Proyecto

final escrito Procesos Biotecnolgicos Dra. Alejandra Lorena San Martn Azcar Integrantes: Martn Guevara Lpez 469381 Uriel Durn Arias 1202092 Daniel Eduardo Muoz Mayorga 988085 Fecha de entrega: 25 de abril de 2013 Introduccin

Los pigmentos naturales estn presentes en toda la materia viva, que la proveen de colores atractivos que los animales y humanos podemos percibir. Ya que el color es parte fundamental de lo que nos rodea, es posible que algo sea rechazado en base a sus caractersticas de color (Delgado-Vargas, 2000). Por definicin, un pigmento natural es todo aquel que es sintetizado, acumulado y excretado en clulas vivas. Sin embargo, esta definicin puede dejar fuera pigmentos formados durante la muerte de la clula, como los compuestos fenlicos oxidados o el pigmento ndigo que no adquiere su caracterstico color azul hasta que es extrado. Por esto, nuestra definicin se expande a que un pigmento natural es aquel es formado es clulas vivas o muertas de plantas, animales, hongos o microorganismos incluyendo compuestos orgnicos extrados de clulas u organismos transformados genticamente y modificados para alterar su estabilidad, solubilidad e intensidad de color (Hendry, 1996). Los pigmentos naturales ms comnmente encontrados en plantas son: carotenoides, antocianinas y betalanas (Delgado-Vargas, 2000). La astaxantina, es uno de estos pigmentos naturales. Este pigmento pertenece a la familia de las xantofilas, derivados oxigenados de los carotenoides, y que en las plantas se derivan del licopeno (Higuera-Ciapara, 2006).

Figura 1. Estructura de la astaxantina (Gajardo-Solari, 2011). Esta xantofila de color rojo, es conocida por el nombre qumico de 3,3'dihidroxicaroteno-4,4'diona con la estructura que vemos arriba. El nombre astaxantina fue adoptado del crustceo Astacus astacus. La astaxantina es uno de los pigmentos ms importantes incluidos en la alimentacin de salmones y crustceos, adems de ser importante para las industrias nutracutica, farmacutica y de alimentos. Su importancia en la

industria acucola se debe ms que otra cosa a que permite el adecuado crecimiento del animal y le da el color rosado caracterstico, como en el caso de los salmones. Por otro lado, la astaxantina tambin ha probado tener propiedades antioxidantes, siendo 550 veces ms potente que la vitamina E y 11 veces ms que el -caroteno, tener efectos benfico sobre la piel y contra enfermedades cardiovasculares (Higuera-Ciapara, 2006) (Gajardo-Solari, 2011). Actualmente, la astaxantina es producida a gran escala de manera sinttica, aunque ciertos organismos pueden producirla a niveles aceptables para la industria. La astaxantina natural puede ser producida en la microalga Haematococcus pluvialis, la levadura Phaffia rhodozyma y crustceos (slo en sus productos de desecho). Sin embargo, la investigacin se ha centrado en la microalga Haematococcus pluvialis evaluando sus condiciones de crecimiento y produccin de astaxantina para llegar a un proceso ptimo y muchos de las astaxantina naturales en el mercado dicen provenir de la produccin con este microorganismo. La produccin de biomasa seca en un polvo fino de color rojo puede contener alrededor de 1.5% a 2% de astaxantina (Higuera-Ciapara, 2006). La produccin de astaxantina por Haematococcus pluvialis se ha visto grandemente beneficiada por el desarrollo de tecnologas en fotobiorreactores, debido a la naturaleza fottrofa de la microalga y su obvia necesidad de luz para desarrollarse. Los fotobiorreactores ofrecen un ambiente de cultivo aislado, controlado y pueden usar la luz disponible del sol. A la fecha se han desarrollado muchos diseos para un fotobiorreactor siendo los tubulares los que cuentan con mayor popularidad. Finalmente, estudios hechos en produccin de biomasa en fotobiorreactores muestran tener mayor produccin de biomasa (2 a 5 g/L) y tiempos ms cortos de cultivo (2 a 4 semanas) que otras tecnologas disponibles (Demirbas, 2010). Objetivo Proponer la estructura de un estudio para la evaluacin de las condiciones ptimas de produccin de astaxantina en un fotobiorreactor por el alga

Haematococcus pluvialis afectada por exposicin a la luz y adicin/remocin de nutrientes. Desarrollo del trabajo Astaxantina: sntesis, qumica, aplicaciones y mercado Los carotenoides son un grupo de cerca de 700 compuestos liposolubles que son principalmente producidos en fitoplancton, algas y plantas. Estos pigmentos son los responsables de los bellos colores que encontramos en la naturaleza, adems de tener las estructuras ms diversas y conocidas. Los carotenoides, incluida la astaxantina, se deben proveer a los animales en la dieta ya que slo se sintetiza en algas y se concentra en la cadena alimenticia mediante zooplancton y crustceos que son presas del salmn por ejemplo, de ah su color rosado en nuestro caso (Lorenz, 2000). La astaxantina es biosintetizada a travs de la ruta isoprenoide de la que se desprenden esteroides, prostaglandinas, hormonas y las vitaminas D, K y E. La ruta empieza con Acetil-CoA, procediendo a fitoeno, licopeno, -caroteno y cantaxantina antes de proceder a los ltimos pasos de oxidacin que generan la astaxantina. Por esta ruta metablica es por la que se sospecha que la acumulacin de astaxantina en Haematococcus pluvialis es una forma de proteccin contra estrs oxidativo y alta luz (Lorenz, 2000). La mayora de los carotenoides presentan configuraciones trans ya que es la ms estable, sin embargo tambin se presentan dos centros quirales C-3 y C-3 y tres ismeros configuracionales; dos enantimeros (3R, 3R y 3S, 3S) y una mesoforma (3R, 3S). El ms abundante en la naturaleza es el ismero 3S, 3S. Tambin es importante mencionar que dependiendo del origen, la astaxantina puede encontrarse esterificada en uno o ambos grupos hidroxilo con diferentes tipos de cidos grasos, libre, con protenas y lipoprotenas. La astaxantina sinttica nunca est esterificada, totalmente al contrario de la natural que siempre est esterificada. La astaxantina sinttica es una molcula idntica a la natural con

una combinacin 1:2:1 de ismeros (3S, 3S), (3R, 3S) y (3R, 3R) (Higuera- Ciapara, 2006). Actualmente la mayor produccin de astaxantina est en manos de Roche, con su versin sinttica y la aplicacin de esta astaxantina se encuentra mayormente en la industria acucola. Desde 1990 Roche prcticamente inund el mercado mundial valuado en 150-200 millones de dlares, sin embargo, el inters de los consumidores en una transicin de lo sinttico a lo natural ha hecho que emerjan compaas como Aquasearch y Cyanotech que producen astaxantina natural mediante el alga Haematococcus pluvialis. Aunque se habla mucho de su aplicacin acucola en salmones y truchas, la astaxantina tiene muchas aplicaciones en la industria como lo son su uso en la produccin avcola para afectar el color de la yema de huevo, produccin de camarn, su comercializacin como suplemento alimenticio antioxidante, uso como pigmento en la industria farmacutica e incluso se le han atribuido propiedades anticancergenas. Esto habla de un producto que tiene mercado, que est creciendo y que vale la pena estudiar su produccin para proponer mtodos ms eficientes y redituables (Higuera-Ciapara, 2006) (Lorenz, 2000). Haematococcus pluvialis: fases y factores de crecimiento, produccin de astaxantina y estudios previos La produccin de astaxantina en Haematococcus pluvialis puede realizarse dos maneras, la primera consta de una sola etapa con uso de medio sub-ptimo en el que se favorece crecimiento celular y concentracin de astaxantina. La segunda manera, consta de dos fases o etapas; verde y roja. La primer etapa, tambin denominada verde o vegetativa, est enfocada principalmente a alcanzar una concentracin de biomasa alta y la etapa roja se orienta a la concentracin de astaxantina en las clulas previamente cultivadas en la etapa verde. El mtodo ms utilizado a nivel industrial es el segundo que involucra dos etapas de crecimiento de la microalga (Gksan, 2006) (Cifuentes, 2003). La microalga Haematococcus pluvialis tiene un ciclo de vida complejo y presenta diferentes tipos de clulas. La primera fase en la vida del alga es la etapa

vegetativa en la que se forman clulas verdes mviles, llamado tambin etapa palmella. En esta etapa palmella se forman zoosporas, que son clulas mviles reproducidas dentro de una clula madre, y que como consecuencia provocan crecimiento y multiplicacin celular, aunque se registran tasas de crecimiento lento. Posteriormente, la etapa roja, o de concentracin de astaxantina, se caracteriza por un cambio morfolgico a aplanosporas, que son clulas inmviles que sern expulsadas por la pared rota de la clula madre. Ests aplonosporas son rplicas casi perfectas de la clula madre pero han perdido la capacidad de formar zoosporas, por lo que la replicacin celular cesa en esta etapa (Cifuentes, 2003) (Barsanti, 2006).

Figura 2. Diferentes etapas de Haematococcus pluvialis Flotow bajo condiciones de laboratorio (Nagaraj, 2012) Para efectos de este trabajo se tomar como base el mtodo de dos etapas descrito previamente. Esta decisin se debe a que la produccin de astaxantina se da principalmente como respuesta a condiciones de estrs oxidativo, que pueden ser desfavorables para la primer etapa en la que se busca el crecimiento de las clulas vegetativas (Kobayashi, 1997) (Cifuentes, 2003). En la primera etapa, para favorecer el crecimiento y multiplicacin celular, se usa un medio ptimo para el crecimiento de la microalga, que incluye una fuente ptima de nitrgeno y una fuente de luz a intensidades ptimas que favorece su crecimiento fottrofo. La primer etapa de crecimiento del alga resulta ser la ms problemtica, dado que Haematococcus pluvialis presenta tasas de crecimiento bajo y puede haber riesgo de contaminacin en el medio de cultivo. Estos factores pueden en consecuencia retrasar la produccin de astaxantina si no se tiene una densidad celular grande que se reporta como 5 x 105 clulas/ml,

aunque otros estudios listan buenas densidades entre el valor de 15.7 x 104 y 17.5 x 104 clulas/ml (Gksan, 2006) (Cifuentes, 2003). Para optimizar la primer etapa de produccin, debemos monitorear principalmente que el medio sea ptimo y la intensidad de luz que se le administra al cultivo. Diversos estudios han probado la efectividad de diferentes fuentes de nitrgeno, mayormente inorgnicas, tanto para la primer etapa de crecimiento como para produccin de astaxantina. Las fuentes de nitrgeno ms estudiadas han sido NaNO3, KNO3, NaCl, K2HPO4,NH4NO3 y urea (Nagaraj, 2012) (Gksan T. (., 2011). En su estudio (Nagaraj, 2012) prueba como fuentes de nitrgeno NaNO3, CH4N2O, NH4Cl, K2HPO4 y NaCl a diferentes concentraciones y condiciones de luz. Se manejaron condiciones de laboratorio y periodos de luz y oscuridad de 12/12 horas. Los resultados obtenidos muestran que a una intensidad de luz de 40 E/m2s1 y con un pH de 7 las concentraciones de fuente de nitrgeno, contenido de carotenoides y nmero de clulas fueron las siguientes: Tabla 1. Desempeo de fuentes de nitrgeno en concentracin de carotenoides y nmero de clulas Fuente de nitrgeno NaNO3 CH4N2O NH4Cl K2HPO4 NaCl En el estudio se concluye que el fosfato y la intensidad de luz influencian de manera significativa la concentracin total de carotenoides. Sin embargo, en su Concentracin de fuente de nitrgeno 0.2 M 2.0 mM 2.0 mM 0.06 mM 0.06 mM Concentracin mxima carotenoides 67.49 g/mL 63.32 g/mL 66.21 g/mL 77.65 g/mL 68.26 g/mL 6.31 log10 clulas/mL 6.52 log10 clulas/mL 6.81 log10 clulas/mL 6.51 log10 clulas/mL 6.41 log10 clulas/mL (Nagaraj, 2012). Nmero mximo de de clulas

discusin tambin se menciona que la etapa vegetativa prefiri como fuente de nitrgeno el NaNO3 a una concentracin de 0.5 M ya que se registr un crecimiento mximo, sin embargo, para el caso de concentracin de carotenoides, fue mejor bajar la concentracin a 0.2 M (Nagaraj, 2012). En el estudio realizado por (Gksan T. (., 2011) tambin se prueban diferentes fuentes de nitrgeno, aunque en este caso se tratan de NaNO3, KNO3, NH4NO3 y urea, usando un medio basal BG11 (Blue-Green Medium) para algas. Las condiciones de cultivo se llevaron a cabo en cilindros de vidrio de 1 L, a 25 0.5 C y con una intensidad de luz de 75 mol fotones/m2s para favorecer su crecimiento fottrofo. La composicin del BG11 es la siguiente: Tabla 2. Composicin de medio de cultivo BG11 Reactivos NaNO3 K2HPO4 * 3H2O MgSO4 * 7H2O CaCl2 * 2H2O cido ctrico (C6H8O7) Citrato frrico de amonio (C6H8O7 * nFe * nNH3) EDTANa2Mg Na2CO3 Solucin stock de microelementos Solucin stock de microelementos H3BO3 MnCl2 * 4H2O ZnSO4 * 7H2O Na2MoO4 * 2H2O CuSO4 * 5H2O Co(NO3)2 * 6H2O 0.001 g 0.02 g 1 ml 2.860 g 1.810 g 0.222 g 0.390 g 0.079 g 0.0494 g Cantidad por litro 1.5 g 0.004 g 0.075 g 0.027 g 0.006 g 0.006 g

pH = 7.4 *Omitido por cianobacteria que arregla N2 (Barsanti, 2006). En este estudio se determin que las mejores fuentes de nitrgeno fueron el NaNO3 (1.0 g/L) y KNO3 (0.5 g/L) y que dieron como resultado una densidad celular de 25.3 x 104 clulas/ml y 26.3 x 104 clulas/ml respectivamente, lo que es consistente con estudios que utilizan medios ptimos de crecimiento para Haematococcus pluvialis y tienen una concentracin de .41 g/L (Fbregas, 2003). Adems de que la urea no result ser una fuente de nitrgeno favorable en este caso, y por los estudios anteriormente revisados, resulta bastante lgico utilizar como fuentes de nitrgeno NaNO3 o NaNO3 a las concentraciones antes mencionadas para tener un crecimiento ptimo en la etapa vegetativa (Gksan T. (., 2011). El medio de cultivo ptimo propuesto en (Fbregas, 2003) es ampliamente conocido y utilizado, tanto que sus resultados se siguen discutiendo hasta hoy en diferentes estudios (Gksan T. a., 2006) (Gksan T. (., 2011) (Nagaraj, 2012) (Choi, 2011) (Choi, Evaluation of Factors Promoting Astaxanthin Production by a Unicellular Green Alga, Haematococcus pluvialis, with Fractional Factorial Design, 2002) por lo que su medio resulta una opcin atractiva para el crecimiento ptimo en la etapa vegetativa. Los componentes de este medio de cultivo son: Tabla 3. Composicin del Optimal Haematococcus Medium (OHM), cada color y letra representan diferentes soluciones A Nitrato de potasio Fosfato de sodio dibsico Sulfato de magnesio heptahidratado KNO3 Na2HPO4 MgSO4 x 7H2O 1X 0.41 g/L 0.03 g/L 0.246 g/L 1X g/L 0.41 0.03 0.246

Cloruro de calcio CaCl2 x 2H2O dihidratado Fe(III)citrate x Citrato de hierro H2O monohidratado C6H5FeO7xH2O Cloruro de cobalto CoCl2 x 6H2O hexahidratado Sulfato de cobre CuSO4 x 5H2O pentahidratado Oxido de cromo Cr2O3 Cloruro de manganeso tetrahidratado xido de selenio Biotin Thiamine B-12 MnCl2 x 4H2O SeO2 Vit H B1 B-12

0.11 g/L 2.62 mg/L

0.11 0.00262

0.011 mg/L 0.012 mg/L 0.075 mg/L 0.98 mg/L 0.12 mg/L 25 g/L 17.5 g/L 15 g/L

0.000011 0.000012 0.000075 0.00098 0.00012 0.000025 0.0000175 0.000015 (Fbregas, 2003).

Ya que este medio ofrece una fuente de nitrgeno que registra buen desempeo, se debe conservar o si hay algn cambio slo habra de cambiarse por NaNO3 (Gksan T. (., 2011) (Nagaraj, 2012). Sin embargo, tambin se ha comprobado que la mezcla de vitaminas B1 (tiamina), B8 (biotina) y B12 (cianocobalamina) no es ms efectiva que si se aade la vitamina B1 solamente, por lo que esta vitamina es un factor de crecimiento importante y debe ajustarse a una concentracin de aproximadamente 0.1 mg/L, ya sea en una mezcla vitamnica o preferentemente la vitamina aislada (Gksan T. (., 2011). Por los estudios antes revisados sobre las fuentes de nitrgeno, niveles de vitamina y requerimientos de temperatura proponemos utilizar una modificacin del medio OHM (Optimal Haematococcus Medium) utilizando como fuente de nitrgeno el NaNO3 a una concentracin de 0.5M o de 1 g/L con todos los componentes antes mencionados y usando la vitamina B1 (tiamina) aislada a una concentracin de 0.1 mg/L. El medio se mantendr preferentemente a una temperatura promedio de 25 C. Las condiciones de agitacin y uso de CO2 se definirn ms adelante.

 Medio de cultivo 1: OHM (Optimal Haematococcus Medium) modificado Tabla 4. OHM (Optimal Haematococcus Medium) modificado para nuestro estudio A Nitrato de sodio Fosfato de sodio dibsico Sulfato de magnesio heptahidratado Cloruro de calcio dihidratado Citrato de hierro monohidratado Cloruro de cobalto hexahidratado Sulfato de cobre pentahidratado Oxido de cromo Cloruro de manganeso tetrahidratado xido de selenio Thiamine Se recomienda que se hagan soluciones stock de todas las soluciones marcadas en la Tabla 4 y se aforen a volmenes de un litro y se mantengan a 4 C. Posteriormente se preparar el medio de cultivo ptimo por disolucin de las soluciones stock hasta quedar las concentraciones especificadas arriba y se cultivar la cepa de Haematococcus pluvialis que se mantendr en las condiciones especificadas arriba. Ya que el estudio est basado en experimentacin en laboratorio, se mantendrn matraces Erlenmeyer con alrededor de 300 ml de medio donde se inocular el alga para su crecimiento. NaNO3 Na2HPO4 MgSO4 x 7H2O CaCl2 x 2H2O Fe(III)citrate x H2O C6H5FeO7xH2O CoCl2 x 6H2O CuSO4 x 5H2O Cr2O3 MnCl2 x 4H2O SeO2 B1 1X 1.0 g/L 0.03 g/L 0.246 g/L 0.11 g/L 2.62 mg/L 1X g/L 1.0 0.03 0.246 0.11 0.00262

B B

0.011 mg/L 0.012 mg/L 0.075 mg/L 0.98 mg/L 0.12 mg/L 0.1 mg/L

0.000011 0.000012 0.000075 0.00098 0.00012 0.0001

 Intensidad de luz en la etapa vegetativa Por otro lado, y como ya se ha mencionado anteriormente, el crecimiento de la microalga debe darse en condiciones fototrficas, para crecer adecuadamente y por lo tanto, se debe proveer al microorganismo de la intensidad de luz apropiada. Al igual que las plantas, la luz es la energa que controla y dispara las reacciones fotosintticas en algas, por lo que la intensidad, calidad y fotoperiodos de luz deben ser tomados en cuenta. Los rangos ms utilizados de luz suelen estar entre los 100 y 200 E/s m2 (cerca del 5 10% de la luz solar) que deben proveerse por lmparas fluorescentes o del espectro rojo y azul tambin son aceptables. Se menciona que calentamiento por exposicin a la luz debe ser evitado, y se deben tener fotoperiodos luz/oscuridad de 16:8, 14:10 o 12:12 (Barsanti, 2006). Ya que la luz es un factor importante, lo ms recomendable es usar lmparas fluorescentes con fotoperiodos de luz. Ya que la alta intensidad de luz puede ser un factor importante de estrs, se debe manejar una intensidad ptima durante la etapa vegetativa. Esta intensidad ptima ha sido evaluada en diferentes estudios y algunos recomiendan una intensidad de luz de entre 100 mol foton/m2 s y 170 mol foton/m2 s en lugar de intensidad que alcancen los 200 mol foton/m2 s. En este estudio se obtuvieron densidades celulares de 15.7, 11.5 y 10.1 x 104 clulas/ml y 17.5, 23 y 27.5 x 104 clulas/ml respectivamente, lo que indica que la intensidad de x 104 clulas/ml fue la de mejor rendimiento en este caso (Gksan T. a., 2006). En un estudio ms reciente hecho por el mismo autor y con condiciones ms parecidas a las que nosotros proponemos, se reporta que la intensidad de luz de 75 y 150 mol foton/m2 es mucho mejor que intensidades bajas de 20 o 40 mol foton/m2 s (Gksan T. (., 2011).. Otros autores manejan diferentes unidades e intensidades, que van del orden de 40 E/m2 s con buenos resultados de produccin de astaxantina (Nagaraj, 2012). Otro artculo por (Choi, Evaluation of Factors Promoting Astaxanthin Production by a Unicellular Green Alga, Haematococcus pluvialis, with Fractional Factorial

Design, 2002) maneja una intensidad de 100 E/m2 s en la etapa vegetativa y que denomina como de baja intensidad para no inhibir el crecimiento. En otro artculo por el mismo autor (Choi, Multistage Operation of Airlift Photobioreactor for Increased Production of Astaxanthin from Haematococcus pluvialis, 2011) mencionan una nueva tcnica que involucra lmparas fluorescentes internas para aprovechar la distribucin de luz uniforme y que hemos decidido usar en este estudio. Aunque no mencionan las intensidades, se pone nfasis en baja intensidad en la etapa vegetativa y que la distribucin de luz decrece con el aumento de clulas, efecto que debemos tomar en cuenta. Nuestro estudio tendr luz fluorescente interna a una intensidad de 150 mol foton/m2 s o de 100 E/m2 s. Otra fuente de luz interesante por ofrecer iluminacin sin aumento de temperatura y a diferentes longitudes de onda son las luces LED. La iluminacin con LEDs, especialmente de color rojo (max= 470 nm) y azul (max= 665 nm) ha sido utilizada y se reportan rendimientos de astaxantina de 20% ms que cuando se us luz fluorescente (Kim, 2009). En otros estudios con iluminacin de LEDs de diferentes colores y emisiones se midieron el efecto de la luz y la longitud de onda; luz roja (max= 625 nm), verde (max= 525 nm), azul (max= 470 nm), azul- violeta (max= 410 nm), violeta (max= 370 nm) y luz fluorescente. Las intensidades que se manejaron fueron 2.8, 8.0 y 12.0 mol foton/m2 s, y la fase logartmica fue prcticamente independiente de la fuente de luz por lo que posiblemente estas intensidades estn en el rango de saturacin, excepto para la luz fluorescente, cuya intensidad en estos rangos es muy baja para producir efectos en el crecimiento celular (Katsuda, 2004). En los experimentos hechos con LEDs se encontr que particularmente la luz roja (max= 625 nm) a relativamente baja intensidad tienen buen desempeo para alcanzar una densidad celular adecuada y se recomienda un proceso de dos pasos, con luz roja y luz azul para concentracin de astaxantina. Por esto hemos seleccionado la luz LED roja (max= 625 nm) para la primera etapa en conjunto con la luz fluorescente (Katsuda, 2004).

Por las revisiones antes hechas, tendremos un mtodo de dos etapas de produccin, en el que nuestra etapa vegetativa tendr el medio antes mencionado, con las condiciones establecidas y sern iluminados internamente por luz fluorescente y luz LED roja. Adems de que se suministrar aireacin CO2 a una concentracin de 5% (Kim, 2009) (Choi, Multistage Operation of Airlift Photobioreactor for Increased Production of Astaxanthin from Haematococcus pluvialis, 2011). Estas condiciones se mantendrn hasta que se alcance una densidad celular de cerca de 17.5 a 27 x 104 clulas/ml, tiempo en el que estarn listas para induccin de produccin de astaxantina (Cifuentes, 2003) (Fbregas, 2003) (Gksan T. a., 2006) (Nagaraj, 2012). Etapa de cambio a aplanosporas y concentracin de carotenoides. Produccin de astaxantina Como se describi anteriormente, la segunda etapa del crecimiento de Haematococcus pluvialis consiste en un cambio morfolgico a aplanosporas que son inmviles y que generan quistes. En estos quistes es donde se da la produccin de astaxantina como tal para volverlos rojos y el cambio morfolgico se dispara principalmente por condiciones ambientales desfavorables para la microalga que generan estrs oxidativo; deficiencia de nutrientes (nitrgeno y fosfatos), intensidades de luz elevadas y adicin de sales. Los dos mecanismos que tiene Haematococcus pluvialis para combatir el estrs ambiental oxidativo son, primero, enzimas anti oxidativas en la etapa vegetativa y finalmente la produccin de ketocarotenoides, astaxantina, en los quistes que se forman por el mismo efecto de estos factores (Kobayashi, 1997). Ya que una de las condiciones de estrs oxidativo es la reduccin en la concentracin de nutrientes, el paso ms lgico es reducir ya sea la concentracin o quitar absolutamente el nitrgeno. En su estudio (Nagaraj, 2012) menciona que la mejor fuente de nitrgeno fue el NaNO3 a una concentracin de 0.5 M en la etapa vegetativa, sin embargo prefiri la concentracin del mismo compuesto de 0.2 M para la etapa de produccin de

astaxantina. Por otro lado, los resultados en la Tabla 1 nos dicen que el mejor desempeo en produccin de astaxantina ocurri con K2HPO4 a una concentracin de 0.06 mM. Basndonos en estos resultados, hemos planteado un medio de cultivo 2 en el que removeremos la fuente ms ptima de nitrgeno para estresar al microorganismo pero mantendremos las dems caractersticas del medio. Medio de cultivo 2 OHM (Optimal Haematococcus Medium) modificado para produccin de astaxantina Tabla 5. Concentracin de reactivos para OHM (Optimal Haematococcus Medium) modificado para produccin de astaxantina. A Fosfato de potasio Fosfato de sodio dibsico Sulfato de magnesio heptahidratado Cloruro de calcio dihidratado Citrato de hierro monohidratado Cloruro de cobalto hexahidratado Sulfato de cobre pentahidratado Oxido de cromo Cloruro de manganeso tetrahidratado xido de selenio Thiamine K2HPO4 Na2HPO4 MgSO4 x 7H2O CaCl2 x 2H2O Fe(III)citrate x H2O C6H5FeO7xH2O CoCl2 x 6H2O CuSO4 x 5H2O Cr2O3 MnCl2 x 4H2O SeO2 B1 1X 0.01044 g/L 0.03 g/L 0.246 g/L 0.11 g/L 2.62 mg/L 1X g/L 0.01044 0.03 0.246 0.11 0.00262

B B

0.011 mg/L 0.012 mg/L 0.075 mg/L 0.98 mg/L 0.12 mg/L 0.1 mg/L

0.000011 0.000012 0.000075 0.00098 0.00012 0.0001

 A pesar de que quitaremos la fuente ptima de nitrgeno de nuestro primer medio, el factor de estrs oxidativo ms fuerte es el estrs a altas intensidades de luz (Kim, 2009). En el estudio de (Nagaraj, 2012) se maneja una intensidad de luz de 40 E/m2 s para probar la ausencia de una fuente ptima de nitrgeno, pero esto contrasta con intensidades recomendadas de 100 E/m2 s e incluso se han usado intensidades de luz de 300 E/m2 s y de hasta 500 E/m2 s, esto especficamente de la luz fluorescente (Barsanti, 2006) (Choi, Evaluation of Factors Promoting Astaxanthin Production by a Unicellular Green Alga, Haematococcus pluvialis, with Fractional Factorial Design, 2002) (Kim, 2009). Por otro lado, la iluminacin con LEDs tambin ha probado ser eficiente para la etapa de produccin de astaxantina. En el estudio de (Katsuda, 2004) se menciona a la luz LED azul (max= 470 nm) como un factor importante de induccin para la produccin de astaxantina y a una intensidad relativamente alta de 12.0 mol foton/m2 s. En este estudio, al ver los resultados obtenidos tanto con luz roja (especialmente efectiva para desarrollo de biomasa) y con luz azul (efectiva para la produccin de astaxantina) se realiz un proceso extra con luz roja en la primera etapa y luz azul en la segunda. Despus de 140 horas de iluminacin con LED azul la concentracin de astaxantina fue de 42 g/ml. Debido a toda la informacin encontrada en los diversos artculos arriba expuestos, nuestro modelo experimental tendra el siguiente aspecto: Tabla 6. Diferentes tratamientos para el estudio de ausencia de nutrientes y exposicin a la luz. Tratamiento 1 Etapa 1 1 Tratamiento 2 Etapa 1 Tratamiento 3 Etapa 1 Control Etapa 1

Medio de cultivo Medio de cultivo 1 Medio de cultivo 1 Medio de cultivo 1

 interna a

Luz

LED a

roja Luz fluorescente Sin luz una interna a 150

Luz fluorescente interna

150 intensidad de 2.8 mol foton/m2 s o de 100 E/m2 s Etapa 2 Luz LED Etapa 2 a 320 Etapa 2

mol foton/m2 s mol foton/m2 s. o de 100 E/m2 s Etapa 2 2 interna E/m2 s. a

Medio de cultivo Medio de cultivo 2 Medio de cultivo 1 Medio de cultivo 2 azul Luz fluorescente Sin luz E/m2 s.

Luz fluorescente interna a 12 mol interna 320 foton/m2 s.

Cada uno de estos tratamientos debe hacerse en triplicado para que tenga un valor estadstico y las condiciones a las que los cultivos deben mantenerse ya han sido mencionadas con anterioridad. Medicin del contenido de astaxantina Para medir el contenido de astaxantina usaremos el mtodo propuesto por (Katsuda, 2004) en el que debemos: 1. Tomar diariamente 0.5 ml de suspensin de clulas. 2. Centrifugar por 10 min a 7,500 g. 3. Resuspender el precipitado en 0.5 ml de metanol y mezclarlo con .40 g de partculas de slica (0.2 1 mm). 4. Mezclar vigorosamente por 10 minutos. 5. Centrifugar por 10 minutos. 6. Tomar el sobrenadante y aplicar HPLC en una columna de fase reversa y usando metanol como fase mvil. Medir a 470 y 680 nm. 7. Cuantificar resultados con una curva estndar de astaxantina.

 Biorreactor El fotobiorreactor a utilizar est basado en los experimentos llevados a cabo por Salazar (2009) y Seplveda (2011) con algunas modificaciones con el fin de nuestro proyecto. Consiste en biorreactores de vidrio tipo columna de burbujeo con volumen de 1litro, con una capa exterior para el control de la temperatura; la agitacin se llevar a cabo por una mezcla de CO2 y aire en la parte inferior con la concentracin antes mencionada a travs de un filtro estril a una velocidad de 2L min-1; con medidores de pH, CO2, O2. Todo esto dentro de una cmara equipada con los LEDs. Discusin Los carotenoides son los pigmentos responsables de los colores que nos otorga la naturaleza y son sintetizados exclusivamente por algas, por lo que es necesario proveerlos en las dietas de los animales. La astaxantina es uno de los principales y es sintetizada por Haematococcus pluvialis como un medio de proteccin ante estrs oxidativo y la luz. Esta alga presenta dos etapas de vida siendo la segunda donde se concentra la produccin de astaxantina. Durante la primer etapa se favorecer el crecimiento y la multiplicacin del organismo con los niveles necesarios de nutrientes, compuestos, nitrgeno y luz, con el fin de obtener una buena densidad celular. Diversos estudios han sido realizados de acuerdo a la fuente de nitrgeno para optimizar su crecimiento, estos principalmente son compuestos inorgnicos como NaNO3, CH4N2O, NH4Cl, K2HPO4, NaCl, entre otros, a diferentes concentraciones molares. Despus de analizar los resultados mostrados por los autores se concluy que lo ptimo es utilizar NaNO3 (1.0 g/L) y KNO3 (0.5 g/L) debido a las altas concentraciones celulares que arrojaba.

Otro aspecto importante es la seleccin del medio de cultivo. Despus de evaluar los niveles de vitamina B1, y los requerimientos de temperatura se propuso utilizar un medio OHM modificado utilizando NaNO3 con concentracin de 0.5 o 1.0M, mantenindolo a una temperatura de 25oC. Las algas sern cultivadas en un fotobiorreactor en condiciones fototrficas a 150 mol foton/m2 con fotoperiodos luz/oscuridad de 16:8, 14:10 o 12:12 por lmparas flourescentes y sin luz. Se implementar el uso de LEDs para la primer etapa utilizando principalmente luz roja (max= 625 nm) a una intensidad de 2.8 mol foton/m2 s, ya que esta tiene un buen desempeo para alcanzar la densidad celular deseada. Para la segunda etapa se utilizar otro medio OHM modificado con la ausencia de NaNO3, y someteremos a las clulas a un alto ests de luz para la obtencin de astaxantina, con una intensidad de luz de 320 E/m2 s e implementacin de LEDs de luz azul a 12 mol foton/m2 s y sin luz. El fotobiorreactor ser de tipo columna de burbujeo de un litro con un suministro de aire y CO2 al 5% a una velocidad de 2L min-1; con una capa exterior para el control de la temperatura y medidores de pH, CO2, O2.. Se espera obtener resultados cercanos a 17.5 a 27 x 104 clulas/ml. Se medirn los contenidos de antaxantina mediante el mtodo de Katsuda (2004) por medio de un HPLC en columna de fase reversa y metanol como fase mvil. Ya que contamos con una slida investigacin bibliogrfica, es muy posible que este experimento pueda llevarse a cabo de manera prctica, que ofrece caractersticas novedosas y que busca estandarizar los procesos de cultivo de Haematococcus pluvialis. Los posibles errores en este proyecto pueden provenir de los cambios realizados al medio de cultivo o que las intensidades de luz no sean las correctas, pero el trabajo de investigacin sugiere que esto no ocurrir. El monitoreo de las condiciones como temperatura, aireacin y el manejo en general del bioreactor pueden proveer fuentes de error importantes, por lo que debe ponerse especial atencin en este aspecto.

 Recomendamos para estudios posteriores hacer un anlisis de intensidad de luz especialmente en el tipo de luz fluorescente. A pesar de que se conocen las intensidades para alcanzar una densidad celular adecuada, muchos estudios utilizan rangos ms altos o ms bajos y an as obtienen resultados relativamente buenos. Nosotros en especial recomendamos que se analice la influencia de luz fluorescente desde 100 mol foton/m2 s hasta 500 mol foton/m2 s tanto en la etapa vegetativa como en la etapa de produccin. Esto podra estandarizar un poco ms los mtodos para el cultivo de Haematococcus pluvialis y podra permitir que se analicen otros tipos de luz o incluso otros tipos de factores de crecimiento y produccin. Conclusin Despus de un arduo trabajo de anlisis de bibliografa para proponer un nuevo estudio donde se prueben las variables de intensidad de luz y remocin de nutrientes, se puede concluir que sabemos las fuentes apropiadas de nitrgeno para nuestro proceso y conocemos la intensidad de luz fluorescente en las etapas vegetativa y de produccin de astaxantina. Tambin nos permiti saber las condiciones ptimas de crecimiento, la aplicabilidad de la astaxantina en diferentes industrias, mtodos de anlisis del contenido de astaxantina, etc. El anlisis bibliogrfico antes detallado nos permiti reducir lo ms posible nuestras variables de estudio y sus parmetros para proponer un estudio novedoso y reproducible. Consideramos que nuestro objetivo se logr ya que mientras condiciones como fuente de nitrgeno o factores de induccin para producir astaxantina ya no son probados en este estudio, ms bien intentamos cubrir aquellas variables que no tienen parmetros ptimos establecidos. Bibliografa Cifuentes, A. S. (2003). Optimization of biomass, total carotenoids and astaxanthin production in Haematococcus pluvialis Flotow strain Steptoe (Nevada, USA) under laboratory conditions. Biological Research , 36, 343-357.

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