Modulo 006

MICROBIOLOGIA CLNICA PARA O CONTROLE DE INFECO RELACIONADA ASSISTNCIA SADE
Mdulo 6: Deteco e Identificao de Bactrias de Importncia Mdica
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria | Anvisa
AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA ANVISA
MICROBIOLOGIA CLNICA PARA O CONTROLE DE INFECO RELACIONADA ASSISTNCIA SADE Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica
Copyright 2013 Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Todos os direitos reservados. permitida a reproduo parcial ou total dessa obra, desde que citada a fonte e que no seja para venda ou qualquer fim comercial. A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens dessa obra da rea tcnica. A Anvisa, igualmente, no se responsabiliza pelas idias contidas nessa publicao. 1 edio 2010 Elaborao, distribuio e informaes: AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA SIA Trecho 5, rea Especial 57 CEP: 71205-050 Braslia DF Tel.: (61) 3462-6000 Home page: www.anvisa.gov.br Diretoria Dirceu Brs Aparecido Barbano Diretor-Presidente Jaime Cesar de Moura Oliveira Jos Agenor lvares da Silva Adjuntos de Diretor Luiz Roberto Klassmann Luciana Shimizu Takara Neilton Araujo de Oliveira Doriane Patricia Ferraz de Souza Gerncia Geral de Tecnologia em Servios de Sade GGTES Diana Carmem Almeida Nunes de Oliveira Gerncia de Vigilncia e Monitoramento em Servios de Sade GVIMS Magda Machado de Miranda Costa Coordenao Tcnica: Ana Clara Ribeiro Bello dos Santos Anvisa Carlos Emlio Levy Universidade de Campinas-SP Redao: Ana Carolina Ramos Moreno Universidade de So Paulo(USP)-SP Ana Luza de Mattos Guaraldi Universidade do Estado do Rio de Janeiro(UERJ)-RJ ngela Von Nowakonski Universidade de Campinas (UNICAMP)-SP Carla Taddei de Castro Neves Universidade de So Paulo(USP)-SP Carlos Emlio Levy Universidade de Campinas (UNICAMP)-SP Doroti de Oliveira Garcia Instituto Adolfo Lutz (IAL)-SP Elsa Masae Mamizuka Universidade de So Paulo(USP)-SP John Anthony McCulloch Universidade de So Paulo(USP)-SP Lycia M. Jenne Mimica Santa Casa de So Paulo-SP Marina Baquerizo Martinez Universidade de So Paulo(USP)-SP Tnia Mara Ibelli Vaz Instituto Adolfo Lutz (IAL)-SP Reviso tcnica Anvisa: Andr Anderson Carvalho Fabiana Cristina de Sousa Heiko Thereza Santana Magda Machado de Miranda Suzie Marie Gomes Cooperao tcnica: Termo de Cooperao n 64 Organizao Pan-Americana da Sade Organizao Mundial da Sade Representao Brasil Joaquin Molina Representante Enrique Vazquez Coordenador da Unidade Tcnica de Doenas Transmissveis e NoTransmissveis e Anlise de Situao de Sade Rogrio da Silva Lima Consultor Nacional da Unidade Tcnica de Doenas Transmissveis e NoTransmissveis e Anlise de Situao de Sade Projeto Grfico e Diagramao: All Type Assessoria Editorial Ltda Capa: Camila Contarato Burns Anvisa Ficha Catalogrfica Brasil. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia Sade. Mdulo 6 : Deteco e identificao de bactrias de importncia mdica /Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Braslia: Anvisa, 2013. 150p..: il.9 volumes ISBN 1. Infeco Relacionada Assistncia Sade Controle. 2. Infeco em Servios de Sade. 3. Microbiologia Clnica. 4. Vigilncia Sanitria em Servios de Sade. 5. Resistncia microbiana. I. Ttulo.
Sumrio
Captulo 1: Estafilococos, Estreptococos, Enterococos e outros. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1.1 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1.2 Identificao de estafilococos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 1.3 Identificao dos Staphylococcus aureus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 Captulo 2: Neisserias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.1 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.2 Isolamento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 2.3 Transporte e semeadura do material. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 2.4 Bacterioscopia e identificao. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 Captulo 3: Enterobactrias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 3.1 Introduo: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 3.2 Tipos de testes utilizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 3.3 Etapas da identificao de enterobactrias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3.4 Identificao das enterobactrias de importncia clnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 3.5 Identificao sorolgica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 Captulo 4: Bastonetes Gram-Negativos No Fermentadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 4.1 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 4.2 Semeadura, leitura e interpretao das provas de identificao utilizadas na triagem inicial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 4.3 Testes necessrios para a identificao bioqumica dos BNFs aps a triagem inicial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 4.4 Procedimentos para a identificao bioqumica dos BNFs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 Captulo 5: Bacilos Curvos ou Espiralados e outros Relacionados de Importncia Clnica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 5.1 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 5.2 Campylobacter. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 5.3 Vibrios, aeromonas e plesiomonas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 Captulo 6: Bacilos Gram Positivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 6.1 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 6.2 Orientao geral para a identificao de BGPs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 6.3 Corineformes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 6.4 Bacilos gram-positivos regulares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 6.6 Bacilos gram-positivos anaerbios que devem ser diferenciados. . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 6.7 Bacilos esporulados aerbios e anaerbios facultativos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
Captulo 7: Fastidiosos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 7.1 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 7.2 Bartonella . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 7.3 Bordetella sp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 7.4 Brucella sp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 7.5 Francisella tularensis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 7.6 Haemophilus sp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 7.7 Legionella sp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 7.8 Pasteurella sp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125 7.9 Actinobacillus sp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 7.10 Capnocytophaga sp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128 7.11 Eikenella sp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 7.12 Kingella sp.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 7.13 Cardiobacterium hominis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 7.14 Chromobacterium violaceum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131 7.15 Streptobacillus moniliformis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131 Captulo 8: Bactrias Anaerbias Estritas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 8.1 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 8.2 Coleta de material. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138 8.4 Processamento do material. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140 8.5 Identificao bacteriana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143 8.6 Provas de sensibilidade a antimicrobianos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica
Apresentao
A resistncia microbiana um grave problema mundial, estando associada ao aumento do tempo de internao, dos custos do tratamento e das taxas de morbidade e mortalidade dos pacientes. O uso indiscriminado e incorreto dos antimicrobianos na comunidade e no ambiente hospitalar reconhecidamente um importante fator de risco para o aparecimento e a disseminao da resistncia microbiana. Nesse contexto, insere-se o Laboratrio de Microbiologia, que tem como objetivo no apenas apontar o responsvel por um determinado estado infeccioso, mas tambm indicar, atravs do monitoramento de populaes microbianas, qual o perfil dos micro-organismos que esto interagindo com o organismo humano, possibilitando a indicao de tratamentos mais adequados. Para o desempenho satisfatrio dessa funo, fundamental que os laboratrios de microbiologia possuam estrutura capaz de estabelecer informaes sobre a melhor amostra biolgica, reconhecer a microbiota e os contaminantes, identificar micro-organismos associados infeco ou com propsitos epidemiolgicos, obter resultados rpidos em casos de emergncia, realizar o transporte rpido das amostras e manter uma educao contnua em relao aos aspectos da infeco relacionada assistncia sade. Tendo em vista esses aspectos e considerando que a microbiologia um campo muito dinmico, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa, em cooperao com a Organizao Pan-Americana da Sade OPAS, prope a terceira reviso do Manual de Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia Sade, buscando atualizar informaes nos temas considerados essenciais e contando com um seleto e conceituado corpo editorial. O manual composto por nove mdulos, a saber: Mdulo 1 Biossegurana e manuteno de equipamentos em laboratrio de microbiologia clnica; Mdulo 2 Controle externo da qualidade; Mdulo 3 Principais Sndromes Infecciosas; Mdulo 4 Procedimentos laboratoriais: da requisio do exame anlise microbiolgica e laudo final; Mdulo 5 Tecnologias em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos; Mdulo 6 Deteco e identificao de bactrias de importncia mdica; Mdulo 7 Deteco e identificao de micobactrias de importncia mdica; Mdulo 8 Deteco e identificao de fungos de importncia mdica e Mdulo 9 Infeces virais. A Anvisa e a OPAS esperam com essa publicao contribuir para que os laboratrios de microbiologia possam assimilar e alcanar novos nveis de complexidade laboratorial, atendendo s exigncias e caractersticas prprias de cada unidade hospitalar, alm de subsidiar a adoo de procedimentos bsicos padronizados nesses servios.
Captulo 1: Estafilococos, Estreptococos, Enterococos e outros

ngela Von Nowakonski Elsa Masae Mamizuka
1.1 Introduo
1.1.1
Staphylococcus aureus Os Estafilococos so cocos Gram-positivos no esporulados que mais resistem no meio ambiente. Podem sobreviver por meses em amostras clnicas secas, so relativamente resistentes ao calor e podem tolerar uma concentrao aumentada de sal. No entanto, apesar dos antimicrobianos existentes, da melhora das condies sanitrias e das medidas de controle de infeco relacionada assistncia sade, esse micro-organismo continua a ser um dos mais importantes patgenos para o homem. Indivduos sadios so colonizados intermitentemente por Staphylococcus aureus desde a amamentao, e podem albergar o micro-organismo na nasofaringe, ocasionalmente na pele e raramente na vagina. A partir desses stios, o S. aureus pode contaminar a pele e membranas mucosas do paciente, objetos inanimados ou outros pacientes por contato direto ou por aerossol, ocasionando infeces letais por conta dos fatores de virulncia ou atravs de resistncia aos antimicrobianos atualmente utilizados. J foram descritos no Brasil casos de infeces causadas por Staphylococcus aureus com sensibilidade reduzida aos antibiticos mais potentes como a Vancomicina, e relatos da capacidade que os Staphylococcus coagulase negativa tm de desenvolver resistncia. Recentemente tem sido relatada a emergncia de Staphylococcus aureus associado a infeces na comunidade com resistncia a oxacilina, (ORSA-AC), porm sensvel maioria das classes de antibiticos, exceto a beta-lactmicos, representados por penicilinas e cefalosporinas, contrapondo ao ORSA hospitalar que multirresistente. Tal emergncia vem preocupando, pois essas linhagens so conhecidas por apresentarem fatores de virulncia como a citotoxina, denominada leucocidina de Panton Valentine, associados principalmente a leses de pele e mucosas e s pneumo-
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nias necrotizantes graves. Esse tipo de pneumonia caracteriza-se por quadros clnicos graves com infiltrado alveolar multilobar, diferente de pneumonias hospitalares que evoluem para empiema. A mortalidade muito mais elevada nos casos de pneumonia necrotizante e o achado de acometimento bilateral do parnquima, associado hemorragia necrotizante comum nesses casos. Alguns autores tm notado uma substituio das linhagens hospitalares tradicionais por essa linhagem ORSA-AC. A emergncia de ORSA-AC foi observada em vrios pases por mtodos moleculares que possibilitou a identificao do ORSA-AC, por meio da caracterizao do gene mecA, como cassete cromossmico tipo IV ou SCCmec tipo IV, devido ao seu baixo peso molecular com taxa de replicao mais rpida, conferindo vantagens de disseminao dessas linhagens. Recente estudo realizado em nosso meio mostrou que os fatores de risco relacionados com a aquisio de ORSA-AC foram crianas menores de um ano, menor nmero de doenas de base e menor frequncia de uso de antibiticos e realizao de procedimentos cirrgicos (Marques 2007). 1.1.2 Estafilococos coagulase negativos Os estafilococos coagulase-negativa (ECN) so habitantes normais da pele e membranas mucosas de humanos e geralmente possuem um relacionamento benigno ou simbitico com seu hospedeiro. No entanto, adquirem potencial patognico se tiverem acesso ao tecido do hospedeiro atravs de trauma da barreira cutnea, inoculao por agulhas ou implante de materiais mdicos (prteses, cateteres, vlvulas cardacas, marcapassos, etc.) (HEIKENS, 2005). Um dos maiores problemas enfrentados pelo laboratrio de microbiologia clnica e pelos mdicos envolvendo os ECN est na dificuldade em distinguir isolados significantes (patognicos) de isolados contaminantes, j que o principal contaminante dos frascos de hemocultura tambm o principal patgeno em infeces envolvendo cateter e outros materiais mdicos implantados (EIFF, 1998). Vrios critrios tm sido utilizados na tentativa de diferenciar bacteremia clnicamente significativa causada por ECN e contaminao de hemoculturas. Esses critrios incluem, entre outros, combinaes de achados clnicos, fonte da amostra de sangue (amostras de sangue perifrico x amostras obtidas de cateter), e, principalmente, o nmero de culturas positivas. No entanto, investigaes recentes utilizando tcnicas de tipagem molecular revelaram que 33% de aparentes infeces da corrente circulatria causadas por ECN diagnosticadas tendo como base o nmero de hemoculturas positivas revelaram isolados no relacionados (OUD, 1999). Outra alternativa utilizada para avaliar a importncia clnica dos ECN a identificao das espcies desses isolados, a qual deve ser rpida e confivel a fim de predizer o mais precocemente possvel o potencial patognico e a sensibilidade aos antimi8
crobianos de cada isolado e esclarecer o significado clnico de cada espcie (COUTO, 2001). No entanto, essa identificao continua problemtica para os laboratrios de microbiologia clnica pela necessidade de uma grande variedade de provas bioqumicas, as quais muitas vezes fornecem resultados no confiveis para os ECN (CARRETO, 2005). 1.1.3 Estreptococos e Enterococos Os estreptococos foram os maiores causadores de infeco relacionada assistncia sade na era pr-antibitica, causando surtos de infeco e morte de purperas. Apesar de no serem atualmente uma importante causa de infeco relacionada assistncia sade, provocam, no entanto, doenas muito graves e muitas vezes letais, mesmo em pacientes imunocompetentes, sendo importante o rpido diagnstico desse agente. J os enterococos apresentam importncia crescente como causadores de infeco relacionada assistncia sade, pelo aparecimento de resistncia quase total aos antibiticos tradicionalmente utilizados para tratamento dessas infeces. Os Enterococos mais comumente isolados so: Enterococcus faecalis (90% dos casos) e Enterococcus faecium, com grande capacidade de colonizao de pacientes e de contaminarem superfcies ou equipamentos utilizados em hospitais. Possuem sensibilidade ou resistncia varivel aos antibiticos chamados glicopeptdios como a vancomicina e teicoplanina. O emprego de muitos antibiticos ou classes de antibiticos tem sido associado infeco ou colonizao por enterococos resistentes a vancomicina ERV em estudos clnicos, incluindo cefalosporinas de espectro ampliado e agentes com potente atividade contra bactrias anaerbias. Enterococcus resistentes vancomicina (ERV) so um problema global e tm sido isolados com alta frequncia nos hospitais brasileiros. A maioria dos ERV so E. faecium fentipo VanA (EVRFM), porm existe um clone especfico de E. faecalis fentipo VanA (EVRFS) que tem se disseminado rapidamente em vrios hospitais do pas. Fatores de virulncia de E. faecalis e E. faecium que influenciam na relao parasita/hospedeiro tm sido descritos. Existem, atualmente, cepas comensais naturalmente resistentes a vancomicina e que podem ser isoladas de pacientes internados, porm excepcionalmente capazes de causar surtos, mas que devem ser corretamente identificadas. 1.1.4 Identificao preliminar A identificao dos estreptococos e estafilococos baseada na morfologia que apresentam em meios lquidos, sendo o estreptococo uma cadeia normalmente longa e os estafilococos mostrando-se em forma de cocos aos pares, em cachos de uva ou agrupados.
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A identificao presuntiva comea com a inoculao primria na placa de gar sangue de carneiro que deve ser incubada em 5% de tenso de CO2 (mtodo da vela ou estufa de CO2). As colnias de estafilococos so geralmente maiores, convexas, de colorao variando do branco-porcelana a amarelo podendo apresentar hemlise ou no. Note-se que o desenvolvimento da cor amarelada no S.aureus ocorre somente aps incubao prolongada (72 horas), temperatura ambiente. As colnias de estreptococos tendem a ser menores (puntiformes), e com halos de hemlise total ou parcial (beta e alfa hemlise). A diferenciao entre os estreptococos e os estafilococos se d, seguramente, pela prova da catalase. A) Prova da catalase Com a ala bacteriolgica ou com um palito coleta-se o centro de uma colnia suspeita e esfrega-se em uma lamina de vidro. Colocar sobre esse esfregao uma gota de gua oxigenada a 3% e observar a formao de bolhas. Para a famlia Staphylococcaceae (estafilococos) a prova geralmente positiva, enquanto que para a famlia Streptococcaceae (estreptococos) negativa.
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Esquema simplificado para identificao das espcies do gnero Staphylococcus spp. (Adaptado de Terasawa 2006)
+ S.aureus +Trealose maltose Coagulase xylose e/ou - arabinose - S.schleiferi subsp. coagulans
+ S.caprae sacarose + uria - S.shleiferi subsp. urealyticum
+, S. xylosus
+ trealose + maltose S. simulans hemlise + ornitina uria S.lugdunensis Crescimento anaerbio em thioglicolato + manitol + uria maltose
S. simulans
nitrato
+ S.capitis +manitol - uria
+ S.cohnii subsp. urealyticum
- S.cohnii subsp. cohnii
+ S.epidermidis Crescimento - anaerbio em thioglicolato - resistncia novobiocina S.hominis subs. hominis + S.hominis subs. novobiosepticus
+ resistncia novobiocina S.warneri
S. haemolyticus
+ S.saprophyticus
+ S.saprophyticus S.hominis subsp. hominis resistncia novobiocina - S.warneri + S.warneri S.haemolyticus
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1.1.5
Diviso dos cocos Gram-positivos pela prova da catalase

Catalase positivos Catalase negativos Enterococcus spp. Streptococcus spp. Aerococcus spp. Gemella spp., Leuconostoc spp. Stomatococcus spp.
Staphylococcus spp. Micrococcus spp. Planococcus spp. Stomatococcus spp. Lactococcus spp.
Ao coletar a colnia, no carregar meio de cultura (gar sangue), que pode acarretar resultados falso-positivos porque o sangue do meio contm catalase. Algumas cepas de enterococos podem dar falsa reao positiva (fazer Gram e ver disposio em cadeias curtas ou aos pares).
Identificao simplificada dos cocos Gram-positivos de importncia clnica Gnero Staphylococcus Planococcus Micrococcus Enterococcus Streptococcus Aerococcus Stomatococcus Kocuria * aderente ao meio Cocos Gram-positivos, Catalase negativa, Motilidade Negativa 1 Gnero Enterococcus Streptococcus Aerococcus Leuconostoc Pediococcus Gemella Rothia mucilaginosa
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Catalase + + + neg neg neg varivel +
Motilidade neg + neg varivel neg neg neg neg
NaCl 5% + + + + varivel + neg +
Oxidase neg neg + neg neg neg neg +
Aerbio estrito no + varivel no no no no varivel
Ttrade varivel varivel varivel no no + varivel +
NaCl 5% + neg + varivel varivel neg neg
Vancomicina varivel sensvel sensvel resistente resistente sensvel sensvel + neg2
PYR +
Bile Esculina
Ttrade no no varivel no varivel no varivel
neg3 varivel varivel + neg +
varivel neg neg + +
1 E. casseliflavus e E. gallinarum so positivos 2 S. pyogenes positivo 3 alguns S. viridans podem ser positivos 4 catalase fracamente positiva
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1.2 Identificao de estafilococos

Os Staphylococcus pertencem famlia Staphylococcaceae. O gnero Staphylococcus apresenta 32 espcies, 14 subespcies, sendo que somente 15 espcies so encontradas em amostras humanas, e, de uma maneira prtica, os estafilococos so divididos em duas categorias: coagulase positivos e coagulase negativos de acordo com a resposta ao teste da plasmo coagulase. O teste mais importante na identificao da famlia Staphylococcaceae a prova da catalase, mas tambem compartilhada por gneros de cocos Gram-positivos relacionados: Micrococcus, Planococcus, Alloiococcus (catalase varivel), Rothia mucilaginosa (catalase variavel) e Kocuria cristinae, pouco isolados e de pouca importncia clnica, mas que podem ser diferenciados dos Staphylococcus pelo teste da bacitracina com disco de 0,04 UI: Micrococcus=sensvel e Staphylococcus=resistente. 1.2.1
Staphylococcus Macrococcus Planococcus Alloiococcus Rothia mucilaginosa Micrococcus Kocuria kristinae
Provas diferenciais dos Gneros Catalase positivos ou variveis

Motilidade Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo NaCl 6,5% Positivo Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo Oxidase Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Positivo Positivo Catalase Positivo Positivo Positivo Varivel Varivel Positivo Positivo
Gnero
* OBs. Apenas S. aureus subsp. anaerobius e S. saccharolyticus so catalase negativos, os demais so positivos Identificao das espcies de Staphylococcus de maior importncia clnica
Espcie S. aureus S. epidermidis S. lugdunensis S. haemolyticus S. saprophyticus S. schleiferi S. intermedius S. hyicus S. hominis S. capitis S. cohnii
DNAse + neg neg neg neg neg + + neg neg neg neg neg + + neg + + neg neg neg neg
PYR
Novobiocina sensvel sensvel sensvel sensvel resistente sensvel sensvel sensvel sensvel sensvel sensvel +
Ureia varivel varivel neg + neg + varivel + neg neg
Polimixina resistente resistente varivel sensvel sensvel sensvel sensvel resistente varivel neg neg
Outras pig.amarelo Ornitina + Ornitina neg isolado em urina Sacarose neg
Obs. Veja esquema completo em Iorio et al 2007
13
Existem cerca de 31 espcies de Staphylococcus coagulase negativa conhecidas, das quais as mais frequentes so:
Staphylococcus epidermidis causador de infeces de cateteres e prteses e o mais frequente micro-organismo encontrado em hemoculturas. Staphylococcus saprophyticus causador de infeco urinria em mulheres jovens. Staphylococcus haemolyticus importante devido resistncia aumentada aos antimicrobianos, e por ser comumente confundido com o S. aureus, pois apresenta hemlise na placa de gar sangue de carneiro.
1.2.2
Teste da resistncia a novobiocina A cepa semeada de maneira semelhante ao antibiograma em placa de Muller Hinton acrescida de um disco teste de novobiocina contendo 5 g. As amostras resistentes mostram zonas de inibio de 6 a 12 mm, enquanto as susceptveis apresentam halos de 16 mm ou mais. As cepas de Staphylococcus saprophyticus so resistentes. Testes da Trealose, Urease e Novobiocina
Trealose Negativo Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo Urease Novobiocina Sensvel Sensvel Resistente
1.2.3
S. epidermidis S. haemolyticus S. saprophyticus
Espcies
1.3 Identificao dos Staphylococcus aureus

A forma mais simples de identificar o Staphylococcus aureus a prova da coagulase que pode ser efetuada em tubo ou em lamina. 1.3.1 Teste da coagulase em lmina A maioria das cepas de Staphylococcus aureus possui a coagulase ligada (ou fator aglutinante) clumping factor na superfcie da parede celular, que reage com o fibrinognio do plasma causando a coagulao do mesmo.

Colocar 2 gotas de salina em uma lmina. Emulsionar uma colnia isolada a ser testada. Colocar uma gota de plasma e misturar com um palito de plstico ou de madeira. Observar se h aglutinao em 10 segundos.
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No se pode executar esse teste a partir de um gar com grande concentrao de sal como gar manitol. 1.3.2 Teste da coagulase em tubo Esse teste baseia-se na presena da coagulase livre que reage com um fator plasmtico formando um complexo que atua sobre o fibrinognio formando a fibrina. O teste melhor efetuado se: Adicionar 0,1 mL de caldo BHI, incubado por uma noite, com colnia suspeita a um tubo de ensaio com 0,5 mL de plasma. Incubar por 4 horas 35C em estufa ou banho maria. A formao do cogulo observada pela inclinao suave do tubo de ensaio a 90 graus da vertical. Um mtodo alternativo a emulsificao dessa mesma colnia suspeita em um 0,5 plasma e incubado da mesma forma. Qualquer cogulo indica uma prova positiva, porm no confundir com precipitados ou floculao. O melhor plasma a ser usado o de coelho com EDTA, no devendo ser usado o plasma humano vindo do banco de sangue.
1.3.3
Teste da DNAse Esse teste consiste na inoculao de colnias em meio contendo DNA, (DNAse test gar) obtido comercialmente.
Adicionar ao meio original azul de ortotoluidina na concentrao de 0,1%. o meio adquire uma colorao azul intensa. Incubar a 35C por 24 horas. Uma colorao rsea caracterstica ao redor das colnias produtoras de DNAse indica a positividade da prova.
O meio adicionado com corante demonstra uma melhor facilidade na leitura, e permite o repique da amostra positiva para o teste de sensibilidade aos antimicrobianos, evitando que se retorne placa original onde nem sempre as colnias esto bem isoladas. 1.3.4 Teste da endonuclease Teste da endonuclease termoestvel efetuado no mesmo meio de DNA. Ferver o caldo de cultura com a bactria suspeita por 15 minutos. Fazer pequenos orifcios no meio (em placa) utilizando canudos de refrigerante. Colocar ao meio de DNA gotas de caldo de cultura turvo com a colnia suspeita. A leitura do teste semelhante ao da DNAse.
15
Note que esse mtodo pode ser efetuado a partir de caldo de hemocultura em que foi observado o crescimento de cocos Gram-positivos agrupados. 1.3.5 Outras provas que diferenciam o Staphylococcus aureus Aglutinao em ltex ou em hemcias de carneiro (sorologia). Esses testes geralmente detectam a coagulase livre e alguns apresentam tambm uma imunoglobulina antiprotena A presente da parede do Staphylococcus aureus. Como so disponveis comercialmente, deve-se seguir as instrues do fabricante. Teste do crescimento em gar manitol O Staphylococcus aureus tem a capacidade de fermentar o manitol em meio contendo 7,5 % de cloreto de sdio, denominado gar manitol salgado ou Meio de Chapman. O indicador de pH o vermelho de fenol, que indica uma reao positiva quando o meio ao redor das colnias se torna amarelo, e negativa quando permanece avermelhado. Identificao de outros gneros A diferenciao entre Micrococcus sp. e os Staphylococcus sp. se d pela colorao de Gram, em que os Micrococcus aparecem em ttrades, ou pela pigmentao de suas colnias (amarelas, rseas ou alaranjadas). Alguns no apresentam pigmentos e podem ser diferenciados pela sensibilidade a Bacitracina 0,004 UI, a mesma utilizada na identificao de Streptococcus pyogenes, mas utilizando-se a inoculao em gar Mueller Hinton. Identificao dos estreptococos Os estreptococos podem ser diferenciados de acordo com sua aparncia na placa de gar sangue aps incubao a 35C em presena de 5% de CO2, podendo apresentar: hemlise total (beta), parcial (alfa, de cor esverdeada) ou nenhuma (gama). A identificao de espcie de estreptococos beta hemolticos feita atravs de aglutinao com soros especficos contra os antgenos de Lancefield (A, B, C, D, F e G), que constitui uma prova rpida, porm no acessvel a todos os laboratrios em virtude do elevado custo. 1.3.9 Teste da bacitracina importante notar que as identificaes devem ser feitas em gar sangue sem tenso de CO2 ou os resultados podem ser conflitantes. Semear meia placa de gar sangue com o estreptococo a ser identificado, como para um antibiograma. Colocar o disco de bacitracina 0,004 UI como indicado.
1.3.6
1.3.7
1.3.8
16
Incubar por uma noite a 35C sem CO2. Observar qualquer zona de inibio como resultado de sensibilidade. O Streptococcus pyogenes (grupo A) assim rapidamente identificado.
1.3.10 Teste do Sulfametoxazol Trimetoprim (SXT) Adicionar na mesma placa de gar sangue o disco de SXT. Incubar por uma noite a 35C sem CO2. A sensibilidade a essa droga significa, em conjunto com as outras leituras, que o estreptococo no pertence ao grupo A, B ou D de Lancefield. Colocar um disco de Bacitracina 0,004 UI direita e um de Sulfametoxazol-trimetoprim esquerda. Havendo necessidade, pode ser feito o teste de CAMP na mesma placa, conforme desenho abaixo. A) Teste de CAMP (NA MESMA PLACA) Inocular uma estria nica de uma amostra de Staphylococcus aureus produtor de beta lisina (ATCC 25923) no centro de uma placa de gar sangue preparada obrigatoriamente com sangue de carneiro. (Essa linhagem de S. aureus deve ser mantida continuadamente em estoque). Inocular as amostras a serem testadas em estrias formando um ngulo reto com a linha de inoculao da amostra teste de estafilococo. As estrias no devem se tocar, ficando a 1 mm de distncia, e desse modo vrias amostras podem ser testadas em uma mesma placa de gar sangue. A maneira de inocular fundamental para a observao do efeito esperado. Incubar a placa a 35-37C durante um perodo de 18-24 horas. A positividade da prova, Streptococcus agalactiae (grupo B), evidenciada pelo alargamento da zona de lise, que adquire a forma de ponta de flecha caracterstica, na rea de interseco entre as duas estrias. Se o teste de CAMP no resultar em uma flecha, mas numa figura semelhante a uma cabea de fsforo, refazer o teste de catalase e em caso positivo verificar as provas para identificao de Listeria sp. B) Teste do PYR Esse teste determina a atividade do PYR tambm chamado pyrrolidonyl-aminopeptidase, uma enzima produzida pelo Streptococcus pyogenes e tambm pelo Enterococcus sp. Utilizar somente colnias puras para o teste, pois podem surgir resultados errneos. Seguir as instrues do fabricante, uma vez que se encontra disponvel comercialmente. Esse teste tecnicamente equivalente prova da hidrlise da bile esculina e crescimento em 6,5% de NaCl, usados na identificao clssica
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dos enterococos, e mais especfico que o teste da Bacitracina na caracterizao presuntiva dos estreptococos beta hemolticos do grupo A, tendo a vantagem de ser mais rpido. Em qualquer dos dois casos, o PYR constitui uma alternativa importante para esclarecer testes duvidosos. Na impossibilidade da realizao de testes sorolgicos de confirmao, reforar o valor dos testes presuntivos clssicos de identificao do Streptococcus pyogenes.
C) Teste da bile esculina e do NACL 6,5% Semear as provas de Bile Esculina e do caldo de NaCl a 6,5%. Incubar da mesma forma. Teste da bile esculina positiva apresenta cor marrom escuro e o do caldo de NaCl a 6,5 % deve mostrar turvao para ser considerado positivo.
1- Disco de bacitracina 2- Disco de sulfametoxazol trimetoprim 3- Camp Test Linhas verticais cepas teste Linha horizontal estria com cepa beta hemol Staphylococcus aureus (ATCC 25923)
Todos os estreptococos do grupo D de Lancefield apresentam a bile esculina positiva, seja Enterococcus sp. ou Streptococcus do grupo D no enterococo (Streptococcus bovis). Quanto ao teste da tolerncia ao NaCl a 6,5%, somente os enterococos so positivos.
1.3.11 Teste da hidrlise do hipurato Os Streptococcus agalactiae (grupo B) so tambm capazes de hidrolisar o hipurato em seus componentes: glicina e cido benzico.
Identificao de estreptococos beta hemolticos dos grupos A, B e D Espcies S. pyogenes S. agalactiae Enterococcus sp. Estreptococo No A, B ou D. Sensibilidade Bacitracina sensvel resistente resistente resistente CAMP teste. Hidrlise do Hipurato negativo positivos negativo negativo SXT negativo (R) negativo (R) negativo (R) positivos (S) Bile esculina. Tolerncia NaCl 6,5% negativo negativo positivos negativo
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1.3.12 Identificao dos estreptococos no beta hemolticos Somente os estreptococos do grupo B (Streptococcus agalactiae) e os do grupo D Enterococcus spp. e Streptococcus bovis podem no apresentar nenhuma hemlise, a denominada gama hemlise. 1.3.13 Identificao de estreptococos gama hemolticos ou sem hemlise A) Identificao CAMP/Hidrlise de hipurato Bile Esculina Tolerncia a NaCl 6,5% Streptococcus agalactiae positivo negativo negativo Enterococo negativo positivo positivo S. bovis negativo positivo negativo 1.3.14 Identificao dos estreptococos alfa hemolticos A identificao desse grupo no deve ser feita por mtodos sorolgicos, pois a maioria no possui os antgenos de Lancefield.
Identificao dos estreptococos alfa hemolticos Identificao Pneumococo Enterococos Grupo viridans Streptococcus Optoquina e Bile solubilidade positivo negativo negativo negativo Bile esculina negativo negativo negativo positivo Tolerncia 6,5% a NaCl negativo positivo negativo negativo
1.3.15 Teste da optoquina Semear um quarto de uma placa de gar sangue com a cepa alfa hemoltica a ser testada. Aplicar um disco de optoquina. Incubar a 35oC em tenso aumentada de CO2 mtodo da vela. Uma zona de inibio de 14 mm ou mais volta de um disco de 6 mm significa sensibilidade e identifica o Streptococcus pneumoniae. 1.3.16 Teste da bile solubilidade O teste da bile solubilidade tambm identifica o Streptococcus pneumoniae. Pode ser executado em placa ou em caldo. B) Caldo: Tomar um caldo turvo aps 3 horas de incubao a 35C. Inocular uma suspenso de desoxicolato a 10%. Clareamento da turbidez reflete a lise bacteriana e confere um resultado positivo prova.
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C) Placa: Inocular gotas de desoxicolato de sdio a 2% sobre as colnias suspeitas. Incubar a 35C por 30 minutos. As colnias positivas iro desaparecer por lise bacteriana. Suspeitar da presena de variante nutricional de Streptococcus desses micro-organismos quando o Gram de amostras positivas de hemocultura obtidas em meios comerciais mostram cocos em cadeias que no crescem no subcultivo em gar sangue, ento deve-se proceder dessa forma: Semear o repique em gar sangue. Fazer estrias perpendiculares ao sentido da semeadura com Staphylococcus aureus, como para a identificao presuntiva de Haemophilus influenzae. Incubar a 35C em atmosfera com CO2.
Identificao dos enterococos mais importantes clnicamente Espcie E. faecalis E. faecium E. casseliflavus E. gallinarum Arabinose negativo positivo positivo positivo Sorbitol positivo varivel varivel negativo Crescimento Telurito 0,04% positivo negativo negativo negativo Motilidade negativo negativo positivo positivo Pigmento negativo negativo positivo negativo Vancomicina varivel varivel resistente resistente
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Referncias Bibliogrficas
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Captulo 2: Neisserias
Ana Carolina Ramos Moreno Carlos Emlio Levy Marina Baquerizo Martinez
2.1 Introduo
O gnero Neisseria formado por bactrias aerbias, imveis e no esporuladas. As neisserias so diplococos Gram-negativos, cuja caracterstica peculiar a unio de seus lados adjacentes. Na rotina do laboratrio clnico, costuma-se comparar essa morfologia a dois gros de feijo ou rins unidos . Apenas a espcie N. elongata difere dessa morfologia, sendo diplobacilos ou diplococo-bacilo. A maioria das espcies de Neisseria pode habitar as mucosas de animais e seres humanos de forma comensal. O crescimento timo se d em ambientes midos com temperatura entre 35 a 37C (temperatura do corpo humano). Todas as Neisserias so micro-organismos fastidiosos, oxidase positiva e a maioria so catalase positiva (com exceo de Neisseria elongata e Kingella denitrificans). Elas utilizam os carboidratos por via oxidativa, com pouca produo de cido. O meio de cultura mais utilizado para verificar a oxidao dos carboidratos o Cistyne Tripticase gar (CTA), com o indicador de pH vermelho de fenol. Para evitar reaes duvidosas na hora da identificao de Neisseria, recomenda-se utilizar uma grande quantidade de inculo para que, assim, haja uma maior produo de cidos. As diferentes espcies de Neisseria, incluindo N. meningitidis e N. gonorrhoeae, so analisadas junto com as espcies Moraxella catarrhalis, Moraxella spp. e Kingella spp. por suas caractersticas morfolgicas, cocos ou cocides Gram-negativos, e pela possibilidade de haver confuso durante a identificao. Embora as doenas causadas por N. meningitidis e N. gonorrhoeae sejam as mais conhecidas, as outras espcies de Neisseria podem causar doenas em pessoas com a imunidade comprometida.
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2.1.1
Bactria
Diagnstico diferencial entre Neisserias e outros cocobacilos Gramnegativos

CTA Gli DNAse Morfol OF Gli MOT neg neg neg CAT OXI AS + neg +
Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Neisseria spp.
diplococo diplococo diplococo/ bacilo diplococo
+ + +
+ + varivel
no cresce no cresce varivel (oxidativo) inerte
+ + varivel
neg neg neg
Moraxella + + neg + + neg catarrhalis Kingella spp. cocobacilo + neg fermentador + neg + varivel Moraxella spp. cocobacilo + + inerte neg neg + neg OXI = oxidase CAT=catalase AS = crescimento em OFGli=OF Glicose CTAGli= utilizao da glicose em gar Sangue base gar cistina tripticase MOT = motilidade
Caractersticas de algumas espcies de importncia clnica 2.1.2
Neisseria gonorrhoeae O ser humano o hospedeiro natural de Neisseria gonorrhoeae e a doena causada por esse micro-organismo denomina-se gonorria. A gonorria, considerada uma doena sexualmente transmissvel, transmitida entre os seres humanos atravs do contato ntimo das mucosas. N. gonorrhoeae pode infectar a uretra, a vagina e o nus e pode se propagar para as articulaes. As mulheres so as principais portadoras assintomticas; no homem encontra-se apenas uma taxa de 1 a 5% de portadores. N. gonorrhoeae sempre considerada patognica, o que indica a necessidade de tratamento. A transmisso para o recm-nascido pode ocorrer durante o parto. No homem, N. gonorrhoeae causa uretrite e est relacionada a complicaes como epididimite, prostatite e estenose uretral. O perodo de incubao da bactria pode ser de um a sete dias. Na mulher, esse micro-organismo causa corrimento vaginal, endocervicite, uretrite, abscesso vestibular, salpingooforite e doena inflamatria plvica. A mudana do microambiente vaginal inibe o crescimento de bactrias produtoras de cido, como Lactobacillus, que fazem parte da microbiota feminina. O pH vaginal torna-se menos cido e uma variedade de organismos , ento, capaz de proliferar, o que acarreta infeces secundrias. N. gonorrhoeae pode ser isolada tambm na mucosa oral e anal. Em recm-nascidos pode causar uma conjuntivite denominada oftalmia neonatorum. A doena sistmica disseminada pode ocorrer em 1 a 3% dos pacientes infectados, principalmente em assintomticos, e caracterizada por febre, tremores, leses cutneas e artrite de extremidades. As leses cutneas so do tipo mculo-pustulares ou hemorrgicas, com centro de necrose. Ocorre artrite sptica, com 50% de positividade de isolamento. Pode ocorrer meningite e endocardite.
24
2.1.3
Neisseria meningitidis N. meningitidis o agente etiolgico da enfermidade meningoccica, mais comumente chamada de bacteremia e meningite meningoccica. Essas duas sndromes clnicas podem aparecer simultaneamente, entretanto, a presena apenas da meningite mais frequente. N. meningitidis tambm pode causar infeco sistmica grave, com coagulao intravascular disseminada (CIVD) e elevada mortalidade, conjuntivite, artrite sptica, pericardite purulenta, sinusite, otite e pneumonia. Esse micro-organismo pode ser isolado das mucosas de 5 a 15% de indivduos sos por perodos de semanas a meses. A transmisso se faz por vias areas (aerossis) ou contato com secrees respiratrias de portadores assintomticos.
A meningite um processo infeccioso que acomete as meninges, sendo que nessa entidade clnica esto comprometidas a piamater, aracnide e espao subaracnideo. Esse espao contnuo e o lquor que nele circula envolve a convexidade cerebral, preenche as cisternas, passa pela emergncia dos nervos cranianos e pela medula espinal. Logo, um agente infeccioso que atinge esse compartimento, espalha-se rapidamente por todo o Sistema Nervoso Central (SCN). N. meningitidis uma bactria encapsulada, sendo esse um importante fator de virulncia. Os meningococos so tradicionalmente classificados pelo sistema de tipagem sorolgica baseada na diferena da estrutura da cpsula (sorogrupo), protenas de membrana externa e lipooligossacardeo. De acordo, com a classificao baseada nos antgenos capsulares, existem 12 sorogrupos conhecidos: A, B, C, 29-E, H, I, K, L, W-135, X, Y, Z. So conhecidos 20 sorotipos (antgenos Protena de Membrana Externa (OMP) classe 2/3) e 10 subtipos (antgenos OMP classe 1).
2.1.4
Moraxella (Branhamella catarrhalis) M. catarrhalis est frequentemente associada a infeces do trato respiratrio e ocorre principalmente em crianas e adultos jovens. Esse micro-organismo pode causar otite mdia, sinusite, bronquite e pneumonia. Mais raramente pode causar endocardite, meningite ou infeces sistmicas. Em idosos, aps o Haemophylus influenzae e pneumococo, M. catarrhalis constitui a terceira causa de pneumonia em pacientes com doena pulmonar obstrutiva crnica. M. catarrhalis raramente isolada em indivduos assintomticos. Cerca de 80% das cepas so produtoras de beta-lactamase e so detectadas atravs do teste do Nitrocefin (cefalosporina cromognica). Os agentes antimicrobianos geralmente utilizados no tratamento de M. catarrhalis so amoxicilina-cido clavulnico, trimetoprim-sulfametoxazol, cefalosporinas orais,
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macroldeos, tetraciclinas e fluoroquinolonas. Outras espcies de Neisseria raramente so isoladas em casos de endocardite.
2.2 Isolamento
2.2.1
Neisseria gonorrhoeae Para o diagnstico de N. gonorrhoeae, o stio apropriado para a coleta do material clnico depende da idade, sexo e prticas sexuais do indivduo, alm dos sintomas clnicos da infeco. O instrumento que ser utilizado para fazer a coleta pode ser lubrificado apenas com gua morna. Outros tipos de lubrificantes podem ser txicos para a bactria. O material pode ser coletado com swab ou ala bacteriolgica, o que depende do material. Sempre que possvel coletar o material em swabs separados, um para cultura e outro para bacterioscopia.
A) Tipos de materiais clnicos: Uretral Endocervical (sexualmente ativas/vaginal em meninas) Retal (colher secreo mucosa e no fezes, utilizando meio seletivo tipo Thayer Martin) Orofaringe Conjuntiva Glndula de Bartholin Trompas Endomtrio Lquido sinovial Leses de pele Sangue B) Recomenda-se: Utilizar swab com algodo atxico ou swab de Rayon ou Dacron. Semear o material clnico nos meios slidos o mais rpido possvel. Sempre utilizar as placas previamente aquecidas em estufa. Urina pode ser utilizada aps centrifugao rpida e semeadura do sedimento. Utilizar meio seletivo no caso de materiais clnicos no estreis, para aumentar a probabilidade de isolamento do patgeno. Usar frascos de hemocultura sem o anticoagulante SPS, que inibidor para as N. gonorrhoeae (Ex: Caldo BHI com 1% de gelatina) ou fazer repiques cegos em 24 horas de incubao no caso de hemoculturas automatizadas.
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Em leses de pele, preferir a bipsia ao swab. Incubar em cmara mida em atmosfera de CO2 a 5% ou em jarra de vela. Sempre realizar bacterioscopia pelo Gram. A temperatura de incubao crtica, no deve ultrapassar os 37C.
2.2.2
Neisseria meningitidis O meningococo isolado mais prontamente quando o material clnico obtido antes do incio da antibioticoterapia e quando rapidamente transportado ao laboratrio, protegido de ambientes secos e temperaturas extremas, especialmente frias. O stio apropriado para a coleta do material clnico depende do indivduo e dos sintomas clnicos da infeco. Sempre que possvel coletar material para cultura e bacterioscopia.
A) Materiais clnicos para isolamento, de acordo com aspectos clnicos: Sangue (usar frascos de hemocultura sem SPS como anticoagulante) LCR Aspirado de petquias Sufuses hemorrgicas ou bipsias Lquido sinovial Swab de conjuntiva Aspirado traqueal ou transtraqueal ou escarro Leses de pele Swab de nasofaringe (prefervel ao swab de orofaringe)
2.2.3
Moraxella (branhamella) catarrhalis A escolha do material clnico em pacientes com otite aguda mdia e sinusite maxilar o fluido de timpanocentese e o aspirado sinusal, respectivamente. Sempre que possvel coletar material para cultura e bacterioscopia.
Material clnico adequado para isolamento de acordo com o quadro clnico: Otite mdia: Timpanocentese (miringotomia) quando indicado. Secreo colhida com swab em geral revela flora contaminante, exceto se rompimento espontneo muito recente e sem uso prvio de antimicrobianos. Sinusite: Aspirado de seios da face comprometidos, quando indicado. Infeces do trato respiratrio inferior/pneumonia: Escarro, aspirado traqueal e transtraqueal podem ser teis ou BAL, quando indicado, e comparados com bacterioscopia.
2.2.4
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2.3 Transporte e semeadura do material

O material clnico coletado deve ser representativo do processo infeccioso investigado, evitando contaminao com as reas adjacentes. A coleta e o transporte inadequados podem ocasionar falhas no isolamento do agente etiolgico e favorecer o crescimento da flora contaminante. Aps a coleta do material clnico, o ideal seme-lo imediatamente em meio slido e incub-lo em estufa bacteriolgica a 35-37C em jarra de vela com umidade. O uso de meios de transporte como Stuart ou Amies deve ser considerado uma alternativa de risco. Para M. catarrhalis, os meios de transporte habituais so adequados. IMPORTANTE: Todo resultado liberado pelo laboratrio de microbiologia consequncia da qualidade da amostra recebida. 2.3.1
Neisseria gonorrhoeae O gonococo muito sensvel a temperatura e atmosfera de CO2 e, frequentemente, um pequeno nmero de organismos est presente no material clnico. Quando a amostra enviada ao laboratrio, ela precisa ser transportada de maneira a preservar a viabilidade do micro-organismo.
Recomendaes:
N. gonorrhoreae sensvel a variaes de temperatura acima de 37C ou abaixo de 35C, de modo que a amostra no pode ser refrigerada ou mantida acima dos 37C. Para cultura do micro-organismo, recomenda-se gar chocolate enriquecido com suplemento de l-cistena, NAD e vitaminas (Isovitalex ou similar). Incubar em jarra com umidade (bola de algodo e gua estril) e CO2 a 5% (jarra com vela ou estufa de CO2). Para secreo retal, swab de orofaringe ou outros materiais com microbiota contaminante abundante ou menor expectativa de isolamento, semear, alm do meio rico, em meio seletivo como Thayer Martin modificado (TMM) ou meio New York City (NYC). Meios seletivos como TMM inibem crescimento de enterobactrias, a maioria das espcies saprfitas de Neisserias (7,5 g/mL de colistina), Gram-positivos (Vancomicina 3 g/mL) e fungos (13,5 g/mL de nistatina) e contm suplementos para suportar crescimento das Neisseria meningitidis e N. gonorrhoeae.
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2.3.2
Neisseria meningitidis N. meningitidis no to fastidiosa quanto a N. gonorrhoeae. O material clnico, aps coletado, deve ser transportado ao laboratrio clnico rapidamente, protegido de ambientes secos e variaes de temperatura, especialmente frias.
Recomendaes:
Transportar em ambientes midos, com CO2, evitando variaes de temperatura. N. meningitidis cresce bem em gar sangue, mas por precauo, deve-se semear tambm em gar chocolate. Incubar em jarra com umidade (bola de algodo e agua estril) e CO2 (jarra com vela ou gerador de CO2). Para materiais com microbiota contaminante ou menor expectativa de isolamento, semear, alm do meio rico, em meio seletivo como Thayer Martin modificado (TMM) ou meio New York City (NYC).
2.3.3
Moraxella catarrhalis A) Recomenda-se: M. catarrhalis tolera a temperatura ambiente, ou seja, no to sensvel a variaes de temperatura como as Neisserias. Possui um bom crescimento em gar sangue de carneiro 5% e gar chocolate. Uma boa porcentagem de M. catarrhalis cresce em gar seletivo. Incubar as placas a 35C em ambiente aerbio ou em atmosfera de 5 a 7% CO2. Material estril ou com pouca microbiota (LCR, sinovial, sangue, bipsia, conjuntiva, nasofaringe) pode ser semeado em meio no seletivo.
2.4 Bacterioscopia e identificao

O exame bacterioscpico muito importante na microbiologia clnica e consiste na observao direta, atravs de microscpio, do material obtido de qualquer tipo de leso (feridas, lquor, urina, entre outros). Isto , o material recolhido e ento observado por microscopia, aps colorao. Em muitos casos, pode ser utilizado para identificao presuntiva dos micro-organismos, como o gnero Neisseria. Recomendaes:
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No momento da coleta, recomenda-se colher dois swabs da amostra clnica, ou material suficiente para a semeadura e bacterioscopia. O esfregao na lmina deve ser feito logo aps a coleta. Quando o swab nico, no caso de Neisseria, d-se preferncia semeadura imediata do material e posteriormente: Ressuspender o swab em 1 mL de salina. Agitar no Vortex. Centrifugar. Fazer um esfregao do sedimento. O laudo da bacterioscopia deve relatar de forma quantitativa o material analisado, salientando a presena ou ausncia de diplococos Gram-negativos com caractersticas de Neisseria em: raros (+) poucos (++) moderados (+++) muitos (++++) Descrever se os micro-organismos so extracelulares ou intracelulares e quantificar os polimorfonucleares e as clulas epiteliais. importante correlacionar a bacterioscopia com achados de cultura e dados do paciente, como quadro agudo, portador, etc. Em casos de abuso sexual, fundamental o isolamento e identificao completa do micro-organismo, considerando que neisserias saprfitas ou mesmo Acinetobacter spp. podem ser diagnosticados erroneamente como N. gonorrhoeae. Identificao A anlise macroscpica das colnias bacterianas revela informaes que so importantes no processo de identificao do micro-organismo. Cada espcie possui caractersticas que, muitas vezes, lhe peculiar, tais com tamanho, forma, cor, aspecto, entre outros. N. gonorrhoeae produz em gar chocolate vrios tipos de colnias. A colnia tpica pequena, brilhante e convexa. So menores do que as de neisserias saprfitas cuja cor pode variar de cinza a amarelo. A colnia de M. catarrhalis de cor cinza rseo-acinzentado, comumente frivel, saindo inteira quando removida com a ala bacteriolgica. As colnias de N. meningitidis so maiores que as colnias de gonococos, brilhantes e convexas. Os subtipos A e C capsuladas podem apresentar-se mucides. Para o diagnstico da gonorria, existem no comrcio recursos como ELISA, sondas genticas de acido nuclico, PCR e suas variantes, que possuem elevado custo e so indicados em caso de levantamentos epidemiolgicos ou
2.4.1
30
quando no se dispe dos recursos tradicionais de identificao. Os testes imunolgicos no substituem a cultura bacteriana e a bacterioscopia. Para LCR, outros fludos estreis e at mesmo a urina, a caracterizao de Neisseria meningitidis pode ser feita pela tcnica de aglutinao com partculas de ltex. Esse mtodo rpido, possui boa sensibilidade, especificidade e permite a tipagem dos sorogrupos de N. meningitidis mais prevalentes em meningites. Uma vantagem do mtodo imunolgico sua positividade nos casos de cultura negativa por uso prvio de antimicrobianos, sendo, no entanto, de custo elevado. Para o tipo B, alguns produtos oferecem testes para afastar reao cruzada com E. coli. A reao negativa no exclui o diagnstico, que deve ser sempre avaliado juntamente com a bacterioscopia e a cultura. 2.4.2 Bacteriologia A identificao de N. meningitidis e N. gonorrhoeae pode ser realizada de duas formas: presuntiva e confirmatria. A identificao presuntiva baseia-se na realizao das provas de oxidase, bacterioscopia e colorao de Gram das colnias crescidas. Em servios de Sade Pblica (relacionados a doenas sexualmente transmitidas DST), a prevalncia da gonorria bem significativa. Desta forma, para fins prticos de tratamento, pode-se fazer o diagnstico atravs de aspectos clnicos associados bacterioscopia positiva (Diplococos Gram-negativos intracelulares) em pacientes de risco. Deve-se, no entanto, sempre colher material para cultura, possibilitando a confirmao e o monitoramento da resistncia dessas bactrias. Na ocorrncia de surtos de meningite meningoccica, o diagnstico presuntivo para fins de tratamento tambm pode ser baseado na clnica e na bacterioscopia positiva do LCR ou de leses (petquias e prpuras). Deve-se realizar a cultura do material clnico para confirmao, identificao de sorotipo e sensibilidade aos antimicrobianos atravs dos seguintes procedimentos:
Fazer a colorao de Gram das colnias isoladas para confirmar a presena de diplococos Gram-negativos. Fazer o teste de oxidase das colnias sugestivas. Deve-se procurar afastar outros gneros de bactrias como Acinetobacter spp., Kingella spp. e Moraxella spp. que so morfologicamente parecidos. Um recurso prtico para evitar erros de identificao de Acinetobacter spp. e Kingella spp. com Neisseria : Semear a colnia suspeita em gar chocolate.
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Colocar um disco de penicilina de 10 UI. Aps 24 horas fazer um Gram das colnias que crescerem prximas zona de inibio. Se permanecerem cocides, com aspecto de neisserias, confirma-se o isolamento; caso tenham adquirido a forma de bacilos longos, o isolado no de Neisseria. Outro passo importante verificar a capacidade de crescimento em meios pobres como o gar nutriente ou a necessidade de crescimento em meio rico (gar chocolate suplementado).
A diferenciao entre as espcies de Neisseria baseia-se na sua capacidade de oxidao de carboidratos especficos (glicose, maltose, lactose, sacarose e frutose) e nas exigncias nutricionais e de meio ambiente para seu crescimento. As neisserias utilizam os carboidratos por via oxidativa e o meio utilizado para verificar a bioqumica bacteriana a base gar Cistina Tripticase (CTA), adicionada de 1% de cada um dos aucares. Essa base possui como indicador de pH o vermelho de fenol, que a partir do pH 6,8 adquire a cor amarela. No entanto, reaes duvidosas podem ocorrer devido a falhas na deteco da acidez produzida pela bactria, o que pode dificultar a identificao. Recomenda-se enviar a cepa isolada rapidamente ao Laboratrio de Referncia para confirmao. 2.4.3
Bactria
N. gonorrhoeae N. meningitidis N. lactamica N. siccca N. mucosa N. flavescens M. catarrhalis Kingella spp.
Provas de rotina para diferenciar Neisserias patognicas

AC 22C
neg neg V + + + + V
NA 35C
neg V + + + + + +
DNAse
neg neg neg neg neg neg + neg
GLI
+ + + + + neg neg +
MAL
neg + + + + neg neg neg
LAC
neg neg + neg neg neg neg neg
SAC
neg neg neg + + neg neg neg
FRU
neg neg nen + + neg neg neg
AC crescimento em gar chocolate 22C; NA crescimento em gar nutriente 35C; GLI glicose; MAL maltose; LAC lactose; SAC sacarose; FRU frutose; NEG negativo; V varivel.
32
FORBES, B.A.; SAHM, D.F.; WEISSFELD, A.S. Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology. 12th ed. St. Louis. Mosby Elsevier, 2007, 1031p. WINN, J.Jr; ALLEN, S.; JANDA, W.M.; KONEMAN, E.; PROCOP, G.; SCHRENKENBERGER, P.C.; WOODS, G.K. Color Atlas and Textbook OF Diagnostic Microbiology. 6th Ed. Lippincott Williams & Wilkins, 2006, 1535p. MC FADDIN, J.F. Biochemical tests for identification of medical bacteria. Baltimore. Ed. William & Wilkins Co., 2000. MURRAY, P.R. et al. Manual of Clnical Microbiology. 9th ed. Washington DC. American Society for Microbiology ASM Press 2007, 2256p http://www.cdc.gov/ Center for Disease Control and Prevention.
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Captulo 3: Enterobactrias
Carlos Emlio Levy Tnia Mara Ibelli Vaz
3.1 Introduo:
A famlia Enterobacteriaceae constituda por um grande grupo de bacilos Gram-negativos, classificados atualmente em 44 gneros, 176 espcies e quatro grupos entricos ainda no nomeados. As enterobactrias esto amplamente distribudas na natureza e so encontradas no solo, gua, frutas, vegetais e produtos de origem animal, como a carne e ovos. Sua ecologia varivel, bem como seu potencial patognico para o homem, animais e vegetais. A) Caracterizao da famlia Enterobacteriaceae: So bacilos Gram-negativos, no esporulados, com motilidade varivel. Crescem na presena ou ausncia de oxignio. Crescem bem nos meios comuns de cultura e nos meios seletivos para enterobactrias como o gar Mac Conkey. Fermentam a glicose com ou sem a formao de gs. A maioria catalase positiva, exceto a Shigella dysenteriae. A maioria oxidase negativa, exceto Plesiomonas, gnero recentemente incorporado na classificao da famlia Enterobacteriaceae e Aeromonas sp. (muito semelhante a E. coli). A maioria reduz o nitrato a nitrito. B) Importncia clnica: As enterobactrias representam 80% ou mais de todos os Gram-negativos de importncia clnica isolados na rotina microbiolgica. Muitas espcies de enterobactrias so patognicas para o homem causando vrios tipos de doenas. Essas incluem doenas diarreicas, infeces em feridas e queimaduras, infeco no trato urinrio e respiratrio, septicemia e meningite, sendo responsveis por cerca de 70% das infeces urinrias e 50% das septicemias.
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Algumas espcies so consideradas enteropatognicas, por causarem preferencialmente infeces gastrointestinais, normalmente transmitidas por gua ou alimentos contaminados. So considerados enteropatgenos clssicos os diferentes sorotipos de Salmonella, Shigella spp., categorias diarreiognicas de E. coli e Yersinia enterocolitica. Alguns desses podem, ainda, estar associados a infeces extraintestinais.
C) Infeces Relacionadas Assistncia Sade e na comunidade: Infeces relacionadas assistncia sade: Nas infeces relacionadas assistncia sade, os gneros e espcies predominantemente isolados, representando 99% das enterobactrias de importncia clnica, so: Escherichia coli, Salmonella spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., Serratia marcescens, Proteus spp., Morganella morgannii, Citrobacter spp., e Providencia spp. Infeces na comunidade: As infeces na comunidade so frequentemente causadas pelos enteropatgenos clssicos, associados s doenas transmitidas por alimentos. Tambm so comuns as infeces urinrias causadas por E. coli, Proteus spp. e Klebsiella spp. Baseado em dados de prevalncia e importncia clnica, considera-se necessrio que os laboratrios de microbiologia utilizem metodologia que permita discriminar com 80% de acerto os gneros e espcies considerados a seguir:
Escherichia coli Shigella spp. Salmonella typhi Salmonella spp. Citrobacter freundii Proteus mirabilis Citrobacter koseri Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Providencia spp. Serratia spp. Proteus vulgaris Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter sakazaki Pantoea agglomerans Yersinia enterocolitica Morganella morganii
Tabela 1 Principais provas para a identificao das enterobactrias de importncia clnica

fermentao da glicose fermentao da lactose motilidade oxidase descarboxilao da lisina produo de sulfeto de hidrognio (H2S) produo de gs (CO2) utilizao de citrato produo de indol produo de urease produo de fenilalanina desaminase ou opo triptofanase produo de gelatinase e/ou DNAse
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Tabela 2 Provas complementares de Identificao

Teste da ornitina descarboxilase e arginina dehidrolase Reao de vermelho de metila (VM) e Voges-Proskauer (VP) Fermentao de outros carboidratos: glicerol, sacarose, maltose, arabinose, salicina, dulcitol, manitol, etc. ONPG teste da Beta galactosidase Utilizao do malonato de sdio Hidrlise da Esculina, etc.
Os esquemas de identificao baseiam-se na determinao dos gneros e espcies mais isolados na clnica, e nas provas mais caractersticas de cada gnero e espcie, segundo alguns critrios como: facilidade de execuo, facilidade de interpretao, custo, rapidez para leitura, etc.
3.2 Tipos de testes utilizados

Na maioria dos laboratrios de microbiologia clnica, a identificao de enterobactrias se baseia em caractersticas fenotpicas. Para a identificao das espcies so utilizados testes convencionais, kits comerciais, mtodos automatizados ou mtodos rpidos utilizando substratos cromognicos. Testes convencionais preparados no laboratrio devem ser submetidos a um rigoroso controle de qualidade. Aqueles adquiridos no comrcio em testes isolados ou em kits devem ser acompanhados dos respectivos esquemas de identificao, previamente validados com cepas padro e desempenho documentado. Mtodos automatizados, em geral, utilizam essas mesmas provas e ampliam o nmero de testes podendo caracterizar com maior segurana e melhor poder de discriminao gneros e espcies no comuns. Mtodos rpidos em geral utilizam substratos cromognicos para deteco de enzimas produzidas pelas bactrias e que se revelam aps 4 a 6 horas de incubao. Na rotina bacteriolgica, existem vrias alternativas e, com base em conjuntos ou sistemas simplificados de provas bioqumicas, possvel realizar a triagem e identificao presuntiva dos principais gneros de interesse clnico. Desse modo, das enterobactrias isoladas de amostras clnicas, cerca de 90% podem ser perfeitamente identificadas atravs desses esquemas, podendo o resultado ser entregue dentro de um espao de tempo relativamente curto, geralmente, entre 48 a 72 horas a partir do isolamento.
37
3.2.1
Principais Meios Bioqumicos Utilizados na Rotina A identificao presuntiva das enterobactrias pode ser facilitada pela utilizao de meios que renem em um s tubo vrias reaes bioqumicas. Assim, possvel realizar a identificao presuntiva dos principais gneros de interesse clnico, minimizando o tempo de sada do resultado. No Brasil, os meios presuntivos de identificao mais utilizados so: Meio de Rugai, modificado por Pessoa e Silva (Meio de IAL), EPM MILI e TSI. As facilidades, dificuldades ou limitaes na utilizao de cada um desses meios dependem do treinamento e conhecimento do analista que est executando o exame. Meio IAL (Instituto Adolfo Lutz) O meio de IAL extremamente prtico por se tratar de um nico tubo reunindo nove reaes: Na fase superior do tubo pode ser verificada a fermentao da glicose, produo de gs, fermentao da sacarose, produo de urease, H2S e triptofano desaminase. Na fase inferior, separada da superior por uma camada de cera de carnaba, verifica-se a descarboxilao da lisina e motilidade. No tampo observa-se a produo de indol. O meio deve ser inoculado com uma picada profunda, at o final do tubo, e posteriormente, aps a picada, estria-se a superfcie, na fase superior. Baseado nestas provas possvel identificar as seguintes bactrias: E. coli, Shigella (indol positiva), Shigella (indol negativa), Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella spp. (sacarose negativa), Enterobacter cloacae, Providencia spp. (ureia positiva) ou Morganella morganii, Providencia spp. (ureia negativa), Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Salmonella spp., Salmonella typhi, Citrobacter freundii, Serratia marcescens (necessita provas complementares), Vibrio cholerae, Vibrio spp. (oxidase positiva) e alguns bacilos no fermentadores. Por se tratar de um meio presuntivo, provas complementares devem ser realizadas sempre que necessrio, especialmente a utilizao do citrato em meio Citrato de Simmons, a DNAse, oxidase e a fermentao da lactose. A) Variantes do meio IAL: Tubo 1 meio de Rugai sem sacarose provas: fenilalanina, fermentao da glicose, gs, H 2 S, ureia Tubo 2 MIO (Motilidade Indol Ornitina) Tubo 3 lisina Tubo 4 citrato Tubo 5 rhamnose
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Conjunto EPM/MiLi/Citrato Trata-se praticamente da mesma combinao de reaes do meio IAL ou Rugai & Arajo (modificado por Pessoa & Silva), separados em 2 tubos, passando a verificao do indol da tampa do IAL, para o meio MILi aps adio do reativo de Kovacs. B) Tubo EPM: Fermentao da glicose, produo de gs, H2S, ureia, fenilalanina; inocular picando at o fundo e semear na superfcie, incubar com a tampa frouxa 24 horas/35oC. Tabela 3 Interpretao do Meio EPM
Produo de gs Base Produo de H2S Hidrlise da Ureia Superfcie Desaminao do Triptofano Formao de bolhas ou rachaduras no meio Presena de pigmento negro de qualquer intensidade Colorao azul esverdeada (fraca) na base indica prova positiva Reao positiva verde escuro ou acastanhado Reao negativa superfcie inalterada
C) Tubo MILi: Fazer picada central apenas incubar 24hs/35oC. Motilidade bactrias mveis crescem alm da picada turvando o meio, enquanto as imveis crescem apenas na linha de picada. descarboxilao da lisina lisina positivo o meio torna-se roxo, na prova negativa o meio permanece amarelado nos 2/3 inferiores. Aps a leitura da lisina adicionar 3 gotas de reativo de Kovacs para o teste de indol a formao de um anel rosa na superfcie do meio indica positividade para o indol. D) Citrato: Inocular a superfcie e incubar 24hs/35oC. A prova positiva evidenciada pelo aparecimento de colorao azul na superfcie.
Meio Trplice Acar Ferro (TSI) Considerado o mais clssico dos sistemas de identificao, necessita de provas adicionais, mas tem a vantagem de ser de mais fcil interpretao. Abaixo ser descrito em detalhes e ser a base da identificao de enterobactrias. Acurcia da identificao Qualquer sistema de testes existentes no comrcio, com leitura manual ou automatizada tem limitaes no nmero de provas e de discriminao dos diferentes gneros e espcies de enterobactrias, de modo que a maioria dos esquemas trabalha com um mximo de 80% de acerto.
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Os esquemas de identificao de enterobactrias podem utilizar uma ampla gama de recursos, variando desde nove reaes como meio IAL ou Rugai & Arajo modificado por Pessoa & Silva, at dez testes propostos nesse manual, ou sistemas como API 32E que pode identificar enterobactrias e alguns no fermentadores, utilizando 32 testes. importante destacar que nenhum sistema oferece 100% de acerto para a caracterizao das espcies de enterobactrias, mas analisam o principal comportamento descrito na literatura. A fonte de informao mais utilizada baseia-se na tabela organizada por Farmer (1999) contando com 47 provas, e os respectivos percentuais de positividade para os diferentes gneros e espcies de enterobactrias. Alguns dos principais gneros e espcies de importncia clnica podem ser caracterizados com >95% de acerto com poucas provas. Entretanto para as espcies dos gneros Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella e Serratia os testes mais utilizados apresentam baixo poder de discriminao, sendo a identificao feita pelo maior percentual de probabilidade. necessrio destacar que padres no usuais podem ocorrer e que o microbiologista deve estar atento para analisar cepas que possam ter importncia clnica e epidemiolgica ou encaminh-las a Laboratrios de Referncia. Antes, no entanto, deve certificar-se da pureza da cultura e que o padro no usual no se deve a cultura mista de bactrias. O meio de TSI inclinado em bico de flauta, de cor vermelho cereja e deve ser inoculado por picada central at o fundo, seguido de espalhamento na superfcie e incubao durante 18-24h a 35oC. Tabela 4 Provas do Meio de TSI
Prpura/amarelo (pice prpura e base amarela) =fermentao apenas da glicose (lactose e sacarose negativos) Amarelo/amarelo (pice e base amarelas) = fermentao da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 acares) Presena de gs (CO2) = bolhas ou meio fragmentado H2S positivo= presena de precipitado negro
40
Tabela 5 Interpretao do resultado das reaes encontradas no TSI

pice Vermelho Vermelho Amarelo Vermelho Amarelo Amarelo
Neg. = negativo
Base Vermelho Vermelho Vermelho Amarelo Amarelo Amarelo

v. = varivel
H2S Neg Neg Neg Neg Neg Pos
Gs Neg Neg Neg V V V
Interpretao mais provvel Sem crescimento = bactria exigente ou no semeado Crescimento na superfcie = No Fermentador ou Gram (+) Crescimento na superfcie = Gram (+) Enterobactria ou Aeromonas lactose e sacarose negativas Enterobactria Salmonella, Proteus/Morganella/Providencia e Citrobacter
Obs.: A presena de H2S em bactrias lactose e sacarose negativas pode ser menos evidente pois a precipitao de sais de ferro pelo sulfeto de hidrognio depende de meio cido (Ex: Salmonella typhi)
3.3 Etapas da identificao de enterobactrias

3.3.1 Anlise do crescimento nos meios ricos e seletivos A identificao de uma enterobactria comea com a anlise da morfologia da colnia obtida a partir do material semeado. Em geral temos os seguintes meios para interpretar: Secrees: gar sangue e Mac Conkey Lquidos nobres e bipsias: gar chocolate e Mac Conkey Fezes: Mac Conkey e SS. Urina: CLED ou gar sangue e Mac Conkey, etc. Devemos considerar que: A enterobactria sempre cresce nos meios ricos (gar sangue, chocolate e CLED), bem como nos meios seletivos: gar Mac Conkey e SS. Os Gram-positivos como regra no crescem em gar Mac Conkey e SS, exceto os enterococos que podem crescer, porm as colnias so menores. No gar Mac Conkey e SS, alm das enterobactrias e dos enterococos, podem crescer bactrias no fermentadoras e Candida. Portanto caracteriza-se uma enterobactria quando ela est presente em todos os meios semeados, mas ainda necessrio diferenciar de outros micro-organismos no muito exigentes como no fermentadores, enterococos e Candida spp. Recomenda-se a seguir realizar:
41
A) Gram da colnia isolada Recomenda-se sempre fazer o Gram para evitar enganos de interpretao (diferenciar cocos de bacilos, Gram-positivos de Gram-negativos e leveduras). B) Prova da oxidase Indicada para detectar e/ou diferenciar o grupo Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio que tambm so fermentadores. A prova de oxidase no deve ser realizada a partir de meios que contm corantes ou indicadores. C) Prova do metabolismo fermentador Triagem utilizando os meios de OF-glicose (quando suspeitar de no fermentador) ou meio presuntivo (IAL, EPM-MILI,TSI) D) Srie bioqumica complementar Sempre necessria para caracterizar gnero e espcie. O nmero de provas permitir maior ou menor discriminao (vide a seguir nvel de complexidade de provas). As Enterobactrias caracterizam-se por se apresentarem como: bacilos Gram-negativos, fermentadores da glicose, com ou sem produo de gs, oxidase negativas, reduzem nitrato a nitrito e que crescem bem no meio de gar Mc Conkey ou gar EMB (Eosin Metilene Blue gar). Como modelo de triagem na identificao bacteriana tem sido utilizado o meio de TSI (Trplice acar ferro), que permite avaliar a fermentao da glicose, produo de gs, fermentao de lactose e/ou sacarose e produo de H2S. O TSI constitui o meio de identificao preliminar mais utilizado no mundo, sendo necessrio, no entanto, adicionar algumas provas para completar a identificao, que podem ser utilizadas em dois nveis de complexidade, dependendo da disponibilidade de testes, interesse ou necessidade de uma melhor qualidade de identificao:
Nvel de complexidade 1 TSI mais: Motilidade, indol, lisina, ureia, citrato, lactose observada no gar Mc Conkey, fenilalanina, DNAse e oxidase. Nvel de complexidade 2 realizar as provas do nvel 1 mais: Ornitina, arginina, sacarose, arabinose, malonato, esculina e PYR.
42
3.3.2
Descrio das Principais Provas Bioqumicas A) Motilidade/H2S/Indol Semear por picada at o fundo, e incubar 24hs/35oC. Motilidade Para testar motilidade pode-se utilizar os meios de Motilidade/ indol (pode-se adicionar resazurina para melhor observao do crescimento); SIM (motilidade, indol e H2S) e Mili (Motilidade, Indol e Lisina): Crescimento apenas na linha de picada = motilidade negativa Crescimento difuso em todo o meio = motilidade positiva H2S Produo de gs sulfdrico, verificado no TSI ou SIM H2S positivo = meio enegrecido H2S negativo = cor inalterada do meio Indol Aps 24h de incubao, pingar 3-4 gotas de Kovacs na superfcie do meio: presena de cor prpura = indol positivo cor do reagente = indol negativo B) Ureia de Christensen Inoculado apenas na superfcie e incubar 24h/35oC Urease positivo = cor vermelha (Proteus apresenta reao mais intensa) Urease negativo = mantm cor amarelada do meio C) Citrato de Simmons Inocular na superfcie (inculo fraco) e incubar 24h/35oC Citrato positivo = azul e/ou crescimento no meio Citrato negativo = cor verde (inalterado) D) Fenilalanina Inocular a superfcie do meio (inclinado) e incubar 24h/35oC, aps crescimento pingar na superfcie 5 gotas do reagente cloreto frrico a 10% FA positivo = cor verde escuro na superfcie FA negativo = mantm a cor do meio inalterada Maiores detalhes e outras provas consultar o fascculo de meio de cultura.
3.4 Identificao das enterobactrias de importncia clnica

3.4.1 Consideraes a) Valores positivos ou negativos referem-se a 80% ou mais de definio; para saber o real percentual de provas positivas ou negativas consultar a tabela geral.
43
b) PB (padro bioqumico) = probabilidade terica da bactria em questo apresentar o padro bioqumico analisado (os testes considerados so indicados pelo sinal). Exemplo: PB para Proteus vulgaris em relao s provas, H2S +(98%) FA +(95%) Indol + (98%) (multiplicar os percentuais de ocorrncia) = 92%. c) Quando o PB baixo significa ter outro padro mais frequente. d) Os padres bioqumicos pouco frequentes tero menor probabilidade de isolamento. e) No aplicado quando se considera gnero pois envolve vrias espcies com diferentes padres de testes (ex: Salmonella spp.). f ) Valores seguidos do sinal positivo (+) ou negativo (-) significa o percentual de cepas com resultado do teste positivo ou negativo. Ex: Lisina 75%+ = 75% das cepas so lisina positivas. g) V = valores >20% e <80% de reaes positivas ou negativas; essas provas podem ser teis para diferenciar duas espcies ou dois gneros quando a reao s ocorre para uma delas. Ex.: ureia em relao a E. coli e Citrobacter. E. coli negativa e Citrobacter varivel. Se a reao encontrada for positiva, exclui-se E. coli. Pela importncia clnica e epidemiolgica, padres no comuns de Yersinia e Salmonella spp. foram considerados, pois na prtica a motilidade pode ser duvidosa e o H2S pode ser falso negativo. h) As provas destacadas com fundo cinza tm a finalidade de facilitar a busca de provas-chave na diferenciao bacteriana. i) Recomenda-se de rotina utilizar as provas do nvel 1 que, para a maioria das bactrias da rotina, permite uma caracterizao adequada. Quando houver necessidade (provas no conclusivas, fins epidemiolgicos, etc) usar as provas de nvel 2. Lac MC= lactose em Mc Conkey Tabela 6 Identificao Bioqumica Simplificada das Principais Enterobactrias
Nvel de Complexidade 1 H2S + + + fenilalanina + + + + + + + + + + + + indol motilidade Citrato DNAse Tabela 6.1 6.2 6.3a 6.3b 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8a 6.8b
44
Tabela 6.1 H2S (gs sulfdrico) positivo, Fenilalanina positivo

Indol + Indol neg Proteus vulgaris Proteus mirabilis PB 92% PB 94%
Tabela 6.2 H2S negativo, Fenilalanina positivo

Indol + Citrato + Citrato neg Indol neg Citrato neg Citrato v Ureia v Ureia + Ureia + Ureia neg Providencia spp. Morganella morganii P. penneri Enterobacter spp. PB 88% PB72% PB 69% PB <16%
Tabela 6.3 H2S positivo, Fenilalanina negativo

a) Indol positivo Bactrias/Provas Citrobacter freundii Edwarsiella tarda Citrato 78% neg Motilidade 89% + urease v neg lisina neg + lac (MC) + neg PB 25% 99%
b) Indol negativo Bactria/Provas Salmonella spp. S. typhi S. gallinarum/S. pullorum C. freundii urease neg neg neg v citrato + neg neg + lisina + + + neg Motilidade + + neg + gs + neg v + sorotipagem + + + neg 97% 90% 52% PB
Tabela 6.4 H2S negativo, FA negativo, Indol positivo, motilidade negativa

Bactria/Provas Y. enterocolitica Shigella spp. Klebsiella oxytoca E. coli inativa (rara)
1
citrato neg neg + neg
urease 75%+ neg + neg
lisina neg neg + v
lactose neg neg + 75%neg
gs neg neg + neg
sorotipagem +Yersinia +Shigella No Invasora2
PB 50% 50% 99% 80%
1 motilidade positiva temperatura ambiente e negativa a 37C 2 em coprocultura testar p/E. coli invasora
Tabela 6.5 H2S negativo, FA negativo, Indol positivo, Motilidade positiva

Bactria/Provas E. coli Citrobacter spp. Aeromonas spp.
1
citrato neg + v
urease neg v neg
lisina + neg +
lactose + v neg
gs + + v
PB 97%
1 oxidase positiva (verificar Aeromonas, Plesiomonas e Vibrio) 2 Aeromonas Dnase positiva e Plesiomonas Dnase negativa
45
Tabela 6.6 H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade negativa

Bactria/Provas Shigella spp. (colnia pequena) Klebsiella pneumoniae 1 Yersinia enterocolitica 2 P. agglomerans 3 urease neg pos 75%+ neg citrato neg pos neg v lisina neg pos neg neg gs neg pos neg neg lactose neg pos neg v comentrio sorotipagem colonia mucide sorotipagem 15% mot neg PB 50% 100% 50% 9,6%
1 cepas isoladas do trato respiratrio superior, especialmente nariz podem ser ureia negativas e bioquimicamente pouco ativas (citrato V, lisina V), denominadas K.ozaenae e K.rhinoscleromatis 2 motilidade(+) temperatura ambiente 3 pode ocorrer falsa motilidade negativa em meio semi-slido e positiva em caldo
Tabela 6.7 H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade positiva, Citrato negativo
Bact/Provas Hafnia alvei Salmonella choleraesuis Salmonella paratyphi A P. agglomerans Salmonella typhi lisina + + neg neg pos lactose neg neg neg v neg sorotipagem negativa + + negativa pos PB 7%6 37% 90% 25% 12%
Tabela 6.8 H2S negativo, FA negativo, Indol negativo, Motilidade positiva, Citrato positivo
DNAse/gelatinase negativos Bactria/Provas Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae lisina pos neg urease neg v lactose pos pos gs ++ ++ Sorotipo neg neg PB 95% 95%
DNAse/gelatinase positivos Bactria/Provas Serratia marcescens Serratia liquefaciens Serratia rubidae1

1 raramente isolada
lisina pos pos 55% pos
urease 85% neg neg neg
lactose neg 90% neg pos
gs 55% pos 75% pos 70% neg
pig. verm. v neg v
PB 95% 76% 85%
46
Tabela 7 Identificao Bioqumica Simplificada das Principais enterobactrias

Nvel de Complexidade 2 H2S + + + + fenilalanina + + + + V indol + + + + + + + + + + + + motilidade citrato DNAse tabela 7.1a 7.1b 7.2a 7.2b 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 7.10
Tabela 7.1 H2S positivo, Fenilalanina positivo

a) Indol positivos Bactria/Provas Proteus vulgaris Morganella morganii ornitina neg + b) Indol negativos ornitina Proteus mirabilis Proteus penneri + neg citrato V (65%+) neg PB 94% 30% sacarose + neg PB 92% 20%
Tabela 7.2 H2S negativo, Fenilalanina positivo

a) Indol negativo Bactria/Provas Proteus penneri Morganella morganii P. agglomerans Enterobacter sakazaki urease + + neg neg citrato neg neg + + sacarose + neg 75%+ + ornitina neg + neg +
b) Indol positivo Bactria/Provas Morganella morganii Providencia spp. neg + Citrato
47
Tabela 7.3 H2S positivo, Fenilalanina negativo e indol positivo

Bactria/Provas Citrobacter freundii Edwarsiella tarda citrato 78% + neg urease 44% + neg lisina neg + ornitina neg + lactose 78 %+ neg sacarose 89%+ neg
Tabela 7.4 H2S positivo, Fenilalanina negativo e indol negativo

Bactria/Provas S. paratyphi A C. freundii Salmonella spp. S. typhi S. choleraesuis S. gallinarum S. pullorum Outras Salmonellas Lisina neg neg + + + + + + citrato neg 78%+ + neg 25%+ neg neg + Ureia neg 44+ neg neg neg neg neg neg ornitina + neg + neg + neg + + Motilidade + 89%+ + + + neg neg + arabinose + + + neg neg + + + Gs + 89%+ + neg + neg + + Sorotip + neg + + + + + +
Triagem rpida para principais bactrias H2S+ Bactria/prova Salmonella spp. Citrobacter spp. Proteus spp. PYR neg + neg Glicerol neg + V Fenilalanina neg neg +
Tabela 7.5 H2S negativo, Fenilalanina negativo, Indol positivo, Motilidade negativa
Bactria/Provas Y. enterocolitica1 Shigella spp. Klebsiella oxytoca E. coli inativa (rara) citrato neg neg + neg ureia 75% + neg + neg lisina neg neg + 40%+ ornitina + neg neg 20%+
o
lactose neg neg + 25%+
gs neg neg ++ neg
sorotip + + NI Invasora2
PB 50% 50% 99% 80%
1 motilidade positiva temperatura ambiente e negativa a 35-37 C 2 em coprocultura testar p/E. coli invasora
48
Tabela 7.6 H2S negativo, Fenilalanina negativo, Indol positivo, motilidade positiva
Bactria/Provas E. coli C. diversus (koseri) 1 Citrobacter amalonaticus1 Yersinia enterocolitica2 Pantoea agglomerans Aeromonas spp3 citrato neg + + neg 50%+ V ureia neg 75%+ 85%+ 75%+ 20%+ neg lisina 90%+ neg neg neg neg +4 ornitina 65 + + + + neg + lactose + 50%+ 35%+ neg 40%+ neg gs + + + neg 20%+ V PB 97% 97% 97% vide 2 16%
1 C. koseri = malonato+, C. amalonaticus= malonato negativo 2 motilidade negativa a 35-37oC e positiva a temperatura ambiente 3 oxidase positiva: Aeromonas Dnase positiva e Plesiomonas shigelloides Dnase negativa 4 Aeromonas caviae lisina negativa e lactose positiva
Tabela 7.7 H2S negativo, Fenilalanina negativo, Indol negativo, Motilidade negativa
Bactria/Provas Shigella spp. (colnia pequena) Klebsiella pneumoniae Klebsiella spp. 1 Citrobacter freundii Yersinia enterocoltica 2 Pantoea agglomerans 3 Ureia neg + neg V 75%+ neg citrato nega + V 78%+ neg V Lisina neg + V neg neg neg gs neg + V + neg neg lactose neg + V 78%+ neg V comentrio Sorotipagem positiva Colnia Mucide Mucide 11% motilidade negativa Sorotipagem positiva 15% motilidade negativa 16% 50% 9,6% PB 50% 100%
1 cepas isoladas do trato respiratrio superior, especialmente nariz podem ser ureia negativas e bioquimicamente pouco ativas (citrato V, lisina V), denominadas K.ozaenae e K.rhinoscleromatis 2 motilidade(+) temperatura ambiente 3 pode ocorrer falsa motilidade (negativa em meio semi-slido e positiva em caldo)
Tabela 7.8 H2S negativo, Fenilalanina neg, Indol negativo, Motilidade +, Citrato neg
Bactria/Provas Hafnia alvei Salmonella typhi 1 S. choleraesuis Y. enterocolitica 2 S. paratyphi A Pantoea agglomerans Lisina + + + neg neg neg Ornitina + neg + + + neg Lactose neg neg neg neg neg 40%+ Urease neg neg neg 75%+ neg 20%+ Arabinose + neg neg + + + Sorologia neg + + + + neg 25% vide 2 PB 76%
1 H2S pode ser positivo no TSI com 48h 2 motilidade negativa a 35oC e positiva a 25oC 49
Tabela 7.9 Tabela fracionada H2S negativo, FA varivel, Indol negativo, Motilidade
Positiva, Citrato positivo Dnase e Gelatina negativos a) Lisina negativa, Ornitina negativa e fenil negativo Bactria/Provas Citrobacter freundii E. agglomerans Arginina 67%+ neg b) Lisina negativa e Ornitina positiva Bactria/Provas Enterobacter cloacae Enterobacter sakazaki Ureia 65%+ neg Fenil neg 50%+ Malonato 75%+ 18%+ Esculina 30%+ + ocorrncia comum raro Gs + neg Esculina neg 60%+
c) Lisina positiva, ornitina positiva e fenil negativo Bactria/Provas E. aerogenes Enterobacter gergoviae neg + Ureia + 55%+ Lactose
Tabela 7.10 Tabela completa H2S negativo, FA varivel, Indol neg., Motilidade positiva, Citrato positivo, Dnase e Gelatina negativos
Malonato Bactria/ Provas Arginina Ornitina Esculina 0 98%+ 30%+ 60%+ 97%+ 100%+ Lactose Neg Neg Neg Pos Lactose 78%+ 95%+ 93%+ 40%+ 55%+ 99%+ Lisina Ureia Fenil Gs 89%+ 100%+ 100%+ 20%+ 98%+ 98%+ Pos Neg Pos Pos
C. freundii E. aerogenes E. cloacae E. agglomerans E. gergoviae E. sakazakii
44%+ 2%+ 65%+ 20%+ 93%+ 1%+
0 0 0 20%+ 0 50%+
0 98%+ 0 0 90%+ 0
67%+ 0 97%+ 0 0 99%+
0 98%+ 96%+ 0 100%+ 91%+
11%+ 95%+ 75%+ 65%+ 96%+ 18%+
Tabela 7.11 H2S neg., Fenilalanina neg., Indol neg., Motilidade positivo, Citrato positivo, Dnase e Gelatina (positivas)
Bactria/Provas Serratia marcescens S. marcescens biog 1 Serratia liquefaciens Serratia rubidae Lisina 99% + 55% + 95% + 55% + Ornitina 99% + 65% + 95% + neg L-arabinose Neg Neg Pos Pos Malonato Neg Neg Neg Pos Motilidade
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Tabela 7.12 Caracterizao geral das principais enterobactrias de importncia clnica (%)
Bactria/Provas Citrobacter freundii Citrobacter diversus (koseri) Citrobacter amalonaticus Edwarsiella tarda Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter gergoviae Enterobacter sakazakii Escherichia coli Escherichia coli inativa Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei Hafnia alvei Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Klebsiella ozaenae Klebsiella rhinoscleromatis Morganella morganii grupo Pantoea agglomerans Proteus mirabilis Proteus vulgaris Proteus penneri Providencia rettgeri Providencia stuartii Providencia alcalifaciens Salmonella spp. Salmonell typhi Salmonella cholerasuis Salmonella paratyphi A Salmonella gallinarum Salmonella pullorum Salmonella outras Serratia marcescens Serratia marcescens bio 1 Serratia liquefaciens Serratia rubidae Yersinia enterocolitica Indol Citrato H2S 33 99 100 99 0 0 0 11 98 80 45 50 25 0 0 0 99 0 0 95 20 2 98 0 99 98 99 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 50 78 99 95 1 95 100 99 99 1 1 0 0 0 0 10 98 95 30 0 0 50 65 15 0 95 93 90 95 0 25 0 0 0 90 98 30 90 95 0 78 0 5 100 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 0 98 95 30 0 0 0 95 97 50 10 100 90 100 0 0 0 0 0 Ureia Fenilala Lisina Arginina Ornitina Motil. 44 75 85 0 2 65 93 1 1 1 0 0 0 0 4 95 90 10 0 95 20 98 95 100 90 30 0 1 0 0 0 0 0 0 15 0 3 2 75 0 0 0 0 0 0 0 50 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 95 20 98 99 99 98 95 90 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 98 0 90 0 90 40 0 0 0 0 100 98 99 40 0 V 0 0 0 0 0 0 0 98 98 95 0 90 100 99 99 55 95 55 0 67 80 85 0 0 97 0 99 17 3 2 5 10 2 6 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 70 3 55 15 10 10 70 0 4 0 0 0 0 99 95 100 98 96 100 91 65 20 0 0 2 98 98 0 0 0 0 95 0 99 0 0 0 0 0 97 0 100 95 95 95 99 99 65 95 0 95 89 95 95 98 97 95 90 96 95 5 0 0 0 0 85 0 0 0 0 V 85 95 95 85 94 85 96 95 97 95 95 0 0 99 97 14 95 85 2
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Bactria/Provas Citrobacter freundii Citrobacter diversus (koseri) Citrobacter amalonaticus Edwarsiella tarda Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter gergoviae Enterobacter sakazakii Escherichia coli Escherichia coli inativa Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei Hafnia alvei Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Klebsiella ozaenae Klebsiella rhinoscleromatis Morganella morganii grupo Pantoea agglomerans Proteus mirabilis Proteus vulgaris Proteus penneri Providencia rettgeri Providencia stuartii Providencia alcalifaciens Salmonella spp. Salmonell typhi Salmonella cholerasuis Salmonella paratyphi A Salmonella gallinarum Salmonella pullorum Salmonella outras Serratia marcescens Serratia marcescens bio 1 Serratia liquefaciens Serratia rubidae Yersinia enterocolitica
gelatina 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 90 91 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 90 30 90 90 0
Malonato 11 95 1 0 95 75 96 18 0 0 0 0 0 0 50 93 95 3 95 1 65 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 V 3 0 2 94 6
Gs glicose 89 98 97 100 100 100 98 98 95 5 0 3 0 0 98 97 97 50 0 99 20 90 85 45 10 0 85 90 0 95 99 0 90 100 55 0 75 30 5
lactose 78 50 35 0 95 93 55 99 95 25 0 1 1 2 5 98 100 30 0 1 40 2 2 1 5 2 0 1 1 0 0 0 0 V 2 4 10 100 5
sacarose 89 40 9 0 100 97 98 100 50 15 0 1 0 1 10 99 100 20 75 0 75 15 97 100 15 50 15 1 0 0 0 0 0 1 99 100 98 99 95
esculina 0 1 5 0 98 30 97 100 35 5 0 0 0 0 7 99 100 80 60 0 60 0 50 0 35 0 0 5 0 0 0 0 0 0 ou 15 95 90 97 94 25
DNAse 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 50 80 40 0 10 0 2 0 0 0 10 0 1 98 82 85 99 5
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3.5 Identificao sorolgica

Dentro da famlia Enterobacteriaceae, encontram-se conjuntos de amostras bacterianas bioquimicamente homogneas e sorologicamente relacionadas, que constituem os gneros e, segundo alguns critrios, podem dividir-se em espcies. As amostras relacionadas bioquimicamente so divididas em subgrupos ou tipos, por critrio sorolgico, de acordo com a presena dos antgenos somtico (O), flagelar (H) e de envoltrio ou cpsula (K). Desse modo, os sorotipos so divises baseadas no relacionamento antignico, enquanto os biotipos so amostras do mesmo sorotipo que diferem em caractersticas bioqumicas. Em atividades de rotina de Bacteriologia Clnica, a identificao ou confirmao sorolgica feita apenas com germes comprovadamente patognicos e de importncia epidemiolgica como Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Yersinia enterocolitica e mesmo assim utilizando-se esquemas simplificados, atravs do seguinte procedimento tcnico: a) Preparar uma suspenso bastante densa (aspecto leitoso) da bactria a ser testada, utilizando-se soluo salina a 0,85%. A massa bacteriana proveniente do gar TSI usado na identificao bioqumica ou, de preferncia, em gar nutriente inclinado aps repique para obteno de massa de germes. Coloca-se a salina sobre o crescimento bacteriano ocorrido na superfcie inclinada do meio e, aps alguns minutos, agitar o tubo de modo a obter a suspenso bacteriana. Bactrias em fase rugosa tendem a se autoaglutinar, e no devem ser utilizadas na classificao sorolgica. b) Sobre uma lmina limpa misturar uma gota do anti-soro conhecido e da suspenso bacteriana a ser testada, e, com movimentos circulares, tornar a mistura bastante homognea continuando o movimento durante um ou no mximo dois minutos. O aparecimento de aglutinao, nesse intervalo de tempo, indica positividade da reao. c) Algumas vezes, necessrio o aquecimento da suspenso bacteriana em banhomaria fervente, durante 15 minutos, com finalidade de eliminar estruturas mais externas da clula que tm ao interferente na reao. Aps resfriamento da suspenso repete-se o teste. Caso ocorra a aglutinao, confirma-se a prova. 3.5.1 Identificao de Salmonella: No gnero Salmonella existe uma grande quantidade de sorotipos, que no so mais considerados como espcies, e sua identificao sorolgica completa e detalhada uma tarefa restrita aos denominados Laboratrios de Referncia. Para identificao rotineira no laboratrio clnico, utiliza-se basicamente trs antisoros:
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a) Anti-Salmonella polivalente somtico (Grupos A,B,C,D,E) b) Anti-Salmonella somtico, Grupo D (S. typhi) c) Anti-Salmonella, anti Vi Quando o denominado antgeno de virulncia (Vi) est presente, poder bloquear a aglutinao do antgeno somtico do grupo D (Salmonella typhi). Desse modo, a suspenso dever ser aquecida em banho-maria fervente e testada novamente com os trs anti-soros citados, dando o resultado abaixo no caso de Salmonella typhi. A partir de uma reao positiva feita apenas com o antgeno somtico polivalente, existe condio de confirmar a amostra como sendo do gnero Salmonella, sem especificar o sorotipo ou sorovar.
Anti-soros Anti-soro poli somtico Grupo D somtico Anti Vi Antgeno vivo + + Antgeno aquecido + + -
Aps a identificao bioqumica e aglutinao com soro polivalente, as amostras podero ser testadas com os soros A, B, C, D, E monovalentes. A bactria pertencer ao sorogrupo em cujo soro houver aglutinao. Se a reao for negativa deve-se aquecer a metade da suspenso em banho-maria fervente e repetir o teste. A metade no aquecida dever ser utilizada para determinao de antgenos flagelares. A identificao at sorotipos poder ser feita com auxlio dos soros flagelares (a, b, c, d, i, 1, 2, 5), e atravs de sua utilizao possvel identificar as seguintes amostras:
Grupo Sorolgico Grupo O2 (A) Grupo O4 (B) Grupo O7 (C1) Grupo O5 (D1) Sorotipos Salmonella Paratyphi A Salmonella Paratyphi B e S. Typhimurium Salmonella Paratyphi C e S. Cholerae suis Salmonella Typhi
3.5.2
Identificao de Shigella: O gnero Shigella est constitudo de apenas quatro sorogrupos, que so identificados sorologicamente, de maneira simplificada, com a utilizao de anti-soros polivalentes. Excepcionalmente, utiliza-se apenas o antisoro monovalente de Shigella dysenteriae tipo 1 (bacilo de Shiga), por ser o mais patognico.
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Grupo Sorolgico - Grupo A - Grupo B - Grupo C - Grupo D
Espcie Bacteriana Shigella dysenteriae Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnei
Sorotipos 15 sorotipos 8 sorotipos 19 sorotipos 1 sorotipo
As culturas suspeitas devero ser testadas, primeiro com os soros contra Shigella flexneri e Shigella sonnei, que representam mais de 95% das amostras de Shigella isoladas em nosso meio. Caso no haja aglutinao, prosseguir com os outros soros. No ocorrendo aglutinao, possvel que a cultura seja rica em antgenos de superfcie que geralmente impedem o contato do soro com o antgeno somtico O. Esses antgenos devem ser destrudos pelo aquecimento da suspenso bacteriana por 15 minutos em banho-maria fervente, procedimento que pode ser adotado como de rotina na sorologia desse gnero. 3.5.3 Identificao de Escherichia coli As amostras de Escherichia coli que causam diarreia pertencem a cinco grupos principais: E. coli Enteropatognica (EPEC), E. coli Enterotoxignica (ETEC), E. coli Enteroinvasora (EIEC), E. coli produtora da toxina Shiga (STEC), a qual inclui o subgrupo referido como E. coli enterohemorrgica (EHEC) e E. coli enteroagregativa (EAEC). No existe nenhuma prova bioqumica que possa, seguramente, distingui-las entre si ou de outros tipos de E. coli pertencentes flora normal do intestino. As cepas diarreiognicas de E. coli so identificadas atravs de mtodos moleculares, tais como PCR utilizando iniciadores especficos, ou mtodos para verificao da produo de toxinas, realizadas somente em laboratrios de referncia ou de pesquisa. As cepas de EPEC e EIEC podem ser identificadas presuntivamente por provas de sorotipificao rotineira. Considerando que um mesmo sorogrupo pode pertencer a uma ou mais categorias diarriognica, as amostras devem ser encaminhadas a laboratrios de referncia para confirmao. Soro Anti E. coli Enteropatognica Clssica (EPEC): Polivalente A: anti 026, 055, 0111, 0119 Polivalente B: anti 0114, 0125, 0142,0158 Polivalente C: anti 086, 0126, 0127, 0128 Para os laboratrios que ainda utilizam a sorotipificao, recomenda-se que essa tcnica seja feita utilizando-se a mesma tcnica descrita para outras enterobactrias. Um melhor resultado obtido, repicando-se cerca de cinco colnias caractersticas a partir do gar EMB (Eosin Metilen Blue) ou Mc
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Conkey, para um tubo contendo gar Nutriente Inclinado, com finalidade de obter massa de germes. feita ento uma suspenso bacteriana em soluo salina, a qual ser testada utilizando-se anti-soros polivalentes, abrangendo os sorotipos mais prevalentes na populao. Soro Anti E. coli Enteroinvasora (EIEC): Polivalente A: anti 028ac, 029, 0136, 0144, 0152 Polivalente B: anti 0112ac, 0124, 0143, 0164, 0167 Soro Anti E. coli O 157 (EHEC): utilizar o soro para O157:H7. A) Observaes importantes: Bactrias isoladas com o mesmo padro de provas de materiais nobres em surtos de infeco relacionada assistncia sade ou isoladas de infeces da comunidade que possam suspeitar de um surto, ou pela gravidade da doena, ou por um padro no esperado de resistncia, devem ser remetidas ao Laboratrio de Referncia para melhor caracterizao. No caso de bactrias que no se enquadram nos padres definidos acima, recorrer a testes suplementares como os descritos abaixo ou usar kits com maior nmero de provas ou em caso de importncia clnica (descritos acima) enviar a Laboratrio de Referncia.
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BARON, E.J., FINEGOLD, S.M. Bailey and Scotts. Diagnostic Microbiology. 8th Ed. St. Louis, Mosby,1990. CHRISTENSEN, W.B. Ureia decomposition as means of differentiating Proteus and paracolon cultures from each other and from Salmonella and Shigella types. J. Bacteriol, 52: 461-466, 1946. FARMER III, J.J., KELLY, M.T. Enterobacteriaceae. IN: Balows A.; Hausler, W.J.Jr.; Herrmann, K.L.; Isenberg, H.D. & Shadomy, H.J. (Eds.) Manual of Clinical Microbiology. 5th Ed. ASM. Washington, D.C.,1991. FORBES, B.A., SAHM, D.F., WEISSFELD, A.S. Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology. 12th ed. St.Louis. Mosby Elsevier, 2007, 1031p. WINN,J JR., ALLEN, S, JANDA, W.M., KONEMAN, E, PROCOP, G, SCHRENKENBERGER, P.C. WOODS, G. KONEMAN Color Atlas and Textbook OF Diagnostic Microbiology. 6th Ed. Lippincott Williams & Wilkins, 2006, 1535p. Mc FADDIN, J.F. Biochemical tests for identification of medical bacteria. Baltimore. Ed.William & Wilkins Co., 2000. VERSALOVIC, J; CARROLL, K.C; GUIDO et al. Manual of Clinical Microbiology. 10th ed. Washington DC. American Society for Microbiology ASM Press 2011 OPLUSTIL, C.P., ZOCCOLI, C.M., TOBOUTI, N.R., SINTO, S.I. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica, 2. ed Sarvier, 2004 So Paulo Brasil,. RHODEN, R.A., HERMANN, G.J. Isolation and identification of Enterobacteriaceaein the clinical laboratory. U.S. DHEW. Center for Disease Control. Atlanta Ga., 1974. SACK, R.B., TILTON, R.C., WEISFELD, A.S. CUMITECH 12. Laboratory diagnosis of bacterial diarrhea. Coord. Ed. S.J. Rubin. American Society for Microbiology.Washington, D.C., 1980. TOLEDO. M.R.F.; FONTES, C.F.; TRABULSI, L.R. Modificao do meio de Rugai e Arajo para a realizao simultnea dos testes de produo de gs a partir da glicose,H2S, urease e triptofano desaminase. Rev. Microbiol. 13(04): 309 315, 1982. TOLEDO. M.R.F., FONTES, C.F., TRABULSI, L.R. MILi. Um meio para a realizao dos testes de motilidade, indol e lisina descarboxilase. Rev. Microbiol. 13(04): 230 235,1982. GARRITY, GMB; DAVID, R; CASTENHOLZ, RW. Bergeys manual of Systematic Bacteriology Garrity, (Eds.) Second edition Springer 721p.
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Captulo 4: Bastonetes Gram-Negativos No Fermentadores

Carlos Emlio Levy Doroti de Oliveira Garcia
4.1 Introduo
Os bacilos Gram-negativos classificados como no fermentadores (BNFs) so micro-organismos aerbios, no esporulados, que se caracterizam por serem incapazes de utilizar carboidratos como fonte de energia atravs de fermentao, degradando-os pela via oxidativa. A identificao dos BNFs sempre foi um desafio para os laboratrios de rotina em microbiologia, considerando que a maioria deles no realiza esse tipo de identificao, ou o faz de maneira elementar em virtude da pouca incidncia em amostras ambulatoriais, assim como pela complexidade e elevado custo dos esquemas completos de identificao. A caracterizao desse grupo de bactrias de grande importncia nos casos de infeco relacionada assistncia sade. Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii na atualidade esto entre as bactrias mais isoladas em hemoculturas e amostras do trato respiratrio de grandes hospitais. No entanto, os demais BNFs representam um percentual pequeno de isolamentos, quando comparados com outros agentes etiolgicos, mas alguns deles apresentam resistncia elevada a vrios antibiticos (complexo B. cepacia e S. maltophilia) e so capazes de causar infeces graves. Essas bactrias colonizam e causam infeces oportunistas, em especial em pacientes graves oriundos de CTI e submetidos a procedimentos invasivos. Muito h por se conhecer sobre a importncia clinica, caracterizao laboratorial, taxonomia, sensibilidade a drogas e patogenicidade desse grupo de micro-organismos, sendo importante classific-los em nvel de gnero e espcie.
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O nmero de bactrias no fermentadoras conhecidas muito grande. Foram selecionadas aquelas atualmente consideradas de maior importncia clnica (*) e as demais para diagnstico diferencial entre si. 4.1.1 BNFs de importncia clnica consideradas nesse captulo*:
Alcaligenes spp.* Bordetella bronchyseptica Elizabethkingia e Chryseobacterium spp.* Moraxella spp.* Pseudomonas fluorescens Pseudomonas oryzihabitans Pseudomonas stutzeri Roseomonas spp. Shewanella spp. Sphingomonas paucimobilis
Acinetobacter spp.* Achromobacter spp. Complexo Burkholderia cepacia* Methylobacterium spp. Pseudomonas aeruginosa* Pseudomonas luteola Pseudomanas putida Burkholderia pseudomallei* Stenotrophomonas spp.* Sphingobacterium spp.
4.1.2
Triagem inicial para identificao de rotina dos BNFs A partir de colnias isoladas em cultura pura com 24-72 horas de crescimento, nos meios de cultura e isolamento primrio, deve-se proceder a realizao das tcnicas de identificao e diferenciao dos BNFs. Observar se h pigmento da colnia isolada (amarelo, rseo, cor metlica)
4.1.3
Testes necessrios para triagem inicial para identificao de rotina dos BNFs Tubo com TSI (trplice aucar ferro) Tubo de TSA (tripticase soja agar)*1 inclinado Disco de oxidase ou reativo de oxidase Caldo TSB (tripticase soja caldo) para motilidade em lmina Colorao de Gram Semeadura em placa de gar MacConkey *1 ou outro meio similar, sem adio de corantes para verificar pigmento e manter o inculo. Semear uma nica colnia nos meios TSI, TSA e TSB e incubar a 30C por 1624 horas. Realizar colorao de Gram, oxidase, motilidade em lmina a fresco, semear em placa de gar MacConkey*2 e observar o crescimento a 30C por 24-72 horas, pois alguns BNFs crescem lentamente. *2 ou considerar o crescimento no primo isolamento, quando utilizado o gar MacConkey.
60
4.2 Semeadura, leitura e interpretao das provas de identificao utilizadas na triagem inicial
TSI Semear com agulha picando at o fundo do tubo e na superfcie do gar inclinado. Leitura TSI No fermentador: o meio permanece inalterado, vermelho (alcalino) no pice e na base. Verificar a produo de H2S. Disco de oxidase Retirar uma alada da massa bacteriana (a partir do TSA), utilizando ala de platina ou descartvel. Esfregar sobre a fita ou disco teste; pode umedecer o papel com 1 gota de salina estril. A leitura feita em 15 a 30 segundos. A cor violeta forte aparece rapidamente. Complexo Burkholderia cepacia e Stenotrophomonas maltophilia podem dar reao fraca ou lenta, em alguns casos aps 30 segundos. Reativo de Oxidase Umedecer um papel de filtro, colocado no interior de uma placa de Petri, com soluo de oxalato de p-aminodimetilanilina a 1%*. Esfregar uma alada da massa bacteriana (a partir do TSA) no papel de filtro umedecido, utilizando ala de platina ou descartvel. A leitura feita em 15 a 30 segundos. A cor prpura forte aparece rapidamente nas amostras oxidase positiva. Complexo Burkholderia cepacia e Stenotrophomonas maltophilia podem dar reao fraca ou lenta, em alguns casos aps 30 segundos. *Preparar a soluo e aliquotar em pequenas fraes. Conservar a -20C. Descongelar apenas no momento do uso. Caldo TSB Motilidade Colocar uma gota do caldo com crescimento bacteriano (16-24 horas a 30C) sobre uma lmina nova. Cobrir a gota com uma lamnula e levar ao microscpio. Observar com aumento de 400 x. Motilidade Positiva: presena de bactrias cruzando o campo em diferentes direes ou girando em torno dela mesma. Motilidade Negativa: movimentos vibratrios fracos. Movimento Browniano: Quando o movimento de todas as bactrias numa mesma direo, provavelmente o movimento do lquido entre a lmina e a lamnula. Obs: Verificar a motilidade em temperaturas de 37C e 20C (ambiente).
61
Gram Observar a colorao, morfologia e a disposio das clulas bacterianas.

Grupamento inicial para a identificao dos bacilos gram-negativos no fermentadores mais frequentemente isolados e de importncia clnica GNERO Pseudomonas Alcaligenes/ Achromobacter Burkholderia Stenotrophomonas Acinetobacter Moraxella Elizabethkingia/ Chryseobacterium
a
MORFOLOGIA CELULAR Bacilar Bacilar Bacilar Bacilar Coco bacilarCocide aos pares Cocobacilar Bacilar (pleomrfico)
OXIDASE +a + + lento + lento neg + +
MOTILIDADE/TIPO +/polar +/peritrqueo +/polar +/polar neg neg neg
Cresc. em gar MacConkey + + + + + V V
OF GLICOSE O/I O/I ou A O O/I O/I O O
exceto P. luteola e P. oryzihabitans que so oxidase negativa O = oxidativo | I = inerte | A = alcalino | V = varivel | neg = negativo
Observaes: Produo de H2S em TSI se positivo: suspeita de Shevanella spp. Colnias bem rugosas, amarelas, oxidase negativa, mveis suspeita de Pseudomonas oryzihabitans e P. luteola Para visualizao de flagelos vide colorao especfica no final desse captulo. No caso de identificaes duvidosas, rever: Motilidade: comum falso negativo; repetir com caldo incubando 6 horas. Oxidase: reaes duvidosas repetir com repique novo.
4.3 Testes necessrios para a identificao bioqumica dos BNFs aps a triagem inicial
Tubo de OF* glicose (com vaselina) Tubo com lisina Tubo com ornitina (complementar em alguns casos) Disco de PYR Tubo gar citrato Tubo de caldo indol Tubo com gar esculina Tubo com gelatina Tubo com caldo NaCl 6%
* pode ser utilizado o MEVAG (Milieau pour letude de la voie dattaque des glucides) como base para a oxidao-fermentao um meio mais sensvel para a deteco da oxidao de acares, mesmo em quantidades mnimas. Pode ser utilizado com maior eficcia que o OF (vide fascculo de meios de cultura).
Tubo de OF* glicose (sem vaselina) Tubo com arginina Tubo controle de aminocidos Caldo TSB crescimento 42C Tubo gar ureia Disco de Polimixina Disco de Imipenem Placa de DNAse
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Semeadura, leitura e interpretao das provas de identificao bioqumica A partir do crescimento no tubo de TSA (ou similar) utilizado para a realizao da prova de oxidase, deve-se proceder a realizao de provas de identificao e diferenciao dos BNFs. Se necessrio, semear em mais de um tubo de TSA (ou similar) para a obteno de maior quantidade de massa bacteriana. Preparar uma suspenso bacteriana em soluo salina a 0,85%, correspondente escala 0,5-1,0 de McFarland.
PROVAS Tubo de OF glicose (com e sem vaselina) SEMEADURAS Picar com agulha at o fundo do tubo LEITURA E INTERPRETAO Fermentador: os dois tubos ficam amarelos (cido) Oxidativo: tubo sem vaselina amarelo tubo com vaselina verde Inerte ou alcalino: dois tubos no mudam de cor (inerte) ou o tubo sem vaselina fica azulado (alcalino). Aguardar, no mnimo, 72h para definir como inerte, pois pode ocorre a oxidao tardia ou lenta. Incubar a 30C. Se negativo, aguardar no mnimo 72h. Se positivo, ocorre precipitado cinza no fundo do tubo Adicionar HCl 1N e aguardar 5 minutos Observar a presena de halo transparente em volta do inculo positivo enquanto o restante do meio fica leitoso Se negativo, repetir o teste com leitura em 72h
Tubo com pedao de filme com gelatina Placa de DNAse
Utilizar um volume da suspenso bacteriana suficiente para deixar o fragmento imerso. Semear com ala em spot (crculo de 1 cm de dimetro)
Tubo com lisina, arginina, ornitina, controle de aminocidos Ureia
Usar inculo denso ou 3 gotas "Comparar os tubos testes dos aminocidos com o controle negativo da suspenso bacteriana; Tubo controle negativo deve ficar azul esverdeado pode adicionar 2 mL de plido e as provas positivas ficam de cor prpura vaselina lquida no tubo com Se negativo, aguardar at 05 dias lisina Semear com agulha inculo denso na superfcie do meio A cor rosa forte aparece em todo o meio aps 24 a 72 h de incubao. Uma ligeira mudana de cor, rsea no pice, que no progride aps um tempo de incubao mais longo, considerada negativa Bordetella bronchiseptica: reao positiva em 4 h
Citrato de Simmons Semear com agulha na A cor azul forte aparece no pico, e aps um tempo superfcie do meio ou uma de incubao mais longo estende-se a todo o meio gota da suspenso bacteriana Caldo TSB Semear 1-2 gotas da crescimento a 42C suspenso bacteriana no e 44C caldo Tubo com caldo NaCl 6,5% Semear 1-2 gotas da suspenso bacteriana no caldo Ocorre turbidez no meio ou ntido o aumento da densidade bacteriana Ideal comparar com controle com mesmo inculo mantido a temperatura ambiente A presena de turbidez e mudana de cor indicam crescimento
63
PROVAS Tubo com gar esculina
SEMEADURAS
LEITURA E INTERPRETAO
Semear com agulha, em estria Ocorre um precipitado negro intenso nas provas na superfcie do meio positivas a partir de 6 horas de incubao at 48h Cor castanho-escuro considerada prova negativa; a cor deve-se produo de pigmentos por alguns BNFs
Tubo de caldo indol Inocular 3 gotas da suspenso Colocar 5 gotas de xilol e agitar bem o tubo. bacteriana no caldo Adicionar 5 gotas do reagente de Erlich ou Kovacs. Observar a presena de anel prpura-plido ou intenso que revelam prova positiva Discos de polimixina e imipenem Semear com swab (como para antibiograma) em gar Mueller Hinton Colocar os discos Incubar a 35 2C por 16-24 hs Colocar o disco sobre colnias de crescimento recentes ou fazer suspenso densa Depositar 3 a 4 gotas sobre o disco de PYR Incubar durante 4 horas numa placa vazia com umidade Polimixina: Qualquer halo em torno do disco significa sensibilidade. Gnero Burkholderia intrinsecamente R Imipenem: S. maltophilia intrinsecamente R
Disco de PYR
Colocar o disco teste em contato com o crescimento bacteriano Coloc-lo sobre uma lmina Depositar uma gota do reagente que acompanha o teste A presena de cor alaranjada prova positiva; mantendo a cor amarela a prova considerada negativa Recomenda-se testar controles positivo e negativo
4.4 Procedimentos para a identificao bioqumica dos BNFs

4.4.1 Resultado do OF-Glicose (OF-G)
Cocobacilos ou cocos Gram-negativos aos pares Bacilos Gram-negativos Tabela 1 Tabela 3 ou 4 Tabela 2 Tabela 4
Bacilo (cocobacilo) Gram-negativo oxidase negativa: OF-G oxidativo/inerte: motilidade negativa: motilidade positiva:
Cocos Gram-negativo, oxidase positiva, motilidade negativa, OF-G inerte Bacilo Gram-negativo oxidase positiva lenta OF-G oxidativo/inerte, Mveis
Se pigmento rosa: Tabela 8 Bacilo Gram-negativo oxidase positiva; OF-G oxidativo/inerte/alcalino: motilidade negativa e pigmento amarelo: Tabela 5 motilidade positiva: se OF-G Oxidativo seguir Tabela 6
se TSI com H2S seguir Tabela 7 se OF-G Inerte/alcalino, seguir se pigmento rosa, seguir Tabela8 Tabela 9
64
Observaes: Lisina e ornitina podem ser negativas em 24h e positivar com 48-72h. Rever quando houver duas reaes positivas, pois raramente ocorrem. Caldo NaCl 6,5% pode turvar mas no virar o indicador no caso de Alcaligenes (OF glicose alcalino). 4.4.2 Tabelas de identificao dos BNFs
Tabela 1 Coco-bacilos ou cocos Gram-negativo aos pares, NF, Oxidase negativa e Motilidade negativa
Micro-organismosa Complexo A.baumannii A. calcoaceticus A. baumannii/A. genoespcie 13TU A. calcoaceticus/A. genoespcie 3 O O I/O I OF-G + neg neg neg Cresc. 44C + + + neg Citrato Gelatina neg neg + neg Hemliseb neg neg + neg
A. haemolyticus A. lwoffii
a b
colnias lisas, no pigmentadas, semelhantes s de enterobactrias em gar sangue (prova opcional) neg= negativo | O= oxidativo | I= inerte
Tabela 2 Cocos Gram-negativo (NF), Oxidase positivo, Motilidade negativa, OF-G inerte
Micro-organismos Moraxella catarrhalis Moraxella canis Psychrobacter phenylpyruvicus/ Oligella ureolytica Moraxella lacunata Moraxella spp.* Urease neg neg positivo neg neg Gelatina neg neg neg pos neg + + neg neg neg DNAse Cresc em gar Mac Conkey neg + + neg V
* Moraxella spp.: nonliquefaciens, lincolnii, osloensis, atlantae e Oligella urethralis neg= negativo V = varivel
Tabela 3 Bacilos Gram-negativo (BNF), Oxidase negativa, Motilidade positiva, OF-G oxidativo, Lisina negativa
Micro-organismos Pseudomonas luteola Pseudomonas oryzihabitans
neg negativo
Lisina Neg Neg
Arginina + neg
DNAse Neg Neg
Pol S S S S
IPM
Caractersticas da colnia Bem rugosa, pigmento amarelo, aderente Bem rugosa, pigmento amarelo, aderente
Pol polimixina
IPM imipenem
S sensvel
R resistente 65
Tabela 4 Bacilos Gram-negativo (BNF), Oxidase negativa ou positiva lenta, Motilidade positivaa, OF-G oxidativo ou inerte, Lisina positiva
Micro-organismos Complexo Burkholderia cepacia Stenotrophomonas maltophilia Oxidase + lenta Lisina maioria + Arginina neg DNAse neg Pol R IPM S Caractersticas da colnia Cremosa, lisa, algumas com pigmento bem amarelo em TSI b Lisas, amarelo plido em meio claro
neg/ + lenta
93% +
neg
neg= negativo | S= sensvel | Pol= polimixina | R= resistente | V= varivel a Complexo B. cepacia pode apresentar fraca motilidade, confundindo com cepas imveis b em gar MacConkey tornam-se frequentemente rosa escuro a vermelho devido oxidao da lactose aps incubao mais longa (4 a 7 dias)
Provas opcionais para as tabelas 3 e 4 Micro-organismos Pseudomonas luteola Pseudomonas oryzihabitans Complexo B. cepacia S. maltophilia
neg= negativo V = varivel
Esculina + neg V V
PYR neg neg + +
Tabela 5 Oxidase positiva, motilidade negativa e OF-G oxidativo, bacilos (BNF) com pigmento amarelo e crescimento em gar MacConkey varivel
Micro-organismos Elizabethkingia meningoseptica Chryseobacterium indologenes Sphingomonas sppa Sphingobacterium sppb
a b
Indol + + neg neg
DNAse + neg neg V
Pol R R S R
Ureia neg neg neg +
motilidade ocorre a 18-22C, mas no a 37C; a reao de oxidase geralmente lenta, raramente negativa S. multivorum, S. spiritivorum e S. thalpophilum neg negativo V varivel S sensvel R resistente
66
Tabela 6 Bacilos Gram-negativo (BNF), Oxidase positiva, Motilidade positiva, OF-Glicose oxidativo vide fluxograma para facilitar a interpretao
Micro-organismos A. xylosoxidans Pol S Lisina neg Arginina 13% + NaCl 6% 69% + Gelatina neg Cresc. a 42C 84% + Caractersticas da colnia No pigmentadas, lisas, semelhantes ao Acinetobacter Pigmentos Pigmentos Pigmentos Seca
P. aeruginosa P. fluorescens P. putida P. stutzeri Burkholderia pseudomallei Complexo B. cepacia Sphingomonas sppa
a
S S S S R R R
neg neg neg neg neg 80% + neg
+ + + neg + neg neg
V V + +
82% + + neg neg V V
+ neg neg V + 83% + neg
pigmento amarelo (V) pigmento amarelo
neg
neg
mveis em temperatura ambiente b crescimento leve neg= negativo | S= sensvel | Pol= polimixina | R= resistente | V= varivel
Provas complementares para a Tabela 6 Micro-organismos A. xilosoxidans subsp. xylosoxidans P. aeruginosa P. fluorescens P. putida P. stutzeri B. pseudomallei Complexo B. cepacia Sphingomonas spp
a
Esculina neg neg neg neg neg V V +
PYR + V V neg neg neg neg 25% +
piocianina (P) neg V neg neg neg neg neg neg
pioverdina ou fluorescena(F) neg 65% + 96% + 93% + neg neg neg neg
Colorao flagelos* Peritrqueo Polar (1) Polar (>1) Polar (>1) Polar (1) Polar ( 2) Polar ( 2) Polar (1-2)
neg= negativo V = varivel * vide consideraes no final do captulo
Tabela 7 BNF, Oxidase, Motilidade e DNAse positivas, com H2S no TSI, OF-G varivel
Micro-organismos Shewanella putrefaciens Shewanella algae Ornitina + neg NaCl 6,5% 43% + + NaCl 0% + neg
67
Fluxograma Auxiliar para as Tabelas 4, 5 e 6

S. maltophilia Imipenem R Lisina positiva Complexo B. cepacia Polimixina R
Negativa arginina
negativa
positiva polimixina
polimixina R
Complexo B. cepacia positiva
esculina
B. pseudomallei
crescimento 42C
negativa PYR
positiva
negativa
S. paucimobilis negativa positiva
Produo de pigmentos negativa
Gelatina
positiva
DNAse
A. xyl subsp xylosoxidans positiva
P. putida negativa
P. fluorescens
positiva
negativa
P. aeruginosa S.putrefaciens TSI= H2S + P. stutzeri (colnia seca)
Colorao de flagelos
Peritrqueo
Polar
A. xyl subsp xylosoxidans
P. aeruginosa
68
Tabela 8 BNF Oxidase positiva, Motilidade positivo, OF-G inerte/alcalino

Micro-organismos Achromobacter denitrificans Alcaligenes faecalis Bordetella bronchiseptica S. maltophilia c
a b
Ureia neg neg ++ neg
NaCl 6,5% 75% neg + +b 78% neg
DNAse neg neg neg +
Gelatina neg 78%neg neg 93% +

c
PYR + neg neg neg
Colorao de flagelosa Peritriqueo Peritrqueo Peritrqueo Polar (> 2)
provas complementares | turva o meio, mas no muda a cor do indicador | raramente pode ser oxidase positiva
Tabela 9 Bacilos e coco-bacilos Gram-negativos no fermentadores (NF), Oxidase positiva ou positiva fraca, OF-G varivel, com pigmento rseo
Microorganismos Methylobacterium spp. Roseomonas spp.* Motilidade + V Morfologia Bacilos Cocobacilos Urease 23% + + Cresc em gar Mac Conkey neg + Cresc. a 42C neg + Caractersticas das colnias Colnia seca coral Colnias mucides rosadas
* oxidase positiva fraca (geralmente aps 30s) ou oxidase negativa
4.5 Tabelas complementares de consulta para identificao de BNFs contendo mais provas e Gneros e espcies menos frequentes
Cocobacilos Gram-negativos, Oxidase e motilidade negativos Micro-organismos Complexo A. baumannii A. calcoaceticus A. baumannii/A. genoespcie 13TU A. calcoaceticus/A. genoespcie 3 OF-G O O I/O I I/O Cresc. a 44C + neg neg neg neg Citrato + + + neg + Malonato + + neg neg V Gelatina neg neg + neg V Hemlise em gar sangue neg neg + neg V
A. haemolyticus A. lwoffii Acinetobacter spp.
O= oxidativo | I= inerte | neg= negativo | V= varivel
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Bacilos Gram-negativos (BNFs), Oxidase negativa ou positiva lenta, Motilidade positiva, crescimento em gar MacConkey positivo
Micro-organismos Oxidase OF-G IPM POL Esculina DNAse Lisina Arginina Cr 42C
P. luteola P.oryzihabitans S. maltophilia Complexo B. cepacia
neg neg neg/+ lenta neg/+ lenta
0 0 85% o 0
S S R S
S S S S
+ neg 39% + 63% +
neg neg + neg
neg neg 93% + 80% +
+ 14% + neg neg
94% + 33% + 48% + 83% +
IPM = imipenem | POL = polimixina | neg = negativo | O = oxidativo | S = sensvel | R = resistente | V = varivel
Bacilos Gram-negativos (BNF), Oxidase positiva, Motilidade negativa, OF-G oxidativo, crescimento em gar MacConkey varivel Micro-organismos Elizabethkingia. meningoseptica C. indologenes Sphingomonas spp. Sphingobacterium spp. Motilidade neg neg neg* neg OF-G O lento O lento O O Ureia neg neg neg V Indol + + neg neg DNAse + neg neg V POL R R S R
* pode ser positiva a 20C POL polimixina | neg negativo | O oxidativo | S sensvel | R resistente | V varivel
Oxidase positiva, Motilidade negativa, OF-G inerte e cocoide Micro-organismos M. catarrhalis M. canis Psychrobacter phenylpyruvica/ Oligella ureolytica M. lacunata Moraxella spp. * raras
neg = negativo | V = varivel
Ureia neg neg + neg neg
Gelatina O lento O lento neg + neg
DNase + + neg neg neg
Cresc em gar MacConkey neg + + neg V
Bacilos Gram-negativos (BNFs), Oxidase positiva, Motilidade positiva e OF-G inerte ou alcalino, crescimento em gar MacConkey positivo Micro-organismos Achromobacter denitrificansa Achromobacter piechaudiia Alcaligenes faecalis B. bronchiseptica
a a
Morfologia Bacilo Bacilo Bacilo cocobacilo Bacilo
Ureia neg neg neg ++ neg neg neg
Citrato + + + + + V V
Reduo Nitrato + + neg + + neg 54% +
Nitrato/ gs + neg neg neg neg neg neg
Cresc a 42C V V V V V + neg
Colorao de flagelos Peritriqueo Peritriqueo Peritriqueo Peritriqueo Polar (> 2) Polar (1) Polar (1)
Comamonas sppb P. pseudoalcaligenes P. alcaligenesb

a b
Bacilo Bacilo
OF-G alcalino OF-G inerte
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Bacilos Gram-negativos (BNFs), Oxidase positiva, Motilidade positiva e OF-G oxidativo Micro-organismos A. xilosoxidans subsp xylosoxidans P. aeruginosa P. fluorescens P. mendocina (rara) P. putida P. stutzeri Sphingomonas spp. Complexo B. cepacia B. pseudomallei S. putrefaciens Cresc em MC + + + + + + neg + + + Cresc a 42C 84% + + neg + neg 69 % + neg V + V Gelatina neg 82% + + neg neg neg neg V V V Esculina neg neg neg neg neg neg + V V neg POL S S S S S S R R R S Lisina neg neg neg neg neg neg NT V neg neg Arginina V + + + + neg NT neg + neg Colorao de flagelos Peritrqueo Polar (1) Polar (>1) Polar (1) Polar (>1) Polar (1) Polar (1-2) Polar Polar (2) Polar (1-2)
NT= no testado (no citado na literatura) | V= varivel | neg= negativo | MC= gar MacConkey | POL= polimixina
Bacilos Gram-negativos (BNFs), oxidase positiva, OF-G varivel, ureia positiva, com pigmento rosa Micro-organismos Methylobacterium spp. Roseomonas spp.
neg= negativo | V= varivel
Motilidade + V
Morfologia Bacilo Cocobacilo
Cresc em gar MacConkey neg +
Cresc a 42C neg +
Caractersticas das colnias Colnia seca, coral, bacilos com vacolos Colnias mucides, rosadas, cocobacilos
4.6 Colorao de flagelos (Clark, 1976)

A colorao de flagelos pelo mtodo de Leifson pode ser uma prova complementar muito til em casos de identificao de P. aeruginosa no produtora de pigmentos, que pode ser confundida com A. xylosoxidans subsp. xylosoxidans e tambm nos casos de bactrias OF-inerte ou alcalino. Componentes do corante: NaCl 0,5 g cido tnico 1,0 g Acetato p-rosanilina ou acetato de sdio P-rosanilina HCl 0,1 g o lcool etlico 95 33 mL H2O destilada 67 mL
0,3 g
71
Os corantes so colocados em um becker e dissolvidos aos poucos no lcool com a ajuda de um basto. Em outro becker, dissolver o NaCl e o cido tnico na gua. Misturar as duas solues e deixar na geladeira em frasco bem fechado. Agitar durante 4-5 dias para dissolver bem o corante. Aps esse perodo est pronto para uso. Aliquotar em pequenas fraes e armazenar a 5o C (semanas) ou a -10o C/-20o C (meses). Agitar antes de usar. Tcnica: As lminas devem estar bem limpas, livres de gordura. Lavar as lminas com sabo neutro, enxaguar muito bem, sem toc-las com as mos, e deix-las imersas em lcool por pelo menos 3 dias, trocando o lcool diariamente. Preparo do inculo: Semear a cepa a ser testada em um tubo grande de TSA inclinado, de preferncia com gua de condensao (pode ser adicionado em torno de 1 mL de soluo salina fisiolgica a 0,85% no fundo do tubo). Incubar a 30C por 16-24 hs. Com o auxlio de uma pipeta Pasteur, cuidadosamente, retirar a suspenso bacteriana que se formou no fundo do tubo atravs de capilaridade (no aspirar, pois pode haver quebra dos flagelos). Introduzir cuidadosamente essa suspenso em um tubo grande inclinado, com 10 mL de gua destilada estril. Deixar descansando por 10 minutos, mantendo o tubo inclinado, sem moviment-lo. Segurar a lmina inclinada e colocar uma gota da suspenso na parte superior da lmina. Deixar que a gota escorra lentamente at o fim da lmina para que no arrebente os flagelos. Deixar a lmina secar naturalmente e corar. Cobrir a lmina com o corante por 10-15 minutos. Cobrir com gua destilada at retirar o excesso do corante. Deixar a lmina secar naturalmente e observar ao microscpio tico no aumento de 1.000 x. Obs: os flagelos geralmente encontram-se no final da lmina.
72
CLARK, W.A. A simplified Leifson flagella stain. J Clin Microbiol. 3: 632-634, 1976. HUGH, R. & LEIFSON, E. The taxonomic significance of fermentative versus oxidative metabolism of carbohydrates by various gram negative bacteria. J Bacteriol 66: 24-26, 1953. KONEMAN, E.W.; ALLEN, S.D.; JANDA, W.M.; SCRECKENBERGER, P.C.; WINN, W.C. Diagnostic Microbiology 6a ed., 2006. LAFFINEUR, K.; JANSSENS, M.; CHARLIER, J.; AVESANI, V.; WAUTERS, G.; DELME. Biochemical ans susceptibility tets useful for identification of nonfermenting Gram-negative rods. J. Clin. Microbiol., 40(3):1085-1087, 2002. MACFADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of medical Bacteria. Third ed. Lippincott Williams& Williams PA USA, 912 p, 2000. MURRAY, P. R. et al. Manual of Clnical Microbiology. American Society for Microbiology. 9th ed., 2007.
73
Captulo 5: Bacilos Curvos ou Espiralados e outros Relacionados de Importncia Clnica

Carla Taddei de Castro Neves Carlos Emlio Levy Marina Baquerizo Martinez
5.1 Introduo
Esse captulo apresenta os principais bacilos curvos ou espiralados de importncia clnica, relacionados s principais patologias, fontes de infeco e recursos diagnsticos para sua caracterizao. Por se tratar de agentes raros, com exceo dos Campylobacter spp., no sero abordados em profundidade, devendo o microbiologista encaminhar a cepa isolada para Laboratrio de Referncia ou consult-lo sobre recursos disponveis para tentativa de isolamento. 5.1.1
Agente Arcobacter spp. Borrelia burgdorferi Borrelia recurrentis Campylobacter coli/ jejuni Campylobacter fetus Helicobacter pylori Helicobacter spp. Leptospira spp. Treponema pallidum Vibrio spp.
Principais bactrias curvas ou espiraladas

Doena Bacteremia, gastroenterite, endocardite e peritonite Doena de Lime Febre recorrente epidmica Gastroenterite Bacteremia, infeco extraintestinal Gastrite, lcera pptica, cncer gstrico Gastroenterite, bacteremia, etc. Leptospirose Sfilis Clera, gastroenterite Reservatrio Gado, humanos, animais domsticos Roedores Humanos Carnes contaminadas (frango), leite e gua Humanos Humanos, macacos, gatos Animais domsticos, humanos. Ces, gatos, porcos, ratos Humanos Alimentos, gua Transmisso Alimentos 1, fecal-oral. Carrapatos Sarna (P.humanus) Alimentos 1, fecal-oral Fecal-oral Alimentos 1, Fecal-oral Fecal-oral, alimentos Alimentos-gua 2 Sexual, transplacentria Alimentos 1, fecal-oral
1 Ingesto de alimentos e gua contaminados 2 Ingesto ou exposio a alimentos ou gua contaminados com urina de animal infectado 75
5.1.2
Agente Arcobacter spp.
Recursos diagnsticos
Testes * Microscopia: bacilos Gram-negativos curvos ou helicoidais. Cultura: cresce entre 15 a 30oC, em ambiente de microaerofilia, em meio seletivo, como CAMPY-CVA. Sorologia: No disponvel. Ensaio Molecular: PCR utilizando iniciadores especficos. Microscopia: espiroquetas visualizadas por colorao de prata de Warthinneg Starry ou complexadas com anticorpos marcados por fluorescena, em bipsia de leses de pele ou tecidos. Cultura: meio BSK II em ambiente de microaerofilia, entre 30-37oC por 6 semanas. Sorologia, Imunofluorescncia e ELISA. Ensaio Molecular: uso de sondas especficas ou PCR. Microscopia: espiroquetas coradas por Giemsa ou Wright, em amostras de sangue colhidas em picos febris. Cultura: igual de B. burgdorferi. Microscopia: bacilos finos e curvos, fracamente corados por Gram (Gram-negativo). Cultura: cresce a 37 e 42C em ambiente de microaerofilia, em meio seletivo como Campy-CVA. Ensaio Molecular: PCR utilizando iniciadores especficos. Microscopia: bacilos finos e curvos, fracamente corados por Gram (Gram negativo). Cultura: cresce a 37 e 42C em ambiente de microaerofilia, em meio seletivo como Campy-CVA. Ensaio Molecular: PCR utilizando iniciadores especficos. Microscopia: bacilos curvos ou espiralados, detectados em bipsia gstrica corada por H&E, Giemsa, colorao pela prata de Warthin-Starry ou Gram (Gram-negativo). Recurso rpido: teste da urease em bipsia gstrica (sensibilidade>90%). Cultura: cresce em meios seletivos ou no em microaerofilia a 37oC por 5-7dias. Sorologia: til para determinar doena ativa por Enzima-Imunoensaio. Ensaio Molecular: PCR utilizando iniciadores especficos. Microscopia: Bactrias estreitas, flexveis, enroladas em espiral, com as extremidades em forma de gancho, detectadas no sangue, LCR e urina, por microscopia em campo escuro (baixa sensibilidade), por imunofluorescncia direta ou colorao pela tcnica de impregnao pela prata (Fontana). Cultura: primeiros 10 dias de doena LCR e sangue colhido com heparina em meio de Fletcher incubado temperatura ambiente por 2 a 16 semanas. Cultura do sedimento urinrio alcalinizado aps a 1 semana da doena. Sorologia: aglutinao ou ELISA so sensveis e especficos. Ensaio Molecular: PCR. Microscopia: espiroquetas longas e finas, com espiras rgidas e regulares, observadas em microscopia de campo escuro ou colorao pela prata (Fontana) de esfregaos de linfa de leses. Testes de imunofluorescncia direta so mais sensveis. Sorologia: testes no treponmicos (VDRL) ou testes treponmicos (FTA-abs) so muito teis para diagnstico. Microscopia: Bacilos Curvos Gram Negativos, em forma de vrgula Cultura: enriquecimento em gua Peptonada. Crescimento em gar TCBS diferencia as espcies V. cholerae e V. fluvialis (colnias amarelas) de V. parahaemolyticus e V. mimicus (colnias verdes). Sorologia: aglutinao Ensaio Molecular: PCR utilizando iniciadores especficos
B. burgdorferi (doena de Lyme)
Borrelia spp.
Campylobacter coli e C. jejuni
C. fetus
Helicobacter pylori
Leptospira spp.
Treponema pallidum
Vibrio spp.
* Recursos no citados: no teis ou no disponveis BSK II = meio de Barbour Stoenner-Kelly Campy-CVA= Meio seletivo para Campylobacter com cefoperazona, vancomicina e anfotericina. PCR: Reao da Polimerase em Cadeia 76
5.2 Campylobacter
Em caso de gastroenterite, as fezes so preferencialmente coletadas para isolamento de espcies de Campylobacter, porm, swabs retais tambm so aceitveis para cultura. As amostras devem ser enviadas rapidamente ao laboratrio ou em meio de transporte de Cary-Blair semi-slido. Em amostras de sangue colhidas em meios convencionais, essas podem suportar o crescimento do C. fetus que a espcie que causa com maior frequncia infeces extraintestinais. A colorao de Gram deve usar no lugar da safranina a carbol-fucsina ou fucsina bsica a 0,1% durante 2 minutos. Exame de fezes costuma revelar presena de leuccitos, mas a ausncia no contraindica a cultura ou a suspeita diagnstica. O Gram das fezes tem sensibilidade entre 70 a 90% e elevada especificidade. A maioria das espcies de Campylobacter exige microaerofilia contendo cerca de 5% de O2, 10% de CO2 e 85% de N2, obtidos com geradores especficos e no apenas com vela. Para aumentar a chance de isolamento em fezes recomenda-se a filtrao das fezes em filtro de acetato de celulose >0,45 m. Vrios so os meios de cultura especficos para coprocultura por serem seletivos, sendo na atualidade os mais recomendados o gar Carvo Desoxicolato Cefoperazona, o meio Campy CVA (Cefoperazona, Vancomicina e Anfotericina) e o meio de Karmali (base de Columbia gar, carvo ativado e suplemento de antibiticos). Amostras de hemocultura devem ser repicadas em meios no seletivos com geradores para microaerofilia. Fazer o teste de crescimento a 25, 37 e 42oC (todos crescem a 37oC). No exame direto em gota direto no microscpio entre lmina e lamnula pode-se observar a motilidade tipo hlice em movimento. As provas de crescimento devem ser feitas em gar Mueller Hinton com 5% de sangue de carneiro em microaerofilia. O teste de sensibilidade ao cido nalidxico e cefalotina pode ser feito em qualquer meio no seletivo e ser considerado sensvel presena de qualquer tamanho de halo.
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Principais espcies de Campylobacter e Arcobacter Bactria C. jejuni Catalase + H2S-TSI neg Cresc. 15oC neg Cresc. 25oC neg + Cresc. 42oC Mac Conkey neg cido Nalidixico sensvel ou resistente sensvel sensvel ou resistente sensvel ou resistente sensvel Cefalotina resistente
C. coli C. fetus
+ +
neg neg
neg neg
neg +
+ neg
neg neg
resistente sensvel
Campylobacter spp. Arcobacter

* C. lari = resistente
varivel
neg
neg
neg
sensvel
neg
varivel
varivel
varivel
5.3 Vibrios, aeromonas e plesiomonas

A suspeita da presena de Vibrio, Aeromonas e Plesiomonas evidenciada pelo:

Isolamento de bactria Gram negativa fermentadora da glicose (TSI fermentador) e oxidase positiva. Materiais clnicos que podem, eventualmente, ser associados com maior frequncia de isolamentos de Vibrios, Aeromonas e Plesiomonas.
Principais bactrias fermentadoras da glicose, oxidase positiva e sua associao com diferentes quadros clnicos: Bactria V. cholerae V. parahaemolyticus P. shigeloides A. hydrophila A. caviae A. veronii Diarreia frequente frequente frequente frequente frequente Infeces partes Moles pouco comum Raro frequente Raro Raro Sepse Raro frequente frequente frequente frequente Outros Raro Raro frequente frequente frequente
5.3.1
Vibrio As espcies do Gnero Vibrio so bacilos curvos ou s vezes retos, longos, anaerbios facultativos, mveis, fermentadores da glicose, em geral sem produzir gs, e oxidase positivas. Alm do Vibrio cholerae, existem mais de 10 espcies patognicas para o ser humano. Algumas espcies podem causar gastroenterite, outras infeces cutneas e bacteremias.
78
A clera causada pelo V. cholerae produtor da toxina CT (toxina colrica), responsvel por diarreia secretria intensa. O bacilo disseminado por via fecal-oral (gua e alimentos contaminados) em surtos e epidemias associadas falta de condies sanitrias adequadas. O quadro clnico pode variar de assintomtico diarreia aguda com morte em 5 horas por desidratao e distrbio eletroltico. Casos espordicos podem ocorrer por ingesto de ostras e outros pescados crus ou mal cozidos. O material utilizado para identificao do agente deve ser preferencialmente, fezes, porm, amostras de swab retal ou de vmitos podem ser utilizadas. A coleta do material quando for fecal dever ser feita utilizando o meio de transporte de Cary Blair, e as cepas suspeitas ou confirmadas de Vibrio devero ser encaminhadas a Laboratrio de Referncia, para registro epidemiolgico. Algumas outras espcies de Vibrios alm do V. cholerae necessitam de NaCl para crescimento. gar sangue e Mac Conkey permitem o crescimento da maioria das espcies, e nesse ltimo meio as colnias so semelhantes s de bastonetes no fermentadores. A diferena que no TSI, EPM ou IAL h fermentao da glicose, como ocorre tambm com Aeromonas e Plesiomonas. So oxidase positivas, a maioria esculina negativa, DNAse positivo e quase todos crescem em caldo com NaCl 6%. Em casos de surtos ou em regies onde a clera endmica, a triagem das amostras e confirmao do gnero pode ser realizada utilizando um meio seletivo para Vibrio, como o gar TCBS (tiossulfato-citrato-sais biliares-sacarose). Cepas de V. cholerae fermentam a sacarose e aparecem como colnias amarelas e cepas de V. parahemolyticus no fermentam a sacarose e aparecem como colnias verdes. 5.3.2 Aeromonas e plesiomonas Vivem em ambientes aquticos em todas as partes do mundo. Podem ser encontradas em gua de fonte, gua de lagos, guas poludas, etc. Plesiomonas preferem guas tropicais e no marinhas, sendo a Aeromonas mais tolerante s diferentes condies ambientais. Aeromonas tm sido isoladas em carnes, meio ambiente aqutico e produtos do mar, e suas diferentes espcies causam doenas no s no homem como em animais, peixes, rpteis, cobras e pssaros. Em nossa experincia comum o isolamento de Aeromonas em abscesso ps-picada de cobra, lquido biliar em pacientes com colicistite, diarreia, sepse (em pacientes com doena heptica crnica) e abscessos cutneos ps79
-acidentes (corto-contusos) em lagos, tanques, etc. A chance de detectar Aeromonas e Plesiomonas depende da adoo do procedimento em se fazer o teste da oxidase em bactrias com caractersticas de Escherichia coli lactose negativa. As principais caractersticas das Aeromonas so: lactose negativa, H2S negativo, fenilalanina negativa, indol positivo, motilidade positiva, e crescem bem em meios ricos e seletivos, como gar Mac Conkey e gar Salmonella-Shigella.
Principais provas diferenciais entre Aeromonas spp., E. coli e Citrobacter spp. Bactria E. coli Citrobacter spp. Aeromonas spp. Citrato Neg + Varivel Ureia Neg Varivel Neg Lisina + Neg + H2S Neg Varivel Neg Lactose Varivel Varivel Neg Gs + + Varivel
1 Aeromonas caviae: lisina negativa e lactose positiva
Provas diferenciais para bactrias fermentadoras da glicose, oxidase positiva: Aeromonas, Plesiomonas e Vibrio Provas Cresce sem NaCl1 Cresce com 6% NaCl1 Oxidase DNAse
1 crescimento em caldo nutriente 2 exceto V. mimicus
V. cholerae
+ + + +
Outros vibrios Neg + + +
Aeromonas spp.
+ Neg + +
Plesiomonas spp.
+ Neg + Neg
Provas para diferenciar as principais espcies de Aeromonas e Plesiomonas Bactrias A. hydrophila A. caviae A. sobria A. veronii A. jandaei A. schubertii P. shigelloides Indol LIS ARG ORN Neg Neg Neg Positivo Neg Neg ARA LAC SAC ESC HEM
Positivo Positivo Positivo Varivel Neg Positivo
Positivo Varivel Positivo Positivo Positivo Positivo Varivel Positivo Positivo Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Positivo Neg Neg Positivo
Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Neg
Positivo Positivo Positivo Neg Neg Neg Neg Neg Neg Positivo Varivel Neg
Positivo Positivo Positivo Neg Positivo Positivo
Positivo Positivo Positivo Positivo
LIS = lisina ARG = arginina ORN = orninina ARA = arabinose LAC = lactose SAC = sacarose ESC = esculina HEM * = hemlise/sangue carneiro
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WINN,J.Jr.; ALLEN, S.; JANDA, W.M.; KONEMAN, E.; PROCOP, G.; SCHRENKENBERGER, P.C. WOODS, G.K. Color Atlas and Textbook OF Diagnostic Microbiology. 6th Ed. Lippincott Williams & Wilkins, 2006, 1535p. MC FADDIN, J.F. Biochemical tests for identification of medical bacteria. Baltimore. Ed. William & Wilkins Co., 2000. MURRAY, P. R. et al. Manual of Clinical Microbiology. 9th ed. Washington DC. American Society for Microbiology ASM Press 2007., 2256p MURRAY, P. R. et al. Manual of Clinical Microbiology. 10th ed. Washington DC. American Society for Microbiology ASM Press 2010., 2252p
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Captulo 6: Bacilos Gram Positivos

Ana Luza de Mattos Guaraldi Carlos Emlio Levy
6.1 Introduo
Esse captulo aborda diversos aspectos prticos para identificao dos seguintes gneros de Bacilos Gram-positivos (BGPs) de importncia clnica:
Irregulares (Corineformes) Regulares Esporulados Ramificados (Actinomicetos) Arcanobacterium, Corynebacterium, Cellulosimicrobium, Gardnerella, Oerskovia, Rothia Erysipelothrix, Listeria Bacillus Nocardia, Rhodococcus, Streptomyces
Alguns BGPs que so citados no texto para fins de diagnstico diferencial e foram abordados detalhadamente em outros captulos incluem as micobactrias e os anaerbios estritos e/ou facultativos pertencentes aos gneros Actinomyces, Bifidobacterium, Clostridium, Eubacterium, Lactobacillus, Mobilluncus, Propionibacterium.
6.2 Orientao geral para a identificao de BGPs

O significado clnico do isolamento de BGPs altamente dependente do contexto do isolamento da amostra. Assim como para os demais patgenos humanos, mais do que um retrato do crescimento nas placas de Petri de BGPs, o laudo microbiolgico deve ser o resultado de uma leitura interpretativa e crtica. O microbiologista na sua rotina diria para decidir a importncia dos BGPs isolados deve considerar o potencial patognico do agente e os dados clnicos do paciente. A comunicao e interao entre o laboratrio de microbiologia e o mdico bastante til.
83
Materiais clnicos oriundos de stios estreis (sangue, LCR, lquido pericrdico, urina) assim como de regies anatmicas contaminadas, bipsias, escarro, LBA, abscessos ou feridas devem ser valorizados, desde que os quadros clnicos sejam compatveis. Valorizar o achado em pacientes imunocomprometidos, incluindo idosos, portadores de neoplasias ou do vrus HIV. Valorizar tambm os achados em pacientes imunocompetentes uma vez que diversas espcies de BGPs tambm podem causar infeces graves, e por vezes fatais, em indivduos previamente sadios. O material deve ser colhido a partir do stio da infeco e com anti-sepsia rigorosa para evitar contaminao. Mesmo em lquidos estreis h risco de contaminao, por isso solicita-se a coleta de no mnimo duas hemoculturas. Realizar exame microscpico pela colorao de Gram diretamente do material clnico descrevendo aspectos qualitativos e quantitativos possibilitar verificar se h predomnio do agente em questo e presena de clulas inflamatrias e de micro-organismos no interior de macrfagos/neutrfilos. No LCR o resultado do Gram do sedimento e a presena de neutrofilia reforam a hiptese de ser agente infeccioso. Fazer colorao de Ziehl-Neelsen ou de Kinyoun, uma vez que o laboratrio deve ficar atento para o isolamento de BGPs como Rhodococcus e Nocardia que exibem graus variados de lcool-cido resistncia. Utilizar meios de cultura ricos alm de meios seletivos que permitam o crescimento e isolamento do BGP em questo. As condies de incubao devem ser observadas atentamente, uma vez que a maioria dos BGPs requer um mnimo de 48 horas de incubao para o crescimento em meios ricos tais como o gar sangue de carneiro. Observar caractersticas da colnia: pigmento, tamanho, cheiro, consistncia, hemlise. Para observar esporos e hifas areas algumas vezes necessrio deixar a colnia envelhecer ou crescer em meios pobres. Lembrar que esse grupo de micro-organismos pode variar muito quanto s caractersticas morfolgicas, de acordo com o material clnico, culturas jovens ou velhas, meios slidos ou lquidos, meios ricos ou pobres, sem que represente contaminao ou cultura mista. sempre interessante fazer repiques em meios slidos e lquidos para observar variaes na morfologia celular, particularmente quando frente a amostras de cocobacilos e BGPs ramificados. Considerar o nmero de espcimes clnicos de que foram isolados BGPs. Alguns desses BGPs so habitantes de pele e mucosas e podem causar infeco mista associada ou no com anaerbios estritos. Nos casos de isolamento de mais de um tipo de micro-organismo, considerar se ocorre predominncia ou co-predominncia de BGPs alm do tipo, nmero relativo e patogenicidade dos outros micro-organismos associados.
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Em casos de abscessos interessante fazer semeadura quantitativa (com ala calibrada), sendo sugestivo o isolamento em cultura pura ou >104 UFC/mL. Em urina, sugestivo quando isolado como nico agente, bacterioscopia concordante, leucocitria, sintomas de infeco urinria e contagem > 102-4 UFC/mL, dependendo da idade e das condies imunolgicas do paciente. Em casos de infeces mistas sugestivo quando isolado como agente predominante e/ou contagem > 105 CFU/mL.
Quadros clnicos relevantes associados aos bacilos gram-positivos

Bactria Arcanobacterium Bacillus Cellulosimicrobium Corynebacterium Erysipelothrix Gardnerella Lactobacillus Leifsonia Listeria Nocardia Oerskovia Rhodococcus Rothia Turicella Streptomyces Quadros clnicos Faringite, pneumonia, infeco de partes moles, pielonefrite, artrite sptica, septicemia, endocardite e meningite Antraz, intoxio alimentar, septicemia e pneumonia Septicemia neonatal, artrite sptica, tenossinovite e endoftalmite ps-trauma Difteria, pneumonia, infeco urinria, infeco por cateter e de ferida cirrgica, septicemia, endocardite, peritonite, osteomielite e meningite Celulite, septicemia e endocardite Vaginose, endometrite ps-parto e infeco urinria Septicemia, endocardite, peritonite, meningite e abscessos Septicemia, peritonite, infeco urinria e meningite Meningite, septicemia e aborto Infeco invasiva pulmonar, septicemia, abscesso cerebral, infeco linfocutnea e cutnea superficial (micetoma, abscesso, celulite) e endocardite Endocardite, bacteriemia, meningite, peritonite, nefrose e endoftalmite Infeco pulmonar (pneumonia piogranulomatosa e cavitao, abscesso e malacoplaquia), septicemia, abscesso cerebral e heptico, osteomielite e pericardite Endocardite, septicemia, pneumonia, aneurisma mictico, peritonite e osteomielite Otite mdia, mastoidite e bacteriemia Micetoma, pneumonia, bacteremia, pericardite e endocardite
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6.2.1
Triagem inicial para bacilos gram-positivos

Esporo + AAR* Ramif. v v Hemlise* beta v v Catalase v + + +
Observaes Alguns aerotolerantes Pleomrfico Mobilidade V Penetrao no gar Pleomrfico; imvel Crescimento de 5 a 42oC; Erysipelothrix alfa pH 6,7 a 9,2; H2S positivo Gardnerella beta** Gram-lbil Listeria beta + Mobilidade a 25-28 oC Hifas; crescimento em Nocardia + + + lisozima Oerskovia v + Penetrao no gar Propionibacterium + v Alguns aerotolerantes Formas cocoides; Rhodococcus + v + pigmento coral Rothia + v Pleomrfico Streptomyces + + Hifas V, varivel; AAR, lcool-acido resistncia fraca ou parcial; Ramif., clulas ramificadas; *, sangue carneiro; **, sangue de coelho ou humano a 3%
Bactria Actinomyces Arcanobacterium Bacillus Cellulosimicrobium Corynebacterium
6.3 Corineformes
Os bastonetes gram-positivos irregulares (BGPIs) ou corineformes formam um grupo bastante heterogneo morfologicamente e com poucas caractersticas bioqumicas em comum.
Arcanobacterium Corynebacterium Leifsonia Arthrobacter Curtobacterium Microbacterium Brevibacterium Dermabacter Oerskovia Cellulomonas Exiguobacterium Rothia Cellulosmicrobium Gardnerella Turicella
A) Dentre os corineformes esto os seguintes gneros: A reclassificao taxonmica desse grupo de micro-organismos frequente conforme aumenta o grau de conhecimento relativo a suas caractersticas fenotpicas e genotpicas, portanto, dificultando a valorizao microbiolgica e clnica do isolamento, a escolha do esquema de identificao para o diagnstico laboratorial, a identificao de gnero e espcies alm da antibioticoterapia.
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Em virtude da relevncia clnica, recomendvel caracterizao e provas diferenciais para os seguintes gneros:
Metabolismo Oxidativo/ fermentativo Mobilidade Sacarose Catalase Esculina Maltose Manitol Glicose Nitrato Xilose
Gnero
Ureia
Outras
Arcanobacterium Arthrobacter Brevibacterium Cellulomonas Cellulosmicrobium Corynebacterium Dermabacter Gardnerella Leifsonia
+ + + + + + + +
F O O F F F/O F F O
v v +
v v + + v v
v v -
v v + + v + v
+ v v + + v + + +
v v v + + v + + v
v v v + + v + v v
v v v +
v + + v v +
Odor de corpo ou queijo Penetrao em gar; xantina positiva Bacilos curtos Gram-lbil Pigmento amarelo; DNAse-positiva; Crescimento em 6,5% NaCl V Penetrao em gar; xantina negativa Aderncia ao gar V
Microbacterium Oerskovia
v +
F/O F
v v
v +
v -
v +
+ +
+ +
v +
v -
v + -
Rothia v F - + - + + + + F, fermentao; O, oxidao; +, positivo; -, negativo; v, varivel
6.3.1
Corynebacterium Atualmente, o gnero Corynebacterium composto de 110 espcies, sendo aproximadamente 40 dessas consideradas de relevncia mdica. Alm das corinebactrias produtoras de toxina, que so patgenos obrigatrios para humanos e/ou animais (C. diphtheriae, C. ulcerans e C. pseudotuberculosis), diversas outras espcies podem fazer parte da microbiota anfibintica normal humana e/ou atuar como patgenos oportunistas.
As infeces humanas causadas pelas corinebactrias vm adquirindo crescente importncia tanto em pases industrializados quanto em desenvolvimento, e podem levar ao bito tanto pacientes imunocomprometidos quanto imunocompetentes. O aparecimento de amostras multirresistentes aos antimicrobianos utilizados no tratamento e o aumento do nmero de casos de infeces de origens diversas, por vezes culminando em bito, tm contribudo para aumentar o interesse pelas corinebactrias. Dentre os fatores predisponentes s infeces pelas corinebactrias oportunistas destacam-se os estados de malignidade, idade avanada, transplantes,
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Aids, diabetes, neutropenia, hospitalizao e/ou antibioticoterapia por perodo prolongado alm de procedimentos invasivos (cateterismo, implantes e vlvulas). Em alguns casos, difcil a distino entre colonizao e infeco. Embora a maioria das infeces graves por corinebactrias multiresistentes seja atribuda ao C. jeikeium, tm sido descritos quadros de infeces por amostras multiresistentes de outras espcies, incluindo C. urealyticum, C. striatum, C. amycolatum, C afermentans e C. pseudodiphtheriticum, particularmente em hospitais. Alm dos mtodos bioqumicos convencionais encontram-se comercialmente disponveis sistemas semiautomatizados de identificao. Mtodos moleculares geralmente so utilizados em Laboratrios de Referncia. As principais espcies de corinebactrias estabelecidas como patgenos humanos esto apresentadas no quadro a seguir.
Micro-organismos C. diphtheriae* C. ulcerans C. jeikeiumMR C. urealyticumMR* C. striatumMR* C. amycolatum C. afermentans C. minutissimum* C. pseudodiphtheriticum* C. xerosis*
MR
Quadros clnicos principais Difteria, lceras cutneas, endocardite, septicemia, pneumonia e osteomielite Difteria, faringite, pneumonia, ndulos pulmonares granulomatosos e lceras cutneas Infeco de ferida cirrgica e prtese, septicemia, pneumonia, endocardite, peritonite e meningite Infeco urinria (cistite encrustada), ferida cirrgica, septicemia, pneumonia, endocardite, peritonite, osteomielite Pneumonia, septicemia, endocardite, osteomielite, peritonite e meningite Septicemia, peritonite, endocardite e mastite Septicemia, endocardite, empiema, abscesso pulmonar, heptico e cerebral, otite Eritrasma, abscesso mamrio, septicemia e endocardite Pneumonia, endocardite, farigite e conjuntivite Infeco de ferida cirrgica, endoftalmite, septicemia, endocardite e osteomielite
* Espcies que podem ser encontradas colonizando superfcies cutneo-mucosas de portadores assintomticos; MR, maioria das amostras so multiresistentes aos agentes antimicrobianos
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Esquema simplificado de caracterizao bioqumica das principais espcies de corinebactrias de importncia clnica Espcies Testes C. afermentans C. amycolatum C. diphtheriae Hidrlise Esculina Metabolismo Oxidativo/ fermentativo
Hidrlise Ureia
Sacarose
Reduo Nitrato
Catalase
Lipofilia
Maltose
Glicose
CAMP
PYZ
Outros
+ + +
O F F
v v
v v
v -
+ + -
+ +
v +
v v
C. jeikeium C. minutissimum C. propinquum C. pseudodiphtheriticum C. pseudotuberculosis C striatum C. ulcerans C. urealyticum C. xerosis
+ + + + + + + + +
O F O O F F F O F
+ + -
+ + v + v
+ + + + -
+ + v + + + +
+ + + + + +
v + + + +
v v v +
DNAse DNAse Hemlise*; - DNAse +; Glicognio V DNAse - GFrutose ; alactose + Frutose +; Tirosina + - Tirosina + - DNAse DNAse Rev hemlise*; Glicognio v Tirosina + Hemlise*; DNAse +; Rev Glicognio +; Gelatina +; - DNAse - DNAse
v -
PYZ, Atividade pirazinamidsica; +, positivo; -, negativo; V, varivel; Rev, reao reversa; *, hemcias carneiro
6.3.1.1 Corynebacterium diphtheriae Apesar da vacinao compulsria, a espcie tipo do gnero, o C. diphtheriae, permanece constante motivo de preocupao da Sade Pblica dos pases nos diferentes continentes. No Brasil, a difteria incide de forma endmica, com o aparecimento de surtos epidmicos nas diversas regies. A prevalncia do bacilo diftrico fermentador de sacarose difere da maioria dos pases onde so isoladas apenas amostras sacarose-negativas. A difteria um processo infeccioso agudo, muitas vezes fatal, caracterizado por uma inflamao local, com formao de pseudomembrana na orofaringe e linfadenopatia cervical. A produo da toxina diftrica e sua liberao na corrente sanguinea levam morte celular, principalmente nos orgos de alta perfuso, como fgado, rins, glndulas adrenais, corao e nervos. A imunidade contra a difteria medida da por anticorpos primariamente contra a toxina, portanto, pessoas imunizadas podem ser portadoras do micro-organismo.
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Na era da vacinao, o ressurgimento da difteria na populao adulta pode ser parcialmente justificado pela maior prevalncia de baixos nveis de IgG antitoxina diftrica entre esses indivduos. Quadros clnicos atpicos, com ausncia de formao de pseudomembrana, podem ocorrer em indivduos parcialmente imunizados e infectados por amostras toxinognicas. C. diphtheriae, independentemente de sua capacidade de produo de toxina, tambm tem sido observado como agente etiolgico de endocardites, alm de outras infeces invasivas em indivduos previamente submetidos vacinao.
Quadro clnico de difteria clssica A faringite produz sintomas como dor de garganta, febre baixa, tosse, fadiga, dificuldade em deglutir e nuseas. As crianas podem ter febre alta. Os ganglios linfticos regionais (no pescoo) ficam muito inchados. Sintomas da intoxicao sistmica podem incluir miocardite, hipotenso, paralisia de msculos e de nervos sensitivos. Difteria cutnea, endocardite, pneumonia, septicemia, osteomielite e infeces relacionadas ao uso de cateter. O material de orofaringe, nasofaringe e/ou de leso cutnea deve ser colhido das bordas da pseudomembrana. Durante a coleta, no deve ser removida a pseudomembrana dos stios de infeco de modo a evitar um aumento da liberao de toxina diftrica na corrente sangunea. No diagnstico bacteriolgico da difteria, a cultura bacteriana deve ser feita atravs de semeadura da secreo em meio de gar sangue utilizado na pesquisa de Streptococcus pyogenes e outros patgenos eventuais. Dentre os meios especficos para a pesquisa de C. diphtheriae, podem ser utilizados meios de enriquecimento como o meio de Leffler, alm de meios seletivos contendo telurito de potssio (gar chocolate-telurito ou gar sangue-cistina-telurito). Nos meios contendo telurito, o bacilo diftrico apresenta maior resistncia quando comparado a outras bactrias e forma colnias de colorao cinza ao negro, cujo tamanho e outras caractersticas dependem da subespcie. O meio de Leffler bastante rico em soro que propicia um crescimento bacteriano mais rpido (4 a 16 horas) alm de permitir o desenvolvimento de morfologia celular caracterstica das corinebactrias, o que favorece o exame microscpico a partir do cultivo primrio. A bacterioscopia direta do material clnico aps colorao pelo mtodo de Gram pode ser sugestiva quando vizualizados bastonetes ou coco-bacilos dispostos em formato de letras chinesas ou paliadas. Granulaes metacromticas, quando presentes, podem tambm ser visualizadas pela colorao de Albert Laybourn. As peculiaridades de superfcie celular bacteriana e as propriedades bioqumicas permitiram a distribuio das amostras de C. diphtheriae em quatro subespcies denominadas gravis, intermedius, mitis e belfanti. O C. diphtheriae subsp. gravis apresenta colnias grandes, achatadas e rugosas, raramente apresentando granulaes metacromticas. So capazes de fermentar glicognio e amido. O C. diphtheriae subsp. intermedius apresenta colnias diminutas, achatadas e umbilicadas, no hemolticas. O C. diphtheriae subsp. mitis apresenta colnias lisas, convexas, negras e brilhosas; hemolticas e frequentemente com granulaes metacromticas. O C. diphtheriae subsp. belfanti se diferencia da subespcie mitis pela incapacidade de reduo do nitrato.
Outros quadros clnicos
Coleta de material
Isolamento
Bacterioscopia
Identificao
90
Identificao
Os bacteriologistas devem tomar cuidado ao descartar os micro-organismos classificados como difterides, j que h relatos de amostras de bacilo diftrico isoladas de locais inusitados como sangue e/ou que exibem comportamentos atpicos, como as amostras fermentadoras de sacarose. A pesquisa de produo de toxina pelo teste de Elek ainda realizada pela maioria dos laboratrios em todo o mundo apesar de j ter sido descrita uma tcnica de PCR multiplex usando iniciadores para os genes dtxR e tox que permitem simultaneamente a identificao da espcie C. diphtheriae e a capacidade de produo de toxina diftrica. Em casos de dificuldades na identificao bioqumica e na pesquisa de produo de toxina de amostras clnicas potencialmente toxinognicas, recomenda-se encaminhar o material ou contactar Laboratrios de Referncia em Difteria para orientao.
6.3.1.2 Corynebacterium ulcerans

Recentemente passou a ser considerada como uma espcie distinta do C. diphtheriae. O micro-organismo capaz de causar processos infecciosos em humanos e animais (mastite bovina), por vezes fatais. Em humanos, tem sido crescente o nmero de casos de quadros infecciosos diversos que no tiveram contatos prvios com animais de fazendas ou derivados alimentares, inclusive no Brasil. Alm dos quadros de difteria, o micro-organismo pode causar faringite, pneumonia, ndulos pulmonares granulomatosos e lceras cutneas. Alm de produzir toxina antigenicamente homloga toxina diftrica, o C. ulcerans tambm produz fosfolipase D. Os micro-organismos produzem colnias fracamente hemolticas e so diferenciados do C. diphtheriae atravs dos resultados positivos nos testes de hidrlise da ureia e de CAMP reverso (inibe a beta-hemlise do Staphylococcus aureus em gar-sangue de carneiro), semelhana de C. pseudotuberculosis. Produzem resultados positivos nos testes de glicognio de hidrlise da gelatina e negativo no teste PYZ.
Importncia clnica
Isolamento e Identificao
6.3.1.3 Corynebacterium pseudotuberculosis

Deve ser lembrado nos casos infeces em veterinrios ou trabalhadores de zona rural com quadros de linfadenite ulcerativa ou abscessos relacionados a procedimentos de aborto de gado. Alm de fosfolipase D, essa espcie tambm pode ser produtora de toxina diftrica. As colnias so pequenas, branco-amareladas; PYZ-negativas; urease e CAMreverso positivas.
Importncia clnica
6.3.1.4 Corynebacterium jeikeium

Os micro-organismos podem ser encontrados colonizando a superfcies cutneo-mucosas dos indivduos hospitalizados e de integrantes do corpo clnico. O isolamento de amostras pode ocorrer a partir de diversos materiais clnicos, principalmente de feridas cirrgicas, sangue e fluido cerebrospinal. Frequentemente ocorre transmisso nosocomial inclusive de amostras multirresistentes que apresentam sensibilidade apenas a vancomicina. As colnias so puntiformes, branco-acinzentadas e lipoflicas (crescem em caldo BHI apenas na presena de 1% de Tween 80); metabolismo oxidativo glicose em base CTA (cystine trypticase gar) semi-slido; urease e esculina negativas e PYZ-positivas.
Importncia clnica
91
6.3.1.5 Corynebacterium pseudodiphtheriticum

Micro-organismo frequentemente encontrado na microbiota de naso e orofaringe de humanos, tem sido relacionado principalmente com quadros de infeces do trato respiratrio inferior em pacientes imunocomprometidos incluindo portadores do vrus HIV, diabetes, transplantados ou portadores de tumores malignos, alm de doenas coronarianas, inclusive em ambiente hospitalar. O micro-organismo tambm foi relacionado com processos infecciosos do trato respiratrio inferior em indivduos imunocompetentes. O estabelecimento do potencial patognico do C. pseudodiphtheriticum baseado em critrios adotados para outros patgenos do trato respiratrio inferior. Exibem colnias esbranquiadas e ligeiramente secas; hidrolisam a ureia e reduzem o nitrato, mas so incapazes de produzir cidos a partir de carboidratos comumente testados.
Importncia clnica
6.3.1.6 Corynebacterium urealyticum

C. urealyticum comumente encontrado em animais e na pele e mucosas de humanos predominantemente em reas perigenitais femininas. Est entre as espcies de corinebactrias de significado clnico mais frequentemente isoladas. fundamentalmente um patgeno oportunista do trato urinrio e pode estar relacionado com quadros de cistite (cistite incrustante), pielouretrite e pielonefrite. Adicionalmente, a espcie tem sido relacionada com quadros de infeco de ferida cirrgica, septicemia, pneumonia, endocardite, peritonite e osteomielite. Na maioria das oportunidades, os isolados clnicos de C. urealyticum so multirresistentes, inclusive para a penicilina. Como as demais espcies lipoflicas, exibem colnias puntiformes, convexas, lisas, esbranquiadas; aerbio estrito e no fermentador com elevada atividade uresica.
Importncia clnica
6.3.1.7 Corynebacterium amycolatum

Micro-organismos no lipoflicos, que apresentam parede celular desprovida de cidos miclicos. Em humanos, casos de endocardite foram associados ao uso de dispositivos intravasculares. A multirresistncia aos agentes antimicrobianos frequentemente observada entre as amostras clnicas. a espcie de corinebactria no lipoflica mais encontrada em quadros de mastite bovina. As colnias so acinzentadas, secas e cerosas com bordos irregulares aps 24 h de incubao. Exibem comportamento bioqumico semelhante ao das espcies pertencentes ao complexo C. minutissimum/C. xerosis/C. striatum apresentado abaixo.
Importncia clnica
92
6.3.1.8 Complexo C. minutissimum/C. xerosis/C. striatum

O C. minutissimum tem sido relacionado com quadros de eritrasma, abscessos, infeco oftalmolgica, pielonefrite e infeces endovenosas associados ao uso de dispositivos intravasculares em pacientes portadores de neoplasias. Quadros de bacteremia tambm foram observados em pacientes imunocompetentes. O C. xerosis uma corinebactria no lipoflica cujas colnias podem apresentar aspecto ressecado, da o nome (xeros = seco), e tem sido isolado em casos de endocardite e feridas cirrgicas. A semelhana de C. minutissimum e C. xerosis, o C. striatum tambm est includo entre os micro-organismos da microbiota de pele que podem ser transmitidos para outros indivduos no ambiente hospitalar. Alm de outros processos infecciosos, o C. striatum tambm foi relacionado com quadros de endocardite. As espcies C. amycolatum/C. minutissimum/C. xerosis/C. striatum podem ser diferenciadas atravs das seguintes reaes: C. amycolatum e C. minutissimum no crescem a 20oC ao contrrio de C. xerosis e C. striatum; C. xerosis no fermenta glicose a 42oC; a maioria das amostras de C. amycolatum resistente ao composto vibriocida 0/129; amostras de C. striatum podem expressar discreta reatividade ao teste de CAMP. Uma vez que apresentam caractersticas bioqumicas similares, muitas vezes, as espcies s podem ser diferenciadas atravs de anlise genotpica.
Importncia clnica
6.3.1.9 C. Afermentans
C. afermentans subsp. afermentans, no lipoflico, componente da microbiota humana de pele e tem sido isolado principalmente de hemoculturas. Amostras C. afermentans subsp. afermentans so frequentemente susceptveis aos antibiticos -lactmicos. Entretanto, j foram observadas amostras multirresistentes. Amostras de C. afermentans subsp. lipophilum isoladas de sangue e de feridas cutneas superficiais foram susceptveis aos antibiticos -lactmicos semelhana de C. afermentans subsp. afermentans. Aproximadamente 60% das amostras C. afermentans subsp. afermentans so CAMP-positivas. C. afermentans subsp. lipophilum a nica espcie lipoflica que pode apresentar reao positiva no teste de CAMP.
Importncia clnica
6.3.2
Arcanobacterium haemolyticum
Juntamente com S. pyogenes tem sido considerado como agente etiolgico de faringites, identificados e relatados com a finalidade de tratamento. Est associado tambm com quadros de infeces de partes moles, septicemia, endocardite e osteomielite. So bacilos delicados e curvos e alguns apresentam dilatao terminal e ramificaes ru dimentares. Crescem em 24-48h como colnias pequenas e beta-hemolticas. A hemlise melhor visualizada em sangue de coelho, e cresce melhor em ambiente de CO2. Pode se apresentar como dois tipos de colnias no mesmo cultivo: lisas, mucides e brancas ou secas e cinza. Produz a prova de CAMP reverso (inibio da hemlise). Colnias mais velhas tendem a adquirir a forma de coco-bacilo, que pode ser confundido com estreptococos. Em caldo tendem a formar ramificaes e em anaerobiose filamentos.
Importncia clnica
93
6.3.3
Gardnerella vaginalis
G. vaginalis apresenta classificao taxonmica incerta e portanto, para fins didticos, estudada no grupo dos corineformes. Coram-se irregularmente pelo cristal violeta em virtude da parede celular ser muito mais delgada do que os demais micro-organismos gram-positivos. Faz parte da microbiota vaginal de cerca de 70% das mulheres em idade reprodutiva, mas est associada vaginose bacteriana, quando predomina na flora vaginal em substituio ao Lactobacillus (bacilos de Doderlein). A vaginose bacteriana e a presena de G. vaginalis esto associadas tambm ao parto prematuro, ruptura prematura de membranas e corioamnionite. Essa bactria comumente isolada em hemoculturas de pacientes com febre puerperal e psaborto. Pode causar sepse em recm-nascidos e raramente infeco urinria em adultos ou em outros stios anatmicos. Crescem no gar sangue humano e de coelho produzindo hemlise beta. So incapazes de produzir hemlise quando cultivadas em gar sangue de carneiro. So visualizadas e caracterizadas no exame citolgico e/ou na colorao de Gram pela presena das clue cells, que so clulas epiteliais abarrotadas de pequenos bacilos Gram lbeis, de modo a perder sua definio morfolgica. Pequenos bacilos ou coco-bacilos irregulares, Gram-lbeis (por vezes Gram-negativa e por outras vezes parcialmente e fracamente Gram-positiva), imveis, sem cpsula; anaerbio facultativo, fermentador lento, catalase e esculina negativos
Caractersticas gerais
Importncia clnica
6.3.4
Rothia dentocariosa
Pertence microbiota da cavidade oral, e pode estar associada a quadros de endocardite, septicemia, pneumonia, aneurisma mictico, peritonite e osteomielite. Bacilos ou coco-bacilos, retos ou ramificados. As colnias so brancas salientes e s vezes rugosas (em forma de rodas de carroa); catalase-varivel, imvel, fermentador de glicose, maltose e sacarose; esculina positiva.
Importncia clnica
6.3.5
Oerskovia turbata
Oerskovia turbata so bactrias do meio ambiente ou solo, relacionadas com raros casos de bacteremia e infeces em implantes de prteses. So micro-organismos cocides ou na forma de bacilos resultantes da quebra de miclios; ramificados e com hifas vegetativas com capacidade de penetrao no gar. Crescimento em gar sangue de carneiro e gar chocolate; colnias com pigmento amarelo aps 24-48h em anaerobiose ou em atmosfera de 5% CO2; catalase positiva e mobilidade varivel; fermentao rpida da glicose, maltose e sacarose, hidrlise da esculina, gelatina e amido; xantina e hipoxantinanegativas.
Importncia clnica
94
6.3.6
Cellulosimicrobium cellulans
Anteriormente caracterizados como Oerskovia xanthineolytica, so bactrias encontradas no meio ambiente ou solo e raramente relacionados com quadros clnicos humanos como bacteremia, meningite, endocardite, peritonite, nefrose, implante de prteses, e endoftalmite. A maioria das infeces foi observada em pacientes hospitalizados e associada quebra de cadeia assptica. Micro-organismos morfologicamente e bioquimicamente similares a O. turbata. Apresentam colnias amareladas, com penetrao no gar aps 24-48h; ao contrario de O. turbata, so imveis, xantina e hipoxantina-positivas.
Importncia clnica
6.4 Bacilos gram-positivos regulares

6.4.1
Listeria monocytogenes
Dentre as sete espcies do gnero Listeria, a nica importante para o homem a L. monocytogenes, encontrada no solo, em matria orgnica em decomposio, gua, leite e derivados, carne alm de ser componente da microbiota de diversos mamferos, aves, peixes e insetos. Importncia clnica particularmente para idosos e indivduos imunocomprometidos causando meningite, encefalite ou septicemia. Em pacientes grvidas, a infeco pode causar amnionite, infeco do feto com aborto, parto prematuro, meningite neonatal e sepse neonatal. Surtos epidmicos podem ocorrer e esto geralmente relacionados com a contaminao de alimentos. Bacilos anaerbios facultativos, uniformes, no ramificados, apresentando-se isolados ou dispostos em cadeias pequenas. Crescem em gar sangue, gar chocolate, CLED, gar nutriente, TSA e gar Mueller Hinton, mas no em Mac Conkey. As colnias so pequenas, crescendo melhor entre 30oC e 37oC, e crescem tambm temperatura ambiente e a 4oC em 3 a 4 dias. A partir de hemoculturas, LCR, placenta, alimentos e gua, semear em gar sangue de carneiro, coelho ou cavalo, com base TSA, embora cresa tambm com outras bases (Mueller Hinton, Columbia, Brucella, BHIA, etc). Existem meios seletivos indicados em investigaes epidemiolgicas. Os micro-organismos produzem reao positiva no teste da catalase e negativa nos testes da oxidase, ureia, gelatina, indol e H2S; cido a partir de glicose; hemlise beta em gar sangue de carneiro e CAMP-positivo. A mobilidade observada em temperaturas de 25oC a 28oC, porm negativa a 37oC. Alm dos resultados positivos nos testes de hidrlise da esculina e crescimento em 6,5% NaCl observada reao rpida na prova da esculina. Sistemas semi-automatizados de identificao desses micro-organismos so encontrados disponveis comercialmente.
Importncia clnica
95
6.4.2
Erysipelothrix rhusiopathiae
Presentes na natureza, em matria orgnica, urina, fezes e carcaa de animais. Alm disso podem ser encontrados em animais, peixes, pssaros e causar erisipela em sunos. No homem, esto relacionados com quadros de doena ocupacional de veterinrios e manuseadores de carne e animais caracterizada por celulite que aparece no local da inoculao aps 2 a 7 dias. A leso costuma ser violcea e com muita dor, acompanhada de edema endurado, sem supurao e bem delineado nas bordas. Ocorre linfangite regional e artrite adjacente. Disseminao da doena e endocardite podem ocorrer, particularmente em imunossuprimidos, cujo prognstico grave. Cicatrizao pode ocorrer em 2 a 4 semanas ou meses, com possibilidade de recada. Material ideal para isolamento a bipsia colhida de maneira assptica. Swabs de leso em geral fornecem resultado negativo, pois o agente encontra-se na profundidade da borda endurecida. Bacilos curtos de extremidades arredondadas, anaerbios facultativos, no esporulado, no lcool-cido resistente, ocorrem s em cadeias curtas ou longas, sem ramificar. Crescem em gar sangue, gar chocolate, caldo tripticase soja, a 35oC aerobiose ou 5% CO2. Crescem entre 5oC a 42oC e em caldo 6,5% NaCl. No gar sangue crescem em 24 a 72h, como colnias minsculas, lisas e transparentes, mas o outro tipo de colnia, maior, rugosa e chata pode aparecer, bem como uma hemlise esverdeada em baixo da colnia no gar sangue. As colnias lisas so bacilos ou coco-bacilos Gram-positivos; s vezes corando-se mal pelo Gram. Os micro-organismos fermentam lentamente a glicose sem produzir gs, so catalase negativa, imveis, esculina, ureia e indol negativos; lactose positiva e sacarose negativa. Caracterizam-se por crescerem em meio TSI produzindo H2S.
Importncia clnica
6.5 Principais diferenas entre BGPS e cocos gram-positivos

Bactria Corynebacterium Enterococcus Erysipelothrix rhusiopathiae1 Kurthia2 Lactobacillus Listeria monocytogenes Streptococcus beta hemolticos Gram bacilos e coco-bacilos pleomrficos cocos ou coco-bacilos em cadeias coco-bacilos ou filamentos longos bacilos grandes, cadeias, cocoide em cultura velha coco-bacilos e cadeias longas bacilos curtos ou cocobacilos regulares e largos cocos em cadeias Catalase + + + Mobilidade 25C + + Hemlise v v alfa beta beta CAMP v + -/+ NaCl 6,5%/ Esculina v/v +/+ -/-/-/+/+ -/-
1, H2S positivo; 2, glicose negativo; 3, S. agalactiae; -, negativo; +, positivo; V, varivel; Rev, reao reversa; *, sangue de coelho ou humano a 3%
96
6.6 Bacilos gram-positivos anaerbios que devem ser diferenciados

6.6.1
Lactobacillus Os lactobacilos fazem parte da microbiota da boca, intestino e flora vaginal (bacilo de Doderlein) humana. So catalase negativos, imveis e apresentam capacidade de crescer em gar sangue e gar chocolate como colnias puntiformes. Esses micro-organismos tm sido associados frequentemente a quadros de endocardite e bacteremia, levando a bito aproximadamente 30% dos pacientes. Casos de peritonite, abscessos e meningites tambm tm sido relatados. Mobilluncus Anaerbios estritos, curvos, mveis encontrados no trato genital e reto de humanos. Os micro-organismos podem ser encontrados juntamente com G. vaginalis em pacientes com quadros de vaginose. Propionibacterium, Eubacterium e Bifidobacterium Anaerbios estritos que so analisados juntamente com os demais anaerbios.
6.6.2
6.6.3
6.7 Bacilos esporulados aerbios e anaerbios facultativos

6.7.1
Bacillus O gnero Bacillus compreende cerca de 259 espcies de bacilos aerbios ou anaerbios facultativos, formadores de endosporos, gram-lbeis; a maioria catalase positiva. Todos exibem mobilidade, exceto as espcies B. anthracis e B. mycoides.
B. anthracis, B. subtilis, B. licheniformis e B. megaterium expressam cpsula polipeptdica na presena de on bicarbonato (HCO3-) e em anaerobiose ou em atmosfera de CO2. As formas vegetativas so retas largas, podendo ser alongadas, dispostas isoladamente ou em cadeias. A morfologia e a disposio intracitoplasmtica dos esporos so teis para sua classificao: cilndricos, ovais, redondos, e riniformes central, subterminal, terminal dilatando ou no a clula vegetativa de origem A maioria dos micro-organismos aerbios formadores de esporos so saprfitas amplamente distribudos na natureza. Entretanto, algumas espcies so
97
oportunistas e outras so patgenos obrigatrios para animais, incluindo os humanos. Os micro-organismos do gnero Bacillus so encontrados principalmentemente no solo, gua, matria orgnica animal e vegetal, em condies ambientais bastante variadas, temperatura, umidade, salinidade e pH. As duas espcies de maior relevncia cllnica e que devem ser reconhecidas pelo laboratrio de microbiologia so o B. anthracis e B. cereus. 6.7.2
Espcie B. anthracis B. cereus B. circulans B. coagulans B. licheniformis B. subtilis B. thuringiensis
Principais espcies de Bacillus relacionadas com quadros de infeces humanas

Quadros clnicos Anthrax cutneo, anthrax intestinal, antrax pulmonar, antrax meningite Intoxicao alimentar, necrose ou gangrena de partes moles, bacteremia e septicemia, infeces pulmonares, endocardite, meningite, osteomielite e endoftalmite ps-trauma Infeces de partes moles, abscessos, bacteremia, septicemia e meningite Infeces de crneas e bacteremia Intoxicao alimentar, bacteremia e septicemia Intoxicao alimentar, bacteremia, septicemia, endocardite e infeces respiratrias Intoxicao alimentar e gastroenterite
A) Diferenas entre Bacillus e Clostridium

Bacillus Endosporos em aerobiose Catalase positivos Clostridium Endosporos em aerobiose Catalase negativos
B) Diferenas entre B. anthracis, B. cereus e espcies relacionadas

Espcies B. anthracis B. cereus B. mycoides B. thuringiensis Morfologia colonial * branco acinzentado esverdeado claro rizides/ espalhando esverdeado claro Mobilidade + + Hemlise + (+) + Penicilina sensvel resistente resistente resistente Citrato v + + v Lecitinase (+) + + +
*gar sangue; positivo; negativo; varivel; (), reao fraca
A produo de material capsular por amostras virulentas de B. anthracis pode ser demontrada em gar nutriente acrescido de 0,7% de bicarbonato de sdio, incubado por uma noite em condies de microaerofilia (mtodo da vela). Colnias capsuladas de B. anthracis exibem aspecto mucoide e a cpsula pode ser evidenciada atravs do metodo de colorao com tinta da India (nanquim).
98
6.7.2.1 Bacillus cereus Em seres humanos, B. cereus pode causar duas enfermidades transmitidas por alimentos, a sndrome diarreica e a sndrome emtica:
Sndrome diarreica de aparico tardia; caracterizada pelo aparecimento de dor abdominal e diarreia 8 a 16 h em decorrncia da ingesto de alimentos contaminados com os esporos, sendo mais comuns os vegetais (crus ou cozidos), produtos crneos, leite e derivados, massas e outros alimentos base de amido e farinhas. Os esporos so ingeridos juntamente com os alimentos e, uma vez no intestino, esses esporos germinam e causam a doena em funo das toxinas que o micro-organismo capaz de produzir. Sndrome emtica caracteriza-se por um perodo de incubao bastante curto (uma a cinco horas); causada por alimentos que j possuem a toxina produzida pela bactria; vmitos, nuseas e mal-estar geral aps a ingesto de alimentos contaminados, principalmente pratos orientais preparados com arroz, alm de alimentos derivados de leite, doces e massas.
6.7.2.2 Bacillus anthracis

Carbnculo, carbnculo hemtico, antraz ou ainda antrax foi no passado causa importante de mortalidade em herbvoros domsticos como vacas, cabras, ovelhas. Atualmente as infeces de carbnculo so raras nos pases desenvolvidos, mas no excepcionais nos subdesenvolvidos. O nmero de casos foi reduzido significativamente em decorrncia de imunizao e melhoria das condies de higiene. Os casos humanos de carbnculo devem-se normalmente exposio a animais infectados ou a carne ou pele infectada. As vtimas tm profisses relacionadas com a manipulao de animais ou de produtos derivados (trabalhadores da rea rural e veterinrios; manuseio industrial de ossos, l, crina, e outros produtos animais). Na comunidade, o risco de infeco preocupante nas regies do globo potencialmente ameaadas por ataques biolgicos. O anthrax cutneo, quando no tratado, pode ser fatal em aproximadamente 20% dos casos, principalmente quando a leso encontra-se prxima a cabea ou pescoo. No local de inoculao, aparece aps 2 a 3 dias uma pequena mancha ou ppula. Em seguida, ocorre o aparecimento de anel de vesculas em torno da ppula, que ulcera, seca, escurece formando uma escara caracterstica que cresce, fica mais espessa e aderente aos planos profundos. O edema pode ser importante, mas tem a caracterstica de ser indolor e sem pus. As formas pulmonares e intestinais so raras e mais graves, e na maioria das vezes fatais em decorrncia da dificuldade em diagnosticar o quadro clnico. No antrax pulmonar o esporo inalado transportado pelos macrfagos do pulmo para o sistema linftico onde os esporos germinam e causam septicemia que fatal. O anthrax intestinal semelhante ao cutneo, atingindo a mucosa com leses e eventualmente gastroenterite devido ingesto de carne contaminada. Ateno ao fato de que evoluo nos casos fatais inicialmente caracterizada por sintomas leves como fadiga, mal-estar e febre baixa, ou s vezes at sem sintomas, quando repentinamente se instala dispnia, cianose, febre elevada, desorientao, falncia circulatria, choque, coma e morte em poucas horas.
Importncia clnica
99
6.8 Actinomicetos
BGPs que apresentam como caracterstica em comum a produo de filamentos ou hifas vegetativas, sendo que alguns tambm apresentam hifas areas, semelhanas na composio e padro de cidos graxos de parede celular. O gnero Oerskovia, embora apresente hifas vegetativas, foi analisado juntamente com o grupo de micro-organismos corineformes. Nesta oportunidade sero abordados os gneros Nocardia, Rhodococcus e Streptomyces. Dentre os demais actinomicetos raros ou de menor importncia clnica esto includos os gneros Gordonia, Tsukamurella, Actinomadura e Nocardiopsis. Informaes importantes sobre os actinomicetos Para a adequada caracterizao dos actinomicetos que apresentam semelhana morfolgica com os fungos, importante considerar os seguintes aspectos:

Origem do material clnico, valorizando os abscessos. Nmero de micro-organismos isolados e correlao com a bacterioscopia direta do material clnico. Possibilidade de contaminao com bactrias da mucosa oral. Pigmento da colnia. Anlise morfolgica da bactria pelo microcultivo em lmina, idntico ao utilizado no setor de Micologia, empregando gar fub sem dextrose a 25oC.
Identificao presuntiva de actinomicetos

Gnero Gordonia Nocardia Rhodococcus Oerskovia Rhotia Streptomyces Tsukamurella Miclio areo + + Condio v + AAR fraca ou parcial + + + + Metabolismo glicose oxidativo oxidativo oxidativo fermentativo fermentativo oxidativo oxidativo Crescimento em lisozima v + v v +
100
6.8.1
Nocardia
O gnero Nocardia compreende atualmente 22 espcies. As nocardias so micro-organismos saprfitas de solo, aerbios estritos, imveis e catalase positivas; levemente lcool-cido resistentes quando visualizados pelo mtodo de Kinyoun-modificado. Usualmente formam hifas areas, algumas vezes observadas apenas ao microscpio. As hifas ramificadas quando fragmentadas podem exibir formas cocides e bacilares. O nmero de casos de nocardioses humanas vem aumentando significativamente, especialmente entre indivduos imunocomprometidos apresentando doena pulmonar, neoplasias, infeces pelo vrus HIV, histria prvia de alcoolismo, cirurgia, trauma, transplantes ou uso de corticosterides. O maior nmero de casos clnicos tem sido observado em pacientes adultos, predominantemente do sexo masculino (razo Masc:Fem = 3:1), a partir da terceira dcada de vida. As manifestaes clnicas, severidade e/ou prognstico da doena so extremamente variveis e relacionados com via de infeco e eficincia do sistema imunolgico do indivduo. Na maioria dos casos de nocardioses ocorre manifestao clnica disseminada. Indivduos imunocomprometidos podem desenvolver doena de evoluo progressiva e doena disseminada ou pulmonar crnica, por vezes apresentando pneumonia necrotizante e cavitao pulmonar. As nocardioses cutneas so usualmente apresentadas em quatro formas clnicas: micetoma, infeco linfocutnea, infeco cutnea superficial (abscesso ou celulite) e infeco cutnea secundria com doena disseminada freqentemente de carter crnico e de difcil diagnstico. Em indivduos imunocompetentes, foram observados quadros de endocardite, abscesso pulmonar e cerebral em adultos, alm de quadros de linfadenite necrotizante em crianas e pneumonia em neonato. O maior nmero de bitos ocorre em pacientes apresentando quadros de abscesso cerebral, infeces sistmicas e pneumonias. As nocardias so transmitidas principalmente por inalao e mais raramente atravs de inoculao direta na pele. A doena cutnea primria pode ocorrer a partir de feridas contaminadas com resduos do solo. Embora a doena esteja mais relacionada distribuio comunitria, surtos nosocomiais de nocardioses em pacientes imunocomprometidos tambm tem sido observados. No ambiente hospitalar, parece ocorrer a disseminao bacteriana por vias areas e transmisso pessoa a pessoa, inclusive ps-cirrgica. Diversas espcies tem sido relacionadas com quadros de nocardioses humanas. Dentre as espcies predominantemente isoladas podemos destacar Nocardia asteroides, Nocardia farcinica, Nocardia brasiliensis e Nocardia otitidiscaviarium. N. asteroides so responsveis pela maioria dos casos de infeces invasivas em humanos, sendo predominantemente relacionadas com quadros pulmonares e raramente com infeces cutneas. A maioria dos casos de artrite sptica foi relacionada com N. asteroides e N. farcinica. N. farcinica tem sido relacionado com quadros de infeces nosocomiais ps-cirrgicas em pacientes submetidos a cirurgias cardacas e vasculares. A diferenciao de N. farcinica dos demais membros do complexo asteroides torna-se ainda mais relevante em virtude da multiresistncia aos agentes antimicrobianos.
Importncia clnica
Importncia clnica
101
Quando colhido o material por puno, bipsia ou mesmo swab da leso profunda, deve ser processado rapidamente; existe uma caracterstica do material descrita como grnulos de enxofre, especialmente nos micetomas. A bacterioscopia pode revelar bacilos irregulares com ramificaes e parcialmente ou fracamente lcool-cido resistentes pelo Ziehl ou Kinyoun. Cortes histolgicos corados pela hematoxilina-eosina caracterizam os grnulos, mas no os filamentos da bactria. O Gram ou a colorao de metenamina prata de Gomori so teis. A presena de hifas areas diferencia as nocardias dos outros gneros relacionados Corynebacterium, Gordonia, Mycobacterium, Rhodococcus e Tsukamurella. As micobactrias de crescimento rpido podem apresentar hifas de substrato curtas ramificadas em ngulo agudo, porm sem ramificaes secundrias, enquanto as nocardias exibem hifas complexas com ramificaes em angulo reto e com ramificaes secundrias. No isolamento de nocardias podem ser utilizados meios de cultivo usualmente empregados na rotina laboratorial (gar sangue, gar chocolate, gar Sabouraud dextrose, gar seletivo para Legionella e Lowenstein Jensen), sendo necessrio tempo de incubao prolongado (4 a 14 dias). Com exceo da N. asteroides, a maioria das nocardias apresenta beta-hemlise em gar sangue de carneiro. Crescem em meio de parafina (como fonte nica de carbono), juntamente com Rhodococcus e algumas micobactrias. Uma caracterstica importante a variedade na cor das colnias lisas ou rugosas, indo do branco giz ao amarelo, salmo, alaranjado e violeta, dependendo da espcie, tempo de incubao e do meio de cultivo utilizado. O envio da amostra clnica a um Laboratrio de Referncia pode ser requerido para a identificao da espcie.
Caracteristicas diferenciais das principais espcies de nocardia de interesse clnico Galactose

Hipoxantina
Lisozima
Gelatina
Catalase
Esculina
Xantina
Inositol
Cultivo 35/45oC
Trealose
Glicose
Nocardia N. nova N. farcinica N. asteroides N. brasiliensis N. otitidiscaviarium
Pigmento* branco giz; laranja branco giz; laranja salmo; laranja amarelo; laranja marrom claro
+ + + + +
+ v -
+ + + + +
+ + +
+ v + -
+ +
v + +
+ -
+ +
+ +
+ +
*, Leitura do teste aps 72h de incubao; +, reao positiva; -, reao negativa; v, reao varivel
102
6.8.2
Streptomyces
Alguns milhares de espcies de Streptomyces j foram caracterizados, sendo na quase totalidade saprfitas. O Streptomyces somaliensis responsvel pelo micetoma de cabea e pescoo. Outras espcies foram identificadas em casos de pericardite crnica e infeces de partes moles ps-traumticas (S. griseus). O abscesso pode revelar a presena de grnulos duros. O mtodo de Gram revela uma massa de BGPs finos. No fastidioso, cresce melhor em meio Sabouraud dextrose incubado a temperatura ambiente entre 4 a 10 dias de incubao. Pode-se visualizar no microcultivo hifas finas e longas com ramificaes, hifas areas e condios (via assexuada de propagao com forma arredondada). No alcoolcido resistente, e apenas os condios podem apresentar essa propriedade; metaboliza a glicose por oxidao e cresce a 50oC. As colnias so mais secas com diferentes pigmentos (creme, marron, preto, etc), com a presena ou no de hifas areas. Uma caracterstica importante das colnias o cheiro de terra molhada.
Importncia clnica
6.8.3
Rhodococcus
R. equi est relacionado com infeces em humanos, principalmente em indivduos imunocomprometidos, especialmente entre pacientes que apresentavam sndrome da imunodeficincia adquirida (SIDA), neoplasias ou terapias imunossupressoras. Quadros de pneumonias causados pelo R. equi podem surgir como o primeiro sintoma de infeco pelo HIV. As manifestaes clnicas pulmonares incluem abscessos pulmonares, pneumonia piogranulomatosa e cavitao de aspecto semelhante tuberculose pulmonar, sendo comum a presena de febre, tosse e dores no peito. Alguns autores sugerem que a deteco de infeco por R. equi deveria ser rotineiramente utilizada como um critrio para o diagnstico de SIDA. Outras patologias humanas, tais como malacoplaquia pulmonar, abscessos cerebrais e na tireide, mediastinite, pericardite, linfadenite, osteomielite, endoftalmite e infeco de feridas, alm de adenite retroperitoneal, com diarreia sanguinolenta e/ou abscesso no psoas, tambm podem estar associadas infeco por R. equi. Infeces pulmonares, associadas ou no a acometimentos extrapulmonares, so observadas na maioria dos casos de infeco em indivduos imunocomprometidos e imunocompetentes. Entretanto, leses exclusivamente extrapulmonares ocorreram principalmente entre indivduos imunocompetentes. Em indivduos imunologicamente competentes o R. equi foi relacionado com quadros de meningite, osteomielite, artrite sptica, endoftalmite e retinite em indivduos imunocompetentes, alm de processos infecciosos em crianas (9 meses e 13 anos de idade). Em algumas oportunidades, o desenvolvimento de infeco por R. equi foi relacionado com o contato prvio dos pacientes com animais. O R. equi agente etiolgico de broncopneumonias supurativas, linfoadenites e enterites em equinos, responsvel por aproximadamente 10% dos casos de pneumonia e 3% de morte em potro. Infeco pelo R. equi tambm pode ocorrer em bovinos, caprinos, ovinos, sunos alm de ces e gatos. O R. equi pode ser isolado de animais sadios e assintomticos, principalmente em regies rurais endmicas. Em raras oportunidades outras espcies do gnero Rhodococcus e dos gneros Gordonia e Tsukamurella foram associados a infeces em humanos. Rhodococcus sp. foram isolados de casos de septicemia endoftalmites. Gordonia spp. de infeces cutneas, pulmonares e sistmicas enquanto Tsukamurella spp. foram isoladas de casos de meningite, pneumonia e peritonite.
Importncia clnica
103
O diagnstico clnico diferencial deve ser feito com micobactrias, fungos, nocardia e actinomices. Hemoculturas com elevada frequncia podem ser positivas. O R equi aerbio, no formador de esporos, imvel, catalase-positivo, DNAse e gelatinase negativos, CAMP positivo (utilizando cepa de Staphylococcus aureus produtora de beta-lisina), incapaz de hidrolizar a esculina, apresenta variabilidade na reduo do nitrato e produo de urease e no fermenta acares. Alguns autores descreveram amostras de R. equi esculina-positivas e/ ou capazes de metabolizar a glicose. A colheita e o transporte dos espcimes seguem os procedimentos comumente utilizados na rotina laboratorial. As amostras de R. equi podem ser isoladas principalmente a partir de sangue, secrees do trato respiratrio, extremidades de cateteres e de outros stios de infeces de acordo com o quadro clnico do paciente. Procedimentos invasivos, como a broncoscopia, podem favorecer o isolamento do micro-organismo nas secrees do trato respiratrio inferior. Na bacterioscopia direta dos espcimes clnicos, o R. equi pode ser observado sob a forma de bastonetes ou cocobacilos localizados extra ou intracelularmente. Em algumas oportunidades o micro-organismo apresenta-se lcool-cido resistente pelos mtodos de colorao de Ziehl ou de Kinyoun. Entretanto os procedimentos de descontaminao dos espcimes clnicos utilizados para micobactrias podem ser prejudiciais ao isolamento do micro-organismo. A maioria dos meios de cultivo empregados na rotina microbiolgica permite o crescimento dos micro-organismos do gnero Rhodococcus, Gordonia e Tsukamurella. Meios seletivos especficos tambm podem ser utilizados na rotina microbiolgica (NANAT). As culturas devem ser incubadas em aerobiose ou em atmosfera de 5% de CO2 em temperaturas entre 35 e 370C. Devem ser examinadas a cada dois dias durante a primeira semana de incubao e 3 a 4 dias durante a segunda e terceira semanas. Nos cultivos realizados em meios slidos, inicialmente o R. equi pode originar colnias esbranquiadas, no hemolticas, comumente mucoides, que frequentemente podem adquirir colorao rosada ou salmo dentro de 4 a 7 dias. No entanto, outras coloraes, tais como vermelho, coral, laranja, amarelo, creme at o branco podem ser observadas mais raramente, sendo tambm infrequente a formao de colnias no mucides. A diferenciao entre as espcies dos gneros Rhodococcus, Gordonia, Tsukamurella e Nocardia pode ser difcil. As cepas de R. equi so sensveis aos antimicrobianos vancomicina, eritromicina e gentamicina permitindo uma diferenciao preliminar das cepas de nocardias. As dificuldades no diagnstico microbiolgico parecem decorrer do isolamento de amostras bacterianas que assemelham-se morfologica e bioquimicamente ao R equi (Rhodococcus equi-like). Segundo alguns autores, tambm tem sido frequente a caracterizao errnea do R. equi como Mycobacterium ou o seu descarte como mero contaminante. Alm dos mtodos bioqumicos convencionais encontram-se comercialmente disponveis sistemas semiautomatizados de identificao, alm de mtodos moleculares.
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Captulo 7: Fastidiosos
John Anthony McCulloch Carlos Emlio Levy Marina Baquerizo Martinez
7.1 Introduo
7.1.1 Caractersticas gerais dos fastidiosos Esse grupo heterogneo de bactrias apresenta como caracterstica comum exigncias especiais de condies de cultivo, em relao s enterobactrias e maioria dos bacilos Gram-negativos no fermentadores. As condies de cultivo variam para cada micro-organismo, tal como uma concentrao de CO2 maior do que a da atmosfera, um maior tempo de incubao (30 dias no caso de espcies do gnero Brucella), ou a suplementao de meios de cultivo com fatores especiais de crescimento, etc. Pontos-chave para classificao Os fastidiosos so bactrias Gram negativas ou Gram lbeis (coram-se de forma tnue pela safranina). Muitos, mas no todos, so coco-bacilos e oxidase positivos; no crescem em gar MacConkey. Para teste de fermentao de carboidratos exigem uma base mais rica do que a base O/F, usualmente empregada. Uma opo para testar a fermentao de carboidratos usar CTA como base (vide fascculo de Meios de Cultura). Para cultivo in vitro, o inculo deve ser denso, sendo que muitas vezes necessria a adio de 2 ou 3 gotas de soro de coelho ou cavalo para permitir o crescimento nos meios utilizados para provas bioqumicas. Com exceo das espcies do gnero Capnocytophaga spp., que crescem formando colnias grandes e com aparncia de vu em torno da colnia, os demais fastidiosos crescem lentamente e necessitam 48 a 72 horas para que as colnias fiquem plenamente visveis, ainda que diminutas.
109
7.1.2
Alguns desses patgenos em potencial esto associados a sndromes clnicas bem definidas, embora no frequentes, tal como a brucelose e tularemia. importante nesses casos obter informaes adicionais com o mdico assistente ou o paciente/familiares para facilitar o processo de identificao microbiolgica. Sempre se deve valorizar isolados de hemocultura, principalmente se ocorrerem em mais de uma amostra, ou em materiais com bom valor preditivo de infeco, tais como LCR, lquidos pleural, pericrdico e sinovial e lavado broncoalveolar. Cabe destacar que alguns fastidiosos podem positivar sistemas automatizados de hemocultura ao mesmo tempo em que a bacterioscopia pode apresentar-se aparentemente negativa tanto pelo pequeno tamanho da bactria como pela m colorao pela safranina. A topografia do local de isolamento uma pista importante, pois diferentes espcies pertencentes aos gneros Neisseria, Haemophilus, Bordetella, Capnocytophaga, Actinobacillus, Eikenella, Kingella e Cardiobacterium podem ser encontrados em pele e mucosas enquanto que bactrias do gnero Gardnerella o so em locais especficos, tal como no trato genital. Como o tratamento de infeces causadas por bactrias fastidiosas pode requerer a utilizao de esquemas teraputicos pouco usuais, extremamente importante chegar definio do gnero ao qual um isolado fastidioso pertence ou encaminh-lo a um Laboratrio de Referncia se o gnero no puder ser definido no laboratrio de rotina. A correta identificao de um fastidioso tambm importante por motivos de epidemiologia, uma vez que um aumento na incidncia de infeces por essas bactrias caracterizaria um surto, e logo, um problema de sade pblica. O diagnstico correto de casos isolados de brucelose, legionelose e coqueluche (causada por Bordetella pertussis) tem importncia individual e coletiva, sendo por isso de suma importncia que o microbiologista tenha em mente esses patgenos e saiba caracteriz-los ou tenha a iniciativa de encaminhar o espcime clnico ou a cepa isolada para Laboratrio de Referncia. A Pasteurella spp., embora considerada uma bactria fastidiosa, cresce com facilidade em gar Sangue, gar Chocolate, e comporta-se no TSI como fermentador, todavia no cresce em meio MacConkey. oxidase positiva. A transmisso de algumas bacterias fastidiosas ocorre atravs de contato com fluidos biolgicos contaminados (saliva, sangue e fezes), atravs de acidente com materiais prfuro-cortantes ou mordedura de animais domsti110
cos ou silvestres, que podem transmitir infeces por bactrias dos gneros Pasteurella, Bartonella, Francisella e Brucella. Destaca-se ainda a necessidade de precaues especiais no manuseio de alguns desses agentes pelo seu potencial patognico (gneros Brucella e Francisella). Com base na importncia clnica e epidemiolgica, esse grupo de bactrias ser dividido em dois grupos:

Grupo A: maior interesse clnico e epidemiolgico Grupo B: casos clnicos espordicos/microbiota oral humana
A) Grupo A Maior interesse clnico e epidemiolgico

Bactria
Bordetella pertussis/parapertussis Bartonella spp.
Hospedeiro principal Homem Gatos, humanos infectados,outros desconhecidos. Mamferos domsticos Animais silvestres Homem Meio ambiente/gua Animais domsticos/silvestres
Via de transmisso Secrees de vias areas Mordida ou arranho de gato; picada de piolho infectado Leite e derivados, carne, sangue, secrees de animais doentes Picada de carrapato ou mosquito infectado em zona endmica Secrees de vias areas Inalao de gua contaminada Mordida e secrees de animais domsticos e silvestres
Brucella spp. Francisella spp. Haemophilus spp. Legionella spp. Pasteurella spp.
B) Grupo B Casos clnicos espordicos

Bactria
Actinobacillus actinomycetemcomitans Cardiobacterium hominis Capnocytophaga spp. Chromobacterium violaceum Eikenella corrodens Kingella spp. Streptobacillus spp.
Fonte Cavidade oral humana Cavidade oral humana Cavidade oral humana gua e solo Cavidade oral humana Cavidade oral humana Cavidade oral de roedores
111
As caractersticas desse grupo heterogneo so: Dificuldade ou ausncia de crescimento em meios ricos como gar Sangue e gar Chocolate. Exigncia de incubao em diferentes concentraes de CO2. Dificuldade em caracteriz-los, pois exigem meios enriquecidos. Crescimento lento e pouca importncia clnica, talvez pela dificuldade do seu isolamento e caracterizao. Os gneros Actinobacillus, Capnocytophaga e Eikenella tm em comum o fato de pertencerem microbiota da cavidade oral humana e estarem relacionados a doenas gengivais e, a partir desse foco, doenas sistmicas especialmente em indivduos imunocomprometidos. As espcies dos gneros Kingella e Cardiobacterium so residentes do trato respiratrio humano. Em contraste, as bactrias desse grupo que no so encontradas em seres humanos so: Chromobacterium violaceum que encontrada na natureza, em gua e solo; e o gnero Streptobacillus, na orofaringe e nasofaringe de camundongos selvagens e de laboratrio. 7.1.3
Bactria Bordetella pertussis Bartonella spp. Brucella spp.
Principais fastidiosos e diagnstico

Material clnico Swab de nasofaringe Sangue, gnglios, bipsias Sangue, aspirado de medula Meio especfico Meio de Bordet & Gengou gar chocolate, gar sangue de carneiro Rotina de Hemocultura ou meio de Castaeda gar chocolate enriquecido gar chocolate de cavalo Meio especfico BCYE* gar sangue, gar chocolate Incubao 7 dias 5 a 15 dias At 30 dias
Francisella spp. Haemophilus spp. Legionella spp. Pasteurella spp.
Gnglios, bipsias Sangue, LCR Secrees ou aspirados de trato respiratrio inferior Sangue, LCR, leses
7 dias 48-72 h at 7 dias 7 a 14 dias 24 a 72 h
* gar extrato de levedura, carvo, com pirofosfato frrico e alfa-cetoglutarato.
112
7.1.4
Principais provas diferenciais para os fastidiosos

Oxidase neg/+ neg + + neg + V + neg Catalase fraco neg varivel + neg neg + neg + Motilidade + varivel neg neg neg neg + neg fraco gar neg + neg + + + + + neg Sangue + + neg + + + + + neg + Chocolate +
Bactrias Actinobacillus actinomycetemcomitans Bartonella spp. Bordetella pertussis Brucella spp. Capnocytophaga spp. Cardiobacterium hominis Chromobacterium spp. Eikenella corrodens Francisella tularensis neg
7.2 Bartonella
A classificao taxonmica dos membros do gnero Bartonella ainda no definitiva e agrupa as espcies B. bacilliformis, B. quintana, B. henselea, B. elizabethae e Afipia felis. B. bacilliformis o agente etiolgico da verruga peruana (febre de Oroya), doena geograficamente restrita regio dos Andes, caracterizada por profunda anemia, trombocitopenia, adenopatia, mialgia, delrio, coma e alta mortalidade. B. quintana causa de doena febril que afetou soldados na I Guerra Mundial, conhecida como febre das trincheiras, e relacionada picada por piolhos infectados e m higiene. Caracterizada por febre e bacteremia com durao varivel. Casos associados infeco por HIV foram relatados. B. henselae pode causar bacteremia, principalmente em imunossuprimidos, bem como uma sndrome conhecida como doena da arranhadura do gato. O quadro de bacteremia caracteriza-se de forma insidiosa por fadiga, dores no corpo, perda de peso e febre progressiva. A doena da arranhadura do gato manifesta-se inicialmente com uma ppula ou pstula localizada cerca de uma semana aps a leso causada pelo animal (gato ou co que arranha ou morde). Aps 1 a 7 semanas ocorre adenopatia regional. Um tero dos pacientes apresenta febre e um em seis apresenta supurao do linfonodo afetado. A maioria dos pacientes evolui sem outros sintomas. A cura espontnea ocorre entre 2 a 4 meses do incio da infeco. B. quintanae e B. henselae podem causar um quadro de angiomatose bacilar caracterizado por proliferao neovascular envolvendo pele, gnglios e fgado. A infeco por B. elizabethae ainda pouco conhecida.
113
Afipia felis foi considerada por vrios anos como sendo o agente etiolgico da doena da arranhadura do gato, que hoje atribuda B. henselae. Seu papel na patognese dessa doena ainda no est bem esclarecido. Isolamento As espcies do gnero Bartonella podem ser isoladas de hemoculturas, leses cutneas, bipsias e gnglios. O SPS (polianetol sulfonato) que o anticoagulante comumente usado em hemoculturas inibidor de espcies do gnero Bartonella, por isso deve-se usar outro anticoagulante. Quando h suspeita clnica, deve-se incubar por pelo menos sete dias, at 40 dias. Vrios meios enriquecidos podem permitir o crescimento das espcies do gnero Bartonella. O caldo infuso corao de preparo recente, com 5-10% de sangue desfibrinado de coelho ou cavalo adequado, bem como o gar chocolate. Essas espcies podem crescer no meio de cultura do sistema Bactec, todavia o alarme de CO2 que indica o crescimento bacteriano pode no ser acionado. Bartonella spp. exige atmosfera mida e temperatura de 35-37oC por 3 a 4 semanas. B. bacilliformis e Afipia fellis crescem melhor entre 25 a 30oC. Identificao Colnias podem crescer rugosas ou lisas, de um mesmo material. So bacilos Gram-negativos pequenos, s vezes curvos. As espcies B. quintana e B. henselae, que so as mais frequentemente isoladas, so caracterizados pelas seguintes provas: catalase e oxidase negativas, motilidade em lmina presente (que no devida a flagelos, uma vez que essas espcies no o possuem, mas sim a fmbrias). O perodo de incubao longo (maior do que sete dias). A espcie B. henselae bastante aderente ao meio.
Provas para diferenciao de espcies de Bartonella e de A. felis Espcies B. baciliformis B. quitanae B. henselae B. elizabetae A. felis * Motilidade por fmbrias + neg neg neg + Catalase Oxidase neg neg neg neg + neg neg neg neg + Ureia + + + neg + Flagelo + * * neg + Motilidade
114
7.3 Bordetella sp.

7.3.1 Caractersticas gerais O gnero Bordetella compreende as espcies B. pertussis, responsvel pela coqueluche ou tosse comprida, e B. parapertussis, com quadro clnico semelhante ao da coqueluche, mas em geral menos severo. Ambas as espcies so exclusivamente patognicas para humanos. A B. bronchiseptica e B. avium so bactrias comensais de mamferos e aves, causando infeces em ces (tosse dos canis) e a B. avium causa rinotraquete em perus. So patgenos oportunistas para humanos que entram em contato com esses animais. Foram classificadas mais recentemente como pertencentes ao gnero Bordetella as espcies B. holmesii e B. hinzii. Importncia clnica A Bordetella pertussis causa a coqueluche em crianas no vacinadas, com quadro clnico bastante caracterstico: Perodo prodrmico que inicia 5 a 10 dias aps a aquisio do agente, com sintomas semelhantes a um resfriado ou gripe. Essa fase altamente contagiosa e os sintomas so inespecficos. Segue-se o perodo paroxstico, com quadro de tosse convulsiva, persistente e caracterstica, seguida de inspirao ruidosa. Podem ser acompanhadas de cianose e vmito e vrias complicaes, tal como convulses, insuficincia respiratria, encefalopatia e infeces secundrias. A convalescena ocorre cerca de quatro semanas aps incio dos primeiros sintomas. Material clnico e Semeadura Para cultivo, podem ser coletadas secreo de nasofaringe por aspirao ou swab seguido de semeadura imediata em meio de Bordet & Gengou suplementado com 40 g/mL de cefalexina (para inibir os contaminantes da microbiota) recm-preparado. Um meio alternativo mais especfico e sensvel o MCS (Ohtuska et al., 2009). Os meios devem ser incubados a 35C por 5 dias at a obteno de colnias. Pode-se realizar uma prova de imunofluorescncia utilizando material colhido da nasofaringe, em concomitncia com o cultivo, que por sua vez mais especfico, e no pode ser omitido. O cultivo, todavia no sensvel j na fase de convalescena, quando ento a melhor opo para diagnstico a sorologia do paciente. Devido s dificuldades inerentes cultura, outro mtodos tm sido utilizados com algumas vantagens. Esto entre esses a imunoflorescncia direta (FA) e o PCR realizados a partir do material clnico. Diferentes iniciadores ou primers tm sido usados para PCR. Uma combinao de mtodos incluindo testes sorolgicos talvez seja a melhor abordagem.
7.3.2
7.3.3
115
Vrios meios de transporte so indicados, incluindo casena hidrlise cida a 1% (Casamino cido) e meio de Amies acrescido de carvo. Vrios meios de isolamento foram descritos, O meio tradicional consiste em base de batata (Bordet-Gengou) ou de carvo suplementado com glicerol, peptona e sangue de cavalo ou carneiro. Antimicrobianos com cefalexina devem ser adicionados para diminuir o crescimento da microbiota. 7.3.4 Isolamento e Identificao As espcies do gnero Bordetella so cocobacilos Gram-negativos pequenos e aerbios estritos. Na colorao de Gram, a safranina deve ser deixada por 2 minutos. Para B. pertussis e B. parapertussis os Laboratrios de Referncia devem dispor de identificao sorolgica para acelerar a identificao.
Provas diferenciais para espcies de Bordetella Espcies B. pertussis B. parapertussis B. bronchiseptica B. avium B. holmesii B. hinzii Oxidase + neg + + neg + Motilidade neg neg + +2 neg + Ureia neg + em 24h + em 4h neg neg varivel gar Sangue e Chocolate neg + + + + + B & G ou Regan-Lowe + 3-6 dias + 2-3 dias + 1-2 dias + 1-2 dias + 1-2 dias + 1-2 dias Salmonella -Shigella neg neg + + + +
1 necessita de meio especfico: Bordet & Gengou (infuso de batata + glicerol + sangue de carneiro) ou Regan Lowe. 2 mais evidente a 25C
7.4 Brucella sp.

A brucelose uma doena de sintomas vagos, de curso insidioso com febre baixa, calafrios, sudorese noturna, cefaleia, mialgia e artralgia. Pode ser acompanhada, na forma crnica, de alteraes hematolgicas importantes como leucopenia, pancitopenia, trombocitopenia e anemia hemoltica. 7.4.1 Importncia clnica A brucelose pode ser contrada atravs da ingesto de leite e seus derivados ou de carne de mamferos infectados. Profissionais como veterinrios, aougueiros ou trabalhadores rurais que manipulam carne e sangue desses animais esto sujeitos infeco. H relatos de contrao de brucelose devido a acidentes em laboratrios que trabalham com Brucella sp. A hemocultura exige um tempo maior do que 5 a 7 dias de incubao. importante a infor-
116
mao de suspeita clnica para orientar o laboratrio na pesquisa e caracterizao do agente. 7.4.2 Material clnico e Semeadura Sangue, aspirado de medula, aspirado e bipsia de gnglios, fgado, bao, LCR e outros materiais. A partir do segundo dia de febre, as hemoculturas podem apresentar-se positivas, ocorrendo tambm hemoculturas positivas em pacientes afebris. Outro recurso utilizado para facilitar o isolamento o mtodo de lise-centrifugao: Colher 5 a 10mL de sangue em tubo de 50mL com 1,5mL de citrato de sdio a 4%. Adicionar cerca de 40mL de gua destilada estril. Centrifugar 2.000g por 30 minutos. Transferir 0,5mL do sedimento para uma placa de gar sangue e semear. Pode-se fazer o mesmo com LCR e aspirado de medula. Incubar 35oC em estufa com atmosfera de 5% a 10% de CO2 (com gerador de CO2 ou estufa apropriada). Isolamento e Identificao As espcies do gnero Brucella so aerbios OF oxidativos, crescem nos frascos de hemocultura, meio de Thayer Martin, gar sangue, gar chocolate tendo como gar base Tripticase Soy gar ou Brucella gar, mas no cresce em Mc Conkey. O crescimento visvel em 48 a 72 horas aps inculo. As colnias so pequenas, brancas a creme, e atravs da colorao de Gram visualizam-se coco-bacilos bem finos e pequenos. Espcies mais importantes so: melitensis, abortus, suis e canis. Ureia positivos: B. suis (1 a 30 minutos), B. canis (1 a 30 minutos) e B. abortus (1 a 2 h). no meio ureia de Christensen. H2S com tira de acetato positivo: B.abortus e de B.suis (biotipo 1). CO2 para crescimento: biotipos de B. abortus e B. ovis.
7.4.3
117
Provas para a diferenciao de coco-bacilos Gram-negativos Bactria Brucella spp. Bordetella bronchiseptic Acinetobacter spp. Moraxella phenylpyruvica Pasteurella spp. Haemophilus influenzae + + neg + * + Oxidase Motilidade neg + neg neg neg neg + + varivel + varivel varivel Ureia gar Sangue + + + + + neg Mac Conkey neg neg + + neg neg
* cresce no TSI como fermentador acidificando pice e base sem gs.
Considerando que as espcies do gnero Brucella so de difcil identificao em laboratrio no especializado, um isolado que for identificado no laboratrio de rotina como pertencente a esse gnero deve ser encaminhado a um laboratrio de referncia para confirmao. Suspeitar quando houver quadro clnico sugestivo, quando o isolado for encontrado em amostra de sangue ou medula, cuja cultura resulta em crescimento de coco-bacilos finos que se coram fracamente, so oxidase e catalase positivas, e que crescem lentamente em gar sangue ou chocolate. A prova de soroaglutinao com anticorpos especficos til como elemento da caracterizao.
7.5 Francisella tularensis

um coco-bacilo pequeno, Gram-negativo, no-mvel e pleomrfico, aerbio estrito e capsulado. Apresenta grande resistncia perda da viabilidade no meio ambiente, sobrevivendo semanas em meios midos, carcaas de animais, gua e lama. o agente etiolgico da tularemia, uma doena de animais selvagens transmitida por vetores artrpodes hematfagos. transmitida principalmente por carrapatos, mas tambm por mosquitos. Nos Estados Unidos prevalece o biovar A, mais grave, enquanto que no hemisfrio sul prevalece o biovar B que causa tularemia em uma forma clnica mais branda, sendo raramente diagnosticada, principalmente devido ao pouco conhecimento sobre a bactria e a doena pelos profissionais de sade. 7.5.1 Fontes de transmisso Centenas de espcies de animais silvestres, bem como algumas espcies domsticas (incluindo ces, gatos e pssaros), podem ser portadores desse agente. Cerca de uma dezena de espcies diferentes de inseto servem de vetores. A
118
transmisso pode ocorrer tambm por contato direto com animais infectados atravs de sua mordida, exposio ao sangue, carne contaminada e eventualmente gua contaminada por esses animais, e at mesmo pela inalao de aerossis deixados pelos animais infectados. 7.5.2 Quadro clnico A bactria extremamente infectante, sendo que o material clnico suspeito deve ser manipulado de acordo com as prticas de biossegurana nvel 2, mas culturas puras dessa espcie devem ser manipuladas de acordo com as prticas de biossegurana nvel 3. A dose infecciosa de apenas 10 clulas injetadas por via subcutnea ou 25 clulas inaladas. Logo aps a penetrao do agente, o que ocorre em geral pela pele, aparecem sintomas semelhantes aos da gripe: febre, tremores, cefaleia e mialgia. Aps um perodo de incubao de 2 a 10 dias, forma-se uma lcera no local de penetrao, que pode persistir por meses. Os linfonodos que drenam a regio inicialmente afetada ficam entumecidos e ento pode ocorrer necrose do tecido. Se a bactria conseguir atingir a circulao sangunea, o quadro de endotoxemia tpico se manifesta. Esses casos so pouco frequentes e ocorrem quando o inculo for grande ou o paciente imunocomprometido. A mortalidade alcana 60%, ocorrendo toxemia, cefaleia intensa, febre elevada e contnua, com delrios, prostrao e choque. A forma lcero-ganglionar ocorre em cerca de 80% dos casos relatados. A lcera endurada, eritematosa, e de difcil cicatrizao. Outras formas relatadas so a culo-ganglionar, a ganglionar sem lcera, a pleuropulmonar e a gastrointestinal. 7.5.3 Material clnico e Semeadura Os materiais que oferecem maior valor preditivo positivo so aqueles obtidos a partir de raspados de lceras, bipsias e escarro. A Francisella tularensis cresce em gar chocolate suplementado com o suplemento comercialmente disponvel Isovitalex . Um laboratrio de referncia deve ser consultado sobre as tcnicas e procedimentos mais recentes para a correta identificao dessa espcie e, se necessrio, pode realizar a confirmao da identificao da amostra. Isolamento e Identificao A bacterioscopia de material clnico de leses ou bipsias raramente ajuda, pois o micro-organismo muito pequeno e cora mal pelo mtodo de Gram, tornando difcil a sua observao por microscopia ptica. Esse agente deve ser considerado sempre que houver doena associada a picada de carrapato e formao de lcera com comprometimento ganglionar. Entretanto, o diag119
7.5.4
nstico microbiolgico difcil, sendo na maioria das vezes feito com base em testes de aglutinao em amostras pareadas colhidas com intervalo de 2 a 3 semanas e armazenadas a 20oC.
7.6 Haemophilus sp.

Diferentes espcies pertencentes ao gnero Haemophilus podem ser encontradas como parte da microflora da nasofaringe e orofaringe em at 50% da populao. As espcies so geralmente no capsuladas. H. influenzae pode causar vrios tipos de infeco, sendo H. influenzae do tipo b a sub-espcie mais virulenta. A partir do incio do sculo XXI, com o aumento da vacinao contra Haemophilus influenzae, houve uma drstica reduo na incidncia dessa bactria nas populaes vacinadas. Doenas causadas pelo H. influenzae tipo b ocorrem principalmente na infncia, sendo meningite, epiglotite, pericardite, pneumonia, artrite sptica, osteomielite, celulite facial. Mais raramente, H. influenzae pode causar peritonite e infeco urinria em crianas menores que cinco anos. As doenas causadas por cepas no b e no tipveis (em maiores de 9 anos e adultos associados a doena de base predisponente, como neoplasia, AIDS, alcoolismo, DPOC) incluem traqueobronquite e pneumonia, bacteremia, conjuntivite, otite (sendo a segunda espcie mais prevalente, depois do pneumococo) e sinusite. 7.6.5
Haemophilus aphrophilus Essa espcie faz parte da microbiota do trato respiratrio superior, especialmente em placas dentrias e no sulco gengival; pode causar endocardite e abscesso cerebral e mais raramente meningite, pneumonia e bacteremia em pacientes com comprometimento imunolgico. A endocardite no est necessariamente relacionada a uma leso valvular prvia, mas a associao com embolia arterial frequente. Existem relatos tambm de isolamento em otites, sinusites e epiglotites. Essa espcie cresce bem em gar chocolate no isolamento primrio e em gar sangue de carneiro nos subcultivos sem exigncia de fatores X e V, mas as colnias so muito pequenas de cor amarelada, tm cheiro de cola e necessitam de 48 a 72h para boa visualizao. Em caldo, essa espcie tem a caracterstica de aderir-se s paredes do tubo, assim como Actinobacillus actinomycetemcomitans o faz. No crescem em meio MacConkey. Haemophilus ducreyi o agente etiolgico do cancro mole, que uma afeco de transmisso exclusivamente sexual, mais frequente nas regies tropicais. Caracteriza-se por leses mltiplas (podendo ser nica) e habitualmente dolorosas. Denomina-se tambm de cancride, cancro venreo, cancro de Ducrey. O perodo
7.6.6
120
de incubao geralmente de 3 a 5 dias, podendo-se estender por at 2 semanas. O cancro mole muito mais frequente no sexo masculino. Devido ao declnio da incidncia da infeco, contaminao das leses com flora genital, que inibe e/ou dificulta o isolamento da espcie e ao frequente uso prvio de antibiticos o isolamento dessa bactria difcil. O material para o isolamento deve ser colhido de lceras genitais, removendo-se previamente a secreo superficial ou lavando-a com salina estril e utilizando um swab. Recomenda-se semear imediatamente e fazer em paralelo um esfregao a ser observado por microscopia. Em geral de difcil cultivo. Emprega-se gar chocolate de cavalo com base GC ou meio Mueller Hinton. O acrscimo de vancomicina pode ajudar a inibir bactrias Gram-positivas. A colorao de Gram em esfregaos do material da base da lcera, ou do material obtido por aspirao do bubo permite a observao de bacilos Gram-negativos intracelulares dispostos em cadeias, geralmente paralelas, acompanhados de cocos Gram-positivos. A colocao de um disco de vancomicina pode ajudar a inibir bactrias Gram positivas. Na bacterioscopia, aparecem coco-bacilos Gram lbeis agrupados e em cadeias como cardumes. 7.6.7 Identificao de espcies do gnero Haemophilus Caractersticas: Anaerbio facultativo. No crescem no TSI e no OF-glicose. Melhor meio de cultura para Haemophilus influenzae o gar chocolate com sangue de cavalo. A base GC usada para Neisseria sp. indicada, embora os hemfilos cresam em meios com outras bases, tal como Columbia e Mueller Hinton. Esse gnero exige uma atmosfera com alta umidade e uma concentrao CO2 entre 3 a 5%, especialmente para as espcies H. influenzae e H. aphrophilus. O gar chocolate suporta muito bem o crescimento dos Haemophilus, mas para outros fastidiosos recomenda-se adicionar suplemento de crescimento (vitox, isovitalex ).
As diferentes espcies de hemfilos podem apresentar reao de oxidase fracamente positiva e demorada (cerca de 25 a 20 segundos). Em amostras de LCR, pode ser til a utilizao de tcnicas de soroaglutinao com partculas de ltex, mas a confirmao bioqumica e sorolgica em laboratrio de referncia necessria. O antibiograma deve ser realizado em meio padronizado HTM ( vide captulo sobre meios de cultura).
121
Verificar hemlise em gar sangue de cavalo GLI = glicose SAC = sacarose LAC = lactose Obs.: Fermentao de aucares com base CTA e 1% de acar adicionado de fator X e V (vide cap. meios de cultura); vide leitura de fatores X e V Tcnica para testar fatores X e V
7.6.8
Espcies H. influenzae H. haemolyticus
Principais provas para diferenciar algumas espcies de Haemophilus Fator X + + neg + neg Fator V + + + neg neg Hemlise * neg + neg fraca neg Fator V Ureia + + + neg neg Indol neg neg + neg neg GLI varivel varivel varivel neg + SAC neg neg varivel neg + LAC neg neg neg neg + Catalase + + varivel neg neg
H. parainfluenzae H. ducreyi H. ducreyi
Fator X
Fator V X
Usar meio gar tripticase soja ou BHI gar. Discos comerciais impregnados com os fatores X=hemina/hematina e V=NAD ou coenzima I. Semear a bactria como se fosse fazer um antibiograma e colocar os discos com pina a uma distncia de 1,5 cm um disco do outro. Flambar a pina antes e aps a retirada de cada disco. Aps 24h de incubao em jarra com vela e umidade a 35oC, verificar crescimento prximo aos discos: Haemophilus influenzae: Crescimento entre os discos (exige X e V).
7.6.9
Prova do satelitismo Semear com swab uma suspenso em salina cerca de 1 a 2 da escala MacFarland no centro de uma placa de gar sangue de carneiro. Semear em uma nica estria um repique de S. aureus hemoltico (ATCC 25923). Incubar 18 a 24h em jarra com vela e umidade ou CO2 a 5%. Verificar crescimento de colnias pequenas prximas a zona de hemlise do estafilococo.
122
Encaminhar cepas isoladas de lquidos nobres (sangue, LCR, pleural, pericrdico) a Laboratrios de Referncia para confirmao e sorotipagem.
7.7 Legionella sp.

7.7.1 Importncia clnica Pneumonia com ou sem sepsis a manifestao clnica mais importante, podendo ocorrer tambm infeces de partes moles e sinusite. Est em geral associada a surtos cuja fonte a gua contaminada com esse agente. Largamente distribuda na natureza em ambiente mido e gua potvel e ocasionalmente em chuveiros. Est associada presena de outras bactrias e amebas de vida livre na gua. A presena de bactrias do gnero Legionella em material clnico humano est invariavelmente associada doena clnica. Espcies e manifestaes clnicas Existem algumas dezenas de espcies de Legionella, sendo a espcie mais importante a L. pneumophila, sorogrupos 1 e 6. A doena pode apresentar-se nas formas subclnica, no pulmonar, pneumonia e doena extrapulmonar. A forma no pulmonar tem perodo de incubao curto (horas a dias), sendo autolimitada e sem evidncias radiolgicas de comprometimento pulmonar. Os sintomas so febre, mal-estar, mialgia e tosse. A pneumonia a forma mais frequente de manifestao da doena, acompanhada dos mesmos sintomas acima descritos para a forma no pulmonar e em geral com tosse no produtiva. A doena apresenta rpida progresso e, nos casos graves, a formao de abscessos so sugestivos da legionelose. Bacteremia comum e o comprometimento dos mais variados orgos e tecidos j foi descrito. Materiais recomendados Escarro. Aspirado traqueal e outros que nesse caso especfico esto indicados como teis. Lavado/escovado bronco-alveolar. Bipsia pulmonar ou outros tecidos e aqueles obtidos em autpsia. LCR e outros lquidos de derrame. Urina (pesquisa de antgenos) conservar a 20oC. Para transporte: usar frasco estril com gua destilada estril, mas no salina, que pode inibir o cultivo. Sempre que possvel concentrar os materiais por centrifugao, evitando formar aerossis.
7.7.2
7.7.3
123
7.7.4
Recursos diagnsticos mais utilizados

Sensibilidade e especificidade de recursos diagnsticos para legionelose Sensibilidade 70% 55-90% 70-80% Especificidade 100% 85-99% >95% Observao * Mtodo de escolha til com cultura ou fins epidemiolgicos
Teste Cultura Aglutinao pelo ltex Imunofluorescncia ndireta
7.7.5
Cultura em meio enriquecido Cresce em meio suplementado com extrato de levedura, l-cisteina, sais de ferro e alfacetoglutarato em meio denominado BCYEa ou BCYE, e seu crescimento favorecido pela incubao em 5% de CO2. Para materiais com microbiota, como para secreo traqueal e escarro, acidificar o meio por 15 minutos a pH 2,0 com tampo cido (0,2M HCl e 0,2M KCl) e em seguida neutralizao a pH 7,0 com KOH 0,1N. Cultura em meio seletivo Recomenda-se uso de meio seletivo, adicionando ao meio BCYE os antibiticos: polimixina B, cefamandol e anisomicina ou vancomicina, polimixina B e anfotericina B. As colnias so azuladas ou esverdeadas. Cultura em meio diferencial BCYE Adicionado de glicina, vancomicina, prpura de bromocresol e azul de bromotimol, a cor das colnias indicativa da espcie, sendo: L. pneumophila (branco esverdeado), L. micdadei (colnias azul claro ou acinzentadas), outras legionelas (colnias verde bem claro). Crescem bem no frasco utilizado pelo BACTEC. Identificao So bacilos Gram-negativos finos que se coram fracamente pela fucsina ou safranina da colorao de Gram. Aps repiques, tornam-se filamentosos. Caractersticas e procedimentos Aerbio estrito. No primeiro isolamento a presena de l-cistena imprescindvel. No meio BCYEa o crescimento pode ser observado a partir do 3 ao 5 dia a 35C. Semear o material tambm em gar sangue como controle, pois a Legionella no dever crescer. Aguardar 14 dias de incubao para descartar as culturas como negativas.
7.7.6
7.7.7
7.7.8
7.7.9
124
7.7.10 Caractersticas da L. Pneumophila oxidase positiva fraca catalase positiva no sacaroltica motilidade positiva gelatinase positiva hidrlise do hipurato positiva sensvel a macroldeos, rifampicina, sulfametoxazol-trimetoprim e a quinolonas. A identificao com base apenas em testes laboratoriais difcil. A suspeita deve ser baseada na clnica, no aspecto da colnia, crescimento em meio BCYEa, dependncia da l-cisteina, ausncia de crescimento em gar sangue e gar chocolate no suplementados. A imunofluorescncia direta de amostras clnicas utilizadas para cultura um mtodo complementar para diagnstico da legionelose. Encaminhar cepas suspeitas a Laboratrio de referncia para confirmao.
7.8 Pasteurella sp.

A infeco pelo gnero Pasteurella constitui uma zoonose, pois se trata de bactria que faz parte da microbiota oral e do trato respiratrio superior de alguns mamferos no humanos e aves. As diferentes espcies esto associadas a infeces em humanos relacionadas mordida dos animais descritos abaixo ou com o contato com o sangue, carne, carcaa, ou outros materiais de animais infectados/colonizados. A P. multocida a espcie mais comumente isolada em material clnico humano, em geral associada mordida ou arranhadura de ces e gatos. Caracteriza-se pela formao de abscessos ou celulite e, eventualmente, osteomielite. Infeces respiratrias podem ocorrer, incluindo pneumonia lobar, com ou sem derrame e empiema. Em pacientes imunocomprometidos, com cirrose ou neoplasias essa espcie pode causar bacteremia e septicemia.
125
Principais espcies de Pasteurella e doenas relacionadas Bactria P. multocida Doenas Relacionadas Microbiota do trato respiratrio de mamferos e aves (domsticos e silvestres, encontrado na boca de cerca de 50% dos ces e gatos). Pode causar infeces em mamferos e diarreia em aves. Trato respiratrio de roedores, ces, gatos, entre outros. Infeces pulmonares em bovinos, mastite em ovelhas, sepse em ovinos e caprinos. Infeces pulmonares em bovinos, mastite em ovelhas, sepse em ovinos e caprinos. Trato respiratrio de ces e gatos
P. pneumotropica P. haemolytica P. aerogenes P. dagmatis (n. sp1)
7.8.1
Diagnstico de zoonoses Para facilitar o isolamento e identificao de espcies do gnero Pasteurella, muito importante a informao clnica, pois deve-se tambm considerar outras zoonoses tal como brucelose, micobacterioses, tularemia, leptospirose e yersiniose. A) Caracterizao microbiolgica Coco-bacilo ou bacilo Gram-negativo podem ser capsulados. Anaerbio facultativo (fermentador) TSI cido/cido. Oxidase positiva em colnias isoladas em gar sangue ou gar chocolate. Catalase positiva. Motilidade negativa. Indol positivo. Sacarose positiva. Muitas espcies so ornitina positivas. Todas so oxidase positiva, catalase positiva e fermentadoras da glicose.
Provas diferenciais das espcies de Pasteurella sp. de importncia clnica
Espcie P. multocida P. pneumotropica P. haemolytica P. aerogenes P. dagmatis (n. sp1)
Hemlise neg neg positivo neg neg
MacConkey neg V V 72% positivo neg
Indol positivo positivo neg neg positivo
Ureia neg positivo neg positivo positivo
Ornitina positivo positivo V V positivo
OF Glicose F sem gs F gs V F sem gs F sem gs F sem gs
Obs.: a P. multocida cresce bem em gar sangue de carneiro e gar chocolate, formando pequenas colnias acinzentadas. No cresce em gar Mac Conkey. Tem odor forte caracterstico e podem ser diferenciadas entre si por poucas provas (vide tabela acima), mas dependendo do animal-fonte, outras espcies menos frequentes podem estar envolvidas.
126
7.9 Actinobacillus sp.

So habitantes das mucosas do trato respiratrio e urinrio de humanos e outros animais. As trs espcies mais importantes so: A. actinomycetemcomitans, A. urea e A. hominis. A. actinomycetemcomitans est relacionada doena periodontal e particularmente periodontite juvenil localizada, bem como endocardite e abscesso cerebral como complicao de infeco na cavidade oral. A doena periodontal est associada endocardite pelos seguintes agentes:

A. actinomycetemcomitans Cardiobacterium hominis E. corrodens Kingella spp.
As outras espcies de Actinobacillus so patgenos oportunistas e causam raramente infeces do trato respiratrio e bacteremia. 7.9.1 Principais caractersticas para diagnstico So coco-bacilos Gram-negativos ou pequenos bacilos que crescem em aerobiose, em uma atmosfera com umidade de 5% a 10% de CO2 ou anaerobiose em gar sangue e gar chocolate. Recomenda-se adicionar suplementos com vitaminas e sangue lisado de carneiro ou cavalo ao gar chocolate. As colnias ficam bem visveis com 48 a 72 h de incubao, so brancas acinzentadas, com um pregueamento no centro, fortemente aderentes ao meio e pegajosas no primeiro isolamento.
Provas diferenciais entre os principais fastidiosos Bactrias Actinobacilus1 Cardiobacterium Eikenella Kingella Kingella Streptobacillus Chromobacterium Oxidase neg ou + fraco + + + neg2 neg varivel Catalase + neg neg neg neg neg + CO2 + + + + + + neg MacConkey varivel neg neg neg neg neg + Ureia neg neg neg neg neg neg neg Indol neg + neg neg neg neg neg + + neg + + + + Glic TSI ac/ac ac/ac alcalino alcalino No cresc. No cresce ac/ac Motil neg neg neg neg neg neg +
127
Principais caractersticas das bactrias fastidiosas analisadas Actinobacilus sp. Cardiobacterium sp. Eikenella sp. Kingella sp. Capnocytophaga sp. Streptobacillus sp. Chromobacterium sp. Cocobacilos a bacilos longos, anaerbios facultativos, colnias cinza, aderentes ao meio, com centro da colnia enrugado Bacilos que podem apresentar formas semelhantes a gota dgua Cocobacilos com extremidades arredondadas, cheiro de gua clorada, colnias podem corroer o meio Pequenos cocobacilos Fusiforme e curvo, colnias crescem espalhadas Filamentos longos Pode ter forte pigmento violeta, cresce em gar MacConkey
7.10 Capnocytophaga sp.

As espcies Capnocytophaga gingivalis, C. granulosa, C. haemolitica, C. ochracea e C. sputigena fazem parte da microbiota da cavidade oral humana, enquanto outras espcies podem ser encontradas na boca de animais domsticos. O isolamento de Capnocytophaga sp. ocorre com maior frequncia em hemoculturas, em pacientes neutropnicos com mucosite, mas esto tambm implicadas na doena periodontal juvenil (C. gingivalis e C. ochracea), periodontite em adultos (C. sputigena) e isoladas em placas dentais supragengivais em adultos (C. granulosa e C. haemolytica). As doenas localizadas (ceratites, abscessos e endoftalmites), bem como doenas sistmicas (septicemia, endocardite, osteomielite), ocorrem em pacientes imunocomprometidos ou no. 7.10.1 Morfologia e cultivo A morfologia de espcies do gnero Capnocytophaga bem caracterstica, facilitando a sua identificao, pois lembra um Fusobacterium sp. aerotolerante. Tem as extremidades afiladas e o centro mais largo, podendo ser encurvada e eventualmente cocoide. Para cultivo, crescem melhor com 5 a 10% de CO2 e em anaerobiose, o que pode levar confuso com o anaerbio estrito, se no for feita a prova de crescimento em aerobiose com CO2. Chama a ateno o fato de crescer melhor em gar sangue de carneiro que em gar chocolate sem suplemento de vitaminas. No crescem em gar MacConkey. O crescimento pode ocorrer em 24 a 72 h. A colnia chata e sua borda irregular; com incubao mais longa, nota-se o espalhamento em torno da colnia, semelhante ao que ocorre com Proteus sp., mas em escala muito reduzida, cerca de 2 a 4 mm de dimetro. A espcie C. haemolytica apresenta um poder hemoltico discreto, e a espcie C. ochracea tem cheiro de amndoas.
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7.10.2 Identificao As Capnocytophaga sp. de origem humana so oxidase e catalase negativas, produzem cido a partir da glicose em caldo enriquecido com soro de coelho com inculo denso. So motilidade negativa; indol negativo; lisina, ornitina e arginina negativas. A maioria esculina positiva (C. gingivalis varivel). A diferenciao entre as espcies difcil. As amostras de origem animal (C. canimorsus e C.cynodegmi) so oxidase, catalase e arginina positivas.
7.11 Eikenella sp.

Tambm uma espcie que faz parte da microbiota da cavidade oral humana e pode causar infeces periodontais, sendo encontrada na placa bacteriana subgengival em adultos com periodontite. Isolada de material obtido do trato respiratrio inferior, abscessos de partes moles, sangue e fludos estreis infectados em casos de infeces pleuropulmonares, infeces ps-cirrgicas, artrite, meningite, endocardite e septicemia. 7.11.1 Cultivo, bacterioscopia e identificao anaerbio facultativo, mas cresce melhor em atmosfera com 5% de CO2, em gar sangue e chocolate, mas no em gar MacConkey. O crescimento lento, necessitando de 2 a 4 dias para boa visualizao das colnias. Em cerca da metade das cepas, pode-se observar a corroso do gar, que sua caracterstica marcante. Produz um pigmento amarelo claro e tem odor de hipoclorito no gar sangue e gar chocolate. Na bacterioscopia so observados bacilos delgados ou coco-bacilos Gram-negativos com extremidades arredondadas. Bioquimicamente, caracteriza-se por ser oxidase positiva, catalase negativa, motilidade negativa e ornitina positiva; provas negativas para a utilizao de carboidratos, ureia, indol e esculina.
7.12 Kingella sp.

Espcies do gnero Kingella fazem parte do trato respiratrio e genito-urinrio humanos. K. kingae a espcie mais importante e um patgeno oportunista responsvel por casos graves de endocardite, osteomielite, septicemia, com provvel porta de entrada em leses da mucosa da orofaringe. A doena valvular pode estar ou no associada doena cardaca prvia. A osteomielite ocorre com maior frequncia em crianas menores de 5 anos. Os quadros spticos podem ser semelhantes doena meningoccica.
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7.12.1 Cultivo, bacterioscopia e identificao A K. kingae cresce em gar sangue e gar chocolate com 5% de CO2, aps pelo menos 48 h de incubao, mas no em gar MacConkey. Tem como caracterstica ser beta-hemoltica no gar sangue de carneiro, no produz hemlise intensa. Pode crescer numa mesma placa de isolamento como colnias lisas e convexas ou fazendo corroso, ou colnias espalhadas como se fossem mveis. So coco-bacilos que ocorrem aos pares ou cadeias curtas, podendo ser confundida com Neisseria spp. So oxidase positiva, motilidade e catalase negativas, e acidificam a glicose lentamente.
7.13 Cardiobacterium hominis

Fastidiosos oxidase positivas e catalase, ureia e esculina negativas Bactrias C. hominis E. corrodens K. kingae neg neg + Hemlise + neg neg Indol neg + neg Ornitina + neg + Glicose
Cardiobacterium sp. faz parte da microflora do trato respiratrio humano e ocasionalmente do trato urogenital. Est associada quase exclusivamente a quadros de endocardite, precedidos de manipulao dentria. 7.13.1 Cultivo, bacterioscopia e identificao Cresce em 3 a 5 dias em hemoculturas, mas no causa alteraes no meio (turvao, hemlise, pelcula ou grumos). Cresce em 3 a 5 dias em 5 a 7% de CO2, em gar sangue e gar chocolate, mas no em gar MacConkey. As colnias so branco-amareladas e podem manifestar um pequeno espraiamento, simulando motilidade no gar como o Proteus spp., e eventualmente pode apresentar corroso do gar. So bacilos Gram-negativos, podendo apresentar pleomorfismo com extremidades dilatadas como bulbos que podem reter corante cristal violeta da colorao de Gram e apresentam arranjos caractersticos em agrupamentos de rosetas e formas isoladas como gota dgua ou halteres. Deve-se observar essas caractersticas para no confundi-los com bacilos Gram-positivos. Uma prova fundamental a pesquisa de produo de indol, que deve ser feita em caldo triptona, com inculo denso, com incubao de 48 h, e extrao com xilol e uso do reagente de Ehrlich.
130
7.14 Chromobacterium violaceum

Encontrada na natureza no solo e na gua, a infeco em geral est relacionada a leses cutneas aps contato com esses elementos. As leses localizadas ou formas septicmicas graves com mltiplos abscessos tm sido esporadicamente relatadas. Mais raramente, diarreia e infeco urinria tm sido descritos. 7.14.1 Cultivo e bacterioscopia um bacilo Gram-negativo anaerbio facultativo, reto ou ligeiramente curvo, com extremidades arredondadas, isolados ou em arranjos aos pares ou em cadeias curtas. Diferente da maioria dos fastidiosos, cresce, alm de no gar sangue e chocolate, tambm em gar MacConkey. Apresenta colnias convexas, lisas e de cor violeta forte, embora algumas variantes sem cor possam ocorrer. Algumas cepas podem ser fracamente hemolticas no gar sangue.
7.15 Streptobacillus moniliformis

Encontrado na nasofaringe e orofaringe de ratos, camundongos e outros roedores domsticos, tal como a cobaia. As infeces esto relacionadas mordida desses roedores ou ingesto de leite ou alimentos contaminados. A febre por mordedura do rato apresenta quadro clnico bem definido com perodo de incubao de cerca de 10 dias, incio abrupto com febre alta, tremores, cefaleia intensa, vmitos e artralgia migratria. Ocorre um rash semelhante ao do sarampo, com erupes maculopapulares podendo ser pustulosa, com petquias ou prpuras nas extremidades, incluindo regio palmar e plantar. Complicaes graves podem ocorrer, como endocardite, pericardite, septicemia e abscesso cerebral. Sem tratamento, pode evoluir favoravelmente em 2 semanas ou pode se tornar crnica; a mortalidade chega a 10%. 7.15.1 Cultivo, bacterioscopia e identificao um bacilo Gram-negativo muito pleomrfico, podendo ter em culturas mais velhas de 1 a 150 m de comprimento (habitualmente bactrias tm de 1 a 3 m), com eventuais dilataes como um colar de prolas, sem apresentar ramificaes, quebrando em formas coco-bacilares. Em culturas jovens pode apresentar uma morfologia mais uniforme. O isolamento feito a partir de hemocultura, aspirado de derrames (devem ser centrifugados para concentr-los) e abscessos.
131
A) Meios de cultivo Colher sangue para hemocultura com citrato. No devem ser usadas hemoculturas com SPS, pois esse inibidor do S. moniliformis. Cultivar em meio bifsico TSA/TSB ou gar infuso corao ou caldo infuso corao, suplementados com 10% de soro de cavalo ou 15% de soro de coelho, e 0,5% de extrato de levedura. Incubar em jarra de anaerobiose ou 10% CO2 a 35-36oC e umidade. Aps cerca de trs dias crescem colnias cinzas de 1-2 mm de dimetro, com consistncia butirosa, podendo surgir colnias variantes com aparncia de ovo frito como a de colnias de micoplasmas. Em caldo de cultura, crescem em 2 a 3 dias com aparncia de bolas de plo. As provas bioqumicas exigem a adio de soro de cavalo ou coelho para suportar o crescimento. So oxidase, catalase, indol e ureia negativos; e positivos para esculina, H2S com a prova da tira de acetato de chumbo e hidrlise da arginina. Acidificam lentamente a glicose em base CTA com 0,5% de soro de cavalo.
132
FORBES, B.A., SAHM, D.F., WEISSFELD, A.S. Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology. 12th ed. St. Louis. Mosby Elsevier, 2007, 1031p. WINN,J. JR.; ALLEN, S.; JANDA, W.M.; KONEMAN, E.; PROCOP, G.; SCHRENKENBERGER, P.C.; WOODS, G.K. Color Atlas and Textbook OF Diagnostic Microbiology. 6th Ed. Lippincott Williams & Wilkins, 2006, 1535p. MC FADDIN, J.F. Biochemical tests for identification of medical bacteria. Baltimore. Ed. William & Wilkins Co., 2000. MURAY , P.R. et al. Manual of Clnical Microbiology. 9th ed. Washington DC. American Society for Microbiology ASM Press 2007., 2256p OHTSUKA, M.; KIKUCHI, K.; SHUNDO, K.; OKADA, K.; HIGASHIDE, M.; SUNAKAWA, K.; HIRAMATSU, K. (2009). Improved selective isolation of Bordetella pertussis by use of modified cyclodextrin solid medium. Journal of Clinical Microbiology, 47(12), 4164-7.
133
Captulo 8: Bactrias Anaerbias Estritas

Lycia M. Jenne Mimica Marina Baquerizo Martinez
8.1 Introduo
Bactrias anaerbias estritas so dominantes na microbiota anfibintica humana e so isoladas de diversas infeces. Algumas dessas infeces so graves e apresentam altas taxas de morbidade e mortalidade. No com facilidade que se define o termo anaerbio. Com finalidades prticas, podemos definir bactria anaerbia estrita com base na quantidade de oxignio que ela pode tolerar, na exigncia de uma tenso de oxignio reduzida e o no crescimento em superfcie de um meio de cultura slido sob uma atmosfera de 10% de CO2 (18% de O2). O oxignio letal ao anaerbio estrito porque na sua reduo so formadas substncias intermedirias txicas (radical hidroxila/anion superxido/perxido de hidrognio) que so removidas, eventualmente, por enzimas da famlia das superxido desmutase e peroxidase, presentes em quantidades variveis em algumas espcies, que assim garantem certa tolerncia ao O2. Os anaerbios exigem, alm da excluso do O2, um ambiente com potencial de xido-reduo (Eh) baixo que pode tambm variar em funo do pH estabelecido. importante salientar que esse grupo de bactrias formado por espcies que variam de aerotolerantes a muito exigentes quanto ausncia de oxignio. As mais estritas crescem em atmosferas com 0,5% de oxignio, muitas crescem em atmosferas ao redor de 3% e algumas podem crescer ainda em concentraes de at 6% de oxignio (Tabela 1).
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Tabela 1 Diferenas quanto sensibilidade ao O2 entre espcies de bactrias

% de O2 no ar atmosfrico Espcies C. haemolyticum C. novyi P. oralis P. melaninogenica B. fragilis F. nucleatum ++ ++ ++ ++ ++ ++ 0,1 ++ ++ ++ ++ ++ ++ 0,5 0 ++ ++ ++ ++ ++ 1,0 0 ++ ++ ++(v) ++ ++ 3,0 0 +,v +,v +,v +,v ++ 6,0 0 0 0 0 0 0 10,0
++ crescimento; + pouco crescimento; 0 sem crescimento; v cepa dependente
Essa labilidade dos anaerbios estritos ao oxignio explica as dificuldades existentes nos laboratrios para seu isolamento e estudo. A introduo dos aminoglicosdeos como agentes antimicrobianos de largo espectro veio a determinar a importncia das bactrias anaerbias em diversas infeces, uma vez que tais bactrias so intrinsecamente resistentes a essa classe de antibiticos. A partir dessa poca, as bactrias anaerbias no esporuladas (cocos e bacilos Gram-positivos; bacilos Gram-negativos) tiveram seu papel reconhecido na etiologia das infeces, particularmente nas intra-abdominais, nas do trato genital feminino e nas pleuropulmonares. A partir da dcada de 1970 foram desenvolvidos procedimentos prticos de laboratrios para criar atmosferas de anaerobiose. At esse momento, somente as infeces provocadas pelos micro-organismos mais resistentes, dentro desse grupo, os esporulados do gnero Clostridium, eram diagnosticadas com maior frequncia. Hoje se sabe que as infeces por Clostridium so menos frequentes que as infeces provocadas por outros gneros de bactrias anaerbias. Um fato que tambm merece ser destacado, para explicar a frequncia com que essas bactrias provocam infeco, que os anaerbios estritos so habitantes normais do organismo humano, ultrapassando em nmero os aerbios e anaerbios facultativos. Assim, os anaerbios estritos esto em propores 5 a 1000 vezes maiores que os aerbios estritos e facultativos na microbiota normal do tubo digestivo, pele, trato respiratrio superior e genital feminino. Quando existem fatores predisponentes, essas bactrias provocam processos patolgicos em diferentes rgos e sistemas. Por esse motivo, a maior parte das infeces provocadas pelas bactrias anaerbias estritas so infeces chamadas endgenas. a prpria microbiota do indivduo que em determinado momento provoca o processo infeccioso, sendo esse tipo de infeco pouco ou nada contagioso. As infeces provocadas pelo gnero Clostridium so fundamentalmente adquiridas a partir do meio ambiente externo e por esse motivo so chamadas de infeces exgenas. Nas mucosas, onde os anaerbios estritos so prevalentes como microbiota, a atmosfera anaerbia conseguida devido ao metabolismo de micro-organismos facultativos e
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aerbios estritos frente a compostos orgnicos, enzimas, restos celulares, entre outros. A ao desses micro-organismos baixa o potencial redox nesses locais. Como as bactrias anaerbias facultativas e aerbias estritas favorecem a mutiplicao dos anaerbios, por consumirem o oxignio existente no local e por produzirem alguns fatores de crescimento como substncias secundrias do seu metabolismo (por exemplo, Staphylococcus sp. produz vitamina k), a maior parte das infeces por bactrias anaerbias estritas so infeces mistas. Assim, so frequentes as infeces conjuntas com Enterobactrias, Streptococcus sp. e Staphylococcus aureus. Alguns aspectos clnicos fazem suspeitar de uma infeco com envolvimento de bactrias anaerbias, sendo os principais esses abaixo relacionados:

Secreo Ftida Infeco nas proximidades de superfcie mucosa Tecido necrtico Presena de gs em tecidos ou secreo Tromboflebite sptica Colorao negra em secreo com sangue Infeco decorrente de mordida humana ou de animal Presena de grnulos de enxofre nas secrees Teraputica prvia com aminoglicosdeo Gangrena gasosa
A presena de leso com aspecto de micetoma e a observao de grnulos de enxofre no pus caracterstica de uma infeco por Actinomyces. A infeco por anaerbios secundria a uma mordida de animal ou do ser humano explicada pela existncia de um grande nmero dessas bactrias na cavidade oral desses hospedeiros. Associados a esses elementos clnicos, existem alguns outros, laboratoriais, que sedimentam ainda mais a suspeita de uma infeco por anaerbios estritos:

Ocorrncia de formas pleomrficas na colorao de Gram (como regra geral, os anaerbios so mais pleomrficos que os aerbios e anaerbios facultativos). Observao no material clnico de bacilos Gram-positivos esporulados que lembram Clostridium. Observao de bactrias no material clnico corado pela colorao de Gram, que no crescem nos meios mantidos em atmosferas de aerobiose. Crescimento de bactrias somente na parte inferior de tubos com meios de caldo Tioglicolato.
137
8.1.1
Fatores predisponentes Uma variedade de condies predispe um indivduo a desenvolver infeco por anaerbios. Baixo potencial de oxi-reduo facilita o crescimento de bactrias anaerbias. A causa clnica mais comum de diminuio do potencial redox a anxia dos tecidos resultante normalmente de leses vasculares, compresso, hipotermia, choque, edema e outras condies que levam m perfuso. Quanto s doenas sistmicas ou condies gerais como corticoterapia, teraputica de tumores, leucopenia, hipergamaglobulinemia, colagenoses, diabetes, esplenectomias, embora relacionadas como predisponentes, no h evidncia concreta de que realmente estejam associadas a maior incidncia de infeco por anaerbios.
8.2 Coleta de material

Devido presena marcante de bactrias anaerbias como microbiota das mucosas e pele e s caractersticas endgena e polimicrobiana das infeces por anaerbios, a coleta de materiais clnicos para a pesquisa de bactrias anaerbias representa uma das etapas cruciais para a realizao de um diagnstico de qualidade. As amostras devem ser colhidas de forma que no entrem em contato com oxignio e no se contaminem com bactrias anaerbias da microbiota. Por esse motivo sempre que possvel devem ser aspiradas com seringa e agulha, da qual eliminado o ar imediatamente aps a obteno da amostra. Amostras de tecido e bipsia tambm so adequadas para pesquisa de anaerbios. A coleta com swab deve ser rejeitada, quando for inevitvel, incluir em meio semi slido. No so aceitveis para o processamento laboratorial espcimes como urina obtida por mico espontnea, escarro expectorado, secrees vaginais e de feridas localizadas prximas a stios contaminados e fezes, pelo fato de que a presena de micro-organismos componentes da microbiota impossibilitam definies quanto etiologia dos processos infecciosos. Em resumo, apenas espcimes clnicas que no estejam contaminadas com as bactrias anaerbias da microbiota so aceitveis (Tabela 2).
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Tabela 2 Amostras clnicas aceitveis para isolamento de bactrias anaerbias

Local Cabea e pescoo Amostras clnicas aceitveis Aspirados de abscessos Bipsias de materiais cirrgicos Swabs obtidos durante o ato cirrgico Aspirado transtraqueal Puno percutnea Bipsias de mat. cirrgicos Amostras de broncoscopia (protegida) Swabs obtidos durante o ato cirrgico Aspirados de abscessos Bipsias de materiais cirrgicos Swabs obtidos durante o ato cirrgico Fluido peritoneal por puno Aspirados de abscessos Bipsias de materiais cirrgicos Swabs obtidos durante o ato cirrgico Aspirado supra-pbico Amostras por culdoscopia Aspirado endometrial (protegido) Aspirados de abscessos Bipsias de materiais cirrgicos Swabs obtidos durante o ato cirrgico DIU Aspirados com agulha e seringa Bipsias de mat. cirrgicos Swabs obtidos durante o ato cirrgico Aspirados com agulha e seringa Bipsias de materiais cirrgicos Aspirados de sinus Aspirados com agulha e seringa de material profundo Somente para pesquisa de toxinas Amostras clnicas no aceitveis Swabs da oro e nasofaringe
Pulmo
Escarro expectorado Escarro induzido Aspirado endotraqueal Amostras de broncoscopia no protegida Swabs mantidos em aerobiose
SNC
Abdomem
Swabs mantidos em aerobiose
Trato urinrio Trato genital feminino
Urina por mico espontnea Urina por cateter Swabs vaginais ou cervicais
Ossos e articulaes
Material superficial obtidos com Swabs
Tecidos moles
Swabs superficiais
Intestino
8.3 Transporte do material

A etapa de transporte do material coletado tambm requer cuidados especiais centrados na manuteno de condies anaerbias, visando minimizar os efeitos deletrios da exposio ao oxignio atmosfrico. O tempo depende do material e do volume da amostra. Grandes quantidades de material purulento (> 3 mL), mantidasem tubos vedados, tm viabilidade por 2-3 horas. Tubos gaseificados (mistura de N2, H2 e CO2 ou CO2 apenas), meios de transporte semi-slidos contendo agentes redutores
139
como a cistena, dispostos em camada alta (Cary-Blair pre-reduzido, tioglicolato) ou envelopes geradores de gs podem ser utilizados. O transporte no deve ser feito na seringa em que o material foi colhido, pelo risco ocupacional que representa; o material deve ser inoculado em meio de transporte semi slido pr reduzido, como tioglicolato (fig. 1). A amostra deve ser mantida entre 18 e 22C durante o transporte.
8.4 Processamento do material

Sempre feita uma colorao de Gram da amostra recebida e, quando necessrio, de esporos. O bacterioscpico pode orientar o clnico quanto ao diagnstico e teraputica precoce. Por exemplo, a observao de bacilos Gram-positivos esporulados em um processo com aspecto de gangrena gasosa indicativo de Clostridium e de gangrena gasosa. Figura 1 Material colhido por aspirao inoculado em tioglicolato
A anlise macroscpica da amostra clnica pode fornecer informaes importantes sobre a natureza e qualidade da amostra. Deve-se observar a presena de pus, necrose, odor ftido e presena de grnulos sulfurosos. A observao da quantidade de bactrias na amostra permite orientar o bacteriologista se ele deve enriquecer previamente a amostra em um caldo ou semear o material diretamente nos meios de isolamento.
140
8.4.1
Produo de anaerobiose Existem vrios procedimentos para conseguir no laboratrio uma atmosfera de anaerobiose adequada multiplicao das bactrias anaerbias patognicas ao ser humano. Por exemplo: o uso de tubos com meios slidos pr-reduzidos a anaerobiose mantida dentro do tubo e os meios utilizados so reduzidos e possuem indicadores de oxi-reduo. O sistema mais empregado em laboratrios clnicos o sistema das jarras de anaerobiose com geradores qumicos que permitem obter uma atmosfera adequada para a multiplicao dessas bactrias. Existem diversos tipos de geradores. Os mais utilizados so os que provocam o consumo do oxignio atravs da reao desse com o H2, gerado pela presena de um haleto, formando gua. A atmosfera da jarra substituda por CO2, gerado pela presena de bicarbonato. Dentro da jarra colocada, alm dos geradores qumicos, uma fita de papel de filtro impregnada de azul de metileno, que um indicador de anaerobiose. Quando a atmosfera do interior da jarra tem condies adequadas de anaerobiose, a fita, inicialmente azul, alterada para branca. Numa jarra de tamanho mdio de 2,5 litros, coloca-se aproximadamente 10 placas e vrios tubos. Nesse sistema o contedo de O2 da jarra cai a 0.4%, em aproximadamente 1 hora e meia, de forma que as condies anaerbias esto presentes bem antes da transformao do azul de metileno, que acontece por volta de 4-6 horas.
Figura 2 Jarra de anaerobiose
8.4.2
Isolamento As amostras so semeadas em duas placas de gar preparadas com sangue desfibrinado de carneiro em uma concentrao de 5%. As bases utilizadas podem ser gar Brucella, gar Columbia ou gar BHI. Aos meios se adicionam tambm vitamina K e hemina bovina. Uma das placas incubada a 35-37C em atmosfera aerbia acrescida de 5% de CO2, e uma segunda
141
incubada a 35-37C em uma atmosfera de anaerobiose. A essa se acrescenta hemina bovina (100 ug/mL), vitamina K (10 ug/mL) e extrato de levedura (2 mg/mL). Como meio seletivo para anaerbios Gram-negativos (ASL), pode-se utilizar uma terceira placa, cujo meio foi acrescido de canamicina e vancomicina, alm da vitamina K e hemina bovina. Para se obter um meio mais eficaz quanto produo de pigmentos, o sangue de carneiro deve ser lisado pelo frio. Outro meio seletivo bastante utilizado o gar feniletialcool, suplementado com sangue de carneiro, hemina e vitamina K, nas mesmas concentraes utilizadas no meio no seletivo. Esse meio seletivo para bactrias anaerbias, pois inibe o crescimento de bactrias facultativas tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Figura 3 Esquema de trabalho recomendado
Transporte Amostra Observao macroscpica Colorao de Gram resultado preliminar Tioglicolato Vit K Hemina Glicose sem indicador AS Anaerobiose por 48 horas GRAM para cada colnia diferente e semeadura em caldo e ASH Ach Aerobiose 24 horas
ASS +VitK Cultura
ASL KV
PEA
ASS= gar sangue suplementado | ASL= gar sangue suplementado lisado | PEA= gar feniletilacool | AS= gar sangue | Ach= gar chocolate
A adio dos antibiticos cria um meio seletivo para bacilos Gram-negativos anaerbios j que essa categoria de bactrias resistente aos aminoglicosdeos e bactrias Gram-positivas so sensveis vancomicina. Como a maior parte das infeces provocadas pelos anaerbios estritos so infeces mistas, o uso de meios seletivos auxilia no isolamento bacteriano. No se justifica o uso de mais uma placa sem antibitico porque aumentam os custos sem aumentar o isolamento de anaerbios. Essas placas so incubadas dentro da jarra de anaerobiose a 35-37C de temperatura durante 48 horas. Quando se suspeita, pelo quadro clnico ou pela colorao de Gram da amostra, que estamos em presena de uma infeco
142
por Clostridium, que so de crescimento mais rpido, as jarras podem ser abertas aps 18 a 24 horas de incubao. Por outro lado, bactrias de crescimento mais lento, como Actinomyces, podem demorar sete dias ou mais para formar colnias visveis.
8.5 Identificao bacteriana

8.5.1 Comprovao de anaerobiose estrita Aps a incubao, as placas so examinadas e, agora o passo mais importante, a comprovao de que as bactrias isoladas nos meios de cultura incubados em anaerobiose so anaerbias estritas. Para esse fim, as caractersticas macroscpicas e microscpicas (colorao de Gram) dos diferentes tipos de colnias, obtidos aps a incubao dos meios de cultura em anaerobiose, devem ser observados. Alm disso, cada tipo deve se semeado em gar sangue (AS) e em gar sangue suplementado (ASS) a fim de se separar os micro-organismos facultativos dos anaerbios estritos. A primeira placa deve ser incubada a 35-37 C em atmosfera de 5% de CO2 e a segunda em anaerobiose. Somente os facultativos crescero na primeira condio. S feito o diagnstico de anaerbio estrito quando, aps 24 a 48 horas da nova incubao, a bactria apenas crescer na placa de anaerobiose. A morfologia microscpica observada pela colorao de Gram das colnias orienta para uma identificao preliminar do grupo de anaerbio isolado. Bactrias anaerbias estritas, de importncia em patologia humana de acordo com sua morfologia na colorao de Gram. Cocos Gram-positivos Peptostreptococcus Peptococcus niger Cocos Gram-negativos Veillonella Acidaminococcus Megasphaera Bacilos Gram-positivos no esporulados Propionibacterium Bifidobacterium Actinomyces
143
Eubacterium Lactobacillus
Bacilos Gram-positivos esporulados Clostridium Bacilos Gram-negativos Bacteroides Fusobacterium Prevotella Porphyromonas Campylobacter Sutterella Bilophila 8.5.2 Identificao bacteriana presuntiva A morfologia microscpica obtida pela colorao de Gram, acrescido do teste de anaerobiose, um resultado presuntivo importante, que deve ser imediatamente passado ao clnico. J nessa etapa o laboratrio informa que o paciente tem uma infeco por uma bactria anaerbia estrita que pertence a um determinado grupo morfolgico. Mtodos convencionais para a identificao de bactrias anaerbias usam, frequentemente, procedimentos que utilizam as bactrias isoladas em cultura pura para o estudo da fermentao de diversos carboidratos e outras atividades bioqumicas. Esses procedimentos envolvem trabalho intensivo e consomem muito tempo. Muitos laboratrios no esto aptos a manterem a vasta seleo de meios e substncias exigidas para a identificao bioqumica. Devido a esses fatores, cada vez mais a pesquisa de mtodos alternativos rpidos e simples estimulada. Os micromtodos, tais como API 20A e Minitek, foram os primeiros a serem propostos como alternativas ao mtodo convencional. Os dois mtodos possuem um melhor desempenho com bactrias anaerbias de crescimento rpido (grupo B. fragilis ou C. perfringens). Outros sistemas como RapID ANA II esto baseados principalmente na deteco rpida de glicosidases e aminopeptidases. O inculo pesado e o curto tempo de incubao (quatro horas) evitam a contaminao e fornecem rapidamente resultados, cuja especificidade na identificao das espcies varia entre 60 a 90%. A pesquisa de cidos graxos produzidos pelo metabolismo da fermentao da glicose utilizando-se cromatografia a gs um mtodo rpido, especfico e sensvel para diversas espcies. O equipamento e os programas com144
putadorizados necessrios representam um custo inicial elevado, porm, subsequentemente, ele menor. Devido caracterstica polimicrobiana das infeces por anaerbios, a reao em cadeia da polimerase (PCR) no preconizada para o diagnstico, com exceo para tecidos ou fludos estreis. Sondas de cidos nuclicos para pesquisa de bactrias anaerbias no esto ainda padronizadas e no so encontradas comercialmente. Contudo, laboratrios de microbiologia oral e empresas que trabalham com esse segmento desenvolveram um conjunto de sondas para a identificao de bactrias envolvidas na doena periodontal. Essas sondas so bastante eficientes na identificao de colnias provenientes da placa de cultura do primeiro isolamento ou de micro-organismos isolados em cultura pura. A interpretao de resultados de uma cultura mista, contendo mltiplos isolados, difcil. Culturas semiquantitativas em conjunto com a bacterioscopia so teis para a definio do que importante ou no entre os isolados. A natureza das bactrias isoladas pode tambm dar indcios da importncia delas no processo infeccioso. Na maioria das vezes, a manuteno de um dilogo entre o mdico e o microbiologista essencial para uma apropriada interpretao dos resultados bacteriolgicos obtidos. A) A identificao de gnero e espcie feito a partir de: Provas bioqumicas: fermentao de acares, produo de indol, reduo de nitrato, pesquisa de urease, crescimento em presena de bile, liquefao da gelatina, hidrlise de esculina etc. Produo de pigmentos Hemlise Aprofundamento no gar Susceptibilidade a antimicrobianos Formao de cidos detectados por cromatografia gasosa Sorologia As seguintes consideraes prticas so teis para a orientao do microbiologista para uma conduta adequada, sem a necessidade de aparelhos ou metodologias dispendiosas por parte do laboratrio:
Na presena de cocos Gram-positivos, quando necessrio o laboratrio deve fazer o diagnstico diferencial de Peptostreptococcus ou Peptococcus que so os mais frequentemente isolados nesse grupo morfolgico. Para a diferenciao entre espcies e gneros so utilizados os seguintes testes: disco de SPS, indol, urease, fosfatase alcalina e alfa galactosidase. Na presena de cocos Gram-negativos, o laboratrio deve fazer o diagnstico presuntivo de Veillonella, gnero mais frequente nesse grupo.
145
Para o diagnstico diferencial com os outros cocos Gram-negativos a prova utilizada a reduo do nitrato e, para diagnstico de outras espcies, a cromatografia gasosa. Na presena de bacilos Gram-positivos esporulados, o laboratrio deve fazer o diagnstico de Clostridium. Na dvida no diagnstico de bacilo esporulado, recomenda-se o tratamento com lcool etlico a 95%, durante 1 hora temperatura ambiente e ressemeadura posterior. Alm disso, a suspenso bacteriana pode ser aquecida a 80C durante 10 minutos, esfriada e feita ressemeadura. Aps um ou outro procedimento, s sobrevivem bactrias esporuladas. importante salientar que C. perfringens dificilmente se apresenta na forma esporulada no material clnico. Ele s esporula em condies bastante adversas. Para o diagnstico diferencial das outras espcies de Clostridium devem ser feitas provas bioqumicas como hidrlise da gelatina, fermentao da glicose, lecitinase, lipase, produo de indol, ureia, nitratos, e motilidade. Na presena de bacilos Gram-positivos no esporulados recomendamos fazer a prova de catalase, reduo de nitratos, hidrlise de esculina, urease, e produo de pigmento. Para o diagnstico definitivo, deve ser feita a pesquisa do perfil da produo de cidos graxos pela cromatografia gasosa. A presena de bacilos Gram-negativos em forma de fuso indicativo de Fusobacterium. Na presena de bacilos pleomrficos ou cocobacilos, recomenda-se seguir o esquema acima descrito. Essas provas junto com a produo de pigmento permitem fazer o diagnstico presuntivo de Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas e Fusobacterium. Frente aos discos de antibiticos, a bactria considerada sensvel se o halo de inibio de 12mm ou maior; como inculo para a semeadura utiliza-se uma suspenso com turvao semelhante ao nmero 3 de escala de MC Farland ou uma turvao semelhante aps incubao em meio de tioglicolato. A prova da bile considerada positiva, se existir crescimento bacteriano no quadrante respectivo. Ainda deve ser observado se o crescimento na presena de bile foi estimulado. Para a produo de pigmento, recomendamos a observao direta das colnias no meio de ASL ou ASS, e, em caso de no existir pigmento evidente, iluminar a placa com luz ultravioleta ( de 360 nm). Colnias de Prevotella melaninogenicus aparecem de cor tijolo avermelhado. Para a prova de indol, recomendamos passar uma colnia, a partir do meio com triptofano, com ajuda de uma ala de platina num papel filtro impregnado em 1% de paradimetilaminocinamaldeido (em cido clordrico 10%). Uma reao positiva produz imediatamente uma cor azul.
146
O diagnstico presuntivo feito de acordo com a seguinte tabela:

Bacilos Gram-negativos anaerbios estritos Bactrias Bacteroides grupo gragilis Prevotella sp. Porphyromonas sp. Bacterides sp. F. mortiferum F. variium Fusobacterium spp. Rifampicin sensvel sensvel sensvel sensvel resistente resistente sensvel Kanamicin a 1.000 mcg resistente resistente resistente sensvel resistente sensvel sensvel sensvel + neg neg neg + + neg Bile 20% Indol +/neg +/neg + neg neg + + Pigmento neg + + neg neg neg neg
Para Rifampicin a Kanamicina: Sensvel = halo de inibio com 12mm ou mais de dimetro Resistente = ausnsia de halo ou menor que 12 mm de dimetro
A diferenciao dos gneros Prevotella e Porphyromonas realizada pela capacidade de fermentar glicose que positiva para o primeiro gnero e negativa para o segundo. Alguns sistemas comerciais manuais ou automatizados permitem fazer o diagnstico das diferentes espcies de anaerbios utilizando numerosas provas bioqumicas. Alguns utilizam a ao de enzimas bacterianas pr-formadas podendo fazer esse diagnstico aps 4 horas de incubao. Destes os mais frequentemente utilizados so: API, Vitek e Microscan. Esses sistemas mais caros no so fundamentais para o diagnstico dos grupos bacterianos e para uma orientao teraputica adequada. Em algumas infeces importante, para o diagnstico, determinar a presena de toxinas como acontece nas infeces intestinais por Clostridium difficille. Essa determinao feita com provas imunolgicas para a pesquisa da toxina nas fezes, disponveis comercialmente.
8.6 Provas de sensibilidade a antimicrobianos

O estudo da sensibilidade dessas bactrias importante pelo aumento crescente de sua resistncia frente aos diversos antimicrobianos disponveis. Essa resistncia mais comum nos gneros Bacteroides e Prevotella, mas pode estar presente tambm nos gneros Clostridium, Porphyromonas e Fusobacterium.
147
8.6.1
Mtodo da difuso em disco

O mtodo do disco difuso no adequado para estudar a sensibilidade das bactrias anaerbias estritas. O CLSI (Clnical and Laboratory Standarts Institute) recomenda um mtodo de diluio em gar, onde as concentraes de antimicrobianos so incorporadas ao meio Wilkins-Chalgren. Cada placa tem uma concentrao de um antimicrobiano. As bactrias so semeadas utilizando o inoculador mltiplo de Steers e as placas colocadas em jarras com gerador de anaerobiose. A leitura feita aps 48 horas de incubao na estufa, determinando-se a CIM (concentrao inibitria mnima).
8.6.2
Mtodo da Fita com gradiente de difuso Um mtodo alternativo mais prtico a determinao da sensibilidade utilizando fitas de plstico impregnadas com gradiente de concentrao de antimicrobianos como no mtodo do E test. As bactrias so semeadas em forma similar empregada no mtodo do disco para aerbios. So colocadas duas fitas cada uma com um antibitico diferente em cada placa de 9 cm de dimetro. Em geral necessrio testar 6 antibiticos (3 placas). Os antimicrobianos com maior atividade in vitro e in vivo frente aos anaerbios estritos so: cloranfenicol, clindamicina, cefoxitina, metronidazol, penicilina e amoxicilina com cido clavulnico. As placas so incubadas dentro de jarra de anaerobiose a 35-37C de temperatura. A leitura feita aps 48 horas de incubao, e a sensibilidade interpretada em ambos mtodos seguindo as ltimas tabelas publicadas pelo CLSI. Salientamos que existe uma boa correlao nos resultados obtidos com as duas metodologias descritas. Contudo h relatos de falsa resistncia ao metronidazol quando o Etest utilizado. Esse fenmeno pode ser resultado das condies do teste e da qualidade do meio de cultura empregado. Geralmente, o problema eliminado quando se utiliza meios recm-preparados ou mantidos em anaerobiose antes do uso.
148
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE GUIDELINES. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 2012 Approved standards M100-S22. 22th ed. Wayne, PA: 2012. ISENBERG, HD (Ed): Clnical Microbiology Procedures Handbook, 3nd edition, 2007, ASM Press, Washington MANDELL, G. & BENNETT, J.; DOLIN, R. Principles and Practice Infectious Diseases. 7th ed., London, Churchill and Livingstone, 2010. MURRAY, P. R. et al. Manual of Clnical Microbiology. 10th ed. Washington DC. American Society for Microbiology ASM Press 2010, 2252p.
149
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria - Anvisa SIA Trecho 5 - rea especial 57 - Lote 200 CEP: 71205-050 Braslia - DF Telefone: 61 3462 6000 www.anvisa.gov.br www.twitter.com/anvisa_oficial Anvisa Atende: 0800-642-9782 ouvidoria@anvisa.gov.br

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MICROBIOLOGIA CLNICA PARA O CONTROLE DE INFECO RELACIONADA ASSISTNCIA SADE

Mdulo 6: Deteco e Identificao de Bactrias de Importncia Mdica

Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria | Anvisa

AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA ANVISA

Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

Captulo 1: Estafilococos, Estreptococos, Enterococos e outros

Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa

Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa

Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

+ S.caprae sacarose + uria - S.shleiferi subsp. urealyticum

+ S.capitis +manitol - uria

+ S.cohnii subsp. urealyticum

- S.cohnii subsp. cohnii

+ resistncia novobiocina S.warneri

+ S.saprophyticus S.hominis subsp. hominis resistncia novobiocina - S.warneri + S.warneri S.haemolyticus

Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa

Diviso dos cocos Gram-positivos pela prova da catalase

Catalase + + + neg neg neg varivel +

Motilidade neg + neg varivel neg neg neg neg

NaCl 5% + + + + varivel + neg +

Oxidase neg neg + neg neg neg neg +

Aerbio estrito no + varivel no no no no varivel

Ttrade varivel varivel varivel no no + varivel +

NaCl 5% + neg + varivel varivel neg neg

Vancomicina varivel sensvel sensvel resistente resistente sensvel sensvel + neg2

Ttrade no no varivel no varivel no varivel

neg3 varivel varivel + neg +

varivel neg neg + +

Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

1.2 Identificao de estafilococos

Provas diferenciais dos Gneros Catalase positivos ou variveis

Ureia varivel varivel neg + neg + varivel + neg neg

Outras pig.amarelo Ornitina + Ornitina neg isolado em urina Sacarose neg

Obs. Veja esquema completo em Iorio et al 2007

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1.3 Identificao dos Staphylococcus aureus

Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

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Diagnstico diferencial entre Neisserias e outros cocobacilos Gramnegativos

Neisseria meningitidis Neisseria gonorrhoeae Neisseria spp.

diplococo diplococo diplococo/ bacilo diplococo

no cresce no cresce varivel (oxidativo) inerte

neg neg neg

Caractersticas de algumas espcies de importncia clnica 2.1.2

Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

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Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

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2.3 Transporte e semeadura do material

Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

2.4 Bacterioscopia e identificao

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Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

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Provas de rotina para diferenciar Neisserias patognicas

Mdulo 6: Deteco e Identificao e Bactrias de Importncia Mdica

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