Mercedes Lerma Snchez, Amparo Farga Mart Servicio de Microbiologa.

Hospital Clnico Universitario de Valencia Los enterovirus se incluyen dentro de la familia Picornaviridae (pico: pequeo, RNA virus), que consta de cuatro gneros. Dos de stos afectan slo a los animales (Cardiovirus y Aphtovirus) y los otros son importantes patgenos humanos: Rhinovirus y Enterovirus. El virus de la hepatitis A fue originalmente clasificado como Enterovirus tipo 72, aunque actualmente ha sido separado del grupo, siendo considerado un gnero aparte denominado Hepatovirus (Tabla 1). Tabla 1. Clasificacin de los enterovirus humanos. Poliovirus: tipos 1-3 Coxsackievirus A: 23 tipos, A1-A24 (el Coxsackie 23 es conocido como Echovirus 9) Coxsackievirus B: tipos B1-B6 Echovirus (Enteric Cytopathogenic Human Orphan): 31 tipos Enterovirus tipos 68-71: previamente clasificados como Echovirus o Coxsackievirus Los enterovirus comparten gran nmero de caractersticas clnicas, epidemiolgicas y ecolgicas, as como ciertas propiedades fsicas y qumicas. Difieren entre s por el distinto comportamiento en cultivo, antigenicidad y ciclo replicativo aunque, en todos los casos, el hbitat comn y el lugar de replicacin es el tracto intestinal humano. Se conocen ms de 70 serotipos que causan infecciones, muchas veces clnicamente inaparentes, pero que, en un pequeo porcentaje de casos, dan lugar a enfermedades graves del sistema nervioso central, como la meningitis asptica, encefalomielitis, ataxia cerebelar, sndrome de Guillain-Barr, mielitis transversa y poliomielitis, entre otras. Aunque determinados enterovirus se asocian con frecuencia a brotes epidmicos, dando lugar a un sndrome especfico, los mismos serotipos pueden, en otras ocasiones, ser responsables de infecciones espordicas, con distintas manifestaciones clnicas, incluso asintomticas. Por otro lado, diferentes virus pueden producir el mismo sndrome. Por estas razones, en general, las manifestaciones clnicas no son una base satisfactoria para el diagnstico. La poliomielitis es una infeccin aguda que afecta de forma grave al SNC, con destruccin de las neuronas motoras de la mdula espinal, dando lugar a una parlisis flccida. Los virus Coxsackie tipo A producen una variedad de enfermedades que incluyen la meningitis asptica, herpangina, mialgia epidmica (pleurodinia o enfermedad de Bornholm), sndrome mano-pie-boca, miocarditis, pericarditis, neumona, exantema cutneo y resfriado comn. Se han relacionado tambin con malformaciones congnitas y algunas formas de diabetes. Existen evidencias de que las infecciones por virus Coxsackie del grupo B juegan un papel importante en la etiologa de la diabetes mellitus dependiente de insulina (DM-1). Algunos estudios post-mortem de pacientes con cetoacidosis diabtica han relacionado a determinados virus de este grupo con esa patologa, particularmente el virus Coxsackie B4. Aunque parece posible su implicacin en desarrollo de la DM-1, queda por determinar si inician los procesos que dan lugar a la diabetes o bien precipitan la enfermedad en aquellos pacientes con la funcin endocrina ya daada. Tambin se ha relacionado a los virus Coxsackie B4, B5 y del grupo A con la pancreatitis en los adultos. Por ltimo, existe una vasta miscelnea de cuadros clnicos en los que se ha implicado a los enterovirus. El sndrome de fatiga crnica, caracterizado por una debilidad del msculo esqueltico, acompaada de mialgias, cefaleas, dificultad de concentracin, parestesias, etc., se ha asociado con mltiples agentes etiolgicos vricos, siendo los enterovirus uno de ellos. La meningitis asptica, ciertas

enfermedades febriles con o sin exantema cutneo y el resfriado comn tambin se relacionan con los Echovirus. El enterovirus tipo 68 causa infeccin de vas respiratorias bajas; el enterovirus tipo 70 es el agente de epidemias de conjuntivitis hemorrgica aguda y el enterovirus tipo 71 causa meningitis asptica, encefalitis y sndrome mano-pie-boca (Tabla 2). Tabla 2. Manifestaciones clnicas asociadas con los distintos tipos de enterovirus. Grupo Manifestacin clnica Poliovirus Poliomielitis paraltica Meningitis asptica Sndrome febril Virus Coxsackie A Meningitis asptica Herpangina Sndrome febril Conjuntivitis Sndrome pie-mano-boca Virus Coxsackie B Meningitis asptica Sndrome neonatal grave Miopericarditis Encefalitis Pleurodinia Sndrome febril Echovirus Meningitis asptica Conjuntivitis Exantema cutneo Sndrome neonatal grave Sndrome febril Enterovirus 68-71 Meningitis asptica Sndrome de pseudo-polio Sndrome pie-mano-boca Conjuntivitis epidmica

MORFOLOGA Y ESTRUCTURA ANTIGNICA. PROPIEDADES FSICAS

Los enterovirus presentan una cpside de simetra icosadrica, sin envoltura; tienen un tamao pequeo (20-30 nm), poseen RNA de cadena nica y polaridad positiva, por lo que se replican utilizando el propio RNA como mensajero. Su genoma se divide en 4 regiones que codifican protenas estructurales y 2 regiones no codificadoras, reguladoras. Sus cuatro protenas estructurales: VP1, VP2, VP3 y VP4 se sintetizan como una poliprotena en la que el extremo 5 est unido covalentemente a una pequea protena VPg. Dentro de cada grupo, existe un nmero de serotipos definidos por los eptopos de la cpside que se deben a modificaciones estructurales de la superficie del virin. Los eptopos antignicos, que definen a cada serotipo, estimulan la formacin de anticuerpos especficos que se comportan como neutralizantes de la infeccin, ya que no permiten su unin al receptor celular. La evolucin de los serotipos sigue un proceso de deriva antignica, en el que durante el proceso de copia del genoma se producen errores que introducen mutaciones puntuales. Estas mutaciones son acumulativas y modifican progresivamente la estructura de la cpside. El ciclo replicativo de los enterovirus es ltico y su receptor celular es una molcula perteneciente a la superfamilia de las inmunoglobulinas que se presenta en distintos rganos diana, como el corazn (Coxsackievirus), el sistema nervioso central (Poliovirus), el hgado o el intestino. Son resistentes a todos los antivricos y quimioterpicos conocidos, y a la inactivacin por solventes de lpidos. Presentan una tendencia natural a la agregacin espontnea que los defiende del efecto de los agentes externos.

Se inactivan rpidamente a ms de 50C, por la luz ultravioleta y en condiciones de desecacin. Son estables a pH cido, caracterstica que los diferencia de los Rhinovirus.

EPIDEMIOLOGA
El hombre es el nico reservorio conocido y la transmisin es, fundamentalmente, por va fecal-oral y respiratoria. Se dan casos de transmisin por fmites o moscas, aunque la ms frecuente es la va directa, de persona a persona, existiendo gran nmero de portadores sanos. Los virus se eliminan por las heces y se pueden detectar en aguas residuales. Pueden presentarse en forma endmica o en brotes epidmicos, siendo ms frecuente en verano y otoo, en niveles socioeconmicos bajos y en lactantes y nios (ms frecuente en varones). La poliomielitis grave ocurra en los pases industrializados antes de la introduccin de los programas de vacunacin. El objetivo 5 de la estrategia de "Salud para todos en el ao 2000" de la OMS plantea la erradicacin mundial de la poliomielitis, para lo que dicho organismo ha elaborado un "Plan de actuaciones para la consecucin del Certificado de Erradicacin de la Poliomielitis", en el que Espaa participa dentro del grupo europeo. Las actuaciones que dicho grupo considera necesarias para la consecucin de dicho certificado son: a) implantar un sistema de vigilancia eficaz de la parlisis flcida aguda, b) alcanzar y mantener altas coberturas de vacunacin, c) organizar un sistema de vigilancia ambiental, d) realizar un estudio seroepidemiolgico que valore el estado inmunitario de la poblacin frente al virus de la poliomielitis. Estas cuatro actuaciones se estn llevando a cabo en Espaa desde 1997.

PATOGENIA
El virus penetra en el organismo por va oral o nasofarngea, con un periodo de incubacin que oscila entre 2 y 30-40 das. Se multiplica localmente en el tejido linfoide de la faringe y las placas de Peyer y despus se disemina por va sangunea a otros tejidos diana, como la piel, miocardio, meninges, pncreas, etc., en donde se replica. Los sntomas pueden ser el resultado directo de la destruccin de clulas diana en los tejidos (como ocurre en la poliomielitis), o puede deberse a la respuesta inmune frente al virus (como ocurre en el modelo murino de miocarditis por virus Coxackie tipo B). La mayora de las infecciones son abortivas, debido a la existencia de anticuerpos neutralizantes. Los anticuerpos IgG, IgM e IgA aparecen con bastante rapidez en el curso de la infeccin. La inmunidad es, predominantemente, humoral, especfica de serotipo y duradera (los anticuerpos persisten durante toda la vida). Las personas con un dficit de la inmunidad humoral tienen un mayor riesgo de desarrollar la enfermedad paraltica cuando se utiliza para su vacunacin la vacuna de antipolio oral con virus atenuados (Sabin, OPV), siendo recomendable en esta situacin el empleo de la vacuna parenteral de virus inactivados (Salk, IPV).

DIAGNSTICO DE LABORATORIO
Aislamiento vrico e identificacin La tcnica de referencia para el diagnstico especfico de las infecciones por enterovirus es el cultivo en lneas celulares susceptibles. Ante una sospecha de infeccin enteroviral se deben remitir muestras de heces (o torunda rectal), o bien un exudado farngeo. En el caso de la meningitis asptica debe remitirse LCR, aunque en la fase aguda de la infeccin se puede detectar el virus tambin en plasma. Asimismo, se puede aislar de fluidos vesiculares, orina, exudado conjuntival y secreciones nasales. Se recomienda el envo

conjunto de muestras de LCR, exudado farngeo y heces, ya que aumenta el porcentaje de aislamiento. La excrecin es con frecuencia intermitente; por tanto, debe recogerse ms de una muestra en un intervalo de 24-48 h. Dicha excrecin comienza a los pocos das de la infeccin y puede mantenerse semanas o incluso meses, excepto en el caso de los Echovirus, donde rara vez excede de un mes. El aislamiento a partir del exudado farngeo es posible durante la fase aguda de la infeccin, especialmente en los casos con sntomas respiratorios. El periodo con el ndice de aislamientos ms alto se establece en los cinco das previos a la aparicin de los sntomas, y contina hasta cinco das despus. Las muestras se transportan refrigeradas a 4C y es recomendable que sean almacenadas a temperaturas inferiores a 20 C si no se procede a la inoculacin inmediata de los cultivos. Se puede realizar un diagnstico presuntivo de infeccin enteroviral sobre la base del cuadro clnico, poca del ao, lnea celular que permite el aislamiento vrico y efecto citoptico asociado. Esta identificacin preliminar, sin esperar el tipo especfico de virus, tiene utilidad en estudios de salud comunitaria, para no administrar tratamiento antibitico innecesario y para racionalizar las pruebas diagnsticas a utilizar con posterioridad. El aislamiento de un enterovirus nicamente a partir de heces, no indica necesariamente que sea el agente etiolgico de la infeccin, pues estos virus pueden excretarse asintomticamente durante bastante tiempo; asimismo, en el caso de los poliovirus, puede tratarse de un virus vacunal si el paciente ha sido vacunado hace poco o ha tenido contacto con alguna persona vacunada. De ah que sea importante la identificacin de los serotipos. La mayora de los serotipos ms habituales de enterovirus citopticos crecen bien en clulas de rin de mono, aunque este tipo celular no se usa actualmente en los laboratorios de diagnstico virolgico debido a la dificultad de obtencin. Por esta razn, si se quiere recuperar el mximo de tipos posibles, se deben inocular las muestras clnicas en distintas lneas celulares, y as aumentar la frecuencia y rapidez de recuperacin de enterovirus en las muestras clnicas. Para detectar los virus Coxsackie A es necesaria la inoculacin en ratones recin nacidos, ya que en las lneas celulares se multiplican mal, o no lo hacen. Los cultivos celulares ms sensibles son las lneas WI-38 (pulmn embrionario humano), HEK (rin embrionario humano) y RD (rabdomiosarcoma humano). Tras la incubacin a 37 C, la presencia del virus se manifiesta por la aparicin de un efecto citoptico tpico y rpido (24-48 h), caracterizado por la picnosis nuclear, redondeamiento citoplasmtico, aparicin de clulas refractarias, degeneracin celular y despegamiento del frasco de cultivo. No deben considerarse nicamente estas caractersticas citopticas como la base para la identificacin, ya que puede confundirse con efectos txicos sobre el cultivo, e incluso es semejante al producido por la toxina de Clostridium difficile. Algunas veces, el efecto citoptico no es claramente visible en ciertos tipos celulares como las clulas Vero o los fibroblastos humanos, pero la realizacin de una tincin inmunofluorescente con anticuerpos monoclonales especficos permite su identificacin, de ah que sea recomendable hacerlo antes de descartar un cultivo como negativo. La centrifugacin aumenta la posibilidad de recuperacin vrica, as como la rapidez de aparicin del efecto citoptico. La identificacin del serotipo no tiene una utilidad clnica inmediata; la mayora de las veces, lo importante es determinar con rapidez si se trata de un enterovirus o no, aunque s tiene un claro inters epidemiolgico. Para la mayora de los enterovirus, la identificacin

especfica se realiza mediante la neutralizacin, aunque tambin se utilizan otros tipos de tcnicas como la hemaglutinacin indirecta (HIA) y la fijacin del complemento (FC). La inmunofluorescencia (IF) es actualmente la forma ms sencilla y rpida de tipificacin de los enterovirus. La prueba de neutralizacin se basa en contrarrestar el efecto citoptico sobre el cultivo mediante la utilizacin de un antisuero especfico que impide la unin del virus a su receptor celular. La tcnica se ha simplificado bastante con el desarrollo de mezclas estandarizadas de antisueros especficos de tipo [como la propuesta por Lim y Benyesh-Melnick (LBM)], de manera que un antisuero concreto aparece en 1, 2 3 mezclas. De esta forma, el enterovirus puede ser identificado por su patrn de neutralizacin, por la mezcla o mezclas que contienen su antisuero homotpico. Las primeras mezclas disponibles fueron A-H, que identificaron 42 enterovirus y la mezcla J-P que identificaba 19 Coxsackievirus. Uno de los inconvenientes de esta tcnica es que ciertas cepas presentan agregacin de partculas vricas u otros factores que reducen el contacto del virus con el anticuerpo. La fraccin no neutralizable puede ser debida a partculas vricas recubiertas entera o parcialmente de material proveniente de la membrana celular, que incrementa la tendencia a agregarse del virus y lo hace menos accesible a la neutralizacin. sta puede mejorarse con tratamientos fsicos y qumicos de la muestra. La filtracin a travs de una membrana de porosidad apropiada consigue eliminar la fraccin no neutralizable, pero la recuperacin no siempre es ptima. Los tratamientos qumicos con desoxicolato sdico, ter o cloroformo tambin mejoran el contacto virusanticuerpo, por disgregacin de las partculas virales, siendo de eleccin el tratamiento con cloroformo para las suspensiones vricas de bajo ttulo. La mayora de los problemas de neutralizacin con clulas en medio lquido se resuelven con las tcnicas de microneutralizacin, que se realizan en placa, y que permiten detectar anticuerpos incluso en presencia de fraccin no neutralizable, ya que es ms sensible que la prueba de neutralizacin en tubos. Sin embargo, la laboriosidad de la tcnica de neutralizacin y la aparicin de otros mtodos ms sencillos (como la IF) ha hecho que se utilice cada vez menos en los laboratorios de diagnstico virolgico. Tambin se utilizan para identificar serotipos la HIA y la FC, aunque slo un tercio de los diferentes enterovirus son capaces de aglutinar los hemates, y no todos pueden ser identificados por FC, por lo que han cado en desuso. Las tcnicas inmunofluorescentes que detectan antgenos vricos son las ms utilizadas por su rapidez y sencillez. Actualmente, existen disponibles antisueros contra el antgeno comn de los enterovirus, que sirven de cribado inicial. Si es positivo, se realiza una segunda tcnica de IF con antisueros comunes de los virus Coxsackie A y B, Echovirus y Enterovirus 68-71. Por ltimo existen tambin antisueros especficos de tipo que permiten fcilmente su reconocimiento individualizado. Deteccin de anticuerpos especficos Las tcnicas serolgicas deben considerarse como un arma diagnstica adicional. La deteccin de anticuerpos especficos de tipo slo deberan realizarse: a) si se dispone del aislamiento de un enterovirus y es necesaria la confirmacin del serotipo infectante, b) cuando en un cuadro clnico puedan estar implicados varios enterovirus de un mismo grupo (v. g., pleurodinia por Coxsackievirus del grupo B), c) ante un brote epidmico causado por un serotipo determinado, y d) en estudios seroepidemiolgicos. Seroneutralizacin. La tcnica recomendada, y considerada de referencia, es la seroneutralizacin. Se necesitan muestras pareadas,

la primera tomada tan precozmente como sea posible durante en el curso de la infeccin, y la segunda 3-4 semanas despus. Los sueros de la fase aguda y convaleciente se estudiarn simultneamente, utilizando varias diluciones del suero frente a una cantidad constante de virus. El ttulo se calcula sobre la base de la dilucin de suero que es capaz de neutralizar una cantidad dada de virus. Se consideran significativos de una infeccin reciente aquellos incrementos de al menos cuatro veces respecto del ttulo basal. Los ttulos de anticuerpos neutralizantes pueden ya ser elevados en el comienzo de la fase sintomtica, haciendo difcil la interpretacin de resultados en una muestra nica. Si el ttulo es igual en las dos muestras apareadas, no es posible discernir si la infeccin se ha producido recientemente o mucho tiempo antes, ya que los anticuerpos neutralizantes persisten durante aos, cuando no de por vida. Fijacin del complemento (FC). Inicialmente se realiza la FC con un antgeno comn de enterovirus; si el resultado es positivo, se debe repetir la tcnica utilizando antgeno de los distintos grupos. Los anticuerpos FC aparecen durante el curso de la infeccin, pero pueden desaparecer o caer a niveles bajos en pocos meses; si se obtienen las muestras en momentos apropiados, es posible aumentar la utilidad diagnstica de la FC. Pueden aparecer reacciones cruzadas entre los distintos enterovirus, que hacen a sta tcnica poco especfica de serotipo. Hemaglutinacin. Relativamente fcil de realizar, los pacientes que son infectados con un enterovirus hemaglutinante desarrollan anticuerpos homotpicos que pueden persistir aos, aunque tambin pueden producirse anticuerpos heterotpicos que hacen que la prueba pierda especificidad. Inmunofluorescencia indirecta. Es posible detectar y titular anticuerpos usando una tcnica de inmunofluorescencia. Se trata de mtodos sencillos que estn teniendo cada vez un uso mayor en los laboratorios diagnsticos, ya que permite la deteccin separada de los anticuerpos IgG e IgM. Si slo se dispone de una muestra, la deteccin de anticuerpos especficos de la clase IgM puede ser til para identificar infecciones recientes. Hemaglutinacin pasiva. Es un mtodo que permite detectar elevaciones en el ttulo de anticuerpos frente a los enterovirus. Existe reactividad cruzada y los serotipos no pueden distinguirse, aunque la prueba puede servir de cribado para diagnosticar una infeccin por enterovirus. Enzimoinmunoanlisis (ELISA). Permite medir la respuesta srica de los distintos tipos de inmnoglobulinas IgM, IgA e IgG; sin embargo no, est establecido su uso en el diagnstico de las infecciones enterovirales. Se ha empleado para detectar IgG especficas, que aparecen generalmente siete das despus del establecimiento de los sntomas. Ms recientemente se han desarrollado tcnicas de captura que permiten detectar IgM especfica de los virus Coxsackie grupo A y B y algunos Echovirus. Aunque existe reactividad cruzada, suele reflejar una infeccin enteroviral reciente. Deteccin de genoma (PCR) Es conocido que el ndice de recuperacin de enterovirus por cultivo a partir de LCR es bajo, debido a la escasa concentracin de viriones en la muestra y a la dificultad de crecimiento de algunos serotipos en los cultivos celulares. La deteccin de genoma mediante PCR, aporta rapidez, aumento de sensibilidad y posibilidad de deteccin de todos los enterovirus, por lo que, aunque est actualmente en evaluacin, resulta muy recomendable en los laboratorios de Virologa. As, Androletti et al. (1998), detectan un 22% de muestras

de LCR positivas, frente a un 2,3% por cultivo. Recomiendan realizar la PCR en LCR y suero para aumentar la sensibilidad diagnstica. Gorgievski-Hriosho et al. (1998) obtuvieron una diferencia significativa entre el porcentaje de diagnstico etiolgico por PCR (85%) frente a un 24% por cultivo en muestras de LCR procedentes de pacientes con meningitis asptica. Estos autores, adems, cultivaron muestras de heces y de exudado farngeo, asemejndose ms el porcentaje diagnstico al obtenido por la PCR (71% vs 85%). Existen varios mtodos comercializados, aunque el ms evaluado y con buena rentabilidad diagnstica (Roche Amplicor) ha sido momentneamente retirado del mercado. Recomendamos que, debido a las posibilidades diagnsticas que ofrecen estos mtodos, sean utilizados en todos aqullos laboratorios con experiencia en tcnicas de biologa molecular.

BIBIOGRAFA
Androletti L, Blasel-Damman N, Dewilde A, Valle L, Cremer R, Wattr P. Comparison of use of cerebrospinal fluid, serum and throat swab specimens in diagnosis of enteroviral acute neurological infection by a rapid RNA detection PCR assay. J Clin Microbiol 1998; 36:589-591. Gorgievski-Hrisoho M, Schumacher Jd, Vilimonovic N, Germann D, Matter L. Detection by PCR of enterovirus in cerebrospianl fluid during a summer outbreak of aseptic meningitis in Switzerland. J Clin Microbiol 1998; 36(9): 2408-2412. Melnick JL. Poliovirus and other enteroviruses. En: Evans AS, Kaslow RA (eds). Viral infections of humans. Epidemiology and control (4ed). Plenum Medical Book Company. New York, 1997, pp. 583-663. Minor PD, Morgan-Capner P, Schild GC. Enteroviruses. En: Zuckerman AJ, Banatvala JE, Pattison JR (eds). Principles and practice of clinical virology (3 ed). John Wiley and Sons. London, 1994. 3 ed.. pp. 417-466. Schunrr D. Enteroviruses. En: Lennette ET (ed). Laboratory diagnosis of viral infections (2 ed). Marcel Dekker. New York, 1992, pp. 351-364.