1. TEMA Tcnica de colorao de GRAM 2. Introduo Corantes so substncias que possuem a propriedade de transmitir sua cor a outros corpos.

Preparaes coradas so comumente usadas no exame microscpico de bactrias em Microbiologia, nas quais esfregaos de material so submetidos ao de um ou mais corantes, aps fixao (Moraes et al., 2000).

Em 1884, o mdico dinamarqus Christian Gram descobriu, empiricamente, ao corar cortes histolgicos com violeta genciana, atravs do mtodo de Ehrlich (1882), que as bactrias que eles continham no eram descoradas pelo lcool, se previamente tratadas com soluo de iodo. Ele adicionou a este procedimento um contra-corante (safranina, fucsina bsica, etc.) e estabeleceu, a partir da, um novo mtodo de colorao diferencial. Ao longo destes anos, o mecanismo de colorao de Gram foi muito estudado, e, nesta medida, muitas modificaes foram propostas, sem, contudo afetar substancialmente a idia original (Moraes et al., 2000; Marczwski & Vlez, 1999).

Externamente membrana plasmtica as bactrias apresentam uma parede celular, esta uma estrutura rgida, responsvel pela forma da clula bacteriana, que age como uma membrana seletiva e permevel, alm de proteger contra choques osmticos. So as caractersticas da parede celular que determinam a reao de Gram.

Anlises qumicas demonstraram diferenas entre as paredes das bactrias Gram positivas e Gram negativas (Fig. 1), j que a parede das Gram negativas geralmente mais rica em lipdios que as Gram positivas. Nas Gram negativas o teor de peptdeoglicano (5 a 10%) mais baixo que nas Gram positivas (40 a 90%) (Salle, 1961; Romeiro, 1995).

Figura 1: Diferenas entre as paredes das bactrias Gram positivas e Gram negativas. Fonte: www.terravista.pt/bilene/biologia/clula/bact24.htm.

Os diferentes tipos de bactrias reagem de modo diferente colorao de Gram, porque diferenas estruturais em suas paredes celulares afetam a reteno ou liberao de uma combinao de violeta de genciana e iodo, denominada complexo violeta-iodo (CV-I).

Entre outras diferenas, as bactrias gram-positivas tm uma parede celular mias espessa de peptideoglicana(dissacardeos e aminocidos) que as bactrias gram-negativas. Alm disso, as bactrias gram negativas contm uma camada de lipopolissacardeos (lipdeos e polissacardeos) como parte de sua parede celular.

Quando aplicada a clulas gram-positivas e gram-negativas, a violeta de genciana e o iodo penetram facilmente nas clulas. Dentro as mesmas, a violeta de genciana e o iodo se combinam para formar o CV-I. Esse complexo maior que a molcula CV que entrou na clula e, devido ao seu tamanho, no pode ser removido da camada intacta de peptideoglicano das clulas grampositivas pelo lcool.

Nas clulas gram-negativas o lcool rompe a camada lipopolissacardica e o complexo removido atravs da camada fina de peptideoglicano, que no consegue reter o complexo. Como resultado, as clulas gram-positivas retm o corante e permanecem de cor prpura. As clulas gram-negativas no retm o corante e ficam incolores at serem contracoradas com um corante vermelho, aps o que adquirem cor rosa.

O mtodo de Gram uma das mais importantes tcnicas de colorao em microbiologia mdica. Porm, os resultados da colorao de Gram no so universalmente aplicveis, pois algumas clulas bacterianas coram-se fracamente ou no adquirem cor. A reao de Gram mais consistente quando usada em bactrias jovens, em crescimento.

O mtodo de colorao de Gram consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio slido ou lquido, com um corante primrio, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactrias gram-positivas quanto gram-negativas absorvem de maneira idntica o corante primrio e o fixador, adquirindo uma colorao violeta devido formao de um complexo cristal violeta-iodo, insolvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgnico, o etanol-acetona.

O solvente dissolve a camada lipdica das membranas externas das bactrias gram-negativas, deixando tambm pequenos buracos na fina camada de peptideoglicana pelos quais o complexo CV-I se espalha , decorando as clulas.

Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactrias gram-positivas e provoca a contrao dos poros do peptideoglicano, tornando-as impermeveis ao complexo; o corante primrio retido e as clulas permanecem coradas.

A etapa da descolorao crtica, pois a exposio prolongada ao solvente ir provocar a remoo do cristal violeta dos dois tipos de bactrias, podendo produzir resultados falsos. A reteno ou no do corante primrio , portanto, dependente das propriedades fsicas e qumicas das paredes celulares

bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade. Em seguida, a amostra tratada com um corante secundrio, a fucsina bsica. Como as bactrias gram-negativas ficam incolores aps a lavagem com lcool, a adio do contracorante colore as clulas.

Ao microscpio, as clulas gram-positivas aparecero coradas em violeta e as gram-negativas em rosa. Em clulas de bactrias gram-positivas velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes fsicos ou qumicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as clulas coradas como gram-negativas. Portanto, o uso de amostra nova importante.

Por outro lado, resultados do tipo "falso gram-positivo" s so obtidos se o tratamento com etanolacetona for omitido. O corante cristal violeta pode ser substitudo, com os mesmos resultados, pelo azul de metileno e a fucsina bsica pode ser substitudo pelo corante vermelho safranina. A fucsina cora muitas bactrias gram-negativas mais intensamente que a safranina, que por sua vez no cora prontamente algumas espcies de bactrias. O solvente etanol-acetona pode ser substitudo por lcool 95%.

3. OBJETIVO

Desenvolver habilidades para executar as tcnicas de preparao de esfregaos e para o mtodo de colorao de Gram, sabendo diferenciar e classificar as bactrias de acordo com a colorao obtida. Desenvolver a habilidade, tambm, para utilizar o microscpio ptico, observando as bactrias aps a colorao de Gram.

4. MATERIAIS E REAGENTES

4.1.

Aparelhagem

Lmina de dimenses 76 x 26 mm; Porta-lmina de ao inoxidvel ou vidro; Pina de ao inoxidvel;

Bico de Bunsen; Ala de platina ou nquel-cromo com aro de 3 mm de dimetro interno e 70 mm de comprimento; Cronmetro; Microscpio ptico, com condensador de campo claro seco , permitindo aumentos de at 1500X (objetiva de imerso).

4.2.

Soluo, Reagente e leo

gua destilada; Gram I (Soluo de cristal violeta); Gram II (Soluo de lugol); Gram III (Etanol absoluto a 95 % (v/v)) ; Gram IV (Soluo de fucsina de Zielh ou safranina); leo de imerso.

5. PROCEDIMENTO

5.1.

Colorao e esfregao

Utilizando-se da rea estril em volta do bico de Bunsen retirar, com o auxlio da ala de platina, uma pequena poro da bactria desejada (j inoculada em placa petri).

Colocar uma gota de gua destilada em uma lmina, esfregar a ponta da ala de platina com a bactria na gota, fazendo um crculo.

Secar a gua com o auxlio do bico de bunsen. Corar com Cristal violeta por 60 segundos. Lavar com esguicho de gua. Corar com Lugol por 60 segundos.

Lavar com esguicho de gua. Passar lcool acetona at que no haja mais desprendimento de corante. Lavar com esguicho de gua.

Corar com fucsina por 30 segundos. Lavar com esguicho de gua e esperar secar.

5.2.

Microscpio

Ligar o microscpio na tenso adequada. Acoplar a lmina mesa (platina) do microscpio.

Focalizar utilizando o parafuso macromtrico, ajustar o foco com o parafuso micromtrico.

No caso da lente de maior aumento, colocar leo de imerso, imergir a lente no leo, focar utilizando o parafuso macromtrico e ajustar com ajuda do micromtrico.

Aps o trmino da visualizao, retirar a lmina e limpar imergindo-a no leo.

6. Resultados e Discusso de Resultados.

A tabela 1 abaixo referente aos resultados obtidos durante a prtica da observao da colorao de GRAM.

Tabela 1: Resultado da Colorao de GRAM PLACAS Resultado da Colorao 1 vermelha 2 3 4 5 6 7 vermelha violeta vermelha Tons de vermelha e violeta violeta vermelha Resultado do tipo da colorao GRAM NEGATIVA GRAM NEGATIVA GRAM POSITIVA GRAM NEGATIVA GRAM POSITVA E NEGATIVA GRAM POSITIVA GRAM NEGATIVA TIPO DE BACTRIA Bastonestes Bastonestes e Bacilos Levedura Cocos Bastonetes Cocos Cocos

O cristal violeta e o lugol penetram tanto nas bactrias Gram-positivas quanto nas Gram negativas, formando um complexo de cor roxa. O tratamento com lcool a etapa diferencial; nas Gram-positivas, o lcool no retira o complexo

cristal violeta + lugol, pois a sua ao desidratante faz com que a espessa camada de peptdeoglicano se torne menos permevel, retendo o corante.

Nas

Gram-negativas,

devido

pequena

espessura

da

camada

de

peptdeoglicano e sua maior permeabilidade, o complexo corado extrado pelo lcool, deixando as clulas descoradas. Como as bactrias Gram positivas possuem a parede celular mais impermevel, o lcool no consegue descolorilas, portanto, permanecem com a colorao azul-violeta do corante. O tratamento com lcool no altera a cor roxa das Gram-positivas, ao passo que as Gram-negativas, descoradas pelo lcool, tornam-se avermelhadas, cor caracterstica do corante de fundo (Moraes et al., 2000; Ferreira & Salgado, 1995; Romeiro, 1995).

O esquema representativo da etapa de colorao de GRAM representado conforme a figura 2 abaixo.

Figura 2: Esquema representativo dos processos envolvidos durante a colorao de Gram. Fonte: WESP, 2003.

Para a identificao das bactrias foi realizado a visualizao e para entender melhor foram postadas as figura 3 a 9 ilustrando o que cada componente do grupo visualizou.

Figura 3: Placa 1 representa os Bastonetes GRAM POSITIVO no esporulados.

Figura 4: Placa 2 representa os Bastonetes ( cocobacilos) Gram Positivo.

Figura 5: Placa 3 representa a Levedura Gram Negativa.

Figura 6: Placa 4 representa o Cocos Positivo agrupados 2 a 2 ( diplococos).

Figura 7: Placa 5 representa os bastonetes em forma de Gram negativo e gram positivo.

Figura 8: Placa 6 representa os Cocos Gram negativo agrupados 2 a 2 (diplococos) intra e extra- celulares.

Figura 9: Placa 7 representa os Cocos Gram positivo agrupados em cachos de uva.