UNIVERSIDADE DE SO PAULO USP ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA

Ana Flvia S. Carmo Eduardo Muniz Alcova Elton Mirela Naldi Freitas

Determinao de protenas e espectro de luz de aminocidos

Lorena, 1 de abril de 2013

Determinao de protenas e espectro de luz de aminocidos

Lorena, 1 de abril de 2013

RESUMO O presente relatrio objetivou o estudo de trs experimentos, no primeiro a determinao da concentrao de protena por fotometria sendo encontrado o mximo 520nm para albumina e calculada as concentraes 0,1357 (mq/mL) e 0,067 (mq/mL) da protena nas amostras desconhecidas 1 e 2. J no segundo experimento determinamos o mximo para 3 aminocidos : triptofano =280nm , tirosina=270 nm e leucina = 250nm e com esses comprimentos de onda calculamos as absorbncias respectivas e as concertaes (mol/L) que foram : 2,088 e 9,793*10^-4 mol/L para o triptofano , 1,550 e 1,104*10^-3 mol/L para a tirosina e 0,097 e 1,525*10^-3 mol/L para a Leucina. Esses valores permitiram-nos calcular a (absortividade Molar) para cada aminocido , sendo = 2132,135 L/mol.cm (triptofano) , = 1403,986 L/mol.cm (tirosina) e = 63,607L/mol.cm (Leucina). A ltima parte do laboratrio 2 foi encontrar a absorbncia em mximo (270nm) em diferentes concentraes de triptofano para fazer o um grfico das Absorbncias x concentraes e comparar com o que literatura diz. O resultado foi insatisfatrio , com pontos dispersos pelo grfico. O ltimo laboratrio foram obtidas as absorbncias a um comprimento de onda ( 595nm) da soluo padro BSA em vrias concentraes para depois , com a concentrao molar das amostras traar um grfico , como do laboratrio 2 de Absorbncia x concentraes, para determinar a concentrao de protena de duas amostras desconhecidas os resultados foram : Amostra 1= 7,217*10^-07 mol/L; Amostra 2=4,407*10^-07 mol/L. Para ter outro parmetro passamos nos espectrofotmetro femto 800xI na luz ultra violeta para determinao de concentraes das mesmas amostras e comparamos , no ultra violeta ,e com a frmula disponibilizada pela professora foi obtido 7,1763mg/mL para amostra 1 e 0,0927mg/mL para amostra 2

1 INTRODUO As protenas so formadas por aminocidos ligados entre si por ligaes peptdicas, so os constituintes bsicos da vida, tanto que seu nome derivado da palavra grega "proteios" que significa "em primeiro lugar". O estudo de aspectos importantes da bioqumica nos leva diretamente ao estudo de protenas, assim torna-se importante a existncia de mtodos adequados de caracterizao e quantificao destes compostos . Inicialmente o termo espectro foi por Newton, quando este descobriu que a luz branca, ao atravessar um prisma, dividida em vrias cores. Hoje em dia se tem conhecimento que o espectro visvel mnima frao do espectro eletromagntico. As substncias qumicas possuem habilidades distintas de absorverem a luz em comprimentos de onda definidos e assim pode se utilizar desta para a determinao qualitativa e quantitativa. Os mtodos espectroscpios se baseiam na emisso e na absoro da radiao eletromagntica das molculas quando os eltrons destas esto se movimentando entre os nveis energticos. A absoro realizada na chamada radiao luminosa que possui o comprimento de onda entre o ultravioleta at o infravermelho. A fotometria tem como principio a medida ou quantificao da luz para quantificar solues. Os espectrofotmetros, em geral, contm cinco componentes principais: fontes de radiao, monocromador, recipientes para conter as solues, detectores e indicadores de sinal. Quando a regio espectral usada a ultravioleta/visvel, so necessrios componentes ticos de quartzo e detectores altamente sensveis aptos de detectar radiaes nessa extensa faixa espectral em que age o instrumento. O espectrofotmetro nos permite saber que quantidade de luz absorvida em determinado comprimento de onda, sendo assim possvel identificar a substancia contida na amostra com base no seu espectro como tambm quantific-la j que a quantidade de luz absorvida est relacionada com a sua concentrao. A caracterstica mais importante dos espectrofotmetros a seleo de radiaes monocromticas, o que possibilita inmeras determinaes quantitativas regidas pela Lei de Lambert-Beer.

A lei de Lambert-Beer estabelece que a absorbncia possua relao diretamente proporcional a concentrao da espcie absorvente, j a concentrao relacionada logaritmicamente com a frao de luz que passa (transmitncia). A lei estabelece a seguinte equao: Log (I0/ I) = A= . c.l Sendo: A= absorbncia = absorvidade molecular ou coeficiente de extino (L.(mol. cm)-); c= concentrao do material absorvedor (mol/L); l= espessura da amostra atravs da qual a luz passa (cm).

A determinao de concentrao de um soluto em uma soluo -problema por espectrofotometria implica na comparao da absorbncia da soluo -problema comum a soluo de referncia, a qual possui concentrao conhecida do soluto. Normalmente se utiliza uma soluo-padro com diferentes concentraes com sua absorbncia determinada o que ira gerar vrios pontos. Esses pontos so preparados diluindo-se a soluopadro no volume necessrio para a obteno das concentraes desejadas, com os valores de absorbncia e de concentrao conhecida feito um grfico conhecido como curva padro. Na curva padro, a reta designa a proporcionalidade entre o aumento da concentrao e da absorbncia e a parte linear indica o limite de sensibilidade do mtodo espectrofotomtrico para o soluto em questo. Existem ainda casos onde necessrio quantificar substancias que no absorvem luz significativamente a nenhum comprimento de luz ou que esto impuras, nessas circunstancias so utilizados mtodos colorimtricos onde utilizado um reagente especifico que em contato com a substncia a ser quantificada ir conferir uma cor cuja intensidade desta seja diretamente proporcional a concentrao da substancia original. A sensitividade entre os mtodos varia e este fator pode ser determinante na escolha do mtodo a ser utilizado, a vantagem de utilizar destes mtodos esta na facilidade de execuo e de poder analisar substancias especificas dentro de uma mistura sem precisar realizar o processo de purificao. O mtodo de Biureto se baseia na reao do reativo do biureto, que constitudo de uma mistura de cobre e hidrxido de sdio com um complexante que estabiliza o cobre em soluo. O cobre, em meio alcalino reage com protenas formando um complexo quadrado planar com a ligao peptdica, o produto desta reao tem duas bandas de absoro, uma em 270 nm e outra em 540 nm. Apesar da banda na regio de 270 nm possuir seis vezes a mais sensibilidade do mtodo do biureto, a banda na regio de 540 nm a mais utilizada para fins analticos, j que diversas substncias que possam

reagir com o cobre (II) esto presentes nos meios utilizados e absorvem na regio de 270 nm o que causa muita interferncia. O mtodo de Bradford uma metodologia para a determinao de protenas totais que utiliza o corante de Coomassie brilliantblue BG-250. Este mtodo baseado na interao entre o corante BG-250 e macromolculas de protenas que contm aminocidos de cadeias laterais bsicas ou aromticas. No pH de reao, a interao entre a protena de alto peso molecular e o corante BG-250 gera o movimento do equilbrio do corante para a forma aninica, que absorve fortemente em 595 nm. O mtodo possui certas desvantagens como a alterao da absortividade especfica para diversas protenas causado pela baixa solubilidade ou pelo baixo peso molecular destas e de proporcionar resultados nem sempre reprodutveis devido ao grau de pureza do corante BG-250 que varia conforme a procedncia. H poucas substncias que so consideradas interferentes no mtodo de Bradford, estas poucas geralmente reagem com as protenas impedindo a reao com o corante BG250 ou podem reagir com o corante causando variao na absorbncia. O mtodo de absoro no ultra-violeta consiste no fato de que as protenas apontam absoro na regio abaixo de 220 nm e na regio de 280 nm, devido ligao peptdica e aos diversos aminocidos (fenilalanina, cistena, cistina, metionina, triptofano, histidina e tirosina). O mtodo apresenta como principais vantagens as de no arruinar a amostra e de ser rpido, por isso empregado nos procedimentos de purificao e separao de protenas para a quantificao. As desvantagens deste mtodo que este sofre a ao de muitos interferentes (qualquer substncia que descreve uma faixa de absoro na regio de leitura) e por isso esta metodologia na maior parte utliizada em processos de purificao de protenas, onde somente um exame semi-quantitativo suficiente.

2 OBJETIVO

3 MATERIAIS E METODOS

4 Resultados e Discusso
Laboratrio 1 As absorbncias obtidas no espectrofotmetro femto 800xI para determinao do mximo do produto da reao de biureto na Tabela 1.
(nm)

Abs 400 0,116 420 0,008 450 0,114 470 0,190 500 0,318 520 0,369 550 0,368 580 0,296 600 0,221 630 0,103 680 -0,017 700 -0,039 Tabela 1: absorbncia do produto da reao do biureto em variados comprimentos de onda.

A partir desses dados foi traada uma curva da absorbncia x (grfico 1)

Absorbncia da albumina
0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 -0.05 0 -0.1

Absorbncia

100

200

300

400 (nm)

500

600

700

800

Grfico 1 :Absorbncia da albumina em diferentes comprimentos de onda.

Com exceo ao primeiro ponto ( = 400 nm), se observa uma curva ascendente da absoro do produto da reao do biureto com o aumento do comprimento de onda , com mximo no comprimento de onda 520 nm. Sendo a absoro tima de luz visvel para o produto da reao do biureto, o valor de 520 nm est prximo o valor encontrado na literatura mostrando um experimento satisfatrio. Em seguida, foram obtidas as absorbncias a 540 nm da protena em diferentes diluies para ser calculada a concentrao (mg/mL) como mostrado na tabela 2. Tubos Albumina (8mg/mL) 0,1mL 0,2mL 0,4mL 0,7mL 1,0mL Dil(1:5) Protena desconhecida 1,0mL gua destilada 1,5mL 1,4mL 1,3mL 1,1mL 0,8mL 0,5mL 0,5mL Reagente biureto 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL 2,5mL Concentrao (mg/mL) 0 0,2 0,4 0,8 1,4 2,0 0,4 Absorbncia (540nm) 0 0,060 0,115 0,208 0,377 0,468 0,492 0,428

Branco 1 2 3 4 5 Amostra desconhecida1 Amostra Dil (1:10) 1,0mL 0,5mL 2,5mL 0,2 desconhecida2 Tabela 2: Dados para a construo da curva para determinao de concentrao de protenas.

A tabela 2 pode nos mostrar como a diluio uma das maiores fontes de erro relativo em um procedimento experimental j que para concentraes iguais (tubo 2 amostra desconhecida1 e tubo 1- amostra desconhecida 2) as absorbncias foram discrepantes.
A partir dos valores da tabela 2 podemos fazer um grfico da Concentrao(dos tubos 1 a 5) (mg/mL) x Absorbncia como exibido no grfico 2

2.5 2 Absorbncia 1.5 1 0.5 0 0 0.1

Curva Padro
y = 4.2569x - 0.0855 R = 0.9891

Curva Padro Linear (Curva Padro )

0.2 0.3 Concetrao (mg/mL)

0.4

0.5

Grfico 2: Curva Padro com equao da reta da albumina (8mg/mL) em variadas concentraes (mg/mL).

Com essa equao podemos discutir os possveis valores que foram atribudos a b (no possui valor na Lei de Lambert-Beer) .O valor de b (da equao) foi distante do esperado pois analisando a Lei de Lambert-Beer( A = lc) , deveria ser atribudo um 0 e o valor mostrado pelo excel foi 0,0855.

Laboratrio 2 A prtica do laboratrio 2 foi dividida em duas partes. Na primeira determinamos as absorbncias a partir da leitura do espectrofotmetro femto 800xI dos aminocidos em variados comprimentos de onda : Leucina (0,2mg/mL) , Triptofano(0,2mg/mL) e Tirosina (0,2mg/mL) esto na Tabela 3:
(nm)

230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340

Triptofano Tirosina Leucina (0,2mg/mL) (0,2mg/mL) (0,2mg/mL) 0,001 0 0,001 0,001 0,302 0,0 3,0(estourou) 3,0 0,097 3,0(estourou) 0,839 0,021 3,0(estourou) 1,550 0,009 2,088 1,061 0,007 1,515 0,042 0,005 0,218 0,012 0,004 0,04 0,009 0,001 0,021 0,006 0,0 0,020 0,008 0,001 0,022 0,007 0,003

350 0,023 0,006 0 360 0,021 0,006 0 370 0,017 0,007 0 380 0,023 0,008 0 390 0,01 0,003 0 400 0,005 0,002 0 410 0,002 0,003 0 420 0 0,002 0 430 0 0,003 0 440 0 0,002 0 450 0 0,001 0 460 0 0,002 0 470 0 0,001 0 480 0 0,001 0 490 0 0,001 0 500 0 0 0 510 0 0 0 520 0 0 0 530 0 0 0 540 0 0 0 550 0 0 0 560 0 0 0 570 0 0 0 580 0 0 0 590 0 0 0 600 0 0 0 Tabela 3: Valores das absorbncias em diferentes aminocidos com concentrao de 0,2 mg/mL Com os valores da Tabela 3 possvel fazer uma srie de determinaes. Primeiramente que os valores de mximo para cada aminocido : Triptofano (0,2mg/mL ) = 280nm;
Tirosina (0,2mg/mL) = 270nm; Leucina (0,2mg/mL) =250nm. Com esses valores, vemos (como j mostrado na introduo) que esses valores esto de acordo com a literatura,a lm disso, podemos ver que a absorbncia obtida no mximo : no Triptofan o= 2,088 (no se deve considerar as absorbncias nos comprimentos de onda de 250nm 270nm pois estourou na leitura, isto

pode ter ocorrido devido ao fato do reagente ter reagido demais ou a concentrao do triptofano estava acima do que era o esperado ); na Tirosina = 1,550; na Leucina =0,097. Com a Absorbncia obtida em mxima, a Lei de Lambert-Beer , e com a concentrao dos aminocidos em mol/L podemos calcular a (absortividade Molar) para cada aminocido. Para converso das

concentraes foi preciso consultar a literatura, o Triptofano possui massa molar 204,225 g/mol

[VOET, 2006] , a Tirosina 181,19 g/mol [VOET , 2006] e a Leucina 131,16 g/mol [VOET , 2006]. Fazendo as devidas converses, temos as concentraes dos aminocidos como: 9,793*10^-4 mol/L para o triptofano; 1,104*10^-3 mol/L para a tirosina; 1,525*10^-3 mol/L para a Leucina. Com esses valores e substituindo na Lei de Lambert-Beer ( A = lc) podemos calcular a (absortividade Molar) para cada aminocido , sendo = 2132,135 L/mol.cm (triptofano) , = 1403,986 L/mol.cm (tirosina) e = 63,607L/mol.cm (Leucina). Foi procurado em diversas literaturas o valor de terico dos aminocidos usados na aula prtica e foi encontrado na mdia eletrnica que o do triptofano 3400 L/mol.cm e da tirosina 1400L/mol.cm . Valores prximos dos encontrados experimentalmente, sendo levado em conta que o estouro na leitura do triptofano tenha dado um valor de absorbncia um pouco abaixo do que realmente. A absortividade molar () da Leucina no foi encontrada em nenhuma literatura. A segunda parte da prtica do laboratrio foi encontrar a absorbncia em mximo (270nm) em
diferentes concentraes de triptofano. Os Resultados esto na Tabela 4. Tubos Triptofano (1mg/mL) gua destilada Concentrao (mg/mL) Branco 0 5,0mL 0 1 0,1mL 4,9mL 0,02 2 0,2mL 4,8mL 0,04 3 0,4mL 4,6mL 0,08 4 0,7mL 4,3mL 0,14 Tabela 4: Absorbncia do Triptofano (1mg/mL) em variadas concetraes. Absorbncia (270nm) 0 0,489 0,851 1,244 1,292

Com essas absorbncias conseguimos traar uma curva padro Absorbncia x Concentrao como observado no Grfico 3

Curva padro
1.6 1.4 1.2 Absorbncia 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0.05 0.1 0.15 Concentrao (mg/mL) Curva padro Linear (Curva padro) y = 6.2976x + 0.5282 R = 0.7852

Grfico 3: Curva padro com equao de reta do triptofano (1mg/mL) em variadas concentraes. Com esse grfico e a equao de reta podemos perceber que nosso experimento ficou longe do esperado. Primeiramente era esperado uma reta, com pontos alinhados , objetivo que no foi alcanado , alm do valor de b da equao da reta (y=ax+b) ter que ser um valor prximo de 0 , algo que no foi alcanado , tendo como valor experimental 0,5282. O valor de a da equao da reta , pode ser equiparado ao valor de (absortividade molar ) , porm no conseguimos comparar pois por mais que temos o valor experimental , no foi encontrado na literatura o valor nas devidas concentraes / absorbncias . Laboratrio 3 Na terceira aula prtica foram obtidas as absorbncias a um comprimento de onda ( 595nm) com
0,5mL da soluo padro BSA em vrias concentraes mostrados na tabela 5.

Tubo BSA (mg/mL)

Leitura de Absorbncia (595nm) gua 0,5 5 0 0 1 0,05 0,5 5 4,167*10^-3 0,205 2 0,1 0,5 5 8,333*10^-3 0,351 3 0,2 0,5 5 0,0167 0,574 4 0,4 0,5 5 0,033 0,859 Tabela 5:Leitura da Absorbncia (595nm) em variadas concentraes de soluo padro BSA. Com esses valores e com auxilio da mdia eletrnica (massa molar do BSA = 66,5kDa) conseguimos calcular a concentrao molar da soluo padro nos tubos de ensaio conforme visto na Tabela 6. Tubo Concentrao Molar (mol /L) 1 6,27*10^-08 2 1,25*10^-07 3 2,51*10^-07

gua Protena Padro (mL)

Reagente de Bradford (mL)

Concentrao (mg/mL)

4 4,96*10^-07 Tabela 6: Concentrao Molar nos tubos da pratica do laboratrio 3. Com os Valores da Tabela 6 (concentraes ) e da tabela 5 ( absorbncia ) conseguimos construir um grfico com uma equao da reta (y=ax+b) obtida pela regresso linear como visto no grfico 4.

curva padro
1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.00E+00 y = 1E+06x + 0.1533 R = 0.9793

Absorbncia

curva padro Linear (curva padro)

2.00E-07

4.00E-07

6.00E-07

Concentrao (mol/L)

Grfico 4: Curva padro com equao obtida por regresso linear da concentrao molar do BSA pela Absorbncia. A partir dos dados do grfico 4 podemos discutir que os dados obtidos no foram to precisos quanto esperados , era esperada uma reta (com os pontos da curva padro) mostrando uma proporcionalidade entre a absorbncia e a concentrao molar da soluo de BSA , mostrando que haver um erro relativo alto pois o valor de b na equao deveria ser o mais prximo de 0 e ele foi 0,1533. Em um segundo momento na prtica dilumos celulase em duas amostras sendo elas amostra 1 e 2(tubo A1 e A2 , respectivamente). Analisamo-las no espectrofotmetro para descobrir suas absorbncias conforme Tabela 7. Tubo Reagente Concentrao de Bradford Branco 0,5mL 5mL 0 A1 0,5mL 5mL ? A2 0,5mL 5mL ? Tabela 7: Absorbncia de amostras de concentraes desconhecidas. gua Amostra 1 Amostra 2 Absorbncia 595(nm) 0 0,875 0,594

Com a equao (imprecisa ou no) e os Valores da Tabela 7 conseguimos estabelecer os valores das concentraes desconhecidas substituindo os valores de y na Absorbncia obtida (tabela 7) e deixando x como incgnita. Resolvendo essa equao obtemos os valores das concentraes como : Amostra 1= 7,217*10^-07 mol/L;

Amostra 2=4,407*10^-07 mol/L. Em um Terceiro momento da aula prtica determinamos as relaes das absorbncias a 280 e 260 nm para a soluo diluda de BSA 400 mg / mL e para as amostras 1 e 2 em um espectrofotmetro sob luz ultra- violeta diferentemente dos outros momentos da prtica em que apenas foi usada a luz branca para obter a absorbncia. Os resultados esto presentes na tabela 8. Tubo 280 (nm) 260 (nm) A1 0,842 3,0 (estourou) A2 0,402 1,744 BSA 400 0,031 0,186 Tabela 8:Absorbncias de trs solues com diluies diferentes de protenas. Com uma frmula disponibilizada pela professora atravs do protocolo da aula prtica , conseguimos determinar a concentrao de protena dessas amostras pelo mtodo do ultra violeta . A frmula : Concentrao de protenas (mg/mL) = F.(1/d). Absorbncia a 280nm em que: F= (abs 280/260) ; d= espessura da cubeta (em centmetros). Na amostra 1 (A1) no possvel fazer o clculo pois no comprimento de onda 260 nm a leitura estourou (absorbncia =3) devido a concentrao da amostra 1 estar muito alta e o espectrofotmetro no conseguir ler. Na amostra 2 (A2) foi calculada uma concentrao de 9,26 mg/mL. E na soluo diluda de BSA 400 g/mL foi calculada uma concentrao de 0,516mg/mL. Com os valores obtidos possvel fazer uma tabela comparativa com os teores de protenas pelos diferentes mtodos mostrado na tabela 9. Mtodo grfico Mtodo do ultra violeta Amostra 1 0,0479 mg/mL Amostra 2 0,0293 mg/mL 0,0927mg/mL BSA 400 0,4mg/mL 5,167*10^-3mg/mL Tabela 9 :Quadro comparativo entre as concentraes obtidas pela leitura (luz branca ) e pela leitura (ultra-violeta) do espectrofotmetro. A partir dos resultados apresentados na tabela 9 podemos ter um comparativo das concentraes obtidas pelos dois mtodos e perceber que a concentrao de BSA 400 obteve um diferena muito grande devido a apenas o triptofano , tirosina e fenilalanina que absorverem radiao ultra-violeta sendo que a BSA composta marjoritariamente por albumina , as concentraes da Amostra 2 foram prximas, podendo discriminar que a amostra desconhecida possui uma boa parcela de triptofano , tirosina e fenilalanina. A amostra 1 no foi calculada pelo mtodo UV mas pode-se obter um valor estimado com uma simples regra de 3 (0,4mg/mL------5,167*10^-3mg/mL x--------0,0927mg/mL) . O valor de x (Concentrao estimada da amostra 1 pelo mtodo do ultra-violeta ) encontrado foi de 7,1763mg/mL , valor muito distante do encontrado pelo

mtodo grfico, como s uma estimativa no se pode dizer com certeza que devido a possuir mais ou menos aminocidos sensveis a absoro de ultra-violeta. Numa anlise de concentrao de protena de amostra tem que sempre usar um comprimento de onda definido para ter uma proporcionalidade nas absorbncias calculadas e assim , na hora de fazer o grfico das absorbncias x concentraes haver uma proporo nos pontos e conseguir fazer a regresso linear no grfico (como visto em quase todos os grficos desse relatrio). Determinar a concentrao pela anlise da luz branca do espectrofotmetro uma boa alternativa quando no se sabe a concentrao de protena na amostra mas para ter uma anlise mais verdadeira e com mais parmetros tambm possvel utilizar o espectrofotmetro na luz ultravioleta (no qual l mais que a luz branca, em um mesmo comprimento de onda).

5 Concluso
Aps esses trs laboratrios conseguimos primeiramente ver na prtica procedimentos vistos na matria de bioqumica que antes ficavam um pouco vagos no slide , ou no caderno. Conclumos tambm que a melhor forma de encontrar a concentrao de uma protena em uma amostra desconhecida lendo no espectrofotmetro em seu comprimento de onda mximo e que a absorbncia diretamente proporcional a concentrao , podendo ser calculada a concentrao pela equao de reta obtida do grfico da absorbncia x concentrao. O valor de b na equao de reta(y=ax+b) obtida (o ideal que fosse 0) so os possveis interferentes na nossa amostra e os erros na prtica , seja da mquina no calibrada ou da impreciso que os equipamentos. O valor de a da equao de reta pode ser equiparado ao valor da absortividade molar x Espessura da cubeta (caminho ptico) e uma vez que temos o valor da espessura da cubeta, fica fcil de calcular a absortividade molar. Se possuirmos a absortividade molar experimental e , dependendo do que estiver sendo calculado , uma absortividade molar terica, podemos calcular o erro experimental. Outra concluso que sempre precisamos ter pelo menos um parmetro para alegar se nosso resultado est coerente, seja calculando por outro mtodo ou com outra referncia. E que , para um resultado mais preciso tem que se definir um comprimento de onda para todas as variaes de concentraes.

REFERNCIAS 1 Manual de prtica de processos bioqumicos - Denise Celeste Godoy de Andrade Rodrigues e Telma Temteo dos Santos, agosto 2011. 2 http://chemkeys.com/br, consultado em 21 de maro de 2013. 3 VOGEL. Anlise Qumica Quantitativa. 5 Edio. Editora: LTC. Rio de Janeiro, RJ: 1992.