MICROSCOPIA MARCO TERICO

MICROSCOPIO.- es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeos para ser vistos a simple vista. El tipo ms comn y el primero que se invent es el microscopio ptico. La ciencia que investiga los objetos pequeos utilizando este instrumento se llama microscopa. El microscopio es un instrumento ptico que amplifica la imagen de un objeto pequeo, siendo el instrumento ms utilizado en los laboratorios donde se estudian microorganismos. TIPOS DE MICROSCOPIOS MICROSCOPA PTICA Microscopio Simple Lupas monoculares Lupas binoculares Microscopio Compuesto Esteromicroscopios De luz ultravioleta De fluorescencia De contraste de fases De campo oscuro De polarizacin MICROSCOPA ELECTRNICA De barrido (MEB) De transmisin (MET)

MICROSCOPIA PTICA: En estos tipos de microscopios, el rea observada est ampliamente iluminada y los objetos que se estudian aparecen ms oscuros que el fondo. Normalmente alcanzan hasta unos 1000 aumentos, aunque con oculares poderosos esta cifra puede llegar a incrementarse en dos veces. El limite til de este aumento es de 2000 y la razn de este lmite de amplificacin se debe al poder de resolucin. Dentro de la microscopa ptica podemos distinguir, segn el nmero y posicin de las lentes, el microscopio simple y el compuesto.

a. Microscopio Simple.- Est provisto de una lente o sistema de lentes convergente dispuestas de manera que proporcionan una imagen virtual, derecha y mayor que el objeto, que a su vez est situado entre la lente y el foco. La ampliacin del microscopio simple es bastante limitada y suele utilizarse para la diseccin de pequeos animales o para la disociacin de piezas histolgicas. Este tipo de microscopio se denomina tambin lupas y puede ser monocular o binocular. b. Microscopio Compuesto.- A diferencia del simple, en este tipo de microscopios se combinan dos lentes o sistemas de lentes convergentes de amplificacin de imagen, colocados en los extremos del tubo: el denominado objetivo, situado ms cerca del objeto a observar; y el ocular, ms cercano al ojo del observador. Estereomicroscopios: Son microscopios dobles, errneamente denominados lupas binoculares, con dos objetivos y dos oculares que poseen un doble prisma, el cual permite enderezar las imgenes y conservar el relieve. La iluminacin del objeto en estos microscopios se hace por transparencia o por incidencia, siendo esta ltima ms frecuente. Estn dotados de accesorios de investigacin tales como: equipo microfotogrfico, doble dispositivo de observacin para poder trabajar dos observadores simultneamente, cmaras claras y microdisectores. De luz ultravioleta: La longitud de onda ms corta corresponde al espectro ultravioleta (180-400 nm). Por este motivo y teniendo en cuenta que el poder de resolucin del microscopio esta en razn inversa a la longitud de onda utilizada, ste ser mayor en una preparacin con radiacin ultravioleta que con radiacin visible. Esta tcnica posee la ventaja de que muchas sustancias estudiadas en Biologa tienen bandas de absorcin ultravioleta, con lo que su observacin microscpica no requerir el uso de una tincin. Hay que sealar que la imagen ultravioleta solo es visible a travs de fotografas, fluorescencia o fotoemisin. De fluorescencia: Es una variacin del microscopio de luz ultravioleta en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la radiacin electromagntica emitida por las molculas que han absorbido la excitacin primaria y re-emitido una luz con mayor longitud de onda. Se usa para detectar sustancias con auto fluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos. De contraste de fases: Esta tcnica se utiliza para estudiar aquellas preparaciones de densidad homognea y transparente como son las de bacterias, clulas, etc., en las que la baja capacidad de absorcin hace que la

imagen obtenida no presente diferencia de luminosidad entre sus elementos permaneciendo prcticamente invisible los detalles. Se utilizan especialmente en examen de preparaciones hmedas y de gota pendiente. De campo oscuro: Este tipo de microscopios producen un efecto consistente en un fondo oscuro sobre el que se ven los objetos intensamente iluminados. El poder ver un objeto depende del contraste existente entre l y el medio que le rodea. El condensador comn es sustituido por uno de campo oscuro a travs del cual pasa solamente un cilindro hueco de luz. Hay objetos y estructuras de clulas que resultan invisibles, pero que se hacen visibles cuando se recurre a esta tcnica de iluminacin. El objeto aparece como una mancha brillante sobre un fondo oscuro. Se utilizan especialmente para observar microorganismos sin teir suspendidos en lquidos (preparaciones hmedas y de gota pendiente). De polarizacin: Son microscopios de luz polarizada que se construyen a partir de un microscopio ordinario, colocando un polarizador entre la fuente de luz y el condensador, y un analizador entre el objetivo y el ocular. Se utilizan estos microscopios en Petrografa y Mineraloga. MICROSCOPIA ELECTRNICA: El microscopio electrnico ha revolucionado el conocimiento de ciencias como la Biologa o la Medicina. Tiene la ventaja de alcanzar una extraordinaria amplificacin. Puede dar un poder de resolucin hasta mil veces mayor que el ptico, debido a que emplea un haz de electrones en lugar de un haz de fotones. De barrido (MEB): En el microscopio electrnico de barrido (MEB) o microscopa de exploracin electrnica (SEM), los electrones inciden desde arriba sobre la preparacin, por ello la muestra puede ser de cualquier grosor o tamao. Este microscopio se basa en el principio de la amplificacin electrnica de seales que se generan al irradiar la superficie de las muestras con un haz muy estrecho de electrones. De transmisin: En este tipo de microscopia electrnica, el haz de electrones atraviesa al material que se desea observar. El modo de operar de este tipo de microscopio es similar al del microscopio ptico, ya que est basado en el hecho de que la manera de actuar de un campo electromagntico sobre un haz de electrones es anloga a la accin de la lente de cristal sobre el haz de fotones. La imagen, sin embargo, se forma sobre una pantalla fluorescente como lo hara en una pantalla de televisor.

DESCRIPCIN DE UN MICROSCOPIO Parte mecnica:

Pie o Base: Generalmente en forma de herradura o rectangular, es el apoyo de las dems piezas del microscopio. El pie debe ser slido y pesado para asegurar su estabilidad. Columna o Brazo: Este elemento relaciona el tubo del microscopio con el pie; sostiene la platina y el condensador y de ella se agarrar el microscopio cuando se traslada durante los trabajos. En algunos microscopios la columna es mvil. Tubo del Ocular: Est colocado en la parte superior del microscopio, donde estn acoplados los oculares, que pueden tener movimiento vertical, con ayuda de una cremallera sobre la columna. En algunos microscopios el tubo del ocular es inclinado y se mantiene fijo, en este caso se mueve la platina. Revlver o Disco Giratorio: Est debajo del tubo ocular donde estn acoplados los objetivos, presenta movimiento giratorio para facilitar el cambio de un objetivo a otro. Platina: Es una placa que puede ser cuadrada, circular o rectangular, con un orificio central que permite el paso de la luz a travs de ella. Su funcin es sostener las placas con los preparados biolgicos que se van observar Carro: es un dispositivo ubicado sobre la platina, cuya funcin es sujetar y mover la placa que se va a estudiar. Posee dos tornillos que permiten movimientos horizontales (hacia adelante, hacia atrs, hacia la derecha y hacia la izquierda) del portaobjeto. Cuando la platina carece del anterior dispositivo, lleva dos soportes para fijar las placas llamadas ganchos o uas.

Mecanismos de movimiento:

Tornillo Macromtrico: Acerca o aleja rpidamente el objetivo del preparado a observar; su funcin es lograr un enfoque ms o menos claro o aproximado del objeto. Tornillo Micromtrico: Acerca o aleja el objetivo del preparado, pero lentamente, casi imperceptiblemente, permite desplazamientos muy finos de la platina o del tubo del ocular. Durante la observacin y enfoque este tornillo debe estarse moviendo permanentemente; su funcin es darle nitidez al enfoque. Parte ptica: Est integrada por los objetivos, oculares y el aparato de iluminacin (espejo, diafragma, condensador y filtros). Estos elementos son los que permiten la iluminacin, ampliacin y la visin aumentada del objetivo.

Objetivo: Es la pieza ms importante del microscopio. Ellos se acoplan mediante roscas estndar al revlver y pueden ser cambiados de posicin con slo rotarlos. Reciben el nombre de objetivos porque son los lentes que estn ms cerca del objeto. La mayora de los microscopios tienen tres o cuatro objetivos. Las lentes de los objetivos son de aumentos diversos, los ms usados son: Objetivos de pequeos aumentos 3.5x; 4x, 5x, 6x, 8x y 10x; objetivos de grandes aumentos 40x, 45x, 50x y objetivos de inmersin 90x, 95x y 100x. Ocular: Estn colocados en la parte superior del tubo ocular. Est formado por dos sistemas de lentes dispuestos de un cilindro. Su finalidad es aumentar la imagen dada por el objetivo y eventualmente corregir algunos defectos de la misma. Reciben dicho nombre porque son las lentes que se encuentran ms cerca del ojo. Hay oculares de 3.5x; 5x; 6,3x; 10x; 12.5x; 15x; 20x y 25x. Aparato de iluminacin: Est conformado por la fuente de luz, el diafragma, el condensador y los filtros. Fuente de luz: Puede ser natural o artificial, cuando es natural (solar) o procede de un foco luminoso situado fuera del microscopio, un espejo recoge la luz del medio y la refleja a travs del objeto y del sistema de lentes. La luz artificial la constituye generalmente un bombillo ubicado en el microscopio y conectado a un circuito elctrico de bajo voltaje. Diafragma: Est ubicado entre la fuente de luz y el condensador, inmediatamente debajo de la platina, su funcin es regular la intensidad de luz que atraviesa el objeto. El diafragma tiene una palanquita que al moverla hacia delante o hacia atrs agranda o achica el orificio central, dejando pasar mayor o menor cantidad de luz respectivamente. Condensador: Es un elemento cnico que posee un sistema de dos lentes convergentes que recogen o concretan los rayos luminosos para enviarlos al objetivo por el agujero de la platina. Filtros: Entre la fuente de luz y el condensador de algunos microscopios existe un portafiltros en el cual se puede colocar filtros a voluntad del observador. Los filtros son elementos de cuarzo o de vidrio, pueden ser de color azul, amarillo o verde.

COLORACIONES BACTERIANAS

MARCO TERICO
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste entre la clula y el medio que la rodea es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse tambin para localizar estructuras especficas en la clula o para distinguir entre tipos diferentes de clulas. Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso llamado fijacin. Para las bacterias la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehdo, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido secadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce generalmente el encogimiento de las clulas, la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles. Los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn. Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente. Un mordiente habitual es el cido tnico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de modo que ahora s podr atacar el colorante. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopia son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de

bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie. COLORACIONES En general, las bacterias y otros microorganismos al ser transparentes o hialinos, dificultan su estudio y observacin al microscopio ptico, por ello la aplicacin de colorantes es necesaria para visualizar formas y estructuras. De acuerdo a lo que se pretende resaltar, existen tres tipos de tinciones: Coloraciones simples. Son aquellas en que se utiliza un solo colorante. Las bacterias se tien en forma homognea, por lo cual, slo es factible observar forma y agrupacin celular. Coloraciones diferenciales. Se basan en la aplicacin de dos colorantes en etapas sucesivas, entre las que se aplican mordientes y compuestos qumicos decolorantes; de esta forma las bacterias de diferente afinidad con el tinte, se observan teidas de distinto color. Tinciones especiales. Permiten poner de manifiesto alguna estructura especial de la clula bacteriana, como el material nuclear, membrana citoplasmtica, flagelos, cpsulas, esporas, etc.

COLORACIN TINCIN DIFERENCIAL GRAM Elaborada por Hans Christian Gram en 1884, es la ms empleada en bacteriologa. Tincin diferencial; ya que organismos difieren fsica y qumicamente entre s por lo tanto reaccionan de manera distinta frente a un determinado tipo de tincin Diferencian a las bacterias en dos grupos : La pared celular es responsable de lo que le sucede al colorante empleado en esta tincin. Tanto las Gram positivas como las Gram negativas captan la misma cantidad de yodo y cristal violeta formando un complejo. Este sin embargo, es atrapado dentro de la clula Gram positiva por la deshidratacin y la reduccin del tamao de los poros de la pared, resultado del proceso de lavado con el solvente (alcohol-acetona). En las Gram negativas en cambio, la fina capa de peptidoglicano no impide la extraccin del complejo por el solvente. PROCEDIMIENTO 1. Extensin.- Para la obtencin de la muestra, con un hisopo estril se coge un poco de muestra de la parte interna de la cavidad bucal. Luego esta se extiende sobre una lamina.

2. Fijacin.- consiste en el secado de lmina, puede ser al aire libre o sometiendo al calor con la finalidad que la muestra conserve los microorganismos para la coloracin.

3. Coloracin.- se cubre toda la extensin con Cristal Violeta, por 60 segundos y luego lavar.

4. Mordiente.- se cubre de nuevo la muestra con Lugol, la finalidad de todo mordiente intensificar el color, se deja por 30 segundo y luego se lava.

5. Decoloracin.- las bacterias GRam se decoloran al agregar el Alcohol Cetona, pero las bacteria Gram +, se mantiene el alcohol por 30 segundos luego se lava.

6. Coloracin contraste.- se cubre la muestra con safranina con la finalidad de que las muestras decoloradas tomen una coloracin rosada se mantiene el colorante por 60 segundos y luego se lava.

7. Secado & observacin microscpica.- luego del enjuagado se deja secar, luego para la observacin microscpica se utiliza el aceite de inmersin y el objetivo 100X para su observacin.

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMTICA Escuela Profesional de Biologa MICROBIOLOGA I PRACTICA 3 Microscopia PRACTICA 4 Coloraciones Bacterianas ALUMNA: HUARCA BALBN, Lilian PROFESORA: YUPANQUI, Gisela LABORATORIO DE PRCTICA: Laboratorio B 2013

INTRODUCCIN