Spindle Self-organization and Cytokinesis During Male

Meiosis in asterless Mutants of Drosophila melanogaster

Silvia Bonaccorsi, Maria Grazia Giansanti, and Maurizio Gatti
Istituto Pasteur-Fondazione Cenci Bolognetti, Dipartimento di Genetica e Biologia Molecolare, Universita di Roma La
Sapienza, 00185 Rome, Italy
Resumen. Mientras los meiosis hembras Drosophila es anastral, ambas divisiones del meiotica en varones de
la Drosfila exhiben asteres conspicuos. Hemos identificado un gene que llamamos asterless (asl) que es
requerido para la formacin del aster durante meiosis masculinos. El anlisis Ultrastructural demostr que los
mutantes del asl tienen centriolos de morfologa normal. Cmo dirigi alguna vez, immunostaining con
anticuerpos ya sea a o centrosomin revelado que estas protenas no se concentre en los
centrosomas, como ocurre en el tipo descabellado. As, asl parece especificar una funcin requerida para la
asamblea de centrosoma material alrededor de los centriolos.
A pesar de la ausencia de asteres, clulas meiotica de asl mu tants se ingenian para desarrollar un malacate
del anastral. Microtbulos orignese de sitios mltiples alrededor de los cromosomas, y luego enfoque en un
malacate bipolar peculiar que media segregacionismo del cromosoma, aunque en una forma altamente
irregular.
Sorprendentemente, los espermatocitos asl eventualmente forjan una normalidad del morphologically ana el
caballito de San Vicente central telofase que tiene habilidad completa para estimular citocinesis. Este reto de
find-ings la vista clsica en as-sembly central del malacate, argumentando a favor de una autoorganizacin de
esta estructura de cualquier microtubules preexistentes o recin formados. Adems, estas conclusiones
fuertemente sugieren que lo asters no es requerido para dar seas de citocinesis.
Desarrollo
El segregacionismo del cromosoma durante ambos mitosis y meiosis es mediado por el malacate, una
estructura bipolar complicada consistente en microtubulos y protenas asociadas. Aunque la estructura bsica
de lo spin-dle es similar en todo lo que la celda escribe de todos los eucariotas ms altos, las rutas a travs de
las cuales el malacate se rene puede sustancialmente ser diferente (revisado por Rieder Et Al., 1993; Mer-
des y Cleveland, 1997; Las Aguas y el Salmn, 1997).
En celdas animales del mitotica, la formacin del malacate es mediada por los centrosomas. Durante la
profase, duplic centro-somes, mientras traslado para lo contrario empuja con una prtiga de la celda,
conjuntos imponentes radiales nu cleate de microtubules designados los asteres. Despus de que la falla del
sobre nuclear, los fines de ventaja de microtubules astrales sean captados y estabilizados por el ki-
netochores, consintiendo la formacin de un malacate bipolar.
En el contraste, las celdas ms altas de la planta y las celdas hembras del meiotica de varias especies
animales como Caenorhabditis, Drosfila, o Xenopus, no contienen centrosomas (Smirnova y Bajer, 1992;
Albertson y Thompson, 1993; Theurkauf y Hawley, 1992; Gard, 1992). En estos sistemas, microtubulos
orignese de sitios mltiples alrededor de los cromosomas y progresivamente auto-organice en un malacate
bipolar. Los estudios en meiosis hembras Drosophila y en asamblea del malacate del vitro de extractos del
huevo Xenopus han demostrado ese microtubulos enfocndose en polos del malacate es mediado por mi-nus-
end las protenas motoras direccionadas. En Drosfila, lo assembly y mantenimiento de un malacate bipolar
del meiotic requiere la accin de Ncd, uno menos el fin direccionado protena del motor del kinesin (Hatsumi y
Endow, 1992; Matthies et al., 1996; Entrguele Una Donacin y Komma, 1997). De modo semejante, en
huevo Xenopus la formacin del polo del malacate de extractos es mediada por citoplasmica dynein, otro
menos el fin la protena motora direccionada (Heald Et Al., 1996; Heald et al., 1997). Dynein forja un
complejo con NuMA (Merdes Et Al (la protena nuclear del aparato del / mitotic tambin) y dynactin, ambos del
cual es necesario para microtubulo correcto enfocando en los polos del malacate., 1996; Merdes y Cleveland,
1997). As, en malacates del acentrosomal lo menos los fines de los microtubules que crecen alrededor de la
cromatina se mueve y converge hacia los polos a travs de la accin de menos motores de microtubule-base
de fin y sus protenas asociadas.
Los estudios recientes han demostrado que las celdas sin centrosomas y celdas con centrosomas comparten
mecanismos comunes de asamblea del polo del malacate (revisado por Merdes y
Cleveland, 1997). La inhibicin de cytoplasmic dynein por un anticuerpo de dynein-specific desestabiliza
formacin del polo del malacate en ambos spin-dles que tiene centrosoma libre de centrosoma y (Gaglio Et
Al., 1997; Heald et al., 1997). Adems, en el dynein ms reciente de sistemas la reduccin drstica resulta en
lo detach-ment de centrosomas de los polos del malacate (Gaglio Et Al., 1995; Echeverri et al., 1996). Estas
observaciones, y el descubrimiento que la mayora de microtbulos interpolares no son conectados para los
centrosomas (Mastronarde Et Al., 1993), suggested un modelo para la formacin del polo en malacates de
contain-ing de centrosoma (Gaglio Et Al., 1997; Heald et al., 1997). Ha estado propuesto que una fraccin
fsica del microtu-bules nucleated por los centrosomas es soltada de estas estructuras durante el proceso de
prometaphase (Kirschner y Mitchison, 1986) de bsqueda y de captura. Lo libre menos los fines de estos
microtubules est entonces enfocado en el malacate empuja con una prtiga a travs de la accin de las
mismas protenas estructurales y motoras que median empuja con una prtiga formacin en acentrosomal
sistemas. El desplazamiento del microtbulos menos los fines para distritos los polos del malacate, acoplado
con microtubulos elongacin en el fines positivos y microtbulos acortndose en lo menos los fines, luego
creara un fundente poleward microtbulos que ejerce la fuerza a travs del malacate (Agua et al., 1996; Las
Aguas y el Salmn, 1997). Adems, las interacciones laterales entre los microtbulos astrales y los fines libres
de mi-nus de microtubules de poleward-migrate ataran con una correa los centrosomas para los polos del
malacate, restaurando el connec-tion entre estos organelles y el resto de malacate.
Si los polos son ensamblados con mecanismos similares en ambos acentrosomal y los sistemas centrosomal,
celdas que tienen centrosoma deberan poder ensamblar un malacate aun a falta de centrosomas. En la
mayora de tipos de la celda, cmo alguna vez, ste no es el caso. Los experimentos de micromanipulacin
por ejemplo, conllevados expulsan en celdas embrionarias equinodermas, clulas somticas vertebradas, y
los espermatocitos del saltamontes claramente han demostrado esa remocin de centrosomas de celdas de
profase impide formacin del malacate (Sluder y Rieder, 1985; Sluder et al., 1986; Rieder y Alexander, 1990;
Rieder et al., 1993; Zhang y Nicklas, 1995). Cmo estn alguna vez, si los centrosomas distantes o perdidos
durante la anafase, el malacate que los polos permanecen enfocados, y segre-gation del cromosoma no es
afectado (para Aguas retrospectivas de la sede y Salmn, 1997). Por otra parte, los experimentos en
espermatocitos del ferruginea de la tpula Pales indican que eso en esta asamblea del polo del malacate de
celdas es independiente de la presencia de centrosomas (Steffen Et Al., 1986). La razn por la que los
espermatocitos Pales pueden reunirse los polos del malacate a falta de centrosomas considerando los otros
sistemas no pueden, no es comprendido. Una posibilidad intrigante es que lo require-ment de centrosomas
para asamblea del malacate simplemente refleja el hecho que en alguna celda escribe estos organelles es la
nica fuente de nucleacin microtubule. As, en el ab-sence de centrosomas, no hay suficiente microtu-bules a
ser enfocado en el malacate empuja con una prtiga, y as-sembly del malacate sera impedido (las Aguas y el
Salmn, 1997).
En este papel describimos otro sistema de contain-ing de centrosoma que no requiere centrosomas para la
formacin del malacate. Mientras los meiosis hembras Drosophila es anastral (Cenci Et Al (Theurkauf y
Hawley, 1992), ambas divisiones del meiotic en varones de la Drosfila exhiben asteres conspicuos., 1994;
Vea Higo. 2). Tenemos genticamente meiosis del varn del micromanipulated Drosophila por medio de
mutaciones en asterless (asl), un gene requerido para la formacin de centrosoma de asamblea y de as-ter.
En espermatocitos del asl, a pesar de la ausencia de centrosomas funcionales, microtubules se originan de
sitios mltiples alrededor de los cromosomas, y auto-organizan en malacates de pe-culiar anastral. Estos
malacates se ingenian para mediar segregacionismo del cromosoma, aunque en una forma muy irregular.
Sorprendentemente, los espermatocitos asl desarrollan una normalidad del morphologically ana el malacate
central telophase. El descubrimiento que los mutantes del asl estn completamente faltos de asteres y tiene
malacates centrales normales nos dieron la oportunidad para probar el papel relativo de estas estructuras en
dar seas de cytokinesis. Nuestros resultados demuestran que los malacates centrales pueden
completamente inducir cytoki-nesis, sealar que los asteres no son requeridos para la seal de cytoki-netic.
Los Materiales y los Mtodos
INMUNOFLOURESCENCIA MICROSCOPICA
Las preparaciones Cytological estaban hechas con testes de terceras larvas del instar o de jvenes crislidas.
Para tubulin immunostaining, tubulin immunostaining positivo KLP3A, y tubulin immunostaining positivo anillin,
testes estaban fijos tan descritos previamente (Cenci Et Al., 1994; Williams et al., 1995). Para phalloidin
manchando y tubulin immunostaining, testes fuera accord-ing fijo para Gunsalus Et Al., 1995. Para tubulin
immunostaining positivo o tubulin immunostaining positivo centrosomin, testes fueron cortado en pedazos y
hacia atrs zen en nitrgeno lquido tan descrito (Cenci Et Al., 1994). Las preparaciones fueron luego fijas en
methanol fro para 15 min y acetona para 30 s, y fueron entonces sumergidas para 10 min en PBS
conteniendo Tween de 0.1 cido actico % 20 y de 0.1 %. Antes de la incubacin con anticuerpos, las
diapositivas fueron enjuagadas varias veces en PBS conteniendo Tween de 0.1 % 20.
Tubulin immunostaining y phalloidin manchando a tubulin immu positivo nostaining han estado descritos
previamente (Cenci Et Al., 1994; Gunsalus et al., 1995). Para immunostainings dobles, testes fueron primera
parte incubada expresa en 48C con cualquier del siguiente conejo anticuerpos primarios diluidos en PBT (PBS
conteniendo Tritn de 0.1 % X-100) conteniendo BSA de 1 %: G tubulin (1:200; Callaini et al., 1997);
Centrosomin (1:1,000; Li y de hombre a Kauf, 1996); KLP3A (1:500; Williams et al., 1995); O anillin cri en
contra de aminocido 1371 (1:300; El Campo y Alberts, 1995). Estos anticuerpos primarios fueron
detectados por la incubacin 2-h en la temperatura del cuarto con anticonejo conjugado a TRITC IgG (Cappel
Laboratories, Malvern, Pensilvania) 1:100 diluido en PBT. Las diapositivas fueron entonces incubadas con un
monoclonal antiun anticuerpo del tubulin (Pharmacia Biotech, S.A., Piscataway, Nueva Jersey) 1:50 diluido en
PBS, lo cual fue detectado por oveja conjugada a FLUOS el ratn IgG (Boehringer Mannheim, Mannheim,
Alemania) diluy 1:10 en PBS. Despus de estos immunostainings, las preparaciones del testculo fueron
sec con aire y manch con Hoechst 33258 tan descrito (Cenci Et Al., 1994).
Todas las preparaciones fueron examinadas con un microscopio Axioplan (el dispositivo de carga acoplada
(Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) equipado con una lmpara de mercurio HBO 50W para epifluorescence, y
con un dispositivo de carga acoplada enfriado; S.A. Photometrics, Woburn, Massachusett). Hoechst 33258,
FLUOS, y la fluorescencia TRITC fueron detectados tan descritos (Gunsalus et al., 1995). La escama gris las
imgenes digitales fuera coleccionada separadamente usando el software del Espectro del Perro Cobrador de
protocolo entre redes. Las imgenes fueron luego convertidas a Photoshop 2.5 formato (el Sistema Adobino,
el S.A., la Vista de la Montaa, el contador pblico certificado), pseudocoloured, y anexadas.
La Microscopa del Electrn
Testes estudi en sus partes de varones del adulto del asl1 fue fijo en glutaraldehyde de 3 % en 0.1
amortiguador de fosfato M (pH 7.2) en la temperatura del cuarto para 1 h, veces cuatro lavadas en
amortiguador de fosfato (5 min cada uno), y aadidleo un sufijo a en OsO4 de 1 % en el mismo amortiguador
para 1 h. Despus de cuatro lavados en amortiguador de fosfato (30, 50, y 70 % 33, 5 min cada uno en 4 C
(5 min cada uno), testes estaban deshidratados con etanol; Y 95 y 100 %, 33, 10 min cada uno en la
temperatura del cuarto). Testes estuviera incrustado en Epon y, despus de seccionar, estuviera manchado
con acetato de ura-nyl de 3 % y pista citrato.
Los resultados
El aislamiento y la Caracterizacin de asterless Mutations
El primer mutante del asl allele (asl1) estaba aislado en el transcurso de una pantalla del cytological de una
coleccin de 16 inducidas por SME mutaciones masculinas y estriles bondadosamente previstas por Barbara
Waki moto (la Universidad de Washington, Seattle, Washington). Vivir preparaciones de mutante para quienes
los testes fueron examinados por la microscopa de contraste de fase deserta en el sperma-tids de etapa de la
cebolla. En el tipo descabellado, cada spermatid contiene un ncleo ligero en la fase y una derivada densa en
la fase del mitochondrial llam al Nebenkern (revisada por Abatanador, 1993). En la cebolla la etapa de
desarrollo del spermatid, los ncleos y Nebenkern tienen formas esfricas y tamaos muy similares (el Higo.
1). El tamao regular de ambos ncleos y Nebenkern de pends en la ejecucin correcta del meiotic van en
procesin; Los ncleos de ab-normal-size y Nebenkern son diagnsticos de er-rors en el segregacionismo del
cromosoma y en la particin de mitochondria, respectivamente (Gonzalez Et Al., 1989; El Abatanador, 1993).
Como se muestra en Higo. 1, asl1 spermatids est compuesto de ncleos y Nebenkern de tamaos muy
diferentes, suggesing ese asl mutaciones desestabiliza ambos seg-regation del cromosoma del meiotic y la
distribucin correcta de be-tween del mitochondria las clulas hijas.
El asl1 es perfectamente viable pero estril en ambos sexos. El phe-notypes de esterilidad masculina,
esterilidad hembra, y aberrante FIGURA 1 spermatids se asociaron con asl1 fue de lo que se traz un
mapa usando un cromosoma ri Ki pp examinando a 44 recombinants entre ri y pp (estos marcadores definen
un intervalo de 1 cM). Este anlisis enseado que estos tres phenotypes comap simplemente a la izquierda de
Kinked (Ki), del cual es separado por slo un acontecimiento de recombinacin.
Determinar si el asl1 phenotype es especficamente producido como respuesta por esta mutacin o es una
caracterstica general de le-sions en el lugar geomtrico del asl, aislamos dos al-leles adicional del mutante.
Nos tratamos 2,360 cromosomas con el SME y los probamos para allelism con asl1. Esta pantalla producida
dos mutaciones nuevas, asl2 y asl3, eso son viables sobre asl1 y dejan de complementar asl1 para la
esterilidad masculina y hembra como para el spermatid phenotype aberrante. Sin embargo, asl2/asl2,
asl2/asl3, e individuos asl3/asl3 son aburridos; El asl2/asl2 y el dado de larvas asl2/asl3 en el lmite larval del
pupal, mientras que individuos del asl3/asl3 tenga una tiempo atrs fase aburrida. Adems, los experimentos
de recombinacin dejaron de separar al le-thal retrasado phenotype de asl2 y el tiempo atrs phenotype letal
de asl3. As, concluimos que el asl es un lugar geomtrico esencial requerido para la viabilidad. Ahora, sin
embargo, no sabemos si asl3 sea una mutacin nula. El hecho que el asl hace mapas muy cerca para
Triplolethal (Tpl) examina-tion impedido del phenotype de asl3 sobre la deficiencia y su com-parison con esos
de individuos del asl3/asl3. En este contexto, es de inters que el patrn y la frecuencia de spermatids
anormales es muy similar en todas las combinaciones del mutante (asl1/asl1, asl1/asl2, asl2/asl2, asl1/asl3, y
asl2/asl3), sealar que el tres mutante los alleles causan interrupciones similares de la funcin del asl1
durante meiosis masculinos.
El asl Spermatocytes est desprovisto de Asteres y tiene Centrosomas Defectuosos
Para definir la lesin primaria conduciendo a la formacin de spermatids aberrantes en mutantes del asl,
analizamos cytologi-cally la divisin del meiotic. Las preparaciones del testculo fueron manchadas con
anticuerpos del tubulin y Hoechst 33258 para la visualizacin de simul-taneous de ambos microtubules y la
cromatina. El examen de meiosis masculinos en asl1/asl1, asl1/asl2, asl2/asl2, asl1/asl3, y los animales
asl2/asl3 revelaron que eso todas estas combinaciones de mu-tant causan un cytological phenotype comn.
Mientras que los espermatocitos de tipo agreste exhiban asteres conspicuos a todo lo largo de divisin celular
del meiotic (el Higo. 2; Vea a Cenci Et Al. 1994 para una descripcin detallada de meiosis masculinos), asl
sper matocytes est completamente desprovisto de asteres (el Higo. 3).
Determinar si la ausencia de asteres en asl mu tants fue la consecuencia de un defecto primario en la
estructura de cen-trosome, nosotros los testes del mutante del immunostained con anticuerpos dirigimos a ya
sea o centrosomin, dos componentes de centrosomas de la Drosfila (Zheng Et Al., 1991; Li y Kaufman, vo~
1996). En tipo salvaje testes, el immunostain de anticuerpos g tu bulin los centrosomas en espermatocitos
primarios premei otic y a todo lo largo de meiosis (el Higo. 4). Adentro madura espermatocitos primarios, los
centrosomas quedan por la membrana plasmtica (no mostrado). Antes de la primera divisin del meiotic
emigran para la periferia del sobre nuclear donde ellos el nucleate as-ters conspicuo que movimiento para los
polos opuestos de la celda (el Higo. 4 A9). En la anafase y el anterior telophase que hay un cen-trosome solo
en cada polo del malacate, cul en telophase retrasado las hendiduras en dos centrosomas que el principio
emigrando para FIGURA 2 los polos de espermatocitos secundarios mientras el nucleating as-ters nuevo
(el Higo. 4, B9? Y C9). Estos centrosomas sobran en los polos del malacate a todo lo largo de la segunda
divisin del meiotic y no se dividen en dos entidades separadas en telophase retrasado II a fin de que cada
spermatid recibe un centrosoma solo. En el contraste, en mutantes del asl no est concentrada vo~XvXvo
en los centrosomas durante cualquier fase de la divisin celular del espermatocito de primario crecimiento y
meiotic (el Higo. 4, D F9). En lugar de eso, est disperso en agregados pequeos mltiples que no hacen
ap-pear para tener la habilidad para nucleate microtubules.
Similares pero no los resultados idnticos fueron obtenidos con cen-trosomin. En el tipo descabellado,
centrosomin se concentra en los centrosomas de ambos premeiotic espermatocitos primarios y celdas meiotic,
lo mismo que (el Higo. 5). En mutantes del asl, los anticuerpos dirigieron a centrosomin deje de vo~XvXvo
detectar entidades discretas del centrosomal en spermato-cytes ms primario adulto en la etapa S5 (el Higo. 5
F). Sin embargo, en tarde prometaphase de profase espermatocitos primarios en la etapa M1, el immunostain
de anticuerpos centrosomin dos provee con una estructura lo-cated cerca del sobre nuclear. Estas estructuras
son con-sistently arreglado en pares, como son los centrosomas de tipo agreste antes de su migracin para
los polos de la clula, pero son mucha menos fluores-cent que centrosomas normales y le falla para nucleate
microtubules estelares (el Higo. 5, G y G9). Durante ana telophase en el que yo, los cuerpos de
centrosomin-enrich soy siempre detectado Slo uno de los polos de la clula, mientras que el otro polo sea
consis-tently falto de ellos (el Higo. 5, H I9). Adems, aunque usualmente aparecen como un par de lugares
fluorescentes (el Higo. 5 H),
FIGURA 3
FIGURA 4
son ocasionalmente transformados en cuatro entidades (el Higo. 5). En telophase que yo, los cuerpos de a
centrosomin-positive me es transmitidos para slo una de las clulas hijas, y est por consiguiente ancestral
por slo la mitad del sper-matocytes secundario. Estos cuerpos tienen tendencia a permanecer asociados ya
sea como pares o cuartetos durante la segunda divisin del meiotic, y es usualmente transmitido
conjuntamente para de un cuarto de los spermatids (el Higo. 5 J). Estas observaciones fuertemente sugieren
que cada elemento de los pares fluorescentes corresponde a un par de centrioles, y que cada elemento del
quar-tets consta de un centriole solo. Sin embargo, ni los pares ni los cuartetos tienen habilidad del nucleating,
como son nunca asociados con conjuntos imponentes astrales de microtubules.
Para averiguar la presencia de centrioles en asl spermato cytes y spermatids, examinamos secciones
delgadas de testes por EM. Este anlisis dej que se sepa que los espermatocitos del asl tienen a centrioles
normales mor phologically (el Higo. 6). Sin embargo, la separacin centriole es anormal adentro que
observamos eso en algunos spermatids, Nebenkern es asociado con dos centrioles en lugar de uno solo,
como en el tipo descabellado (el Higo. 6). Adems, los dos centrioles del spermatid mostrado en Higo. 6, C y
D, le mienten paralelamente cada quien en lugar de en un ngulo recto, como hacen al padre y su centriole de
la hija en el tipo descabellado. Este spermatid por consiguiente puede contener cuatro centri-oles, con slo
dos de ellos en el avin de la seccin.
El asl Mutants Organize Anastral Spindles que el Segregacionismo Mediato del Cromosoma
A pesar de la ausencia de asteres, los espermatocitos primarios asl desarrollan un malacate peculiar del
anastral. Despus de la falla del sobre nuclear, microtubules se originan de sitios mltiples cerca de los
cromosomas, y los conjuntos imponentes del nervio radial de la forma extendindose de cada uno bivalente
(el Higo. 3 B). Estos microtubules luego organizan en manojos bipolares, minimalacates que crea se asociaron
con bivalents individuales (el Higo. 3 C). Sin embargo, en muchos espermatocitos del asl, no todos los
bivalents dentro de la misma celda desarrollan minimalacates claros; Algn resto de bivalents se asoci con
una red no polarizada o pobremente polarizada de microtubules (el Higo. 3 C). Adems, el bun-dles de
microtubules se asoci con los bivalents es de diez orientados en direcciones diferentes (el Higo. 3, C F; El
higo. 4 E9). Como consecuencia, los bivalents nunca se congregan en una metafase que chapo durante
meiosis masculinos en mutantes del asl.
Interesantemente, la red de microtubules asociados con los cromosomas cuartos diminutos es siempre muy
ms pequea tan asociado con los mayores bivalents, sealar que el crecimiento del microtubule alrededor de
los cromosomas es promovido por la cromatina entera, y no por el kineto-chore a solas. Es digno de notar eso
en la mayora de metafase como figuras los cuartos cromosomas exhibir segregacionismo precoz (el Higo. 3
C), como ocurre en la metafase de tipo descabellado yo meiosis hembras (McKim y Hawley, 1995).
A pesar de estos problemas en congression, asl meiotic chro mosomes progresa en una A de anafase
altamente irregular (el Higo. 3, D F; El higo. 4 E9). Los homologs se ingenian para segregar, pero su
separacin es a menudo asincrnica (el Higo. 3 D; El higo. 4 E9). Adems, en % de anafase guste las mo
figuras, las cromatidas de hermana de uno o ms media hendidura de bivalents y seprese el uno del otro (el
Higo. 3, E y F). Este ana excepcional las fases son anafase genuina las figuras, y no son celdas
experimentando anafase II. Esta conclusin es sugerida por el descubrimiento que en telophase las figuras
que nunca observamos segregacionismos anormales con todo el migrat-ing de cromosomas para un polo solo
(la sede debajo de). As, ms en caso de que no todas las celdas dividing con un complemento del 2N tienen
probabilidad de ser espermatocitos primarios experimentando meiosis yo, y no los espermatocitos diploides de
sec-ondary en meiosis II. que El fenmeno de separacin de la cromatida de hermana precoz observ en la
anafase del asl yo las figuras estoy probablemente debido a la estructura del kinetochore de sus medios
bivalents. Durante tipo salvaje prometaphase, cada medio bivalente tiene a un hemispheri cal kinetochore solo
que diferencia en dos kineto-chore planar entre prometaphase retrasado yo y la anterior anafase yo
(Goldstein, 1981). En mutantes del asl dnde la formacin del malacate tiene probabilidad de ser demorada
con relacin al tipo descabellado (vea debajo), la duplicacin kinetochore puede ocurrir antes de que lo en set
de anafase. Como consecuencia, algunos medios bivalents pueden volverse conectados para ambos polos a
travs de su dupli partite o malacates centrales multipartite (el Higo. 3 H; La Mesa). Adems, los malacates
centrales expanden normalmente y son pellizcados en el medio durante cytokinesis (los Higos 3 G, 4 F9, y 5
H9, I9; Vea debajo). Sin embargo, en cuestin de 80 % del ana-telophases con normalidad del
morphologically spin-dles central, estas estructuras son asymmetrically localizado con respeto para los polos
de la clula, a fin de que los cytokinesis produciran dos clulas hijas de tamao diferente (el Higo. 7; La
Mesa). Adems, en la mayora de celdas (compare Higos (60 %) los cromosomas tambin permanecen scat-
tered durante B de anafase y no se congregan en dos ncleos de la hija tan en el tipo descabellado. 2 Figs D
y 4 C9with. 3 G, 4 F9 y 5 H9, I9; La Mesa).
Acerca de 70 % de telophase la exhibicin de figuras desigual chro-mosome segregacionismo (el Higo. 4 F9;
El higo. 7 C; La Mesa). En celdas mostrando ambos un asymmetrically malacate central localizado y
segregacionismo desigual del cromosoma, no hay correla-tion entre el tamao de las clulas hijas y su
contenido de chro-mosomal, indicador eso position-ing central del malacate y segregacionismo del
cromosoma son casos independientes.
A consecuencia de la divisin primera anormal del meiotic, los espermatocitos secundarios asl reciben
nmeros variables de cromosomas. Estas celdas experimentan un anastral en segundo lugar
Figura 6. La presencia de centrioles de normalidad del morphologically en mutantes del asl1. (Uno) la seccin
transversal a travs de la parte del proximal de un centri-ole en un espermatocito primario adulto. (B) Un par
de ly-ing centrioles en aproximadamente el derecho pesca con caa, localizado en la periferia de un
espermatocito primario. (C) la Seccin Transversal a travs de un Nebenkern de un spermatid de la etapa de
cebolla, irregularmente asociado con dos cuerpos basales (la flecha). La magnificacin (D) Superior de los
cuerpos basales en C, consistente en nueve trillizos perifricos de tubules. (Uno) 28,0003;(B) 22,0003; (C)
13,0003; (D) 60,0003. Las barras, 0.2 U
Cated kinetochores, conduciendo a la separacin de sus cromatidas de hermana compo nent.
A pesar del tipo de segregacionismo exhiben, anafase yo cromosomas de mutantes del asl no soy nunca orga
nized en dos sets discretos, pero me esparzo en lugar de eso a todo lo largo de la celda (compare Higo. 2 C
con Higo. 3, D F e Higo. 4 E9). Ms probablemente este acomodamiento irregular del cromosoma de
anafase refleja ambos la polarizacin escasa de los malacates y el asynchrony en el segregacionismo del
cromosoma.
Despus de A de anafase, los espermatocitos primarios asl experimentan B de anafase. A pesar de la
configuracin aberrante de A de anafase, el % de estas celdas desarrolla uno spin-dle central, lo cual es nmo
indistinguible de su contraparte de tipo descabellado (compare Higos. 2 D y 4 C9 con Higos. 3 G y 4 F9; La
Mesa). El faltante 15 el % de divisin del meiotic de la forma de ana-telophases que tiene las mismas
caractersticas se report arriba para mutante primero divisiones del meiotic. El mutante la forma secundaria
de sper-matocytes un malacate irregular del apolar que media segregacionismo del cromosoma, y
eventualmente ensambla un malacate central normal ap parently (los datos no enseados).
Figura 7. La formacin central del malacate y cytokinesis en asl mu tants. Las celdas fueron immunostained
para tubulin (el verde); El cido desoxirribonucleico (el azul); Y cualquier actina (la naranja; Uno y B), anillin (la
naranja; C), o KLP3A (la naranja; D). (Uno) Un telophase del tipo descabellado yo y (B) un asl telophase yo
saliendo a la vista bandas similares de actina en la mitad de su spin-dles central. (C y D) asl telophase
normalidad de aparicin de figura anillin (C) y acumulaciones KLP3A (D) en el midzone del malacate. Note
eso en las celdas en B y C, el malacate central es lo-cated del asymmetrically con relacin a los polos de la
clula. La barra, 10 U
Figura 5. Centrosomin im munostaining de asl testes. Las celdas estaban manchadas para tubu-lin (el
verde), centrosomin (or-ange), y cido desoxirribonucleico (el azul). Pan-els en la funcin blanquinegra slo
immuno-fluorescence centrosomin. Los paneles de color demuestran imgenes mancomunadas; Tubu-lin
immunofluorescence no fue mancomunado en el im-age de color mostrado en E9 y J9. El tipo (uno E9)
descabellado; (Un, A9) madure espermatocito primario en la etapa S5 mostrando un par de centrosomas
simplemente bajo la membrana plasmtica; (B, B9) prometaphase; (C, C9) telo-phase; Y (D, D9) el telophase
retrasado yo mostrando promi-nent centrosomas centrosomin decor. Note eso en el telophase mostrado en
D y D9, los centrosomas tienen listo en la Alabama iniciado para separarse. (E y E9) Dos spermatids, cada
uno consistente en un ncleo y un Nebenkern. La fluorescencia dbil del Neben-Kern (las flechas) es debida
al cido desoxirribonucleico del mitochondrial que aprenden de memoria azogue. Reparo en que los
anticuerpos de anticen-trosomin detectan el cuerpo basal be-tween localizado el ncleo y el Nebenkern. (F
J9) mu-tants asl; (F y F9) madure espermatocito de pri-mary en la etapa S5 no mostrando a centro las
acumulaciones somin; (G y G9) prometaphase yo mostrando un par de cuerpos de centrosomin-enrich cerca
del sobre de nu-clear; (H y H9) telophase con un par de bod-ies de centrosomin-enrich a las un de los polos;
(Yo e I9) telophase yo mostrando un cuarteto de cuerpos de centrosomin-enrich a las un de sus polos.
(Ampliado en el inserto de J (J y J9) Altamente irreg ular spermatid se asoci con cuatro entidades de
centrosomin-con-taining; La flecha seala al Nebenkern). La barra, 10 U
Obtener compenetracin en la dinmica y la oportunidad del momento del meiotic tramitan en mutantes del
asl, determinamos que el fre-quencies del meiotic diversos figura en asl testes, y comparado ellos con esos
obedecidos en los controles de tipo (la Mesa II) descabellado. Una inspeccin de Table II revela que el fre-
quencies de profase retrasada / el anterior prometaphase yo y / el telophase de anafase que creo encontrado
en asl testes es slo ligeramente ms alto que esos comentaron en los controles. En el contraste, las
frecuencias de prometaphase/metaphase yo y la anterior anafase que las figuras estamos muy ms altos en
asl en controles. Porque la frecuencia de cada etapa del meiotic debera ser proporcional para su duracin en
vivo, estas conclusiones sugieren que la duracin de prometaphase de profase del asl que soy nico
ligeramente aumentado con relacin al control. Sin embargo, prometaphase yo, la metafase yo, y
especialmente anterior ana-phase que parezco durar muy ms largo en mutantes del asl en el tipo
descabellado. Una explicacin probable de esta observacin es que el proceso de organizacin del malacate
en mutantes del asl dura ms largo que dura en el tipo descabellado por la ausencia de microtubules
nucleated estelares por los centrosomas. El hecho que el asl que los mutantes y el sitio inexplorado escriben
controla exhiba frecuencias similares de ana telophases con un malacate central bien estructurado
fuertemente sugieren tan la mayora de en caso de que no todas las celdas del asl que entran en meiosis
progreso hasta ana telophase
Las frecuencias de figuras meiosis II son sustancialmente inferiores en asl que en el control, pero las
proporciones entre celdas de anafase de in-terphase-early II y las figuras de anafase / telophase II son
similares en ambos mutantes y el control. Porque no hay razn para asumir como premisa que la segunda
vista meiotic di es ms rpida en asl en el tipo descabellado, la explicacin ms franca para estos resultados
es esa slo una fraccin de asl espermatocitos secundarios tiene la capacidad de organizar un malacate del
anastral. Sin embargo, una vez este malacate del anastral es ensamblado, las celdas pueden progresar a la
fase ana telo y pueden completar la segunda divisin del meiotic.
El Malacate Central tiene al Ability para Stimulate Cytokinesis Una cuestin dudosa acerca de hendidura de la
clula en celdas animales es la fuente de seales que estimulan formacin contrctil del anillo y cytokinesis.
Ahora es poco claro ya sea este sig-nals dimane de los asteres o del malacate central (revisado por Fishkind y
Wang, 1995; Glotzer, 1997; Goldberg et al., 1997). El hecho que los mutantes del asl forman un malacate
central a falta de asteres nos provey de una oportunidad nica discriminar entre este alterna-tives.
Manchamos a asl testes con rhodamine-phalloidin, lo cual detecta la actomiosina anillo contrctil durante
meiotic cytokinesis masculino (Gunsalus Et Al., 1995). Adems, nosotros immunostained asl testes para
KLP3A (Williams Et Al., 1995) y anillin del tipo descabellado dos protenas que el concentrado en el surco de
la hendidura durante (Williams Et Al (el Campo y Alberts, 1995) meiotic cytokinesis wild-type., 1995; Hime et
al., 1996). Como se muestra en Higo. 7, ambos simtricamente y asym-metrically localiz exhibicin central de
malacates un anillo contrctil basado en actinas normal y acumulaciones normales de ambos KLP3A y anillin.
Independientemente, el posicionamiento del malacate de cen-tral dentro de la celda, la actina, anillin, y KLP3A
estn todo el tiempo localizados en la mitad de esta estructura, como ocurre en el tipo descabellado. Adems,
en correspondencia con lo lo-calization de estas protenas, el malacate central es pellizcado, sugiriendo
ejecucin normal de cytokinesis.
El debate
El asl Mutants es defectuoso en Asamblea del Centrosoma
Hemos identificado un gene que llamamos asterless (asl), que speci-fies una funcin necesaria para la
formacin del aster durante meiosis del varn de Drosoph-Ila. En la interfase los espermatocitos primarios y
las celdas meiotic de varones de tipo de sitio inexplorado, los centrosomas son enriquecidos en vo~XvXvU
En el contraste, en los mismos tipos de la celda de asl mu tants esta protena no se concentra en los
centrosomas pero los restos se dispersaron en las cantidades globales mltiples del cytoplasmic que no
tienen habilidad de microtubule-nucleating. Ms probable, este defecto primario en asamblea del centrosoma
se predesahoga de formacin del aster a todo lo largo de divisin celular del meiotic en mutantes del asl.
Una situacin similar pero no idntica ha sido observada en la lnea de la celda del acentriolar Drosophila
11824, establecidos de embriones del aploid producidos por el mu-tant hembra estril mh 1182 (Gans Et Al.,
1975; Debec, 1978; Debec et al., 1995). En el control las lneas de la clula embrionarias,
en la interfase y los centrosomas mitotic. En celdas 1182-4 acentriolar vo~XvXvossXXo~UXo
deja de asociarse con los centrosomas de interfase, pero se concentra en los polos del malacate vo~XvXvo
donde exhibe patrones diferentes de acumulacin (De-Bec et al., 1995). Sin embargo, los lugares
y polares vistos en las celdas del acentriolar no son centrosomas verdaderos en que fcilmente vo~XvXvo
desaparecen en el desmontaje del microtubule con ya sea fro o tratamiento colchicine (Debec Et Al., 1995).
Basado en estos resultados, Debec Et Al. (1995) sugerido que la obra teatral de centrioles un papel
importante en la asamblea de material cen trosomal.
Le hemos mostrado eso en el tipo descabellado testes, di-rected de anticuerpos a centrosomin immunostain
los centrosomas en spermatoytes primarios adultos y a todo lo largo de meiosis. En mutantes del asl estos
anticuerpos detectan ya sea pares o cuartetos de estructuras discretas que estn presentes en todo
prometaphase retrasado de profase los espermatocitos primarios, excepto son transmitidos para slo la mitad
del spermato-cytes secundario y para un cuartos de los spermatids. El comportamiento de estos cuerpos de
centrosomin-enrich vistos en mutantes del asl puede estar con holgura explicado si uno da por supuesto que
corresponden a los centrioles.
En el tipo descabellado, cada uno madura azogues primarios de contra del espermatocito dos pares de
centrioles duplicados, con el centriole de la hija yaciendo en un ngulo recto con relacin a su padre. En la
preparacin de meiosis yo, ambos pares de centrioles emigran conjuntamente de la membrana plasmtica
para el enve-lope nuclear, se vuelven asociados con material del centrosomal, y se mudan a los polos de la
clula mientras nucleating microtu-bules astral. As, durante meiosis de los que cada centrosoma contengo un
par duplic centrioles. Sin embargo, all no est duplicacin de centri-ole antes de la segunda divisin del
meiotic; En espermatocitos de sec-ondary cada par de centrioles se divide en dos centrioles solos que
emigran a los polos de la clula opuestos. Por consiguiente, cada spermatid hereda un centriole solo que se
convierte en el cuerpo basal del axoneme (revisado por Abatanador, 1993) que expande.
Basados en el comportamiento del centriole en el tipo descabellado, nos declaramos esos los pares de
centrosomin-enrich vistos en asl los espermatocitos primarios corresponden a los centrioles. El hecho que
estos pares son ocasionalmente transformados en cuatro entidades adicionalmente sugieren que cada
elemento de los pares de hecho consta de un par de centrioles. Adems, nos declaramos que los dos pares
de centrioles, debido a la ausencia de microtubules estelares (las Aguas y el Salmn, 1997), dejan de
separarse y emigrar para los polos de la clula durante ambas divisiones del meiotic de mutantes del asl. As,
durante cada divisin del meiotic a ellos les es transmitidos conjuntamente para slo una de las dos clulas
hijas. Este modelo para el comportamiento del centriole en mutantes del asl es soportado por los resultados
obtenidos por EM. El anlisis EM ha demostrado que las celdas del asl contienen centrioles de normalidad del
morphologically que en varios casos deja de separar correctamente. Hemos observado a varios Nebenkern
asociado con dos en lugar de un centriole solo. Adems, en algn asl spermatids, estos dos centrioles le
mienten paralelamente cada quien en lugar de en un ngulo recto, como hacen al padre y su centriole de la
hija en el tipo descabellado. Este acomodamiento paralelo del centriole est consistente con la posibilidad que
los dos centrioles en el avin de la seccin forme parte de pares diferentes de a centrioles que han estado
transmitidos conjuntamente para el spermatid seccionado.
El anlisis Centrosomin Immunostaining y EM claramente
Sealo que las celdas asl meiotic contienen centrioles de morfologa normal que se duplican normalmente.
As, el asl1 func tion no parece ser requerido para ya sea la estructura fina centriole o la duplicacin. Sin
embargo, la observacin que asl centrioles es nunca asociado con y acumula mucho menos vo~XvXvo
centrosomin que sus contrapartes de tipo descabellado, fuertemente sugiere que el asl especifique una
funcin requerida para la asamblea de centrosomal material alrededor de los centrioles. La identificacin de tal
funcin debe esperar el anlisis molecular de asl, cul, sin embargo, puede cambiar de direccin fuera para
ser en particular difcil. No tenemos suc-ceeded en aislar a asl alleles por P-Mutagenesis, y mo-lecular
reproducindose asexualmente de asl por el caminar cromosomas es al que se puso obstculos por sus
afueras para el lugar geomtrico Tpl.
La asamblea del malacate en asl Mutants
Hemos demostrado que a pesar de la ausencia de asteres, asl mu tants ensambla un malacate peculiar del
anastral. Meiotic chro mosomes parece jugar un papel importante en este proceso, a ttulo de centros de
microtubule-organize y a promover formacin de minimalacates bipolares. Este descubrimiento fue antici-
pated por la aparicin de experimentos de micromanipulacin que los bivalents masculinos Drosophila
desprendido del malacate pueden provocar la formacin de minimalacates (la Iglesia et al., 1986).
Los meiosis aberrantes observados en varones del asl tienen muchas similitudes con naturalmente ocurriendo
divisiones del anastral, algo semejante como esos meiosis hembras acompaantes en ratones, Cae-
Norhabditis, Xenopus, y Drosfila (revisados en McKim y Hawley, 1995). La senda de formacin del malacate
del asl es tambin reminiscente lo en assem-bly del malacate del vitro inducido por rosario recubierto en cido
desoxirribonucleico en extrechos del huevo Xenopus (Heald Et Al., 1996; Heald et al., 1997). En todos estos
sistemas, la cromatina puede inducir nucleacin microtubule y estabilizacin. Estos microtubules estn
inicialmente al azar orientado; Su menos los fines luego enfoca en los polos del malacate a travs de la accin
de menos el fin motores direccionados y sus protenas asociadas (Hatsumi y Endow, 1992; Heald et al., 1996;
Matthies et al., 1996; Merdes et al., 1996; Heald et al., 1997). Sin embargo, los minimalacates asociados con
los asl bivalents no estn siempre claramente organizados en un conjunto imponente bipolar. Adems, cuando
ellos exhiben un configu-ration bipolar, los polos son anchos y nunca estn tan enfocados como esos
comentaron en meiosis hembras Drosophila o en el Xe-Nopus en los sistemas del vitro. Este resultado sugiere
que los espermatocitos de Drosoph-Ila no tengan suficientes menos la actividad del motor de fin para
completar polarizacin del malacate a falta de centrosomas.
Nuestros resultados en asl que los mutantes indican que celdas en las cuales asamblea del malacate es
normalmente conducida por none-theless de centrosomas tienen la capacidad de formar malacates del
anastral. Las conclusiones similares han sido obtenidas con espermatocitos de la tpula (Dietz, 1966; Steffen
et al., 1986), pero no con espermatocitos del saltamontes donde ambos los cromosomas y el cen-trosomes
sean esenciales para la formacin del malacate (Zhang y Nicklas, 1995). Adems, una serie de estudios
claramente han demostrado que la asamblea del malacate durante la divisin del mitotic de una coleccin
variada de vertebrado que la celda categoriza invariablemente requiere la presencia de centrosomas
funcionales (revisado en Rieder Et Al., 1993). Conjuntamente, estas conclusiones suben la pregunta de por
qu la habilidad a formar malacates del anastral en celdas que nor-mally contienen centrosomas est
restringida para algunos meiotic
Los sistemas. Es posible que esta propiedad refleja tipos diferentes de interaccin entre cromosomas y
microtu-bules. En celdas vertebradas del mitotic y en sper-matocytes del saltamontes, los cromosomas slo
pueden capturar y stabi-lize los microtubules nucleated por los centrosomas, y no pueden parecer tener la
capacidad de estimular crecimiento del microtubule (Rieder Et Al., 1993; Zhang y Nicklas, 1995). En el
contraste, en meiosis masculinos Drosophila y ms probablemente tambin en Pales Meiosis, los
cromosomas actan como el microtubule-organize se concentre, aun a falta de centrosomas (el Higo. 3 B;
Vea tambin a Church et al., 1986). As, sugerimos que los malacates del anastral sean ensamblados slo en
esos sistemas de cen-trosome-contain donde los cromosomas pueden inducir formacin de un suficiente
nmero de microtubules. En los sistemas donde los cromosomas son incapaces de promover crecimiento
sustancial del microtubule, no hay suficientes microtubules para formar un malacate bipolar.
El asl la Forma Mutants un Spindle Central Normal que es Completamente Capaz para Induce Cytokinesis
Una de las caractersticas ms notables de meiosis del varn del asl es la formacin de una normalidad del
morphologically malacate central en la mayora de ana telophases. Este descubrimiento desafa la vista de
classi-cal de asamblea central del malacate a travs de la interaccin de microtubules polares antiparalelos.
Nuestros resultados argumentan a favor de una autoorganizacin del malacate central usando ya sea
microtubules preexistentes o (Masuda y Cande, 1987) recin forjados. La formacin del malacate ms
probable, central durante meiosis masculinos es mediada por microtubule interrelacionando, y fin el kinesin
direccionado como motores (revisado en Sawin y Endow, 1993; Ault y Rieder, 1994; Hoyt, 1994). Este hy-
pothesis es soportado por el descubrimiento que las mutaciones en KLP3A, un gene de la Drosfila
codificando un kinesin como protena que se concentra en el varn central del malacate midzone dur ing
meiosis, desestabiliza formacin central del malacate y cytokinesis (Williams Et Al., 1995; Giansanti et al.,
1998).
Una cuestin dudosa acerca de hendidura de la clula en los sistemas animales es la fuente de seales que
estimula for-mation contrctil del anillo y cytokinesis (revisado por Fishkind y Wang, 1995; Glotzer, 1997;
Goldberg et al., 1997). Ha sido sugerido que a estas seales les puede ser provisto cualquier por los
cromosomas de metafase (Earnshaw Et Al., 1991) o lo as-ters (Rappaport, 1961; Hiramoto, 1971; Rappaport,
1986) o el malacate central (Rappaport y Rappaport, 1974; Cao y Wang, 1996; Fishkind et al., 1996). Nuestros
resultados claramente demuestran que los asteres no son necesarios para la seal de cyto-kinetic. Adems, el
hecho que los cromosomas del asl se esparcen dentro de la celda y nunca el congreso en un plato de
metafase fuertemente sugiere que los cromosomas el dictamen que se enlata no el posicionamiento del surco
de la hendidura. Esta conclusin est muy bien de acuerdo con los resultados de experimentos recientes de
mi-cromanipulation demostrando que los cytokinesis pueden ocurrir a falta de cromosomas en sper-matocytes
del saltamontes (Zhang y Nicklas, 1996). As, de los tres componentes del malacate de anafase los asteres,
el chro-mosomes, y el malacate central slo lo ms reciente parece ser requerido para dar seas de
cytokinesis. A este respecto, nos gustara sealar que nuestras conclusiones descartan el possi-bility del
malacate central meramente acumulando seales de cytoki-netic originndose de los asteres.
Recientemente hemos mostrado eso durante varn de la Drosfila
Meiosis, hay una interaccin cooperativa entre el malacate central y el anillo contrctil; Cuando uno de estas
estructuras es desordenado el otro es tambin afectado (Gian-Santi et al., 1998). As, el malacate central
parece jugar un papel esencial durante cytokinesis. Los asteres, sin embargo, pueden ser importantes para el
posicionamiento simtrico del malacate de cen-tral entre las dos clulas hijas.
Agradecemos B. Wakimoto para mutantes estriles masculinos inducidos por SME; C. El campo, W.G.
Whitfield, T.C. Kaufman, y Antes de Cristo Williams para anillin, gtubulin, centrosomin, y los anticuerpos
KLP3A, respectivamente; C. Goday, L. Lascari, y F. Pasquetti para el consejo y la ayuda con EM; Y M.L.
Goldberg para comentarios en el escrito.
Este trabajo fue soportado en parte por una concesin de Progetto Strategico Del Ciclo CNR Cell y Apoptosis.
Recibido para publicacin 10 de marzo de 1998 y adentro forma revisada 15 junio de 1998.