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Enzimas

Objetivos 0 Analizar las caractersticas y el mecanismo de accin de las enzimas 0 Enumerar de qu factores depende la actividad enzimtica. justificarlo. 0 Diferenciar entre actividad enzimtica y actividad especfica y aplicar estos conceptos a la resolucin de problemas. 0 Calcular la velocidad inicial (Vo) de una reaccin enzimtica midiendo la formacin de producto en funcin del tiempo. 0 Formular la ecuacin de Michaelis-Menten, registrar grficamente dicha ecuacin, y evaluar la informacin que proporciona la misma. 0 Conocer el significado de los parmetros cinticos Km y Vmx, y determinar los mismos a partir de los datos numricos (tablas o grficos) 0 Utilizar el grafico de Lineaweaver-Burk para la obtencin de los parmetros cinticos. 0 Resolver, en cada caso, los diferentes tipos de ejercitacin presentada.

Las funciones vitales de una clula implican la existencia de un gran nmero de procesos y vas metablicas que consisten en secuencias de reacciones qumicas que se llevan a cabo con la presencia de una serie de catalizadores orgnicos denominados Enzimas. Si las mismas reacciones tuvieran que realizarse sin la presencia de dichos catalizadores, las velocidades con las que ocurriran serian tan lentas que serian incapaces de reconocer las necesidades fisiolgicas de la clula. Una funcin tan compleja y especfica como la de las enzimas, slo podra ser cumplida por molculas estructuralmente tambin tan complejas y susceptibles a la accin de diversos factores que modifiquen su actividad, como son las protenas. Una enzima es una protena con propiedades catalticas, elaborada por la clula, susceptible de ser regulada y que adems presenta, como veremos ms adelante, un alto grado de especificidad. Como todo catalizador, aceleran notablemente la velocidad de una reaccin qumica y cumple con las siguientes condiciones: a) Son efectivas en cantidades pequeas b) No sufren modificaciones ni cualitativas ni cuantitativas al final de la reaccin. Es decir deben quedar qumicamente inalteradas. c) No afectan la posicin de la reaccin que catalizan. Es decir se llega mucho ms rpidamente al equilibrio, pero el mismo es igual al que se llegara en ausencia del catalizador. Pero adems de cumplir estas condiciones propias de todos los catalizadores, las enzimas presentan una serie de caractersticas, derivadas de su naturaleza proteica que las diferencia netamente de los catalizadores inorgnicos:

a) Son termolbiles b) Presentan una mayor eficiencia. Entendiendo por eficiencia en este caso al numero de moles de sustrato transformado por mol de catalizador en la unidad de tiempo c) Presentan alta especificidad en relacin a la naturaleza de la reaccin que catalizan y al sustrato que utilizan. d) Estn sujetas a una gran variedad de controles celulares.
Energa de activacin Para que ocurra una reaccin qumica en un sentido determinado debe producirse con un G negativo, pero adems debe producirse a una velocidad adecuada. Un valor negativo de G no implica necesariamente que la reaccin ocurra en ese sentido a alta velocidad. Para que esto ltimo ocurra es necesario que las molculas del sistema estn en un estado especial de reaccin denominado estado activado o excitado o de transicin. Tal activacin de las molculas involucra cierta energa adicional que es necesario entregar al sistema antes de la reaccin propiamente dicha. Esta energa adicional se denomina energa de activacin (Ea). Una vez vencida esta barrera energtica, el sistema reaccionaba de tal forma que se recobrar la energa de activacin, liberndose la energa libre Estado activado propia del sistema (G). La forma de sin enzima actuar de un catalizador y en particular de Ea sin con las enzimas es, como la de todo enzima enzima catalizador, disminuyendo la energa de Ea con enzima activacin lo cual se traduce en un incremento de la velocidad de la reaccin. S G El catalizador (enzima) se combina con los reactantes (sustratos) para formar un P complejo intermedio en un estado de transicin (complejo enzima-sustrato) que Grado de avance de la reaccin posee una energa libre menor que la que caracteriza al estado de transicin de la reaccin no catalizada, por lo que es mas fcil vencer la barrera presentada por la energa de activacin. Una vez que los productos de la reaccin se han formado se desprenden del catalizador el que queda libre para comenzar un nuevo ciclo cataltico. Otra forma de proveer al sistema qumico de la energa de activacin necesaria es calentando el sistema con lo cual aumenta la energa de las molculas. Pero, los organismos vivientes no pueden recurrir a cambios en la temperatura para acelerar sus procesos metablicos ya que las altas temperaturas que se requeriran serian incompatibles con la vida. Por esa razn, los organismos vivientes deben recurrir a las enzimas que actan como catalizadores para disminuir el valor de la Ea correspondiente. Por otra parte si las reacciones biolgicas importantes pudieran realizarse sin las enzimas, la clula no podra ejercer ningn control sobre las velocidades respectivas perdindose total posibilidad de que, como se dijo anteriormente, los distintos procesos metablicos acten en forma concertada.
G (cal/mol)

Centro activo de las enzimas Anteriormente se haba mencionado que una de las caractersticas ms importante de las enzimas es su alto grado de especificidad. Esa idea de especificidad esta relacionado con la interaccin de la enzima con el sustrato. El mecanismo de accin cataltica de un enzima radica en su estructura terciaria tridimensional que va hacer que la enzima sea especfica para el sustrato sobre el que acta. La unin enzima-sustrato se produce mediante fuerzas intermoleculares de carcter dbil que tienen lugar en la zona especfica del enzima que se denomina centro activo. Es una zona relativamente pequea y restringida de la enzima que posee estructura tridimensional en forma de hueco. Es donde actan las cadenas laterales de los aminocidos de fijacin y catalticos. El centro activo del enzima es el responsable directo de la accin cataltica y especfica de la enzima, aunque el resto de la molcula de la enzima (constituida por los aminocidos estructurales) tambin tiene importancia en el mantenimiento de todo el conjunto. . Este centro activo es pues una zona relativamente pequeo y restringido de la molcula proteica constituida por los grupos laterales de ciertos aminocidos de la cadena polipeptdica capaces de combinarse con diferentes partes de la molcula del o los sustratos y cofactores. As permiten una adaptacin ms o menos exclusiva de los mismos. A esos grupos responsables de la unin del sustrato a la enzima se los denomina sitios de unin. En la siguiente figura se muestra un diagrama de la enzima fructosa 2,6 difosfatasa (celeste claro) y la relacin existente entre el sustrato (azul) y los aminocidos que conforman el centro activo de la enzima. Los grupos laterales responsables de la actividad cataltica propiamente dicha reciben el nombre de sitios catalticos. En algunos casos esos grupos pueden corresponder a los grupos prostticos de los cuales hablaremos ms adelante. Los grupos que constituyen el centro activo, quizs situados bastante lejos unos de otros en la secuencia proteica, se aproximan y adoptan la configuracin caracterstica del mismo. Por esa causa aquellos factores que hacen que la enzima pierda su estructura terciaria nativa (por ejemplo en la desnaturalizacin proteica) se produce una alteracin profunda del centro activo, y conducen a la prdida de la actividad enzimtica.

Agentes auxiliares o Cofactores Algunas enzimas dependen para ser activas solamente de su estructura proteica. Mientras que otras necesitan adems estructuras no proteicas, denominados cofactores. Los cofactores puede ser un in metalico o bien una molcula orgnica compleja llamada coenzima. El complejo enzima cofactor cataliticamente activo recibe el nombre de HOLOENZIMA. Cuando se separa el cofactor, la protena restante, que por si misma es inactiva catalticamente, se denomina APOENZIMA.

Recordar. Unidad funcional: Holoenzima Apoenzima (protena) + grupo prosttico o cofactor Parte proteica de una enzima: Apoenzima, No tiene actividad cataltica. Cofactores. - Iones metlicos. La forma en que dichos iones actan en el proceso cataltico es ms o menos compleja y es imposible indicar un modo de accin comn a todos ellos. Cuando las enzimas requieren cationes para actuar, el requerimiento es estricto ya que en su ausencia la actividad es prcticamente nula. Tambin los aniones pueden actuar con ciertas enzimas como activadores, por ejemplo: sulfato, fosfato, cloruro, etc. COFACTORES (iones) Zn2+ Mg2+ Mn2+ Fe2+o Fe2+ Cu2+ Ni2+ Se K+ Na+ ENZIMAS Alcohol deshidrogenasa Anhidrasa carbnica Hexoquinasa Glucosa 6 fosfatasa Piruvato quinasa (junto con K+) Arginasa Ribonucletido reductasa Citocromos Peroxidasa Catalasa Tirosinasa Citocromo oxidasa ureasa Glutation peroxidasa Piruvato quinasa (junto con Mg2+) ATPasa (junto con Na+ y Mg2+)

- Coenzimas Son molculas orgnicas de estructura ms o menos compleja que intervienen en la reaccin generalmente como transportadores de algn grupo qumico. Se unen muy dbilmente a la enzima, por lo tanto son fcilmente disociables. El proceso de asociacin-disociacin es siempre reversible. Algunas coenzimas estn unidas a la molcula de la enzima, y reciben entonces el nombre de grupos prostticos. Estn fuertemente unidos a la protena, a veces por uniones covalentes. Son de difcil disociacin y cuando esto ocurre, la enzima pierde su actividad. Es interesante hacer notar que muchos grupos prostticos y coenzimas estn estructuralmente relacionados con las denominadas vitaminas. Estas sustancias son utilizadas en el organismo en esos casos como precursores de las coenzimas y grupos prostticos respectivos, y como el organismo carece de la capacidad de sintetizarlas deben se administradas en la dieta. Coenzima o grupo prosttico NAD y NADP Vitamina ENZIMA de la que deriva nicotinamida, o Deshidrogenasas vitamina B3 FAD y FMN riboflavina o vitamina Deshidrogenasas B2 piridoxal fosfato vitamina B6 Transaminasas glucgeno fosforilasa pirofosfato de tiamina o vitamina B1 -cetoglutrico decarboxilasa tiamina piruvato decarboxilasa Biotina biotina Piruvato carboxilasa Acetil-CoA carboxilasa cido tetrahidroflico cido flico Acta como transportador intermediario de grupos con un tomo de carbono (formilo, metenilo y metileno) Transferencia de grupos acetilo Coenzima A cido pantotnico o pirvico decarboxilasa. vitamina B5 Especificidad enzimtica Se haba mencionado anteriormente que una de las caractersticas distintivas que presentan las enzimas con respecto a los catalizadores inorgnicos era su alto grado de especificidad. Es sta, una propiedad de notable significacin biolgica, pues es la que hace posible la coexistencia de diversas vas metablicas perfectamente diferenciadas. Debemos entender por especificidad enzimtica a la limitacin de accin de cada enzima hacia un sustrato determinado (o un grupo de sustratos estructuralmente relacionados) y en relacin a una reaccin qumica perfectamente definida. As por ejemplo una enzima capaz de hidrolizar las uniones glicosdicas presentes en un polisacrido como el almidn, es incapaz de hidrolizar las uniones peptdicas de una protena y viceversa. Ms an, una enzima como la -amilasa pancretica, principal responsable de la degradacin del almidn y el glucgeno en el tracto gastrointestinal, actan hidrolizando las uniones ,1-4

glicosdicas de las mencionadas sustancias liberando unidades del disacrido maltosa y es incapaz de hidrolizar a esta ltima en dos molculas de glucosa a pesar de que la unin tambin es ,1-4 glicosdica. Esa funcin es llevada a cabo exclusivamente por otra enzima de origen intestinal, la maltasa. Si bien todas las enzimas exhiben la propiedad de su especificidad, el grado de especificidad puede variar de una enzima a otra. As por ejemplo algunas poseen especificidad absoluta. Estas enzimas tan solo pueden ejercer su accin sobre un sustrato determinado (o un par de sustratos, si la reaccin es bimolecular, donde la enzima utiliza dos sustratos). Como ejemplo podemos mencionar a la ureasa, enzima que desdobla especficamente a la urea en amonaco y CO2. Ureasa NH2-CO-NH2 + H2O CO2 + 2NH3 y la succinato deshidrogenasa que oxida exclusivamente al cido succnico para dar cido fumrico. Esta ltima enzima es una flavoprotena que contiene FAD covalentemente unido el cual tambin acta especficamente en la reaccin como aceptor de hidrgeno succinato deshidrogenasa Succinato + enzima-FAD

fumarato + enzima-FADH2

En algunos casos de reacciones bimoleculares, la enzima es altamente especfica para uno de los sustratos de la reaccin y no para el otro. Por ejemplo el caso del alcohol deshidrogenasa que es especfica para la coenzima NAD, pero no es tan especfica con respecto al otro sustrato que puede ser un gran nmero de alcoholes primarios, secundarios o polialcoholes como el etilenglicol. alcohol deshidrogenasa Alcohol + NAD

aldehido (o cetona) + NADH + H+

Otras enzimas presentan especificidad de reaccin Es decir son especficas en relacin al tipo de reaccin que catalizan pero no lo son tanto con respecto al sustrato involucrado. A este grupo de enzimas pertenecen algunas enzimas hidrolticas entre las cuales podemos mencionar como ejemplo a la fosfomonoestearasa alcalina que cataliza especficamente hidrlisis de steres fosfricos de acuerdo a la reaccin general, independientemente del carcter del grupo R. fosfomonoestearasa alcalina

R-O-PO32-

+ H2O

R-OH

+ PO4H2-

Por ltimo debemos mencionar aquellas enzimas que actan con sustratos que pueden existir en dos formas isomricas (ya se trate de ismeros pticos o geomtricos). En esos casos la enzima acta preferentemente sobre uno de los ismeros y no sobre el otro.

Por ejemplo existen dos enzimas capaces de desaminar oxidativamente a los aminocidos para dar los cetocidos respectivos (aminocido oxidasa). Una de ellas acta especficamente con los Laminocidos mientras que la otra lo hace exclusivamente con los D-aminocidos. Expresin de las concentraciones enzimticas La deteccin de una enzima en un medio biolgico, involucra dos aspectos, uno cualitativo y otro cuantitativo. Primero se debe poner de manifiesto la presencia en el medio de la enzima en estudio para en caso afirmativo determinar la cantidad en que se halle presente. Para lo primero, se recurre a la determinacin de la reaccin especfica por ella catalizada. Para ello se hace actuar alcuotas del medio en que se supone existe la enzima sobre el o los sustratos especficos en condiciones determinadas y se observa la transformacin de los mismos en los productos correspondientes. En cuanto a la cantidad de enzimas presente, como en la mayora de los casos es imposible determinar la cantidad de la misma en trminos absolutos (miligramos o micromoles de enzima) ya que por lo general se trata de medios que contienen una mezcla compleja de diversas protenas adems de la enzima en estudio. Por lo tanto, se recurre a la medida de la velocidad de la reaccin catalizada por la misma. Se entiende por velocidad de una reaccin qumica a la cantidad de reactivos que se transforman en producto en la unidad de tiempo, en condiciones ptimas. Ello es posible gracias al hecho de que en condiciones adecuadas de medida, la velocidad de la reaccin es directamente proporcional a la cantidad de enzima, por lo menos en un rango determinado.

V5

velocidad de reaccin

V4

V3 V2 V1 0 0 E1 E2 E3 E4 E5

cantidad de enzima

Variaciones de la velocidad de la reaccin en funcin del tiempo

En la prctica cuando se quiere medir la velocidad de una reaccin se agrega a un tubo de ensayo la solucin que contiene la enzima y la solucin que contiene el sustrato y se lo incuba a una temperatura adecuada. De esta manera el sustrato puede unirse a la enzima y formar el complejo ES que dar luego origen al producto. As, es posible medir la cantidad de producto que se va formando en intervalos de tiempo sucesivos. Si representamos en un grfico la cantidad de producto formado en funcin del tiempo, vemos que inicialmente (a tiempos cortos) se observa una recta, pero luego la formacin de producto no es lineal con el tiempo debido a que se van modificando las condiciones en las que se realiza la reaccin (como por ej. cambios en el pH, comienza a aumentar la formacin de producto y por lo tanto la reaccin inversa tiene una velocidad considerable, puede haber aparicin de subproductos, etc.). En consecuencia la velocidad de la reaccin se mide por la PENDIENTE DE LA TANGENTE A ESTA CURVA A TIEMPO CERO (t0). A la velocidad medida en estas condiciones se la denomina VELOCIDAD INICIAL (v0). La velocidad inicial es dependiente de la cantidad de sustrato y de enzima presente. Porque. a) para una dada cantidad de enzima: a mayor nmero de molculas de sustrato ms rpidamente se formarn el complejo ES y por lo tanto ms rpido se formarn molculas de producto b) para una dada concentracin de sustrato: cuantas ms molculas de enzima tenga, mayor ser la cantidad de molculas de ES formadas y, en consecuencia, mayor ser la formacin de producto Es posible expresar la cantidad de una enzima en trminos de unidades enzimticas, entendindose por unidad de una enzima, la cantidad de la misma que produce una cierta velocidad de reaccin bajo ptimas condiciones. Esa velocidad de reaccin se expresa como la cantidad de sustrato transformado en cierto tiempo.

Para evitar ambigedades en la utilizacin de distintas unidades, se ha definido por convencin una unidad que puede ser aplicada a todas (o casi todas) las enzimas, y que permite comparar las actividades de enzimas diferentes. La definicin recomendada es la siguiente: Una unidad internacional (UI) de cualquier enzima, es la cantidad de la misma que cataliza la transformacin de un micromol (mol) de sustrato por minuto bajo condiciones definidas.

UI = mol / min
Existe otra unidad denominada Katal que se define como la cantidad de enzima que transforma un mol de sustrato en producto en un segundo

Katal = mol / seg


En cuanto a las mencionadas condiciones ``optimas`` de medida, debe establecerse la temperatura a la cual se define la unidad, adems del pH del medio de reaccin, la concentracin del o los sustratos y cofactores, etc. Es necesario establecer estrictamente las condiciones de medida, debido al hecho de que todos los factores mencionados inciden en forma notable sobre la actividad enzimtica tal como se ver a continuacin.

Efecto de la temperatura Cuando se estudia la variacin de la actividad de una enzima en funcin de la temperatura y los resultados se representan en un sistema de coordenadas cartesiana, se obtienen grficos del tipo observado en la figura siguiente. Este tipo de curva es la resultante de dos factores fundamentales. En primer lugar, las reacciones qumicas, catalizadas o no, aumentan su velocidad al aumentar la temperatura. Pero en el caso particular de las reacciones catalizadas por enzimas ese aumento tiene un lmite. Debido a su naturaleza proteica, por encima de cierta temperatura (variable con cada enzima) las mismas comienzan a desnaturalizarse convirtiendo ese proceso de inactivacin trmica en un factor ms importante que el del incremento de la velocidad de la reaccin. Por esa causa todas las enzimas exhiben una temperatura, o un rango de temperaturas, a la cual la velocidad de la reaccin catalizada es mxima y se la denomina

temperatura ptima. Para las enzimas de animales de sangre caliente la temperatura ptima est por lo general comprendida entre 25 y 37C. Esta temperatura es lo suficientemente alta como para dar una actividad razonable, y lo suficientemente baja como para evitar la desnaturalizacin trmica de la mayora de llas. Efecto del pH En general, cada enzima es activa tan slo en un mbito de pH ms o menos restringido y en la mayora de los casos presenta un pH ptimo definido, es decir un pH para el cual la actividad es mxima. A partir de ese punto hacia un lado y hacia el otro la actividad disminuye. La curva de actividad enzimtica en funcin del pH adopta, en general, una forma caracterstica de campana tal como se muestra en el ejemplo de la figura siguiente. Tanto el mbito del pH dentro del cual es activa una enzima as como su pH ptimo son caractersticas de cada enzima y se adaptan a las condiciones fisiolgicas en las cuales la misma debe actuar. As la pepsina, enzima proteoltica del jugo digestivo tiene un pH ptimo de 1,5 a 2,5 mientras que la tripsina, enzima tambin proteoltica pero de origen pancretico y que acta a nivel de la luz intestinal, tiene un pH ptimo de 9 a 11. Es de hacer notar que no todas las enzimas presentan una curva de pH de tipo campana tan caracterstica. Por ejemplo, la papana, una enzima fuertemente proteoltica que se encuentra en el fruto de la papaya, tiene una actividad constante en el mbito 4 a 9, y la colinesterasa, enzima que en el tejido nervioso hidroliza a la acetil colina, mediadora del impulso nervioso, en cido actico y colina, no presenta la rama descendente de la curva pH. La dependencia de la actividad enzimtica con el pH puede atribuirse a una serie ms o menos compleja de factores entre los cuales podemos mencionar a los siguientes: 1) Ionizacin directa de los residuos de aminocidos presentes en el centro activo, 2) El pH puede alterar el o los sustratos responsables de la reaccin qumica, por lo tanto tambin en esos casos la formacin del complejo enzima-sustrato ser dependiente el pH. 3) Tambin pueden modificarse los grupos de la cadena laterales de los aminocidos de la protena, esto trae aparejada la posible modificacin de
Velocidad de reaccin (%)

su estructura espacial de tal manera que facilite o dificulte su unin con el sustrato. Fuerza inica La fuerza inica de una solucin esta relacionada con la cantidad y el tipo de iones presentes en la misma. Como ya mencionamos anteriormente, fundamentalmente algunos cationes son necesarios en el centro activo de algunas enzimas para su normal funcionamiento. Efecto de la concentracin del sustrato Este es uno de los factores ms importantes que determinan la velocidad de las reacciones enzimticas. En la mayora de los casos, cuando se representa esta ltima en funcin de la concentracin de sustrato, manteniendo la concentracin de la enzima, pH, temperatura y fuerza inica constante, se obtienen curvas hiperblicas tal como se indica en la figura siguiente. En dicha curva puede observarse que para valores muy pequeos de la concentracin del substrato (S), la velocidad de la reaccin (Vo) es directamente proporcional a S. Es decir al duplicarse o triplicarse la concentracin del sustrato se duplica o triplica respectivamente la velocidad de la reaccin. Al seguir aumentando (S), el incremento de (v) deja de ser lineal y la velocidad va hacindose cada vez menor hasta que llega un momento en que permanece constante, es decir, no aumenta por ms que se incremente (S). A la velocidad alcanzada en ese momento se la denomina velocidad mxima de la reaccin (Vmx) para esa cantidad de enzima y slo puede ser aumentada aumentando la concentracin de la enzima. Basndose en este fenmeno, Michaelis y Menten enunciaron en 1913, una teora general de la accin enzimtica que fue la base del desarrollo posterior de la moderna cintica enzimtica. En esa teora se adopt la primitiva sugestin hecha por Henri de 1902, de que la enzima forma primero un complejo con su sustrato el cual se desdobla subsecuentemente en la enzima libre y los productos de la reaccin. Esquemticamente el mecanismo de la reaccin podra representarse en la siguiente forma:

E + S ES E + P
En las cuales E, representa a la enzima; S, al sustrato; E-S al complejo enzimasustrato y P y el producto o los productos. Mediante un desarrollo matemtico de dichas ecuaciones Michaelis y Menten dedujeron una ecuacin que relaciona cuantitativamente la velocidad iniciales de la reaccin (Vo) con la concentracin de sustrato (S) y que concuerda perfectamente con los datos experimentales.

La ecuacin, conocida con el nombre de Michaelis-Menten es la siguiente:

V max x (S) Vo = ----------------K m + (S)


Vmx es la velocidad mxima a que hemos hecho referencia y que es un valor constante para cada concentracin de enzima y Km es una nueva constante denominada constante de Michaelis, depende del sustrato y es independiente de la concentracin de enzima y a cuyo significado nos referiremos ms adelante. Un ligero anlisis de la ecuacin de Michaelis-Menten nos permitir comprobar como la misma se adapta a la curva experimental observada. Si analizamos la zona de la curva para la cual la concentracin de sustrato es muy pequea con respecto al valor del Km, el valor de Km + (S) del denominador se hace muy aproximadamente igual a Km. Esto indica que Vo es directamente proporcional a (S) y ese trozo de la curva ser muy aproximadamente una recta como se indic oportunamente.

(S) < Km
Vo = V max x (S) ------------------Km

(S) = Km
V max x Km V max Vo = ------------------- = ------------Km+Km 2

(S) > Km
Vo = V mx

A la inversa, para concentraciones de S muy grandes con respecto a Km, el denominador Km + (S) ser ahora muy aproximadamente igual a (S). As se obtiene un valor constante e igual a la velocidad mxima. En esas condiciones toda la enzima presente est formada del complejo enzima-sustrato: se dice que el sustrato est en condiciones saturantes o que la enzima est saturada. Veamos ahora que velocidad obtendr cuando se toma un valor de (S) igual al valor de la constante Km. Para ello reemplacemos en la ecuacin de Michaelis-Menten (S) por Km. Es decir que ahora le podemos asignar a Km un significado experimental inmediato: es la concentracin del sustrato para la cual la velocidad de la reaccin es la mitad de la velocidad mxima. Tiene una importancia fisiolgica muy grande ya que cuando una enzima tiene un valor muy pequeo del Km para un dado sustrato significa que con una concentracin muy baja de dicho sustrato se puede alcanzar la saturacin de la enzima. Desde otro punto de vista, se considera al Km como una medida indirecta e inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato. Es decir, cuanto menor es el valor de Km mayor ser la afinidad de la enzima por el sustrato y viceversa a un valor muy grande del Km corresponder una afinidad muy pobre de la enzima por el sustrato. El conocimiento de los valores del Km es muy til por ejemplo en los casos de enzimas que tienen una especificidad no muy estricta, es decir que pueden actuar sobre ms de un sustrato al permitir tener una indicacin de hacia cual de ellos va a

tener mayor afinidad y actuar en esa forma preferentemente. As la hexoquinasa de cerebro, enzima que como se ver oportunamente puede actuar sobre varias hexosas catalizando su fosforilacin con ATP, para dar sus steres 6-fosfato correspondientes, tiene distinta afinidad por cada uno de ellas segn se desprende del anlisis de los valores de las Km respectivas indicadas a continuacin. Hexosa Glucosa Manosa Fructosa Galactosa Km (M) 8 x 10-6 5 x 10-6 1,6 x 10-3 1 x 10-1 Es evidente que su afinidad por glucosa y manosa es muchsimo mayor que sobre fructosa y galactosa. Tambin puede darse el caso de dos enzimas distintas que pueden catalizar una reaccin semejante como por ejemplo la ya mencionada hexoquinasa cerebral y la glucoquinasa heptica. Ambas enzimas catalizan la formacin de glucosa-

6-fosfato a partir de glucosa. Mientras que la hexoquinasa tiene un Km hacia la glucosa de 1 x 10-4 M, el de la glucoquinasa (heptica) es 1 x 10-2 M, es aproximadamente 100 veces mayor. Si se tiene en cuenta adems el valor de la concentracin de glucosa en sangre (3.8 a 6.1 mM) se puede deducir que, en condiciones normales la hexoquinasa cerebral estar saturada de su sustrato y por lo tanto actuar a su mxima velocidad. En cambio la actividad de la glucoquinasa heptica slo ser significativa cuando la concentracin de glucosa se eleve por encima de lo normal, cuando hay una ingesta considerable de glcidos dietarios. Los casos mencionados ejemplifican adems otra caracterstica de las enzimas con respecto a los Km y es que enzimas similares pero de distintos rganos pueden diferenciarse en la afinidad hacia el mismo sustrato como ocurre con las hexoquinasas de cerebro e hgado ya mencionadas. Esas enzimas que catalizan la misma reaccin y pertenecen a la misma especie, pero se distinguen en algn parmetro cintico o estructural, se denominan isoenzimas. Debemos mencionar que tambin el conocimiento de las Vmx puede aportar datos tiles para la evaluacin de la importancia fisiolgica de una dada enzima ya que conjuntamente con el conocimiento del Km (o de los Km si la reaccin involucra ms de un sustrato), nos permitir determinar cuan efectivamente la misma est funcionando en los tejidos de un organismo vivo. Establecida la importancia de ambos parmetros (Km y Vmx) veamos ahora como pueden determinarse fcilmente por un mtodo grfico. Para ello hallemos la inversa de la ecuacin de Michaelis-Menten.

V mx x (S) Vo = ---------------Km + (S) Km + (S) Km 1/v = ---------------- = ---------------- + Vmx x (S) Vmx x (S) (S) ---------------Vmx x (S)

Km 1 1 1/Vo = ---------- x ------- + -------Vmx (S) Vmax


Esta ecuacin conocida con el nombre de ecuacin de Lineweaver y Burk corresponde a la ecuacin de una recta del tipo y = a x X + b, en la cual y = 1/v; X = 1/[S]; a = Km/Vmax; b = 1/Vmax Midiendo las velocidades enzimticas para distintas concentraciones de sustrato y representando grficamente en funcin de 1/[S] se obtendrn rectas como se indica en la figura siguiente. Es fcil demostrar que la interseccin la recta con el eje de las ordenadas ser igual a 1/Vmx y la interseccin con el eje de las abscisas corresponder a (-1/Km), por lo tanto una vez trazada la recta podremos obtener directamente del grfico los valores correspondientes de Km y Vmax.

1/Vo
1/v tal de
1/Vmx Pendiente = Km/Vmx

-1/Km

1/(S)

Cuando se trata de reacciones con dos o ms sustratos es necesario determinar los Km para cada uno de ellos. Para esto se agregan los otros en exceso (concentraciones saturantes) y se vara tan solo la de aquel cuyo Km se quiere determinar.

Curiosidades (este recuadro es a titulo informativo, no sera incorporado al parcial).


MAUD LEONORA MENTEN. Maud Menten naci en Port Lambton, Ontario, Canad, el 20 de marzo de 1879. Se gradu en la universidad de Toronto en 1913. Menten fue una de las primeras mujeres canadienses doctoradas en medicina. Dos aos ms tarde ella y Leonor Michaelis publicaron un artculo que describa la relacin entre el ndice de una reaccin enzima y de la concentracin del substrato de la enzima. La ecuacin de Michaelis-Menten dio a los cientficos una manera de la cual podran analizar matemticamente sus observaciones y descripciones de reacciones biolgicas. Menten continu su carrera brillante como patlogo en la universidad de Pittsburgh a partir de 1918, publicando extensivamente en temas mdicos y bioqumicos. Sus muchos logros incluyeron co-descubrimientos importantes referentes el azcar de la sangre, la hemoglobina y a las funciones del rin. Public en 1944 el qu puede ser el primer uso de la electroforesis en la separacin de las protenas. Entre 1951 y 1954 ella condujo la investigacin de cncer en la Colombia britnica. Maud Menten era una mujer interesada en muchas cosas, incluyendo idiomas, msica, y las bellas artes. Realiz exposiciones de pintura con otros artistas de Pittsburgh. Volvi a Ontario seis aos antes de su muerte, el 20 de julio de 1960 en Leamington. LEONOR MICHAELIS. Fue un bioqumico y mdico famoso nacido en Alemania. Nacio el 16 de enero de 1875, estudi medicina en Friburgo de Brisgovia, donde se gradu en 1897. Luego se mud a Berln, donde recibi su doctorado. Michaelis trabaj como asistente de Paul Ehrlich (1898-1899), Moritz Litten (1899-1902) y Ernst Viktor von Leyden (1902-1906). En 1906 comenz como director del laboratorio de bacteriologa en el hospital de la Charit en Berln, convirtindose en profesor extraordinario en la Universidad de Berln en 1908. En 1922 se traslad a la Facultad de Medicina de la Universidad de Nagoya (Japn) como profesor de bioqumica; en 1926 a la Universidad Johns Hopkins en Baltimore, Maryland como profesor residente en la investigacin mdica y en 1929 el Instituto Rockefeller de Investigacin Mdica de Nueva York Ciudad, donde se retir en 1941. Adems de su papel en la formulacin de la ecuacin Michaelis-Menten (1913) descubri la tincion vital de la mitocondria con verde Jano como y el cuerpo de Michaelis-Gutmann en infecciones del tracto urinario (1902) y encontr que el cido tiogliclico podra disolver la queratina.Muri el 8 de octubre de 1949 en Nueva York.