Inhibicin enzimtica

0 Analizar los diferentes tipos de inhibicin presentados, irreversibles y reversibles. 0 Diferencia entre inhibidores competitivos y no competitivos. ejemplos 0 Utilizar los grficos de Michaelis-Menten y Lineaweaver-Burk para estudiar el efecto de los diferentes inhibidores sobre los parmetros cinticos. 0 Representar los grficos de Michaelis-Menten y Lineweaver-Burk en una situacin problema. 0 Describir los diferentes mecanismos de regulacin enzimtica. 0 Comparar y diferenciar entre una enzima michaeliana y una enzima alostrica. 0 Conocer de qu manera las determinaciones de actividades enzimticas en sangre pueden ser utilizadas para el diagnstico de enfermedades. 0 Definir mapa enzimatico, identificar difrentes mapas enzimticos caracteristicos de diferentes patologias. 0 Definir el termino Isoenzimas, ejemplos. 0 Resolver la ejercitacin y los casos clnicos. Bibliografa. Bioqumica de Harper. Editorial el Manuel Moderno (Mxico) Principios de Bioqumica. Lenhinger. Editorial Omega (Barcelona) Bioqumica. Lutber Stryer. Editorial Revert (Barcelona)

La actividad de una enzima puede ser disminuida o eliminada completamente por la accin de ciertas sustancias a las cuales se las conoce con el nombre genrico de inhibidores enzimticos. Debemos aclarar que no deben ser incluidos en este grupo de sustancias, aquellos agentes que producen simplemente una destruccin irreversible de la enzima, como podran ser todos aquellos que conducen a su desnaturalizacin, como por ejemplo los cidos fuertes. La inhibicin enzimtica es de gran importancia fisiolgica, ya que a veces la inhibicin de una sola enzima que forma parte de una cadena de reacciones metablicas puede inhibir por completo a todo el proceso metablico involucrado y ejercer en esa forma un efecto profundo y a veces fatal sobre el organismo. De ms est recalcar la importancia que este fenmeno tiene en farmacologa y toxicologa como as tambin en el desarrollo de herbicidas e insecticidas. De ah que el estudio del mecanismo de accin de los inhibidores se haya constituido en una de las ms exploradas de la enzimologa prctica. Los inhibidores pueden clasificarse en dos grandes grupos:

1) Irreversibles. 2) Reversibles i) competitivos ii) no competitivos

En el primer caso la enzima no recobra su actividad por remocin del inhibidor libre. Esto es debido a que el inhibidor irreversible, acta por lo general modificando irreversiblemente o an destruyendo algunos de los grupos esenciales del centro activo. En el segundo caso, la enzima recobra su actividad por remocin del inhibidor libre (por ejemplo por simple dilisis). Lo cual demuestra que hay un equilibrio entre el inhibidor libre y la enzima. Ejemplos de uno y otro tipo de inhibidores los encontramos entre los llamados reactivos de tioles. Estas sustancias tienen la particularidad de reaccionar especficamente con grupos sulfhidrilos de las proteinas, aportados por los grupos laterales correspondientes a los residuos de cistena. Existen ciertas enzimas que requieren para actuar que algunos de esos grupos sulfhidrilos estn libres. Es evidente que en esos casos los reactivos de tioles, al bloquear los grupos sulfhidrilos esenciales de estas enzimas, pueden actuar como inhibidores. Entre algunos reactivos de tioles podemos mencionar al p-cloromercuribenzoato y el alquilante iodoacetato, que ejemplifican a un inhibidor reversible y aun inhibidor irreversible respectivamente. Ambos reaccionan con los grupos sulfhidrilos libres (-SH) de las proteinas, pero en tanto que el primer lo hace formando un complejo reversible (mercaptida), el segundo forma un carboximetil-derivado de gran estabilidad, incapaz de disociarse.

Cl-Hg

COO-

Hg

COO- + ClH

Enzima

P-cloromecuribenzoato

Enzima inactiva

En el primer caso, una vez establecido el equilibrio, si se elimina el pcloromercuribenzoato, la reaccin, por el principio de accin de masa, se va a desplazar hacia la izquierda, disocindose el complejo enzima-inhibidor en enzima libre e inhibidor. Si la eliminacin es total, toda la enzima recuperar su forma libre activa. En cambio, en el segundo caso, una vez formado el carboximetil-derivado, es imposible disociarlo dada su extraordinaria estabilidad, por ende, la eliminacin del exceso del inhibidor ser ineficaz para hacer recuperar la actividad original. Otro ejemplo de inhibicin irreversible es el representado por los llamados gases neurotxicos que se desarrollaron durante la 2 guerra mundial, para ser utilizados como gases de guerra.

Son sustancias que reaccionan con el grupo alcohlico del resto lateral correspondiente a la serina de algunas enzimas que tienen un hidroxilo en el centro activo y que es necesario para que la enzima presente actividad. Una enzima de ese tipo es la acetilcolinestearasa que interviene en los procesos de transmisin del impulso nervioso, causando entre otros efectos, parlisis de los msculos estriados. acetilcolinestearasa

Acetilcolina + H2O colina + acetato

Una de las primeras sustancias que se utiliz con ese fin es el diisopropilfluorofosfato que reacciona con la enzima en la siguiente forma.

Se lo utiliz tambin como insecticida (pertenece al grupo de los organofosforados). Es muy efectivo pero sumamente peligroso por su volatilidad. Vamos ahora a referirnos exclusivamente a la inhibicin reversible en la cual el inhibidor tambin interacta con algn grupo esencial de la enzima, pero hacindolo en forma reversible. Las distintas formas de interacciones se traducen en varios tipos de inhibicin perfectamente diferenciables experimentalmente. Los dos tipos ms comunes son la competitiva y la no competitiva. En la inhibicin competitiva el inhibidor se combina reversiblemente con la enzima en el sitio por el cual se debera unir el sustrato, impidiendo por lo tanto la formacin del complejo activo enzimasustrato. De ah el nombre de competitiva porque efectivamente tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el mismo sitio y tratan de desplazarse mutuamente de la enzima. Las posibles formas de reaccionar del sustrato y el inhibidor con la enzima pueden presentarse

por las ecuaciones indicadas en el recuadro. Por ello este tipo de inhibicin puede disminuirse considerablemente aumentando la concentracin de sustrato. En este tipo de inhibidores se incluyen sustancias que estructuralmente son muy parecidas al sustrato y, por lo tanto, pueden ocupar el lugar que ocupara el mismo sobre la enzima pero no van a ser transformadas por la enzima. . Un ejemplo clsico de este tipo de inhibicin es el de la inhibicin de la succinato deshidrogenasa, enzima que tiene por sustrato el cido succnico, por otras sustancias estructuralmente parecidas al cido succnico, como el cido masnico, el cido oxlico, y el cido glutrico.

cido succnico cido malnico

cido oxlico cido glutrico

En la inhibicin no competitiva, se postula que el inhibidor se une con la enzima en otro sitio, que no es aquel por el cual se une el sustrato. Por esa razn la unin del sustrato con la enzima no es afectada por la presencia del inhibidor y se puede formar entones un complejo enzimasustrato-inhibidor. Pero este complejo es catalticamente inactivo y no puede escindirse en productos de la reaccin y complejo enzima-inhibidor. En este caso, las posibles formas de reaccionar del sustrato y el inhibidor con la enzima se representan por las ecuaciones siguientes. Este tipo de inhibicin se caracteriza entonces porque no puede ser revertido por un aumento en la concentracin de sustrato. El sustrato no puede desplazar al inhibidor unido a la enzima. Experimentalmente ambos tipos de inhibicin pueden distinguirse fundamentalmente mediante la aplicacin del mtodo de Lineweaver y Burk, antes descripto, a la reaccin

enzimtica con y sin inhibidor en cuyos respectivos casos se obtendrn los grficos indicados en las figuras siguientes.
Inhibicin competitiva Michaelis-Menten
Vo Vmx
Sin inhibidor

Lineweaver-Burk
1/Vo
Con inhibidor

Con inhibidor

Vmx/2

1/Vmx

Sin inhibidor Km Km inh

10
0

(sustrato)

-1/Km -1/Km inh

1/(S)

Como puede apreciarse en el grfico, en el caso de la inhibicin competitiva la Vmx para una dada cantidad de enzima no se modifica por el agregado de inhibidor porque agregando una concentracin lo suficientemente grande de sustrato se pude desplazar completamente al inhibidor. Sin embargo, el Km aumenta porque la presencia del inhibidor hace que se necesite una mayor cantidad de sustrato para saturar a la enzima que la que se necesitar si el inhibidor no estuviera presente. En contraposicion a lo anterior, en la inhibicin no competitiva, el inhibidor disminuye el valor de la Vmx sin modificar el Km ya que la unin del sustrato a la enzima no est alterada por la simultnea unin del inhibidor. Inhibicin NO competitiva
Michaelis-Menten
Vo
Vmx Sin inhibidor

Lineweaver-Burk
1/Vo
Con inhibidor

Vmx/2 Vmx inh Vmx inh/2

Con inhibidor

Sin inhibidor

1/Vmx inh

1/Vmx Km = Km inh
(sustrato)

-1/Km

1/(S)

En resumen. Sitio de unin de la enzima - La unin del sustrato y competitiva del inhibidor son mutuamente excluyentes - A muy altas concentraciones de sustrato desaparece la inhibicin - Por lo general, el inhibidor competitivo es un anlogo qumico del substrato. no competitiva - Se une a un lugar diferente del sitio activo de la enzima - Se une a la enzima libre y tambin al complejo enzima-sustrato - El valor de Km se mantiene - Disminuye el valor de Vmx Tipo de Inhibicion reversible En presencia del inhibidor - el valor de Km aumenta - Se mantiene el valor de Vmx esquema

Enzimas alostricas
Las enzimas a las cuales nos hemos referido hasta este momento, enzimas michaelianas, corresponden a lo que se ha dado en llamar enzimas clsicas. Pero adems existen ciertas enzimas con caractersticas regulatorias que poseen propiedades que las distinguen de las primera y que e denominan enzimas alostricas. Las enzimas alostricas como las clsicas reconocen y se asocian en su centro activo a un sustrato especfico y catalizan su conversin en productos. Pero adems estas enzimas tienen la propiedad de reconocer selectivamente a uno o varios compuestos distintos del sustrato cuya asociacin reversible con la proteina tiene por efecto modificar su actividad frente al sustrato, ya sea activndolo o inhibindolo, sin participar en nada en la reaccin en s. Dichos compuestos que reciben el nombre de efectores o moduladores alostricos interaccionan con la enzima en un sitio distinto y generalmente distante del centro activo que recibe el nombre de sitio alostrico. Se acepta que la asociacin del efector alostrico a la proteina en el sitio alostrico produce una alteracin de la configuracin espacial de la enzima (transicin alostrica) que se transmite al centro activo modificndolo de tal manera que la actividad de la enzima aumenta o disminuye segn se trate de un efector o modulador alostrico positivo o negativo respectivamente.

Las enzimas alostricas tienen por lo general una estructura proteica ms compleja que la de las enzimas no regulables, estn constitudas por subunidades. Adems pueden responder a la accin de ms de un efector alostrico (positivos y negativos), en cuyo caso poseen en su estructura un sitio alostrico distinto para cada uno de ellos. Desde ese punto de vista las enzimas alostricas pueden clasificar en tres grandes grupos: a) Homotrficas : en las cuales el mismo sustrato puede actual como modulador, generalmente positivo. b) Heterotrficas: aquellas que son moduladas positiva o negativamente por sustancias distintas del sustrato para cada una de las cuales la enzima posee un sitio especfico de reconocimiento, y c) Homotrficas-heterotrficas: responden a efectos regulatorios del mismo sustrato y de sustancias distintas del mismo Desde el punto de vista metablico, estas enzimas, que generalmente catalizan reacciones prcticamente irreversibles, se encuentran ubicadas estratgicamente en ciertos puntos de las vas metablicas, de tal manera que su regulacin coopera en forma efectiva en la economa general de la clula. As por ejemplo las encontramos como primera enzima de una secuencia de reacciones de tal manera que su activacin o inhibicin aumente o disminuya respectivamente la velocidad de toda la va metablica involucrada de acuerdo a las necesidades de la clula. Modelos para las enzimas alostricas Se han propuesto algunos modelos para interpretar las interacciones entre la proteina, el sustrato y el o los efectos de las enzimas alostricas. Entre ellos vamos a describir brevemente los debidos a Monod, Wyman y Changeux (1965) y a Koshland, Nemethy y Filmes (1966). El primero de ellos, conocido con el nombre de modelo concertado simtrico, parte del supuesto de que la proteina regulatoria (oligmero) consiste de dos o ms subunidades idnticas (protmeros) que se asocian de tal manera que la molcula posea por lo menos un eje de simetra. Cada subunidad contiene un sitio de unin para cada sustrato y efector mantenindose la simetra de la molcula. Cada subunidad puede existir en dos estados conformacionales distintos denominados estados R y T, que difieren en la posibilidad que poseen de unirse al o los sustratos y los efectores. As R tiene afinidad por el sustrato mientras que T tiene baja afinidad por el mismo. La transicin de una conformacin de una subunidad es concertada con la correspondiente transicin en las subunidades vecinas de tal manera que todas las subunidades se

encuentren en el mismo estado conformacioneal simultneamente y la simetra molecular se mantenga. Por otra parte el equilibrio entre la forma R y la forma T, se establece en ausencia de los sustratos y efectores.

En la figura se representa esquemticamente este modelo para una proteina oligomtrica constituida por dos subunidades en la cual sustrato S y el efector positivo A se unen slo al estado R, mientras que el inhibidor I lo hace exclusivamente al estado T. En ausencia de sustrato y activador el equilibrio entre los estados T y R est desplazado hacia el estado T, es decir la mayor parte de las molculas de la enzima se encuentran al estado T, pero al agregarse el sustrato S o el activador A, y al unirse selectivamente estos ligandos a las molculas que se encuentran en el estado R, el equilibrio se desplaza en este sentido. Como la transicin entre las formas T y R para las subunidades es concertada, es suficiente la unin de la molcula de sustrato o activador a una sola de las subunidades para que la otra quede en la forma R dejando de esa forma disponible otro sitio de ms alta afinidad para el sustrato. Cuanto ms sustrato o activador se agregue mayor ser el nmero de oligmeros en la forma R, observndose en consecuencia lo que se denomina un efecto coorperativo positivo del estrato y del activador, que se traduce en una curva de saturacin sigmoide. En el primer caso (sustrato) y de acuerdo a lo que se indic anteriormente el efecto ser homotrfico cooperativo o positivo y en el segundo caso (activador), heterotrfico cooperativo o positivo. Pero si se agrega activador en cantidad suficiente, el equilibrio quedar totalmente desplazado hacia la forma R, y todas las molculas del oligmero estarn exclusivamente en esa forma y la adicin del sustrato en ese caso, no podr producir un mayor desplazamiento del equilibrio, comportndose entonces el sistema como un sistema para el cual es vlido un

tratamiento cintico del tipo Michaelis-Menten, obtenindose entonces una curva de saturacin para el sustrato de tipo hiperblico. En contraste con lo que ocurre con el sustrato y el activador, el inhibidor se une exclusivamente a la forman T. Si debido a la presencia de sustrato en concentracin saturante, la enzima se encontraba originalmente casi exclusivamente en el estado R, el agregado de inhibidor producir un desplazamiento hacia la forma T y por ende la curva de saturacin para el sustrato se har ms sigmoide a medida que aumenta la concentracin del inhibidor. El efecto en este caso ser heterotrfico negativo (del inhibidor con respecto al sustrato). El modelo de Koshland, Nemethy y Filmer tambin denominado secuencial se basa en la explicada teora del ajuste inducido. El modelo establece que la unin de un ligando (sustrato, activador o inhibidor) a una de las subunidades de la molcula enzimtica oligomtrica, produce un cambio conformacional de dicha subunidad. Esa distorsin en una subunidad puede afectar secuencialmente la estabilidad y configuracin de las subunidades vecinas, en la misma forma que la distorsin de una parte de una cadena polipeptdica, aumentando o disminuyendo la afinidad de las mismas por el sustrato. La figura siguiente ilustra lo dicho para el caso de una enzima alostrica que posee dos subunidades, cada una de ellas capaz de unirse a una molcula de sustrato y que presenta un efecto homotrfico positivo de S sobre S.

En el modelo secuencial las interacciones entre las subunidades son posibles estando las subunidades en distintos estados conformacionales. En el modelo concertado slo seran posibles los estados AA y BB de la figura anterior y no el hbrido AB, los cuales por otra parte deben preexistir actuando el ligando como estabilizador del estado al cual se une preferencialmente. En cambio el modelo secuencial si bien no descarta la posibilidad extrema de un cambio simultneo en todas las subunidades, sostiene preferentemente la existencia de cambios secuenciales en la conformacin de las subunidades inducidas por la unin del o los ligandos, con la posibilidad de ocurrencia de estados conformacionales hbridos cuando la proteina est parcialmente saturada.

Enzimas alostricas - Las enzimas alostricas presentan estructura cuaternaria. - Tienen diferentes sitios activos, unen ms de una molcula de sustrato - La unin del sustrato es cooperativa - La curva de velocidad en funcin de la (s) presenta una forma sigmoidea - Pequeos cambios en la concentracin del modulador se asocian con grandes cambios en la actividad de la enzima

Regulacin enzimtica
Cuanto ms se avanza en el conocimiento de la bioqumica celular, especialmente por los aportes hechos en los ltimos aos por la biologa molecular, ms se afianza el concepto enunciado oportunamente por Changeux, de equiparar el funcionamiento de una clula al de una verdadera fbrica qumica automtica diseada para aprovechar lo ms eficientemente la energa disponible. En efecto, en una fbrica automtica coexisten varias lneas de produccin que trabajan simultneamente en forma concertada y que se regulan a s mismas y entre ellas por medio de controles automticos, consistentes en circuitos electrnicos especficos de retroalimentacin. Estos principios pueden aplicarse tambin a los seres vivos, As, el funcionamiento de la clula ms sencilla, implica la existencia de una verdadera maraa de procesos metablicos consistentes en secuencias de reacciones qumicas catalizadas por enzimas especficas. Cada una de estas vas metablicas sera equiparable a las mencionadas lneas de produccin de la fbrica automtica y las mquinas elementales de la fbrica celular seran las mencionadas enzimas. Existen en principio cuatro formas posibles de que la clula controle la velocidad de funcionamiento de dichas vas metablicas: 1) DISPONIBILIDAD DE SUSTRATO Como ya hemos indicado, la actividad de la enzima guarda proporcionalidad con los niveles de sustrato. Estos determinan la mayor o menor velocidad en la actividad enzimtica. Al aumentar la concentracin de sustrato, en la clula aumenta su utilizacin y viceversa. Generalmete el sustarto debe ingresar a la clula o al interior de una organela. Ejemplo: -oxidacin y sntesis de cuerpos cetnicos. 2) MODIFICACIN COVALENTE Muchas enzimas son reguladas por el agregado o sustraccin de grupos unidos covalentemente a la misma. La regulacin covalente ms frecuente se realiza por modificacin de los residuos de tirosina, serina y/o treonina de las enzimas por un proceso de unin o eliminacin de grupos fosfatos. Existen tambin enzimas cuya actividad es modulada por la insercin covalente de otros grupos., como se muestra en la siguiente tabla.

En la siguente tabla se dan ejemplos de algunas enzimas cuyas actividades estan reguladas por modificacin covalente que implica fosfo- desfosforilaciones.

3) MODULACIN ALOSTRICA. Ya se describi anteriormente. Algunos casos particulares dan origen a diferentes modos regulatorios. En algunas vas metablicas, la enzima que cataliza la primera etapa de la serie suele ser inhibida por el producto de la ltima. Cuando la concentracin de ese producto final aumenta, ello indica que su elaboracin excede las necesidades y se frena el funcionamiento de la va reduciendo la actividad de la enzima reguladora. Se habla de un proceso de retroinhibicin. Tambin puede suceder que una enzima sea estimulada por algn agente que se acumula en el medio. Cuando existe un exceso de sustrato, l mismo promueve su utilizacin activando a al enzima.

E1 E2 E3 E4 S1 A B C

+
E1 E2 E3 E4 S 1 X Y Z P

4) INDUCCIN O REPRESIN DE LA SINTSIS DE LA ENZIMA. Implica el control de la sntesis de las enzimas regulatorias involucradas en un camino metablico. Se habla entonces de induccin enzimtica o represin enzimtica segn que la velocidad de produccin de una dada enzima, o de un conjunto de enzimas metablicamente relacionadas, y por ende su concentracin celular, sea aumentada o disminuda respectivamente como respuesta a las necesidades de la clula, actuando por lo general un metabolito particular como seal desencadenante del proceso. En el caso de la induccin, ese metabolito puede ser el mismo sustrato de la enzima (metabolito inductor), y en la represin, el producto final de la va metablica de la cual la enzima reprimida forma parte (metabolito represor). Este mecanismo es mucho ms lento que los anteriores ya que inplica la sintesis o degradacin de las enzimas involucradas.