aves clnicamente sanas fue revelado con quimiluminiscencia (Amersham- Pharmacia) exponindolo a una pelcula Kodak Biomax ML en un casette con pantalla intensificadora.

Resultados:

Figura 1. SDS-PAGE de Omp de cepas de E. coli adherentes (3-6) y no adherentes (7-9) al colgeno tipo IV. 1. ASB; 2. Marcador de peso molecular; 3. YA26 adh. +++; 4.CA4 adh+++; 5.EI35 adh +++; 6. YA21-14 adh +++; 7.YA21-6 adh -; 8. YA4 adh -; 9.K12-711 adh. -.

Figura 2. SDS-PAGE de Omp de cepas de E. coli patgenas (3-5) y cepas de E. coli aisladas de aves clnicamente sanas (6-9). 1. ASB; 2. Marcador de peso molecular; 3.YA21-14; 4. EI35; 5. YA 26; 6. CA2; 7.CA4; 8. CA5; 9. CA1.

Figura 3. Western-blot revelado por diaminobencidina de Omp de cepas de E. coli adherentes al colgeno tipo IV: 1)YA26; 2) YA21-14; 3) EI35; 4) CA4y no adherentes al colgeno tipo IV: 5)YA 2106; 6) YA4; 7) K12-711.

Figura 4. Quimiluminicencia de Omp de cepas de E. coli aviar patgenas: 1)YA2114; 2) EI35; 3)YA26 y cepas de E. coli aisladas de aves clnicamente sanas: 4) CA2; 5) CA4; 6) CA5.

Resultados: Deteccin de Omp en cepas adherentes y no adherentes al colgeno tipo 1V

Los estudios de Western blot permitieron detectar diferencialmente una banda que se encuentra en el rango entre 97 y 45 kDa, presente nicamente en las cepas patgenas adherentes (figulas 3 y 4), dicha banda no se detect en las Omp de la cepa indgena CA4 adherente al colgeno (fig. 4).

Deteccin de Omp en cepas APEC y en cepas indgenas aisladas de pollos sanos

El anlisis de los PAGE-SDS, permiti detectar adems de las Omp principales OmpF y OmpC ampliamente descritas, una banda de aproximadamente 39 kDa exclusivamente en las cepas patgenas. En contraste, en los patrones de las Omp de cepas aisladas de pollos sanos, nicamente se detectaron las dos bandas de 38,000 y 37,000 caractersticas.

Discusion:
Es un gran reto entender como se desarrolla la fisiopatologa de la colisepticemia aviar y la manera como E. coli utiliza sus molculas de superficie en eventos especficos. Un hallazgo sorprendente al analizar los PAGE-SDS fue el encontrar claras diferencias entre las Omp principales de las cepas APEC y las de la flora indgena. Detectndose claramente una banda de Omp de peso aproximado de 39 kDa (fig. 2), adems de las esperadas OmpF y OmpC en las patgenas, inclusive, en la figura 1 se visualiza que las Omp de las cepas CA4 de flora indgena (carril 4) y de la cepa de laboratorio avirulenta K12 711 (carril 9) nicamente presentan dos bandas, quiz parte de estos resultados se deban al rigor con que se seleccionaron las cepas indgenas, ya que de 80 aislamientos de E. coli provenientes de pollos clnicamente sanos nicamente se seleccionaron cinco que mostraron ser ColV- y fimbria tipo 1 negativos (), caractersticas asociadas a la patogenicidad , por lo que ser importante ampliar estos estudios para elucidar si esta banda adicional corresponde a PhoE as como su papel en la patogenia e inmunogenicidad en la colisepticemia aviar. Resulta interesante observar los resultados de los estudios en Western blot, ya que se detect una banda caracterstica en los rangos entre 97 kDa y 45 kDa nicamente en las Omp de cepas patgenas adherentes al colgeno tipo (no se detect en las cepas APEC YA4 ni en la YA2106, no adherentes). En contraste, dicha banda no se observ en la cepa indgena CA4, a pesar de ser adherente al colgeno tipo IV (figura 3). Es importante mencionar que una cepa, la YA4, a pesar de ser muy virulenta (DL50 1.6X107) () no mostr la capacidad de adherencia al colgeno tipo IV ni present el patrn de Omp observado en las cepas patgenas adherentes, lo que pudiera ser indicativo de que dicha banda podra estar relacionada con la capacidad de adherencia bacteriana a esta protena de la matriz extracelular. Sin embargo, ser necesario realizar pruebas ms finas utilizando anticuerpos especficos contra esta Omp para elucidar su papel como adhesina. Asimismo, estos hallazgos corroboran la gran diversidad de fenotipos asociados a la patogenicidad. Por otro lado, de las cepas de E. coli aisladas de pollos clnicamente sanos, la CA4, a pesar de ser adherente al colgeno tipo IV, no present la banda caracterstica que presentaron las cepas patgenas adherentes, lo que pudiera ser indicativo de que se requieren otros atributos, presentes en las cepas APEC, pero no en las indgenas para que se exprese esta protena.

El conocimiento cabal de los eventos que interactan durante el desarrollo de la colibacilosis aviar, permitir desarrollar estrategias para su prevencin y control, de manera objetiva.

Reconocimientos: Conacyt: 3788-M Universidad Autnoma de Zacatecas. Literatura Citada 1. Walker, S.: Clasificacin, estructura y funcionamiento de las bacterias, en
Microbiologa, macGraw Hill Interamericana. Mxico 2000.

2. Nikaido H. : Outer memmbrane in Escherichia coli and Salmonella cellular and

molecular biology. Neidhardt, F. Editor in chief. 2d. Ed., ASM Press. 1999

3. Henderson, B., Poole, S., and Wilson, M.: Bacterial modulins: a novel class of
virulence factors wich cause host tissue by inducing cytokine sntesis. Microv. Rev. 60 (2): 316-341. 1996.

4. Williams, K., Bigley III, E., and Raybourne, R.: Identification of murine B-cell and Tcell epitopes of Escherichia coli outer membrane protein F with syntetic polipeptides. Infect. Immun. 68 (5): 2535-2545. 2000.

5. Jubier-Maurin, V., Biogegrain, A., Cloeckaert , A., Gross, A., lvarez-Martnez, M.,
Terraza, A., Liautard, J., Khler, S., Rouot, B., Dornand, J., and Liautard, J.: Major outer membrane protein Omp25 of Brucella suis is involved in inhibition of tumor necrosis factor alpha production during infection of human macrophages. Infect. Immun. 69 (8): 4823-4830. 2001.

6. Prasadarao, N., Wass, C., Stins, M., Huang, S. and Kim, K.: Outer membrane
protein A of Escherichia coli contributes to invasion of brain microvascular endothelial cells . Infect. Immun. 64 (1): 146-153. 1996.

7. Prasadarao, N., Wass, C., and kim, K.: Endotelial cell GlcNAc1-4GlcNAc epitopes for
outer membrane protein A enhance traverssal of Escherichia coli across the blood-brain barrier. Infect. Immun. 64 (1): 154-160. 1996.

8. Prasadarao, N., Wass, C., Stins, M., Shimada, H., and Kim, K.: Outer membrane
protein A-promoted actin condensation of brain microvascular endothelial cells is required for Escherichia coli invasion. Infect. Immun. 67 (11): 5775-5783. 1999.

9. Weiser, J. and Gotschlich G.: Outer membrane protein A (OmpA) contributes to

serum resistance and pathogenicity of Escherichia coli K-1 . Infect. Immun. 59(7): 2252-2258. 1991.

10. Schulze-Koops, H., Burkhardt, H., Heesemann, J., Kirsh, T., Swuboda, B., Bull, C.,
Goodman, S. and Emmrich, F.: Outer membrane protein YadA of enteropathogenic

yersiniae mediates specific binding to cellular but not plasma fibronectin. Infect. Immun. 61 (6): 2513-2519. 1993von der Mark, K.,

11. Schulze-Koops, H., Burkhardt, H., Heesemann, J., von der Mark, K., and Emmrich,
F.: plasmid-encoded outer membrane protein YadA mediates specific binding of enteropathogenic Yersiniae to various types of collagen. Infect. Immun. 60(6): 21532159.1992.

12. Tafazoli, F., Holmstrm, A., Forsberg, A., and magnusson, K.: Apically exposed,
tight junction-associated 1-integrins allow binding and YopE-mediated perturbation of epithelial barriers by wild-type Yersinia bacteria. Infect. Immun. 68 (9): 5335-5343. 2000.

13. Kresse, A., Rohde, M., and Guzmn, C.: The EspD protein of
enterohemorragic Escherichia coli is requuired for the formation of bacterial surface appendages and is incorporated in the cytoplasmic membranes of target cells. Infect. Immun. 67 (9): 4834-4842. 1999.

14. Blanco, M., Blanco, J. Mora, A., y Blanco J.: Escherichia coli septicmicos aviares:
serotipos, factores de virulencia, resistencia a los antibiticos y desarrollo de vacunas. Med. Vet. 13: 525-535. 1996.

15. Emery, D., Naraja, K., Sivandan, JV., Lee, B., Zhang, C. And Newman, J.:
Endotoxin lipopolysaccharide from Escherichia coli and its effects on thephagocytic function of systemic and pulmonary macrophages in turkey avian. Avian Dis. 35: 901909. 1991.

16. Lpez, J.: Escherichia coli: mechanisms de patogenicidad. Ciencia Vet. :1-99. 1975. 17. Dho-Moulin, M. And Fairbrother M.: Avian pathogenic Escherichia coli (APEC). Vet.
Res.: 299-316. 1999.

18. Snchez Villanueva C.: Adherencia de Escherichia coli patgena aviar al colgeno
de la matriz extracelular. Tesis M. en C. U.A.Z. 2001.

19. Kapur V., Withe, D., Wilson, R., and Whittam, T.: Outer membrane protein patterns
mark clones of Escherichia coli O2 and O78 strains that cause avian septicemia. Infect. Immun. 60(4): 1687-1691. 1992.

20. Ramrez, R., Moreno, A. Y Almanza Y.: Factores de virulencia de Escherichia

coli asociados a la colisepticemia en pollos de engorde. Rev. Arg. Microbiol. 33:52-57. 2001.

21. Gallagher, S. And Smith, J.: Electrophoretic separation of proteins. In: Current
protocols in molecular biology. Edited by:Ausubel, F. 2: 10.2.1.-10.- 10.2.21. Massachusetts general Hospital Harvard Medical School. Massachusetts. 1991.