Modulo 005

MICROBIOLOGIA CLNICA PARA O CONTROLE DE INFECO RELACIONADA ASSISTNCIA SADE
Mdulo 5: Tecnologias em Servios de Sade: Descrio dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiolgicos
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria | Anvisa
AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA ANVISA
MICROBIOLOGIA CLNICA PARA O CONTROLE DE INFECO RELACIONADA ASSISTNCIA SADE Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: Descrio dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiolgicos
Copyright 2013 Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Todos os direitos reservados. permitida a reproduo parcial ou total dessa obra, desde que citada a fonte e que no seja para venda ou qualquer fim comercial. A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens dessa obra da rea tcnica. A Anvisa, igualmente, no se responsabiliza pelas idias contidas nessa publicao. 1 edio 2010 Elaborao, distribuio e informaes: AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA SIA Trecho 5, rea Especial 57 CEP: 71205-050 Braslia DF Tel.: (61) 3462-6000 Home page: www.anvisa.gov.br Diretoria Dirceu Brs Aparecido Barbano Diretor-Presidente Jaime Cesar de Moura Oliveira Jos Agenor lvares da Silva Adjuntos de Diretor Luiz Roberto Klassmann Luciana Shimizu Takara Neilton Araujo de Oliveira Doriane Patricia Ferraz de Souza Gerncia Geral de Tecnologia em Servios de Sade GGTES Diana Carmem Almeida Nunes de Oliveira Gerncia de Vigilncia e Monitoramento em Servios de Sade GVIMS Magda Machado de Miranda Costa Coordenao Tcnica: Ana Clara Ribeiro Bello dos Santos Anvisa Carlos Emlio Levy Universidade de Campinas-SP Redao: Julia Taeko Utiyama Yoshida Instituto Adolfo Lutz (IAL)-SP Maria Carmen Gonalves Lopes Centro Infantil Boldrini-SP Rosngela Aparecida Mendes Silva Centro Infantil Boldrini-SP Reviso tcnica Anvisa: Andr Anderson Carvalho Fabiana Cristina de Sousa Heiko Thereza Santana Magda Machado de Miranda Suzie Marie Gomes Cooperao tcnica: Termo de Cooperao n 64 Organizao Pan-Americana da Sade Organizao Mundial da Sade Representao Brasil Joaquin Molina Representante Enrique Vazquez Coordenador da Unidade Tcnica de Doenas Transmissveis e NoTransmissveis e Anlise de Situao de Sade Rogrio da Silva Lima Consultor Nacional da Unidade Tcnica de Doenas Transmissveis e NoTransmissveis e Anlise de Situao de Sade Projeto Grfico e Diagramao: All Type Assessoria Editorial Ltda Capa: Camila Contarato Burns Anvisa
Ficha Catalogrfica Brasil. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia Sade. Mdulo 5 :Tecnologias em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos/Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Braslia: Anvisa, 2013. 95p..: il.9 volumes ISBN 1. Infeco Relacionada Assistncia Sade Controle. 2. Infeco em Servios de Sade. 3. Microbiologia Clnica. 4. Vigilncia Sanitria em Servios de Sade. 5. Resistncia microbiana. I. Ttulo.
Sumrio
Apresentao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1.1 Procedimentos gerais para preparao e distribuio de meios de cultura. . . . . . . . . . . 7 1.2 Controle de qualidade de esterilidade e crescimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.3 Recomendaes gerais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Captulo 1: Meios de Cultura para Transporte e Conservao. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.1 Cary Blair . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.2 Salina tamponada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.3 Meio Stuart. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 1.4 gar nutriente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 Captulo 2: Meios para Crescimento e Isolamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 2.1 gar chocolate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 2.2 gar Thayer-Martin chocolate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.3 gar Salmonella-shigella (SS). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 2.4 Caldo selenito com novobiocina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2.5 Caldo tetrationato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.6 Meio de Tioglicolato com indicador. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 2.7 Meio de Tioglicolato sem indicador. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 2.8 gar Mac Conkey . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 2.9 gar sangue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 2.10 gar Cled Cystine Lactose Electrolyte Deficient. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 2.11 Caldo BHI Brain Heart Infusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 2.12 Lwenstein Jensen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 2.13 Meio bifsico: Lwenstein e Middlebrook. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 2.14 gar Mycosel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2.15 gar Sabouraud Dextrose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 Captulo 3: Meios Comerciais para Provas de Identificao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3.1 Base de nitrognio para leveduras Yeast Nitrogen Base . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3.2 gar Citrato Simmons. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 3.3 gar Bile-Esculina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 3.4 gar Sangue CAMP. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 3.5 Caldo Base de Moeller. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 3.6 gar Dnase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 3.7 gar Esculina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 3.8 gar Fenilalanina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14
CTA Cystine Tryticase gar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 Caldo Triptona e SIM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 Caldo Malonato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 Caldo Nitrato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Meio Base Para Oxidao e Fermentao OF. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 M.E.V.A.G. (Milieu pour ltude de la voie dattaque ds glucides Hugh & Leifson, 1953). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 3.15 gar TSI Triplo Acar Ferro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 3.16 gar Base Uria (Christensen). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 Captulo 4: Produtos para Provas de Identificao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 4.1 Prova de catalase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 4.2 Prova de coagulase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 4.3 Prova de gelatinase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 4.4 Prova de Lecitinase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 4.5 Prova de oxidase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 4.6 Fermentao de carboidratos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 4.7 Prova PYR. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 4.8 Crescimento a 42 E 44C. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 4.9 Teste de motilidade. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 4.10 Prova de tolerncia ao NaCl 6,5% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89 Captulo 5: Discos para Identificao. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 5.1 Bacitracina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 5.2 Novobiocina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 5.3 Optoquina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 Referncias Bibliogrficas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: Descrio dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiolgicos
Apresentao
A resistncia microbiana um grave problema mundial, estando associada ao aumento do tempo de internao, dos custos do tratamento e das taxas de morbidade e mortalidade dos pacientes. O uso indiscriminado e incorreto dos antimicrobianos na comunidade e no ambiente hospitalar reconhecidamente um importante fator de risco para o aparecimento e a disseminao da resistncia microbiana. Nesse contexto, insere-se o Laboratrio de Microbiologia, que tem como objetivo no apenas apontar o responsvel por um determinado estado infeccioso, mas tambm indicar, atravs do monitoramento de populaes microbianas, qual o perfil dos micro-organismos que esto interagindo com o organismo humano, possibilitando a indicao de tratamentos mais adequados. Para o desempenho satisfatrio dessa funo, fundamental que os laboratrios de microbiologia possuam estrutura capaz de estabelecer informaes sobre a melhor amostra biolgica, reconhecer a microbiota e os contaminantes, identificar micro-organismos associados infeco ou com propsitos epidemiolgicos, obter resultados rpidos em casos de emergncia, realizar o transporte rpido das amostras e manter uma educao contnua em relao aos aspectos da infeco relacionada assistncia sade. Tendo em vista esses aspectos e considerando que a microbiologia um campo muito dinmico, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa, em cooperao com a Organizao Pan-Americana da Sade OPAS, prope a terceira reviso do Manual de Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia Sade, buscando atualizar informaes nos temas considerados essenciais e contando com um seleto e conceituado corpo editorial. O manual composto por nove mdulos, a saber: Mdulo 1 Biossegurana e manuteno de equipamentos em laboratrio de microbiologia clnica; Mdulo 2 Controle externo da qualidade; Mdulo 3 Principais Sndromes Infecciosas; Mdulo 4 Procedimentos laboratoriais: da requisio do exame anlise microbiolgica e laudo final; Mdulo 5 Tecnologias em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos; Mdulo 6 Deteco e identificao de bactrias de importncia mdica; Mdulo 7 Deteco e identificao de micobactrias de importncia mdica; Mdulo 8 Deteco e identificao de fungos de importncia mdica e Mdulo 9 Infeces virais. A Anvisa e a OPAS esperam com essa publicao contribuir para que os laboratrios de microbiologia possam assimilar e alcanar novos nveis de complexidade laboratorial, atendendo s exigncias e caractersticas prprias de cada unidade hospitalar, alm de subsidiar a adoo de procedimentos bsicos padronizados nesses servios.
Introduo
1.1 Procedimentos gerais para preparao e distribuio de meios de cultura
Usar EPIs para o preparo de meios de cultura (mscaras, jaleco de manga longa e touca). Observar os riscos indicados nos rtulos dos frascos de meios de culturas e de reagentes qumicos e fazer uso de EPIs especficos (mscaras, culos de proteo e luvas). Usar vidrarias limpas, secas e sem trincos ou defeitos. Utilizar vidraria (balo de fundo chato, Placa de Petri, tubo de ensaio, frasco, pipeta e outras Vidrarias auxiliares) em vidro neutro temperado, termo resistente com parede uniforme e reforado. Esterilizar a vidraria pelo processo de calor seco (forno Pasteur) 170C por 120 minutos ou 180C por 60 minutos. Usar gua destilada, deionizada, ou produzida por osmose reversa na preparao de meios de cultura e solues. Os meios comerciais devem ser hidratados em pequena quantidade de gua at que todo o meio fique mido e s depois deve-se acrescentar o restante da gua. Os meios comerciais e preparados no comerciais devem ser pesados separadamente em papel manteiga e adicionados em uma vidraria adequada, hidratar em pequena quantidade de gua at que todo o meio fique mido. Agitar firmemente por alguns segundos at obter uma suspenso homognea. Escorrer o restante da gua pela parede para retirar qualquer material aderente. Ajustar o pH dos meios preparados no comerciais com soluo de HCl e NaOH 0,1N ou 1N. Nos meios contendo gar, pesar o gar separadamente e acrescentar aps o ajuste do pH para no obstruir o eletrodo. O pH dos meios comerciais, normalmente, no precisa ser reajustado mas deve ser verificado a cada lote. Dissolver os meios lquidos e solues com agitao e leve aquecimento (no abrir fervura).
Introduo
Aquecer os meios contendo gar at ferver com constante agitao. A parede da vidraria deve estar lisa sem pontos de gar. Caso observe pontos, a fervura no foi suficiente para a total dissoluo. Retornar ao fogo para finalizar o procedimento. Sempre que for necessrio o aquecimento dos meios, usar vidro termo resistente tipo Pyrex e aquecer sobre a tela de amianto ou similar e trip, no bico de Bunsen ou em placa aquecedora. Usar sempre luvas trmicas apropriadas para laboratrio para manipular vidrarias quentes. Normalmente, quando for usado o termo esterilizar em autoclave, o tempo de esterilizao de 15 minutos e a temperatura de 121C. Observar as recomendaes contidas no rtulo ou manual do fabricante. Sempre que for usado o termo esterilizar por filtrao, usar membrana composta por steres de celulose ou polmeros plsticos e com porosidade de 0,22m de dimetro, recomendado para reter partculas bacterianas. A esterilizao por filtrao utilizada quando o material sensvel ao calor, como alguns meios de cultura, solues de acares, solues de antibiticos e outros. Quando distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos no precisam estar esterilizados. Quando distribuir o meio aps a autoclavao, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias ou materiais auxiliares obrigatoriamente devem ser estreis. Os meios devem ser autoclavados com as tampas semiabertas, para que a esterilizao seja por igual em todo o contedo dos tubos. Tampas fechadas no permitem a entrada do vapor.
1.2 Controle de qualidade de esterilidade e crescimento
Avaliar sistematicamente os meios de culturas e solues quanto qualidade de crescimento, seletividade, checagem de caractersticas bioqumicas diferenciais e caractersticas fsicas. Para todos os meios confeccionados, colocar no mnimo 10% do lote preparado na estufa 35 1C por 24 horas para o controle de esterilidade. No deve haver mudana de cor nem crescimento de qualquer colnia. Para o controle de crescimento, sempre que possvel usar cepas ATCC, que so cepas de referncias de origem e padro definido de provas para a sua caracterizao. Usar cepas de micro-organismos de referncia obtidas diretamente de uma coleo nacional ou internacional reconhecida ou culturas comerciais com propriedades equivalentes comprovadas para avaliao de desempenho dos meios de cultura e de outras solues preparadas no laboratrio. Manter instruo de manuteno e preparo de cultura de trabalho no laboratrio. (consultar ISO 11133-1 anexo B guia de preservao e manuteno de cultura de referncia).
Controlar a eficcia da autoclave ou estufa, realizando semanalmente teste biolgicos para essa finalidade. Os testes biolgicos para autoclaves a vapor so os que contm 106 Geobacillus stearothermophilus e os testes biolgicos para estufa de calor seco contm 106 Bacillus subtilis.
1.3 Recomendaes gerais
No usar meios prontos para uso em tubos ou placas que estejam ressecados ou vencidos. A validade dos meios preparados, mantidos nas condies definidas de armazenamento, deve ser determinada e controlada. Observar com ateno para as instrues dos rtulos pois, dependendo do fabricante, podem ter o mesmo nome, mas composio diferente e portanto ser diferente a quantidade de meio a ser usada. Recomenda-se o uso de tubos com tampa de rosca, pois evitam o ressecamento rpido do meio (tamanho dos tubos utilizados geralmente so de 10X100 mm, 16x150mm e 20x150mm). A validade citada nesse documento indicada para meios de cultura distribudos em tubos com tampa de rosca. As placas de Petri so de 50, 90 ou 150 mm de dimetro. Todos os meios confeccionados devem ser devidamente identificados com o nome, data de fabricao, nmero de lote interno do laboratrio, data de validade e tipo de armazenamento. Todos os meios em placa devem ser embalados na posio invertida e em pacote de filme plstico PVC transparente e de papel grau cirrgico para evitar o ressecamento. Evitar o uso de sacos plsticos para embalar as placas, pois a gua de condensao formada facilita a proliferao de fungos; para meios de cultura em tubos, colocar em sacos plsticos, procurando tirar o excesso de ar.
Captulo 1: Meios de Cultura para Transporte e Conservao

Rosngela Aparecida Mendes Silva Maria Carmen Gonalves Lopes Julia Taeko Utiyama Yoshida
1.1 Cary Blair

1.1.1 Princpio Meio de Cary Blair foi formulado a partir do meio de Stuart, uma vez que micro-organismos patognicos e outros coliformes fecais sobrevivem bem nesse meio. A carncia de uma fonte de nitrognio impede consideravelmente a multiplicao de micro-organismos e a composio nutritiva garante a sobrevivncia deles. O que difere esse meio do meio de Stuart a adio de uma soluo salina balanceada de tampo fosfato inorgnico e a retirada da frmula o azul de metileno. Utilidade Transporte de material fecal e consequente conservao dos micro-organismos. Frmula/produto Meio comercial: Meio de transporte Cary Blair. Procedimentos Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Fundir completamente. Distribuir 7 mL por tubo. Esterilizar em autoclave. Aps retirar da autoclave, manter os tubos em posio vertical para solidificar. pH: 8,0 +/- 0,5 (BBL) (25C).
11
1.1.2
1.1.3
1.1.4
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa
1.1.5
Controle de qualidade Crescimento bom (com, 24 e 48 horas de crescimento): Shigella flexnerii ATCC 12022. Conservao e validade Conservar de 4 a 10C de 6 a 8 semanas. Inoculao Introduzir um swab estril de madeira nas fezes recm-coletadas. Aps a coleta, introduzir imediatamente o swab no meio de cultura e quebrar a ponta da haste, de modo que a parte que contm o algodo fique no meio de cultura. Fechar o tubo. Manter em temperatura ambiente at o momento de semear nos meios seletivos adequados. Interpretao Cor original do meio: Branco opalescente. Como esse um meio de transporte, no h evidncia de crescimento bacteriano. Recomendaes No deixar o meio com a tampa aberta ou semiaberta aps a semeadura. No semear fezes coletadas com mais de 6 horas.
1.1.6
1.1.7
1.1.8
1.1.9
1.2 Salina tamponada

1.2.1 Princpio Meio lquido tamponado que mantm a bactria vivel. Utilidade Meio de transporte de fezes. Frmula/produto Frmula: NaCl 4,2 g. Fosfato dipotssico anidro 3,1 g. Glicerina bidestilada 300 mL. gua destilada 700 mL. Procedimentos Distribuir 10 mL em cada tubo de 16 x 160 mm.
1.2.2
1.2.3
1.2.4
12
Esterilizar em autoclave.
1.2.5
Controle de qualidade Shigella flexneri ATCC 12022. Inoculao Inocular 2 g da amostra de fezes e homogeneizar. Incubar a 35 1C por 12 a 18 horas. Interpretao O crescimento indicado pela turbidez do meio. Aps incubao semear 3 a 4 aladas da amostra em uma placa de SS e/ ou MacConkey. Conservao e validade Conservar de 4 a 8C por at 3 meses.
1.2.6
1.2.7
1.2.8
1.3 Meio Stuart

1.3.1 Princpio A carncia de uma fonte de nitrognio impede consideravelmente a multiplicao de micro-organismos e a composio nutritiva garante a sobrevivncia deles. Utilidade Transporte de diversos materiais e consequente conservao dos micro-organismos. Conservao de micro-organismos patognicos como: Haemophilus spp., Streptococcus pneumoniae, Salmonella spp., Shigella spp. entre outros. Frmula/produto Meio comercial: Meio de transporte STUART. Procedimentos Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Fundir completamente. Distribuir 7 mL por tubo. Esterilizar em autoclave. Aps retirar da autoclave, manter os tubos em posio vertical para que solidifiquem. pH: 7,4 +/- 0,2 (25C).
1.3.2
1.3.3
1.3.4
13
1.3.5
Controle de qualidade Crescimento bom (com, 24 e 48 horas de crescimento): Haemophilus influenzae ATCC 10211 Shigella flexneri ATCC 12022 Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 Bordetella pertussis ATCC 9340 Conservao e validade Conservar embalado de 4 a 8C por 1 a 2 semanas. Inoculao O material biolgico deve ser coletado com auxlio de um swab estril com haste de madeira. Aps a coleta, introduzir imediatamente o swab no meio de cultura e quebrar a ponta da haste, de modo que a parte que contm o algodo fique no meio de cultura. Fechar o tubo. Manter em temperatura ambiente at o momento de semear nos meios seletivos adequados. Interpretao Cor original do meio: Branco opalescente. Como esse um meio de transporte, no h evidncia de crescimento bacteriano. Recomendaes No deixar o meio com a tampa aberta ou semiaberta aps a semeadura.
1.3.6
1.3.7
1.3.8
1.3.9
1.4 gar nutriente

1.4.1 Princpio O gar Nutriente um meio relativamente simples, de fcil preparao e barato, muito usado nos procedimentos do laboratrio de Microbiologia. Utilidade gar Nutriente tem vrias aplicaes no laboratrio de Microbiologia, e pode ser utilizado para anlise de gua, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas a exames bacteriolgicos e isolamento de organismos para culturas puras. Uso mais frequente para a conservao e manuteno de culturas em temperatura ambiente nesse gar, como mtodo opcional para os labo-
1.4.2
14
ratrios que no dispem do mtodo da crio conservao (congelamento das cepas em freezer 70C). Usado para observar esporulao de espcies de bacilos Gram-positivos.
1.4.3
Frmula/produto Produto comercial: Nutriente gar Frmula: Extrato de carne 3 g Peptona 5 g gar 15 g gua destilada 1000 mL pH: 6,8 +/- 0,2 (25C) Procedimentos Pesar e hidratar os componentes. Fundir. Distribuir 3-5 mL por tubo. Esterilizar em autoclave. Aps retirar da autoclave, inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45). Controle de qualidade Crescimento bom a excelente: Escherichia coli ATCC 25922 Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 Conservao e validade Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses. Inoculao Estriar a superfcie inclinada do meio. Incubar. Interpretao Cor original do meio: branco opalescente. Positivo: Crescimento na superfcie do gar. Negativo: por ser um meio geral, no cabe fazer controle negativo. Recomendaes Por ser um meio nutritivo, a ausncia de crescimento no dever ocorrer.
1.4.4
1.4.5
1.4.6
1.4.7
1.4.8
1.4.9
15
Captulo 2: Meios para Crescimento e Isolamento

2.1 gar chocolate

2.1.1 Princpio Meio de gar Chocolate amplamente utilizado para o cultivo de micro-organismos exigentes, embora cresam nesse meio quase todos os tipos de micro-organismos. base do meio adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho e levado para achocolatar em banho-maria a 80-85C por 15 minutos, o que faz com que as hemcias lisem, liberando hemina e hematina, compostos fundamentais para o crescimento dos micro-organismos exigentes. Observao: se utilizar sangue de carneiro ou coelho no lugar do sangue de cavalo, resfriar a base achocolatada a aproximadamente 50C e adicionar os suplementos base de NAD (coenzima I) e cistena. 2.1.2 Utilidade Crescimento de micro-organismos exigentes Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp. Frmula/produto Meios comerciais: BHI gar *, Columbia gar Base, Blood gar Base, Mueller Hinton gar. Sangue de cavalo, carneiro ou coelho desfibrinado. Recomenda-se o uso da base de BHI gar, por apresentar melhor crescimento das cepas exigentes, principalmente cepas de Haemophilus spp.
2.1.3
17
2.1.4
Procedimentos Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Esterilizar em autoclave. Esfriar a base temperatura de aproximadamente 80C. Adicionar 5-10 mL de sangue desfibrinado de cavalo para cada 100 mL de base; Recomenda-se, conforme o micro-organismo, gar BHI chocolate 10% sangue de cavalo, gar Muller Hinton chocolate 5% sangue de coelho/carneiro/cavalo e gar chocolate 5% sangue de carneiro com base de gar comum. Levar para achocolatar em banho-maria a 80-85C por 15 minutos. Homogeneizar constantemente at lisar totalmente as hemcias e o meio apresentar uma cor castanho escuro (chocolate). Distribuir aproximadamente 20mL em placas de Petri estril de 90 mm de dimetro ou 6mL em tubo estril 16x160mm e inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45). Controle de qualidade Crescimento bom a excelente: Haemophilus influenzae ATCC 10211. Conservao e validade Conservar de 4 a 10C por 3 meses (tubos) e 1 ms (placas). Inoculao Estriar a superfcie do meio, usando a tcnica de semeadura para isolamento. Incubar a 35C por 24 horas. Interpretao Cor original do meio: castanho escuro (chocolate). Colnias de tamanho pequeno a mdio, com pigmento amarelo: sugestivo de Neisseria spp., Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp. Colnias pequenas e delicadas, com pigmento creme claro: sugestivo de Haemophilus spp. Recomendaes Lembrar que um meio rico e crescem vrios tipos de micro-organismos. Fazer esfregao de todas as colnias suspeitas e corar pela tcnica de Gram, para confirmar se trata ou no de Neisseria spp., Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp. (cocos Gram-negativos reniformes) ou Haemophilus spp. (bacilos Gram-negativos delicados e pleomrficos). No usar sangue desfibrinado vencido.
2.1.5
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18
Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biolgicos em geral costuma ser abundante. Sempre que necessrio, isolar a colnia em estudo para os procedimentos de identificao, para no correr o risco de trabalhar com cepas misturadas.
2.2 gar Thayer-Martin chocolate

2.2.1 Princpio um meio rico e superior a outros meios de cultivo destinados para o isolamento de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis, pois contm em sua frmula antibiticos que inibem o crescimento de bactrias do gnero Neisseria saprfitas e outras bactrias, quando em amostras colhidas de stios contaminados. Utilidade Usado para o isolamento seletivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis, a partir do material de investigao. Frmula/produto Meio comercial: Thayer-Martin gar Base. Sangue desfibrinado de carneiro. Suplemento I: mistura de inibidores (antibiticos VCN ou VCNT). Suplemento II: mistura de fatores de crescimento. Procedimentos Dissolver os suplementos liofilizados conforme instrues do fabricante com o diluente que acompanha o suplemento e reservar. Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante (normalmente prepara-se 250mL de base para cada frasco de suplementos I e II); existe no mercado frasco de suplemento para 500mL de base. Esterilizar a base em autoclave. Esfriar a base a 80C. Adicionar 5 mL de sangue desfibrinado de carneiro para cada 100 mL de base. Levar para achocolatar em banho-maria a 80-85C por 15 minutos. Homogeneizar constantemente. Homogeneizar bem at lisar totalmente as hemcias e o meio apresentar uma cor castanho escura (chocolate). Deixar resfriar a base a 50C. Adicionar assepticamente base resfriada os suplementos previamente dissolvidos. Homogeneizar delicadamente para no formar bolhas.
2.2.2
2.2.3
2.2.4
19
Distribuir 20-25mL em placas de Petri estril de 90 mm ou 4mL em tubo e inclinar para a superfcie ficar em forma de bico de flauta (ngulo de 45). pH: 7,2 +/- 0,2.
2.2.5
Controle de qualidade Positivo: Neisseria gonorrhoeae 43069 e Neisseria meningitidis 13090. Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923. Conservao e validade Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses (tubos) e 1 ms (placas). Inoculao Usar a tcnica de semeadura por esgotamento. Incubar em CO2 e umidade (jarra com vela acesa e um chumao de algodo embebido em gua). Incubao por 48 horas. Interpretao Cor original do meio: castanho escuro (chocolate). Colnias pequenas com pigmento creme: sugestivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis . Fazer esfregao de todas as colnias suspeitas e corar pela tcnica de Gram, para confirmar se trata ou no de Neisseria (diplococos Gram-negativos reniformes). Confirmando a morfologia pelo Gram, seguir identificao com testes de oxidase e provas de fermentao. Recomendaes Antes de semear o material biolgico aquecer o meio de cultura em estufa 35C, pois temperaturas baixas podem inibir o crescimento de Neisseria. No usar meio, suplementos e sangue vencidos. Se no for incubado em CO2 e no houver crescimento, pode ser um resultado falso-negativo, pois bactrias do gnero Neisseria necessitam de atmosfera com o CO2 para o crescimento. Se no houver crescimento, incubar at 5 dias.
2.2.6
2.2.7
2.2.8
2.2.9
2.3 gar Salmonella-shigella (SS)

2.3.1 Princpio gar SS possui componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sdio) que inibem micro-organismos Gram-positivos.
20
A incorporao de lactose ao meio permite diferenciar se o micro-organismo lactose positiva (bactrias que fermentam a lactose produzem cido que na presena do indicador vermelho neutro resultando na formao de colnias de cor rosa), e bactrias que no fermentam a lactose formam colnias transparentes. Tiossulfato de sdio e o citrato frrico permitem a deteco de H2S evidenciado por formao de colnias de cor negra no centro.
2.3.2
Utilidade Selecionar e isolar espcies de Salmonella e Shigella, em amostras de fezes, alimentos e gua. Frmula/produto Meio comercial: gar SS. Procedimentos Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Aquecer o meio at fundir o gar. No autoclavar Este meio no precisa ser esterilizado. Resfriar at 50C e distribuir 20 a 25 mL em placas de Petri 90 mm estreis. Deixar em temperatura ambiente at resfriar; pH: 7,0 +/-0,2 (25C). Embalar as placas com plstico PVC transparente e guardar em geladeira de 4 a 8C. Controle de qualidade Positivo: Salmonella typhimurium ATCC 14028. Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923. Inoculao Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas. Se negativo aps 24 horas, reincubar por mais 24 horas. Interpretao Cor original do meio: vermelho alaranjado. Colnias com centro negro (HS) ou colnias incolores: suspeita de Salmonella. Colnias incolores: suspeita de Shigella spp. Colnias cor de rosa ou vermelho: suspeita de Escherichia coli ou Klebsiella spp. As bactrias no fermentadoras de lactose so incolores. As bactrias fermentadoras de lactose aparecem na cor rosa.
2.3.3
2.3.4
2.3.5
2.3.6
2.3.7
21
2.3.8
Conservao e validade Conservar embalado de 4 a 8C por 1 ms. Recomendaes Ausncia de crescimento ou crescimento escasso, reincubar a placa mais 24 horas. No autoclavar, pois a alta temperatura degrada o acar contido no meio.
2.3.9
2.4 Caldo selenito com novobiocina

2.4.1 Princpio Possui propriedades que inibem coliformes e outras espcies da flora intestinal como estreptococos. Utilidade Utilizado para o enriquecimento e isolamento de Salmonella spp. e Shigella spp. em amostras de fezes, urina e alimentos. Frmula/Produto Meio comercial: Caldo Selenito. Procedimentos Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Aquecer at levantar fervura, homogeneizando de vez em quando. No autoclavar. Aguardar esfriar e adicionar 0,04 g de novobiocina por litro de meio (novobiocina inibe o vu de Proteus spp.); pH: 7,0 +/- 0,2 (25C). Esterilizar por filtrao. Distribuir 7 mL em tubos estreis de 15x150 mm com tampa de rosca. Controle de qualidade A) Crescimento: Preparar uma suspenso de Escherichia coli ATCC 25922 e Salmonella typhimurium ATCC 14028 na escala 0,5 de Mac Farland. Semear 0,01 mL da de cada suspenso nos tubos de Selenito com novobiocina. Incubar os tubos a 35 1C por 24 horas e semear 0,01 mL na placa de SS. Incubar a placa a 35 1C por 12 a 18 horas. Positivo: crescimento da Salmonella typhimurium. Negativo: crescimento parcial ou no h crescimento de Escherichia coli.
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2.4.2
2.4.3
2.4.4
2.4.5
Consultar: BRASIL. Ministrio da Agricultura. Portaria n 101 de 11/08/1193. Mtodos analticos para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes e mtodos microbiolgicos. Dirio Oficial da Unio. (Anexo-6.1.3 Avaliao do desempenho de caldo seletivo com uma mistura de culturas desejadas e no desejadas). 2.4.6 Inoculao Inocular 3 a 4 aladas da amostra de fezes no meio de cultura. Incubar a 351C por 12 a 18 horas. Interpretao Cor original do meio: vermelho tijolo. Conservao e validade Conservar embalado de 4 a 8C por 3 meses.
2.4.7
2.4.8
2.5 Caldo tetrationato

2.5.1 Princpio Os sais de bile contidos no meio de tetrationato inibem micro-organismos Gram-positivos e a adio da soluo de iodo e de verde brilhante 0,1% inibem a flora intestinal normal de espcies fecais. Utilidade Meio de enriquecimento para Salmonella spp. Frmula/produto Meio comercial: Caldo Tetrationato. Soluo de Iodo para tetrationato: para ser adicionado no caldo antes de semeada a amostra de fezes. Iodo metlico 6,0 g Iodeto de potssio 5,0 g gua destilada 20,0 mL Procedimentos A) Caldo tetrationato Pesar e hidratar o meio segundo instrues do fabricante. Aquecer at ferver. Distribuir 10 mL em tubos estreis com tampa de rosca. No autoclavar. Conservar de 4-8C.
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2.5.2
2.5.3
2.5.4
B) Soluo de iodeto de potssio Macerar o iodeto de potssio e o iodo em um gral. Adicionar gua aos poucos at dissolver completamente. Colocar em frasco mbar. 2.5.5 Controle de qualidade A) Crescimento: Preparar uma suspenso de Salmonella typhimurium ATCC 14028 e uma cepa de Escherichia coli ATCC 25922 na escala 0,5 de Mac Farland. Semear 0,01 mL de cada suspenso nos tubos de caldo tetrationato. Incubar os tubos a 35 1C por 24 horas e semear 0,01 mL na placa de SS. Se houver crescimento de Salmonella e inibio de Escherichia coli, liberar o lote para uso. Consultar: BRASIL. Ministrio da Agricultura. Portaria n101 de 11/08/1193. Mtodos analticos para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes e mtodos microbiolgicos. Dirio Oficial da Unio. (Anexo-6.1.3 Avaliao do desempenho de caldo seletivo com uma mistura de culturas desejadas e no desejadas). 2.5.6 Inoculao No momento da inoculao, adicionar 0,2 mL da soluo de iodo no tubo e 0,1 mL da soluo de verde brilhante 1% por tubo. Inocular 1 a 3 g da amostra de fezes e homogeneizar vigorosamente. Incubar a 35 1C por 12 a 18 horas. Interpretao Cor original do meio: lmpido com precipitado branco. O crescimento indicado pela turbidez do meio. Aps incubao, semear 3 a 4 aladas da amostra em uma placa de SS e/ou Mac Conkey. Conservao e validade Tetrationato: Conservar de 4 a 8C por at 3 meses. Soluo de iodo: Conservar em frasco mbar a temperatura ambiente por at 12 meses.
2.5.7
2.5.8
24
2.6 Meio de Tioglicolato com indicador

2.6.1 Princpio O meio de Tioglicolato d suporte para o crescimento de vrios micro-organismos. O potencial de oxidao e reduo baixo do meio neutraliza efeitos antibacterianos das espcies preservadas com mercrio. A resazurina e o azul de metileno so indicadores da posio de oxidao de aerbios e a dextrose includa na frmula para os micro-organismos que apresentam crescimento vigoroso na presena do carboidrato. Utilidade Usado para o cultivo de micro-organismos aerbios, microaerfilos e anaerbios. Usado para controle de esterilidade bacteriana de diversos materiais. Frmula/produto Meio comercial: Meio de Tioglicolato caldo com indicador Procedimentos Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Aquecer em bico de Bunsen, abrir fervura devido ao gar na sua composio (0,5g/L) at dissolver completamente. Distribuir 5 mL por tubo. Esterilizar em autoclave. pH: 7,2 +/- 0,2 (25C) Controle de qualidade Crescimento bom a excelente: Bacillus subtil is ATCC 6633, Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Conservao e validade Conservar embalado a temperatura ambiente por 3 meses. Inoculao Com auxlio da ala bacteriolgica, inocular o material biolgico introduzindo a ala at a metade do tubo. Retirar a ala sem agitar o tubo. Incubar 35 1C por 24 horas. Interpretao Cor original: amarelo claro. Presena de crescimento: turvao do meio.
25
2.6.2
2.6.3
2.6.4
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2.6.6
2.6.7
2.6.8
Ausncia de crescimento: meio permanece inalterado. Crescimento de micro-organismos anaerbios: crescimento na profundidade do meio. Crescimento de micro-organismos aerbios: crescimento na superfcie do meio.
2.6.9
Recomendaes No usar o meio quando mais de 30% do tubo estiver com cor rosa ou esverdeado na superfcie, pois indica a presena de oxignio no meio. Recomenda-se o uso do meio recm-preparado, porm, se no houver a presena de oxignio, pode-se usar um perodo maior. No usar meios que estejam turvos. No utilizar o meio quando o indicador atingir a metade do volume do meio.
2.7 Meio de Tioglicolato sem indicador

2.7.1 Princpio As substncias redutoras tioglicolato, cistena e sulfito de sdio produzem uma anaerobiose suficiente para micro-organismos anaerbios exigentes. Utilidade Usado para o cultivo de micro-organismos anaerbios. Frmula/Produto Meio comercial: Meio de Tioglicolato caldo sem indicador. Procedimentos Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Aquecer em bico de Bunsen, at dissolver completamente. Distribuir 5 mL por tubo. Esterilizar em autoclave. pH: 7,2 +/- 0,2 (25C). Controle de qualidade Crescimento bom a excelente: Clostridium perfringens ATCC 10543. Conservao e validade Conservar embalado a temperatura ambiente por 3 meses.
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Inoculao Com auxlio da ala bacteriolgica, inocular o material biolgico introduzindo a ala at o fundo do tubo. Retirar a ala sem agitar o tubo. Incubar 35 1C em jarra com gerador de anaerobiose durante 48 horas. Interpretao Cor original: amarelo claro. Presena de crescimento: turvao do meio. Ausncia de crescimento: meio permanece inalterado. Recomendaes No usar meios que estejam turvos. Se necessrio, incubar um perodo superior 48 horas.
2.7.8
2.7.9
2.8 gar Mac Conkey

2.8.1 Princpio O cristal violeta inibe o crescimento de micro-organismos Gram-positivos especialmente enterococos e estafilococos. A concentrao de sais de bile relativamente baixa em comparao com outros meios, por isso no to seletivo para Gram-negativos como, por exemplo, o gar SS. Utilidade Isolar bacilos Gram-negativos (enterobactrias e no fermentadores) e verificar a fermentao ou no da lactose. Frmula/Produto Meio comercial: gar MacConkey. Procedimentos Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Aquecer sob agitao at fundir o gar completamente. Esterilizar em autoclave. Resfriar at 50C e distribuir 20 a 25 mL em placas de Petri 90 mm estreis. Deixar em temperatura ambiente at resfriar. Embalar as placas com plstico PVC transparente e guardar em geladeira de 4 a 8C.
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Controle de qualidade Positivo: Proteus mirabilis ATCC 12453 (no fermentador de lactose). Positivo: Escherichia coli ATCC 25922 (fermentador de lactose). Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923. Inoculao Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas. Se negativo aps 24 horas, reincubar por mais 24 horas. Interpretao Cor original do meio: rosa avermelhado. Crescimento de bacilos Gram-negativos. Colnias cor de rosa: fermentadoras de lactose. Colnias incolores: no fermentadoras de lactose. No h crescimento de cocos Gram-positivos. Conservao e validade Conservar as placas embaladas de 4 a 8C por at 3 meses.
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2.9 gar sangue

2.9.1 Princpio O meio de gar sangue, usando uma base rica como abaixo descrita, oferece timas condies de crescimento a maioria dos micro-organismos. A conservao dos eritrcitos ntegros favorecem a formao de halos de hemlise ntidos, teis para a diferenciao de Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. Utilidade Usado para o isolamento de micro-organismos no fastidiosos. Verificao de hemlise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. Usado na prova de satelitismo (para identificao presuntiva de Haemophilus spp.). Frmula/Produto Meio comercial: Blood gar Base, Columbia gar Base, BHI gar, Mueller Hinton gar. Sangue desfibrinado de carneiro ou coelho: 5 mL para cada 100 mL de meio base. pH: 6,8 +/- 0,2 (25C).
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Procedimentos Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Esterilizar em autoclave. Esfriar a base +/- 50C. Adicionar 5 mL de sangue desfibrinado de carneiro para cada 100 mL de base. Homogeneizar delicadamente para no formar bolhas. Distribuir em placas de Petri de 90 mm de dimetro. Controle de qualidade Hemlise beta hemoltica: Streptococcus pyogenes ATCC 19615 ou Staphylococcus aureus ATCC 25923. Hemlise alfa hemoltica: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305. Hemlise gama (sem hemlise): Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou Staphylococcus epidermidis ATCC 12228. Conservao e validade Conservar de 4 a 10C por 20 a 30 dias. Inoculao Estriar a superfcie do meio, usando a tcnica de semeadura para isolamento. No final da semeadura, picar o meio com a ala para verificar hemlise em profundidade. Incubar 35C 24 horas. Interpretao Cor original do meio: vermelho. Beta hemlise: presena de halo transparente ao redor das colnias semeadas (lise total dos eritrcitos). Alfa hemlise: presena de halo esverdeado ao redor das colnias semeadas (lise parcial dos eritrcitos). Gama hemlise (sem hemlise): ausncia de halo ao redor das colnias (eritrcitos permanecem ntegros). Recomendaes No usar sangue de carneiro vencido, pois o meio fica hemolisado ou com cor muito escura, dificultando o estudo de hemlise. No usar sangue humano, pois alguns micro-organismos no apresentam hemlise. No adicionar o sangue na base do meio quente, pois as hemcias rompem-se, dificultando o estudo de hemlise.
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Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biolgicos em geral costuma ser abundante, sempre que necessrio, isolar a colnia em estudo para os procedimentos de identificao, para no correr o risco de trabalhar com cepas misturadas.
2.10 gar Cled Cystine Lactose Electrolyte Deficient

2.10.1 Princpio Usado para isolamento e quantificao de micro-organismos presentes em amostras de urina. A deficincia de eletrlitos inibe o vu de cepas de Proteus. 2.10.2 Utilidade Isolar e quantificar micro-organismos Gram-positivos, Gram-negativos e leveduras. 2.10.3 Frmula/Produto Meio comercial: gar Cled. 2.10.4 Procedimentos Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Esterilizar em autoclave. Resfriar +/- 50C e distribuir de 20 a 25 mL em placas de Petri 90 mm estreis. Deixar em temperatura ambiente at resfriar. pH: 7,3 +/- 0,2 (25C) 2.10.5 Controle de qualidade Positivo: Lactose positiva: Escherichia coli ATCC 25922: crescimento moderado a denso, colnias mdias ou grandes amareladas, aps 48 horas de incubao. Lactose negativa: Proteus vulgaris ATCC 8427: crescimento moderado a denso, colnias azuis translcidas. Negativo: ausncia de crescimento. 2.10.6 Inoculao Verificar tcnica de semeadura quantitativa. 2.10.7 Interpretao Cor original do meio: azul claro. Colnias lactose positiva: cor amarela. Colnias lactose negativa: cor azul.
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A) Caractersticas de crescimento: Escherichia coli: colnias opacas, amarelas com ligeira cor amarelo escuro no centro, com cerca de 1,25 mm de dimetro, as no fermentadoras de lactose colnias azuis. Espcies de Klebsiella: colnias muito mucosas, cor varivel de amarelo a branco azulado. Espcies de Proteus: colnias azul translcidas, geralmente menor que E.coli. Espcies de Salmonella: colnias planas, cor azul. Enterococcus faecalis: colnias amarelas, com cerca de 0,5 mm de dimetro. Staphylococcus aureus: colnias amarelas, com cerca de 0,75 mm de dimetro. Staphylococcus coagulase negativa: colnias amarelo palha e brancas. Corynebacterium: colnias pequenas e cinza. Lactobacilos: colnias pequenas e com superfcie rugosa. Pseudomonas aeruginosa: colnias verdes, com superfcie prateada e periferia rugosa. 2.10.8 Conservao e validade Conservar embalado e refrigerado (entre 4 a 8C) por at 3 meses (tubos) e 1 ms (placas). 2.10.9 Recomendaes Organismos que fermentam lactose baixam o pH e mudam a cor do meio de verde para amarelo, podendo assim verificar se o micro-organismo lactose negativa ou positiva. Espcies de Shigella no crescem em meios deficientes em eletrlitos.
2.11 Caldo BHI Brain Heart Infusion

2.11.1 Princpio um meio derivado de nutrientes de crebro e corao, peptona e dextrose. A peptona e a infuso so fontes de nitrognio, carbono, enxofre e vitaminas. A dextose um carboidrato que os micro-organismos utilizam para fermentao.
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2.11.2 Utilidade Meio para cultivo de estreptococos, pneumococos, meningococos, enterobactrias, no fermentadores, leveduras e fungos. Pode ser utilizado na preparao do inculo para teste de susceptibilidade aos antimicrobianos, Para realizao de teste de coagulase em tubo, para teste de crescimento bacteriano a 42 e 44C, para teste de motilidade em lmina. 2.11.3 Frmula/Produto Meio comercial: Caldo BHI (infuso de crebro e corao). 2.11.4 Procedimentos Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Distribuir 3,0 mL em tubos com tampa de rosca. Esterilizar em autoclave. Retirar os tubos da autoclave e deixar esfriar em temperatura ambiente. pH: 7,4 +/- 0,2 (25C). 2.11.5 Controle de qualidade Positivo: Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 e Candida albicans ATCC 10231. Negativo: meio sem inocular. 2.11.6 Inoculao Com o auxlio de uma ala ou fio bacteriolgico, inocular a colnia ou o material a ser testado-realizar o teste com colnias puras de 18 a 24 horas. Incubar a 35C 2 por 24 a 48 horas. Para isolamento de fungos incubar por at 5 dias. 2.11.7 Interpretao Cor original do meio: amarelo claro, lmpido. Positivo: presena de turvao = crescimento bacteriano. Negativo: ausncia de turvao. 2.11.8 Conservao e validade Conservar de 4 a 10C por 6 meses. 2.11.9 Recomendaes Para cultivo de anaerbios, acrescentar 0,1% de gar. Para crescimento de Haemophilus e outros fastidiosos necessrio adio de suplementos a base de L-cistena, NAD (fator V) e hemina (fator X).
32
2.12 Lwenstein Jensen

2.12.1 Princpio A base do meio constituda por ovos integrais, o que permite amplo crescimento das micobactrias e o crescimento satisfatrio para o teste de niacina (que positivo para Mycobacterium tuberculosis). 2.12.2 Utilidade Isolamento primrio das micobactrias. 2.12.3 Frmula/Produto Meio comercial: Meio TB para Bacilos de Koch Seg. Lwenstein Jensen ou Lwenstein Medium Base. Ovos de galinha frescos. A) 1 Etapa: Meio base Fosfato monopotssico 1,2 g Sulfato de magnsio 0,12 g Citrato de magnsio 0,3 g L-asparagina 1,8 g Fcula de batata 15,0 g Glicerol 6,0 mL Verde malaquita 0,2g gua destilada estril qsp 320mL Vide orientaes do fabricante B) 2 ETAPA: Ovos totais 500 mL 2.12.4 Procedimentos A) Preparao dos ovos: Escovar os ovos, um a um, com escova de cerdas macias. Deixar os ovos submersos em gua e detergente comum, durante 30 minutos. Enxaguar com gua corrente cuidadosamente um a um. Deixar os ovos submersos em lcool etlico a 70% durante 30 minutos. Retirar os ovos cuidadosamente e secar com pano estril. Reservar os ovos.
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B) Meio comercial: Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Esterilizar em autoclave. Resfriar a base a 45 50C. Quebrar os ovos, um a um, cuidadosamente em copo de bquer estril e transferir, um a um, para uma proveta estril de 500 mL. Completar a proveta com ovos at completar 500 mL. Transferir os ovos para um copo de liquidificador estril se no tiver liquidificador prprio para laboratrio, transferir os ovos para um balo de 1000 mL contendo prolas de vidro de tamanho mdio, ambos estreis. Homogeneizar os ovos. Passar os ovos para o balo que contm a base fria, filtrando em funil e gaze estril. Homogeneizar bem. Distribuir 10 a 12 mL por tubo de rosca estril. Colocar os tubos no coagulador inclinados com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45) durante 50 minutos a 85C se no tiver coagulador, pode-se coagular os ovos em banho de areia 85C colocado em estufa de esterilizao, tambm por 50 minutos, tendo o cuidado de verificar a temperatura constantemente. 2.12.5 Controle de qualidade Esterilizao: colocar todos os tubos em estufa. Crescimento bom a excelente: Mycobacterium tuberculosis ATCC 25618 Mycobacterium avium ATCC 25291 2.12.6 Conservao e validade Conservar entre 4 a 8C por 3 meses. 2.12.7 Inoculao Para materiais biolgicos de stios contaminados, fazer descontaminao prvia pelas tcnicas desejadas (Petroff, NALC, Lauryl sulfato de sdio, Corper & Stoner modificado). Semear 5 gotas ou mais, cobrindo bem a superfcie do meio. Manter os tubos inclinados com a tampa semiaberta at secar bem o inculo. Depois de seco o inculo, rosquear os tubos e incubar 60 dias 35C. Semanalmente, abrir as tampas prximo ao bico de Bunsen para ventilar os cultivos e observar a presena ou no de crescimento.
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2.12.8 Interpretao Cor original do meio: verde claro. Positivo: Crescimento de colnias amarelas. Negativo: ausncia de crescimento. 2.12.9 Recomendaes Como um meio rico em protenas, bactrias proteolticas contaminam o meio, liquefazendo-o, para isto, deve-se fazer uma leitura com 24 horas de incubao para tirar as culturas que possam ter contaminado. No usar ovos velhos. No quebrar mais que um ovo por vez, pois pode ter algum estragado e contaminar os demais. Manter sempre mais que um bquer estril para o caso de haver algum ovo estragado. No liberar culturas negativas com tempo inferior a 60 dias de incubao, pois as micobactrias desenvolvem-se lentamente. Fazer um esfregao do crescimento e corar pela tcnica de Ziehl para confirmar ser um Bacilo lcool cido Resistente, pois alguns contaminantes podem crescer com pigmento amarelo.
2.13 Meio bifsico: Lwenstein e Middlebrook

2.13.1 Princpio O meio constitudo de duas fases, uma slida que o meio de Lwenstein Jensen e uma lquida, que o meio 7H-9, juntos fornecem os nutrientes necessrios para o desenvolvimento das micobactrias isoladas de materiais nobres. 2.13.2 Utilidade Sistema desenvolvido para o isolamento de micobactrias do sangue e de materiais paucibacilares, como lquor, lquido pleural, bipsias, entre outros. 2.13.3 Frmula/Produto Meio comercial: Meio TB para Bacilos de Koch Seg. Lwenstein Jensen ou Lwenstein Medium Base. Meio comercial: Middlebrook 7H-9 broth. Meio comercial: Middlebrook Enrichment (suplemento para enriquecimento). Ovos de galinha frescos.
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2.13.4 Procedimentos A) Fase slida: Meio de Lwenstein Jensen: procedimento igual ao j descrito. Distribuir 12 mL do meio em frascos estreis com capacidade para 100 mL com tampo de algodo e levar ao coagulador na posio inclinada a 85C por 50 minutos. B) Fase lquida: Meio Middlebrook 7H-9 broth: .. Pesar e hidratar conforme instrues do fabricante. .. Adicionar o glicerol, conforme instrues do fabricante. .. Esterilizar em autoclave. .. Resfriar a base 50C. .. Adicionar o suplemento Middlebrook Enrichment, conforme instrues do fabricante. .. Homogeneizar bem. C) Fase slida + lquida: Distribuir 15 mL do Meio Middlebrook 7H-9 em cada frasco de Lwenstein Jensen inclinado e coagulado. Fazer o controle de qualidade de esterilidade. Retirar o tampo de algodo e lacrar os frascos com tampa de borracha (previamente submersas em lcool etlico 70% durante 30 minutos) e lacre de alumnio. As tampas e os lacres podem ser autoclavados num recipiente e retirados com pina estril. pH: 6,6 +/- 0,2. 2.13.5 Controle de qualidade Crescimento bom a excelente: Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294 e Mycobacterium fortuitum ATCC 6841. 2.13.6 Conservao e validade Conservar os frascos embalados de 4 a 8C por at 3 meses. 2.13.7 Inoculao Por serem materiais estreis, no necessrio a descontaminao. Colher assepticamente 5 mL de sangue e inocular no frasco. Se for outro material, inocular at 5 mL de material. Incubar durante 60 dias 35 1C. Banhar o meio slido semanalmente.
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2.13.8 Interpretao Cor original do meio: parte slida: verde clara, parte lquida: mbar claro. Positivo: turvao do meio lquido e crescimento de colnias amarelas no meio slido. Negativo: ausncia de turvao e crescimento nos meios lquido e slido. 2.13.9 Recomendaes No usar frascos com meio lquido turvo. Volumes de inculos inferiores a 2,5 mL podem resultar em culturas falso negativas. No liberar culturas negativas com tempo inferior a 60 dias de incubao, pois as micobactrias desenvolvem-se lentamente. Fazer um esfregao do crescimento e corar pela tcnica de Ziehl para confirmar ser um Bacilo lcool cido Resistente, pois alguns contaminantes podem crescer com pigmento amarelo.
2.14 gar Mycosel

2.14.1 Princpio A Cicloheximida, um dos componentes do meio, serve para selecionar dermatfitos. O cloranfenicol inibe o crescimento de bactrias e alguns fungos filamentosos. 2.14.2 Utilidade Isolamento de fungos patognicos, principalmente dermatfitos, a partir de material de investigao contaminado. 2.14.3 Frmula/Produto Meio comercial: Mycosel gar, Mycobiotic gar ou gar seletivo para fungos patognicos. 2.14.4 Procedimentos Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Esterilizar em autoclave. Resfriar +/- 50C e distribuir em placas de 90 mm de dimetro ou 4 mL por tubo ou 20mL por tubo de 20x200mm. Se distribuir em tubos, distribuir antes da esterilizao e deixar solidificar com inclinao em forma de bico de flauta (ngulo de 45). pH: 6,9 +/- 0,1.
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2.14.5 Controle de qualidade Crescimento bom a excelente: Trichophyton verrucosum ATCC 36058, Candida albicans ATCC 10231. Crescimento inibido: Aspergillus niger ATCC 16404, Candida tropicalis, Penicillium spp. 2.14.6 Conservao e validade Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses (tubos) e 1 ms (placas). 2.14.7 Inoculao Inocular sempre dois tubos ou placas. Se em placa: semear com a tcnica de semeadura quantitativa. Se em tubo: estriar na superfcie inclinada do meio. Incubar um dos meios semeados em temperatura ambiente (25C) e o outro a 37C. Observar diariamente a presena ou no de crescimento. Incubar 40 dias. 2.14.8 Interpretao Cor original do meio: amarelo claro opalescente. Aps o crescimento, deve-se seguir a identificao do micro-organismo que cresceu. 2.14.9 Recomendaes A ausncia de crescimento no indica uma cultura negativa para fungos, pois alguns fungos podem ter o crescimento inibido nesse meio. Recomenda-se o uso de meios em tubos, pois a incubao demorada resseca com facilidade o meio contido em placas.
2.15 gar Sabouraud Dextrose

2.15.1 Princpio Meio com nutrientes que favorece o crescimento de diversos fungos leveduriformes e filamentosos. 2.15.2 Utilidade Cultivo e crescimento de espcies de Candidas e fungos filamentosos, particularmente associados a infeces superficiais. Caracterizao macroscpica do fungo filamentoso (colnia gigante).
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2.15.3 Frmula/Produto Meio comercial: Sabouraud Dextrose gar. 2.15.4 Procedimentos Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Esterilizar em autoclave. Resfriar +/- 50C e distribuir em placas de 90 mm de dimetro ou 4 mL por tubo ou 20mL por tubo de 20x200mm. Se distribuir em tubos, distribuir antes da esterilizao e deixar solidificar com inclinao em forma de bico de flauta (ngulo de 45). pH: 5,6 +/- 0,1. 2.15.5 Controle de qualidade Crescimento bom a excelente: Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404. 2.15.6 Conservao e validade Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses (tubos) e 1 ms (placas). 2.15.7 Inoculao Inocular sempre dois tubos ou placas. Se em placa: semear com a tcnica de semeadura quantitativa. Se em tubo: semear na superfcie inclinada do meio. Incubar um dos meios semeados em temperatura ambiente (25C) e o outro 37C. Observar diariamente a presena ou no de crescimento. Incubar 40 dias. 2.15.8 Interpretao Cor original do meio: amarelo claro opalescente. Aps o crescimento, deve-se seguir a identificao do micro-organismo que cresceu. 2.15.9 Recomendaes Recomenda-se o uso de meios em tubos, pois a incubao demorada resseca com facilidade o meio contido em placas. No usar meios vencidos e/ou ressecados. Para suspeitas de Histoplamasma capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis , semear em BHI gar.
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Captulo 3: Meios Comerciais para Provas de Identificao

3.1 Base de nitrognio para leveduras Yeast Nitrogen Base

3.1.1 Princpio Determina a capacidade das leveduras de assimilar carboidratos, utilizando um meio a base de Nitrognio, livre de carboidratos e discos de papel impregnados com carboidratos, nos quais observa presena de crescimento ao redor, aps um perodo de incubao. Utilidade Identificar as espcies de leveduras atravs da prova de assimilao de carboidratos. Frmula/Produto Meio comercial: Yeast Nitrogen Base ou Base de nitrognio para leveduras. Discos comerciais de carboidratos. Discos preparados no laboratrio, impregnados com solues de carboidratos a 1%: Carboidrato 1 g. gua destilada 100 mL. Procedimentos A) Para os discos de carboidratos: Se for preparar os discos com carboidratos, preparar 2 dias antes de fazer o meio. Usar discos estreis disponveis para compra ou esterilizar papel de filtro de 10 mm de dimetro em autoclave.
3.1.2
3.1.3
3.1.4
41
Pesar o carboidrato (cada carboidrato em frasco separado) e adicionar gua, homogeneizar bem at completa dissoluo carboidratos utilizados: glicose, maltose, sacarose, lactose, galactose, melibiose, celobiose, inositol, xilose, rafinose, trealose, dulcitol. Esterilizar por filtrao (cada um em frasco separado). Impregnar os discos previamente estreis (embeber totalmente os discos). Deixar os discos em estufa 37C at secarem totalmente.
B) Para meio base de nitrognio: Pesar e hidratar conforme instruo do fabricante; acrescentar metade do volume de gua; Esterilizar por filtrao e reservar. Pesar gar bacteriolgico (13g/l) e acrescentar a outra metade de gua. Esterilizar em autoclave e resfriar. Misturar as duas partes e distribuir 20mL em tubos 20x150 com tampa estreis. 3.1.5
Glicose Maltose Sacarose Lactose Galactose Melibiose Celobiose Inositol Xilose Rafinose Trealose Dulcitol
Controle de qualidade
POSITIVO Candida albicans Candida albicans Candida tropicalis Candida kefyr Candida albicans Candida guilliermondii Candida guilliermondii Cryptococcus neoformans Candida albicans Candida guilliermondii Candida albicans Candida guilliermondii NEGATIVO Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei Candida krusei
3.1.6
Conservao e validade Conservar os tubos de 4 a 8C por at 3 meses. Discos: refrigerado e se possvel em dessecador durante 1 ano ou mais. Inoculao Aquecer o tubo contendo 20 mL de meio base de nitrognio at fundir totalmente. Resfriar a base 47 48C.
3.1.7
42
Fazer uma suspenso das leveduras na escala 4 ou 5 de McFarland em 4 mL de gua destilada estril,, usando um cultivo de leveduras de 24 a 72 horas. Despejar a suspenso de leveduras no tubo contendo a base de nitrognio. Homogeneizar bem. Despejar o contedo homogeneizado (meio base + suspenso de leveduras) em placa de Petri de estril de 150 mm de dimetro. Esperar solidificar em temperatura ambiente. Colocar os discos impregnados com carboidratos com auxlio de uma pina flambada. Incubar 30C durante 18 a 24 horas.
3.1.8
Interpretao Cor original do meio: amarelo palha. Positivo: halo de crescimento ligeiramente opaco ao redor dos discos, que significa a assimilao do acar pela levedura. Negativo: Ausncia de halo de crescimento. O meio permanece inalterado. Recomendaes No usar cultivos de leveduras superiores a 72 horas. No usar inculo inferior ao recomendado, pois pode resultar em prova falso negativa. No adicionar a suspenso de leveduras base com temperatura superior a 48C, pois pode inativar as clulas e resultar em prova falso negativa. Aps homogeneizar o meio base e suspenso de leveduras, despejar imediatamente na placa de Petri, pois solidifica rapidamente.
3.1.9
3.2 gar Citrato Simmons

3.2.1 Princpio Verifica a capacidade da bactria de utilizar o citrato de sdio como nica fonte de carbono, juntamente com sais de amnia, alcalinizando o meio. Utilidade Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias e no fermentadores. Frmula/Produto Meio comercial: gar Citrato Simmons.
3.2.2
3.2.3
43
3.2.4
Procedimentos Pesar e hidratar o meio segundo instrues do fabricante. Ajustar o pH para 6,9 0,2. Aquecer sob agitao at fundir o gar. Distribuir em tubos com tampas de rosca. Esterilizar em autoclave. Retirar os tubos da autoclave e inclin-los ainda quentes, para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45). Deixar solidificar em temperatura ambiente. Controle de qualidade Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883. Negativo: Escherichia coli ATCC 25922. Inoculao Com o auxlio de um fio bacteriolgico, inocular na superfcie a colnia, no furar a base. Realizar o teste com colnias puras de 18 a 24 horas. Interpretao Cor original do meio: verde Positivo: cor azul ou crescimento no local do inculo. Negativo: no h crescimento e a cor permanece inalterada. Se houver crescimento visual na rea do inculo sem mudana de cor, o teste pode ser considerado positivo, reincubar por 24 at 72 horas, a incubao poder mudar a cor do meio para azul (alcalino). A) Leitura inicial com 24 horas: Se resultado positivo: encerrar o teste. Se resultado negativo ou houver dvida: reincubar por mais 24/48 horas. B) Leitura com 48 horas: Se houver crescimento visvel na rea do inculo sem mudana de cor, o teste pode ser considerado positivo, (encerrar o teste). Se resultado negativo ou houver dvida, reincubar por 24 at 72 horas, a incubao poder mudar a cor do meio para alcalino (azul).
3.2.5
3.2.6
3.2.7
3.2.8
Conservao e validade Conservar de 4 a 10C de 6 a 8 semanas. Aps esse perodo realizar controles negativo e positivo semanalmente.
44
3.2.9
Recomendaes Manter a tampa do tubo frouxa, o meio necessita de oxignio. No se devem transportar colnias de meios que contenham glicose ou outros nutrientes/substratos, pois podem entrar em contato com o meio de citrato, podendo dar um resultado falso positivo. Se algum resultado estiver duvidoso, inocular um novo tubo e incubar em temperatura ambiente (22 a 25C) por at 7 dias. No usar repiques de caldo. Deixar o tubo em temperatura ambiente antes de inocular a bactria. Para fazer o inculo flambar o fio bacteriolgico. No fazer inculo muito denso (pode acidificar o meio deixando-o amarelo).
3.3 gar Bile-Esculina

3.3.1 Princpio A prova de Bile-Esculina baseada na capacidade de algumas bactrias hidrolisarem esculina em presena de blis. A esculina um derivado glicosdico da cumarina. As duas molculas do composto (glicose e 7-hidroxicumarina) esto unidas por uma ligao ster atravs do oxignio. A esculina incorporada em um meio contendo 4% de sais biliares. As bactrias Bile-Esculina POSITIVAS, so capazes de crescer em presena de sais biliares. A hidrlise da esculina no meio resulta na formao de glicose e esculetina. A esculetina reage com ons frricos (fornecidos pelo composto inorgnico do meio o citrato frrico), formando um complexo negro. Utilidade Separao dos Streptococcus Bile-Esculina positiva dos Bile-Esculina negativa. Identificao dos Enterococcus spp., que so Bile-Esculina positiva. Identificao de bacilos Gram-negativos no fermentadores e enterobactrias, usar o meio sem blis (vide prova de esculina). Frmula/Produto Meio comercial: gar Bile-Esculina Frmula: Peptona 5 g Extrato de carne 3 g Blis 40 g Esculina 1 g Citrato frrico 0,5 g gar 15 g
45
3.3.2
3.3.3
gua destilada 1000 mL pH = 6,8 +/- 0,2 (25C)
3.3.4
Procedimentos Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Fundir o meio. Distribuir 2,5 mL por tubo. Esterilizar em autoclave. Aps retirar da autoclave, inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45). Controle de qualidade Positivo: Enterococcus faecalis ATCC 29212. Negativo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Conservao e validade Conservar de 4 a 10C por 3 meses. Inoculao Estriar a superfcie inclinada do meio. Incubar a 35C 24 horas. Interpretao Cor original do meio: acinzentado. Positivo: Enegrecimento em pelo menos metade ou mais do meio. Negativo: Ausncia de enegrecimento ou crescimento de menos da metade do meio aps 72 horas de incubao. Recomendaes Provas negativas com 24 horas de incubao, recomenda-se perodo de incubao maior (48 horas). Alguns Streptococcus do grupo viridans (cerca de 3%) podem hidrolisar a esculina em presena de blis se incubados em atmosfera de CO2.
3.3.5
3.3.6
3.3.7
3.3.8
3.3.9
3.4 gar Sangue CAMP

3.4.1 Princpio Consiste na interao da beta hemlise secretada pelo Staphylococcus aureus com o micro-organismo em estudo, que secreta uma protena, denominada fator CAMP, produzindo aumento de hemlise no local da inoculao.
46
3.4.2
Utilidade Separao do Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo B de Lancefield (S. agalactiae) e da Listeria monocytogenes (CAMP positivos) dos demais Streptococcus beta hemolticos e espcies de Listeria. Frmula/Produto Para essa prova utiliza-se: Placa de meio gar Sangue. Cepa de Staphylococcus aureus produtora de beta hemolisina ATCC 25923. Controle de qualidade Positivo: Streptococcus agalactiae ATCC 13813. Negativo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Inoculao Com auxlio do fio bacteriolgico, semear na superfcie de meio gar Sangue a cepa de Staphylococcus aureus com uma nica linha reta. Novamente com o fio bacteriolgico (flambado), tocar nas colnias em estudo. Semear uma nica linha reta na superfcie do meio gar Sangue, perpendicularmente linha de semeadura do S. aureus, sem tocar no inculo do S. aureus. Logo em seguida, sem flambar o fio, picar o meio gar Sangue duas vezes, uma de cada lado da semeadura da cepa em estudo, sem tocar nas duas linhas de inculo j feitos (a do S. aureus e da cepa em estudo). Incubar 35C 24 horas. (a) Inculo do S. aureus. (b) Inculo da cepa em estudo. Interpretao Positivo: Aumento da rea de hemlise em forma de flecha no local onde esto mais prximas as duas estrias de crescimento. Negativo: Ausncia de aumento da hemlise. Observa-se nitidamente a hemlise do S. aureus e da cepa em estudo, inalteradas. Recomendao No utilizar cepas velhas de S. aureus, pois podem no produzir beta hemolisina. No tocar as estrias da semeadura das cepas, para no dar um resultado falso negativo.
3.4.3
3.4.4
3.4.5
3.4.6
3.4.7
47
No utilizar placas de gar Sangue velhas que dificultem a leitura da prova, j que baseada na hemlise das cepas.
3.5 Caldo Base de Moeller

3.5.1 Princpio As descarboxilases so um grupo de enzimas com substrato especfico, capazes de reagir com o grupo carboxila dos aminocidos para formarem aminas alcalinas. Essa reao, conhecida como descarboxilao, origina dixido de carbono como produto secundrio. Emprega-se normalmente trs aminocidos para identificao dos micro-organismos: lisina, ornitina e arginina. A base de Moeller a mais utilizada. Os produtos aminados especficos, so: Lisina: Cadaverina. Ornitina: Putrescina. Arginina: Citrulina. A converso da arginina em citrulina uma atividade de diidrolase, e no descarboxilase, na qual o grupo NH2 retirado da arginina como primeira etapa. Em seguida, a citrulina convertida em ornitina, que sofre descarboxilao para formar putrescina. A incubao deve ser em anaerobiose e para isso adicionado 1 mL de leo mineral estril aps a inoculao. No incio da incubao, a glicose contida no meio fermentada e ocorre viragem de cor prpura para o amarelo. Quando o aminocido descarboxilado, as aminas alcalinas formadas revertem a cor do meio para prpura original. Utilidade Verificar a capacidade de micro-organismos usarem enzimas, auxiliando na identificao. Utilizado principalmente para identificaes de enterobactrias, bacilos Gram-negativos no fermentadores, estafilococos. Frmula/Produto Meio base comercial: Caldo Base de Moeller para Descarboxilase. Aminocidos: L lisina ou DL lisina, L ornitina ou DL ornitina, L arginina ou DL arginina. Procedimentos Preparar os meios com a Base de Moeller e aminocidos. Preparar o meio apenas com a Base de Moeller, sem aminocidos, que ser usada como controle.
3.5.2
3.5.3
3.5.4
48
Seguir as recomendaes do fabricante para pesar o meio Base de Moeller. Se usar aminocido L (levgiro), adicionar 1 grama do aminocido para cada 100 mL de meio base. Se usar aminocido DL (dextrgiro), adicionar 2 gramas do aminocido para cada 100 mL de meio base. Homogeneizar bem o meio. Acertar o pH para 6,0 com HCl 1 N. Distribuir 2 mL por tubo (usar tubos de rosca). Esterilizar em autoclave.
3.5.5
Controle de qualidade Positivo: Lisina: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 ou Enterobacter aerogenes ATCC 13047. Ornitina: Enterobacter cloacae ATCC 13047 ou Serratia marcescens ATCC 13880. Arginina: Enterobacter cloacae ATCC 13047 ou Enterobacter sakazakii. Negativo: Lisina: Enterobacter cloacae ATCC 13047 ou Citrobacter freundii ATCC 8454. Ornitina: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 ou Citrobacter freundii ATCC 8454. Arginina: Enterobacter aerogenes ATCC 13047 ou Klebsiella pneumoniae ATCC 13883. Conservao e validade Conservar entre 4 a 10 C por 3 meses. Inoculao A partir de crescimento recente, inocular a colnia em estudo no tubo contendo o aminocido e no tubo controle. Colocar aproximadamente 1 mL de leo mineral estril em cada tubo. Incubar 35 +/- 1C em aerobiose. Interpretao Cor original do meio: prpura. Positivo: Tubo controle (sem aminocido): amarelo e turvo indica que o micro-organismo vivel e o pH do meio abaixou o suficiente para ativar as enzimas descarboxilase. Tubo com aminocido: prpura e turvo indica a formao de aminas a partir da reao de descarboxilao.
49
3.5.6
3.5.7
3.5.8
Negativo: Tubos controle e com aminocido: prpura.
3.5.9
Recomendaes Verificar se o inculo foi satisfatrio para o crescimento, pois a cor original do meio prpura, sem apresentar turvao, no significa positividade e sim, ausncia de crescimento bacteriano. Como a reao ocorre em anaerobiose, imprescindvel a adio de leo mineral. Pode-se autoclavar o meio j com o leo mineral ou adicionar aps a inoculao do micro-organismo. Para alguns micro-organismos, como bacilos Gram-negativos no fermentadores, necessrio um perodo de incubao prolongado (24 a 72 horas).
3.6 gar Dnase

3.6.1 Princpio Cepas de alguns micro-organismos produzem DNase e endonuclease termoestvel. Essas enzimas hidrolisam cido desoxirribonuclico (DNA) contido no meio de cultura aps um perodo de incubao. Posteriormente esse meio acidificado com HCl 1N para a revelao da prova. Utilidade Prova de identificao que separa os principais micro-organismos de importncia clnica, entre eles: DNase positivos: Staphylococcus aureus, Serratia spp. e Proteus spp., Stenotrophomonas maltophilia, Cryseobacterium meningosepticum, Moraxella catarrhalis. DNase negativos: Staphylococcus coagulase negativa, demais enterobactrias, demais bacilos Gram-negativos no fermentadores. Frmula/Produto Meio comercial: DNase gar. Procedimentos Pode-se revelar a prova de duas maneiras: Com uma soluo de cido clordrico 1 N Adicionando base do meio de cultura azul de Toluidina O. Para a revelao com cido clordrico 1N: Preparar e esterilizar o meio conforme instrues do fabricante.
3.6.2
3.6.3
3.6.4
50
Esfriar o meio a aproximadamente 50C. Distribuir em placas de petri de 50 mm de dimetro. Preparar uma soluo de HCl 1N, seguindo a frmula abaixo: N = C1 (Nmero de equivalentes grama de soluto) V (volume da soluo)
C1 = M1 E E = M x
(Peso molecular do soluto) (Volume da soluo)
x: para bases: OH desprendido na reaopara cidos: H+ ionizveis para oxidantes/redutores: variao do NOX para sais normais: valncia do ction ou nion Para a revelao com azul de Toluidina O: Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Acrescentar para cada 1000 mL de base 0,1g de azul de Toluidina O. Esterilizar em autoclave. Esfriar o meio a aproximadamente 50C. Distribuir em placas de petri de 50 mm de dimetro. 3.6.5 Controle de qualidade Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923 ou Serratia marcescens ATCC 13880. Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 ou Escherichia coli ATCC 25922. Conservao e validade Meio: 4 a 10 C por 1 meses. cido Clordrico 1N: Guardar em frasco mbar, em temperatura ambiente, ao abrigo de luz, calor e umidade. Validade: 6 meses. Inoculao Para as duas tcnicas de preparao, a inoculao a mesma: Com auxlio de um fio bacteriolgico, tocar nas colnias em estudo e fazer um esfregao circular e denso na placa de DNase. Incubar 35 +/- 1C 24 horas.
3.6.6
3.6.7
51
3.6.8
Interpretao A) Revelao com HCl 1 N: Cor original do meio: amarelo claro. Colocar sobre o crescimento bacteriano HCl 1 N at banhar totalmente a superfcie do meio. Aguardar aproximadamente 3 minutos ou at que o meio fique opaco. Positivo: Presena ntida de halo claro na parte inferior e em volta da colnia. Negativo: Ausncia de halo claro em volta da colnia. B) Revelao com azul de toluidina O: Cor original do meio: azul claro Positivo: Presena de colorao rosa na parte inferior e em volta da colnia. Negativo: Ausncia de cor rosa. O meio permanece com a cor original, azul.
3.6.9
Recomendaes Usar sempre uma cepa controle positivo para facilitar a leitura da prova. Em uma mesma placa, pode-se fazer at 4 testes (placas de 50 mm de dimetro). armazenamento incorreto e uso com validade vencida do HCl 1 N pode dar leituras falso negativas. Para a deteco da atividade de DNase no necessrio que haja crescimento, por isso que semeadura deve ser de forma circular densa e no de estria. Para o meio preparado com Azul de Toluidina O, algumas cepas requerem um perodo maior de incubao (at 48 horas) para produzirem DNase. Usar cultura jovem (at 24 horas).
3.7 gar Esculina

3.7.1 Princpio Verifica se a bactria capaz de hidrolisar a esculina. A esculetina exige sais de ferro formando precipitado marrom escuro ou preto. Utilidade Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias e no fermentadores.
3.7.2
52
Para identificao de Streptococcus e Enterococcus , usar o meio com blis, vide prova de Bile-Esculina.
3.7.3
Frmula/Produto gar trptic de soja (TSA) ou base de gar sangue 4 g. Citrato frrico 0,05 g. Esculina 0,1 g. gua destilada 100 mL. Procedimentos Pesar o TSA ou a base de gar sangue, o citrato frrico e a esculina e colocar tudo no mesmo Erlenmeyer. Colocar gua destilada. Ajustar o pH para 7,0. Aquecer lentamente at fundir o gar e dissolver o citrato frrico (lentamente porque o citrato frrico demora a dissolver). Distribuir 3 mL do meio em tubos com tampa de rosca. Esterilizar em autoclave. Retirar os tubos da autoclave e inclin-los ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45). Deixar solidificar em temperatura ambiente. Controle de qualidade Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883. Negativo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Inoculao Inocular colnias de crescimento recente (18 24 h). Picar o meio e semear na superfcie do gar. Incubar a 35 C por 24 horas. Interpretao Cor original do meio: palha. Positivo: marrom escuro ou preto. Negativo: inalterado (palha). Conservao e validade Conservar de 4 a 8C, de 6 a 8 semanas. Aps esse perodo realizar controle negativo e positivo semanalmente.
3.7.4
3.7.5
3.7.6
3.7.7
3.7.8
53
3.7.9
Recomendaes A enzima glicosidase responsvel pela hidrlise da esculina em todas as enterobactrias exceto a Escherichia coli. A Escherichia coli no possui a enzima glicosidase sendo necessrio usar a lactose, outro dissacardeo ou outra fonte de carbono. Fazer um inculo leve com agulha bacteriolgica e interpretar aps 18-24 horas. A produo de piocina pela Pseudomonas aeruginosa pode escurecer o meio, isso no uma reao positiva. Resultado falso positivo pode ocorrer pela produo de H2S em no fermentadores, semelhante ao bacilo da bactria Shewanella putrefaciens.
3.8 gar Fenilalanina

3.8.1 Princpio Verifica a capacidade da bactria de produzir cido fenilpirvico a partir da fenilalanina por ao enzimtica. Utilidade Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias. Frmula/Produto Meio comercial: gar Fenilalanina: Soluo de cloreto frrico. Cloreto frrico 10 g. Adicionar 100 mL de gua destilada. Colocar em frasco mbar. Validade: 6 meses. A soluo de cloreto frrico 10% utilizada para revelar a atividade da enzima fenilalanina desaminase no meio de fenilalanina. Procedimentos Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Aquecer sob constante agitao at fundir o meio. Ajustar o pH para 7,3 0,2. Distribuir em tubos com tampas de rosca. Esterilizar em autoclave. Retirar os tubos da autoclave e inclin-los ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo 45). Deixar solidificar em temperatura ambiente. Controle de qualidade Positivo: Proteus vulgaris ATCC 8427 ou Proteus mirabilis ATCC 12453.
3.8.2
3.8.3
3.8.4
3.8.5
54
Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.
3.8.6
Inoculao Fazer um inculo denso. Inocular colnia pura de 18 a 24 horas. Incubar a 35C por 18 a 24 horas. Interpretao Adicionar diretamente o cloreto frrico no tubo inoculado, antes da interpretao do resultado e distribuir o reagente sobre a superfcie do meio. Cor original do meio: amarelo palha. Positivo: formao de uma colorao esverdeada na superfcie do meio aps a adio do cloreto frrico. Negativo: o meio permanece inalterado. Conservao e validade Conservar de 4 a 8C, de seis a oito semanas. Recomendaes Um resultado positivo deve ser interpretado imediatamente aps a adio do reagente, pois a cor verde desbota rapidamente. A interpretao deve ser feita em at 5 minutos.
3.8.7
3.8.8
3.8.9
3.9 CTA Cystine Tryticase gar

3.9.1 Princpio CTA um meio semi-slido, recomendado para o estudo de fermentao de carboidratos de micro-organismos exigentes. Utilidade Usado para diferenciar espcies de Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Corynebacterium spp. Frmula/Produto Meio comercial Cystine Tryticase gar Medium. Carboidratos mais utilizados: glicose, maltose, lactose, sacarose, frutose, manose. Carboidrato 10 g gua destilada 100 mL pH: 7,3 +/- 0,2
3.9.2
3.9.3
55
3.9.4
Procedimentos Esterilizar os carboidratos, separadamente, por filtrao e reservar. Pesar o CTA conforme instrues do fabricante, acrescentar 900 mL de gua e homogeneizar bem. Esterilizar em autoclave. Esfriar a base a aproximadamente 50C. Adicionar o 100mL de soluo de carboidrato a 1% esterilizado por filtrao. Distribuir em 3 mL por tubo. Deixar os tubos esfriar na posio vertical. Controle de qualidade
POSITIVO Neisseria sicca Neisseria sicca Neisseria lactamica Neisseria sicca Neisseria sicca Haemophilus parainfluenzae NEGATIVO Branhamella catarrhalis Branhamella catarrhalis Neisseria sicca Branhamella catarrhalis Branhamella catarrhalis Haemophilus influenzae
3.9.5
Glicose Maltose Lactose Sacarose Frutose Manose
3.9.6
Conservao e validade Temperatura ambiente por 3 meses. Inoculao Fazer um inculo bem denso, no centro do meio. Incubar 35C em jarra com vela acesa e gaze embebida em gua de torneira para manter a umidade da atmosfera. Interpretao Cor original do meio: alaranjado. Positivo: cor amarela, indicando acidificao (fermentao) do meio e turvao. Negativo: Ausncia de crescimento. O meio permanece com a cor original, alaranjado, e sem turvao. Recomendaes Para provas negativas, incubar um perodo maior (72 horas). No autoclavar a base com o carboidrato, pois a alta temperatura pode degradar o carboidrato. Fazer inculo denso, pois inculos fracos podem dar resultado falso negativo.
3.9.7
3.9.8
3.9.9
56
3.10 Caldo Triptona e SIM

3.10.1 Princpio Determinam a habilidade do micro-organismo de metabolizar o triptofano em indol. Triptofano um aminocido que pode ser oxidado por certas bactrias resultando na produo de indol, aps a adio de reagentes de Erlich ou Kovacs. 3.10.2 Utilidade Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias, no fermentadores, Haemophilus e anaerbios. 3.10.3 Frmula/Produto Meio comercial: Caldo Triptona. Meio comercial: SIM (sulfato/indol/motilidade gar). Reativo Erlich Paradimetilaminobenzaldedo 1 g lcool etlico (95%) 95 mL cido clordrico concentrado 20 mL Guardar em frasco mbar em temperatura ambiente (22-25C). Cor original do reativo de Erlich: amarelo Ou Reativo de Kovacs (pode ser adquirido comercialmente pronto para uso) ou ser preparado no laboratrio: lcool isoamlico 150 mL Paradimetilaminobenzaldedo 10,0 g cido clordrico concentrado 50 mL Dissolver o aldedo em lcool e adicionar lentamente o cido clordrico. Guardar em frasco mbar e no refrigerador quando no estiver em uso. Obs.: No conservar em temperatura ambiente por longo perodo, a cor pode ser alterada de amarelo palha para marrom, perdendo assim a sensibilidade. Xilol: pode ser adquirido comercialmente pronto para uso. 3.10.4 Procedimentos A) Meio Caldo Triptona Pesar e hidratar conforme instrues do fabricante. Aquecer sob agitao, at fundir o meio. Distribuir aproximadamente 3,0 mL em tubos com tampas de rosca. Esterilizar em autoclave. Retirar os tubos da autoclave. Deixar esfriar em temperatura ambiente na posio vertical.
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B) Meio SIM Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Aquecer sob agitao, at fundir o meio. Distribuir aproximadamente 3,0 mL em tubos com tampas de rosca. Esterilizar em autoclave. Retirar os tubos da autoclave. Deixar solidificar em temperatura ambiente na posio vertical. 3.10.5 Controle de qualidade
Microrganismo Proteus vulgaris Shigella sonnei Escherichia coli POS NEG NEG H2S POS NEG POS INDOL POS NEG POS MOTILIDADE
3.10.6 Controle qualidade para meio Caldo Triptona: Positivo: Escherichia coli ATCC 25922. Negativo: Enterococcus faecalis ATCC 29212. 3.10.7 Controle qualidade para meio SIM: Proteus vulgaris ATCC 13315, Shigella sonnei ATCC 25931, Escherichia coli ATCC 25922 3.10.8 Inoculao A) Meio Caldo Triptona Fazer um inculo leve com colnia pura de cultura de 18-24 horas (para enterobactrias, bacilos Gram-negativos no fermentadores ou anaerbios). Fazer um inculo denso com colnia pura de cultura de 18-24 horas (para Haemophilus). Incubar a 35C por 24 horas (enterobactrias) ou at 48 horas (bacilos Gram-negativos no fermentadores ou anaerbios) em aerobiose ou anaerobiose, respectivamente. B) Meio SIM Com o auxlio da agulha, inocular uma colnia no meio na posio vertical, lentamente at a base . Afastar a agulha seguindo a linha inicial do inculo. Incubar a 35C por 18-24 horas.
58
3.10.9 Interpretao Cor original do meio. Aps incubao, revelar com reagente de Ehrlich ou Kovacs. A escolha entre os reagentes de Ehrlich ou Kovacs depende da preferncia dos Gram-negativos no fermentadores ou anaerbios, que podem produzir mnima quantidade de indol. Revelao com reativo de Ehrlich ou Kovacs no meio de Caldo Triptona Colocar 1mL de xilol no tubo com crescimento bacteriano, homogeneizar vigorosamente e aguardar 1 minuto. Adicionar pela parede do tubo 0,5 mL do reativo de Erlich e realizar a leitura. Indol positivo: aparecer um anel vermelho logo abaixo da camada de xilol. Indol negativo: permanecer um anel amarelo logo abaixo da camada de xilol. Revelao com reativo de Kovacs no meio SIM. Realizar a leitura da motilidade e do H2S. Em seguida adicionar 5 gotas do reativo de Kovacs pela parede do tubo no meio contendo o crescimento bacteriano. Agitar o tubo suavemente e proceder a leitura do indol. Motilidade positiva: micro-organismos mveis migram pela linha do inculo e difundem-se no meio causando turbidez. Motilidade negativa: bactria tem um crescimento acentuado ao longo da linha do inculo, em volta continua lmpido. HS positivo: ao longo da linha de inoculao aparecer a cor negra. HS negativo: linha ao longo da inoculao inalterada. Indol positivo aparecer um anel vermelho. Indol for negativo aparecer um anel amarelo. 3.10.10 Conservao e validade Caldo Triptona: 6 meses se conservado de 2 a 8C. Meio SIM: 6 meses se conservado de 2 a 8C em tubos com tampas de rosca, tubos com tampo de algodo o meio pode ressecar antes deste prazo. 3.10.11 Recomendaes Um timo pH para triptofanase levemente alcalino (pH 7,4-7,8), um pH cido pode baixar a produo do indol indicando um resultado falso negativo ou positivo fraco. Cultura para ser testada produo de indol deve ser incubada em aerobiose, a baixa tenso de oxignio baixa a produo de indol. Indol positivo se perde aps 96 horas de incubao.
59
Alguns micro-organismos formam indol, mas se quebram ou baixam rapidamente a produo, podendo ocorrer um resultado falso negativo. Ocorre principalmente entre algumas espcies de Clostridium spp. Pequenas modificaes podem ser necessrias para testar a produo de indol em no fermentadores (fracos produtores de indol), como a utilizao de um meio enriquecido, como o meio BHI enriquecido com 2% de soro de coelho ou isovitalex, extrao com xilol e revelao com reagente de Ehrlich. Na extrao de indol com o reagente xilol, colocar pequena quantidade de xilol para evitar a diluio do indol tornando-o fraco positivo ou negativo. Algumas cepas de Cardiobacterium hominis, Kingella spp., Sutonella indologenes, Eikenella corrodens, necessitam de inculo denso no caldo de triptona, incubao de 48 horas, extrao com xilol e revelao com reagente de Ehrlich.
3.11 Caldo Malonato

3.11.1 Princpio Determina a habilidade do micro-organismo de utilizar malonato de sdio como nica fonte de carbono, resultando em alcalinizao do meio. 3.11.2 Utilidade Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias e no fermentadores. 3.11.3 Frmula/Produto Meio comercial: Caldo Malonato. 3.11.4 Procedimentos Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Ajustar o pH 6,7 0,2. Distribuir 1,5 mL em tubos com tampa de rosca. Esterilizar em autoclave. Retirar os tubos da autoclave e deixar esfriar em temperatura ambiente. 3.11.5 Controle de qualidade Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883. Negativo: Escherichia coli ATCC 25922. 3.11.6 Inoculao Inocular colnias puras de 18 a 24 horas. Inculo leve.
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Incubar a 35C de 24-48 horas, observando o cultivo diariamente.
3.11.7 Interpretao Cor original do meio: verde. Positivo: azul. Negativo: inalterado (verde). 3.11.8 Conservao e validade Conservar de 4 a 10C de 6 a 8 semanas. Aps esse perodo realizar controle positivo e negativo semanalmente. 3.11.9 Recomendaes Alguns resultados negativos produzem cor amarela, isso porque a fermentao da glicose aumenta a acidez. Alguns micro-organismos malonato positivo produzem uma fraca alcalinizao, dificultando a interpretao. Se o resultado for duvidoso incubar um tubo sem inculo para comparao, junto com o teste em questo, se no aparecer nenhum trao azul, incubar por mais 24 horas, liberando o resultado negativo aps incubao de 48 horas. Cuidado ao interpretar resultados aps incubao prolongada. Cor azul fraco (azul esverdeado) pode parecer uma reao fraca positivo podendo ser ignorado.
3.12 Caldo Nitrato

3.12.1 Princpio Determina a habilidade do micro-organismo de reduzir o nitrato (NO) a nitrito (NO) ou gs nitrognio (N) (denitrificao). 3.12.2 Utilidade Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias, no fermentadores, anaerbios, Haemophilus, Neisseria e Mycobacterium. 3.12.3 Frmula/Produto Meio comercial: Caldo Nitrato. Reagentes para revelao da reao. A) Soluo A cido sulfanlico 0,8 g cido actico 5N 100 mL
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B) Soluo B N,N-dimetil-l-naftilamina 0,6 g cido actico 5N* 100 mL * cido actico 5N: cido actico glacial 40 mL gua destilada 100 mL Zinco em p (pronto para uso) 3.12.4 Procedimentos Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Acertar o pH 7,0. Distribuir 3 mL do meio em cada tubo, contendo um tubo de Durhan invertido. Esterilizar em autoclave. Deixar o tubo esfriar na posio vertical. Reagentes para revelao da reao. Soluo A Dissolver o cido sulfanlico em uma parte do cido e depois completar com o restante do cido actico q.s.p. 100 mL. Soluo B Dissolver o N,N-dimetil-l-naftilamina com uma parte do cido e completar o restante do cido actico q.s.p. 100 mL. 3.12.5 Controle de qualidade
Resultado Nitrato reduzido a nitrito Nitrato a gs Nitrato no reduzido Cepa Enterobactrias Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Resultado esperado Colorao vermelha Bolhas no tubo de Durhan Colorao vermelha somente aps adio de p de zinco
3.12.6 Inoculao Fazer um inculo denso, com colnias recentes (18 24 horas) no meio com ala bacteriolgica. No agitar o tubo aps inoculao. Incubar 351C por 24 a 48 horas, sendo necessrio algumas vezes at 5 dias. Verificar se existe crescimento aparente no meio antes de colocar os reagentes para revelar a Reao. Verificar a presena de bolhas dentro do tubo de Durhan. 3.12.7 Interpretao Cor original do meio: incolor a palha.
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Verificar se h bolhas de gs dentro do tubo de Durhan, se houver significa que a bactria reduziu nitrato a gs = denitrificao. Adicionar 5 gotas dos reagentes A e B no meio, sem homogeneizar. Se houver desenvolvimento de cor vermelho tijolo significa que a bactria reduziu nitrato a nitrito. Se aps a adio dos reagentes A e B o tubo continuar incolor, adicionar uma pitada de p de zinco no tubo, se houver desenvolvimento de cor vermelho tijolo significa que a bactria no reduziu nitrato a nitrito e o nitrato ainda permanece no meio. IMPORTANTE: algumas bactrias no conseguem reduzir nitrato a nitrito e s conseguem reduzir nitrito, como por exemplo, Alcaligenes Faecalis e Oligella Uretralis, havendo a necessidade de utilizar o caldo nitrito para esse fim.
REAGENTES A e B Pos NEG NEG P DE ZINCO No houve reao Pos NEG GS NO TUBO DE DURHAN No houve reao NEG POS
RESULTADO Reduziu nitrato a nitrito No reduziu nitrato a nitrito Nitrato reduzido a gs
3.12.8 Conservao e validade Caldo nitrato: conservar o meio de 4 a 8C por at 3 meses. Solues A e B: guardar em frasco escuro na geladeira (4 a 8C) por at 12 meses. cido actico 5N: Conservar de 4 a 8C por at 12 meses. 3.12.9 Recomendaes Utilizar o tubo de nitrato sem inocular como controle negativo, para evitar resultado falso positivo, devido alta sensibilidade do teste. Quando for adicionado o p de zinco, no colocar em excesso, pode resultar em falso negativo (incolor).
3.13 Meio Base Para Oxidao e Fermentao OF

3.13.1 Princpio Verificar a capacidade do micro-organismo em utilizar os carboidratos pela via oxidativa ou fermentativa. 3.13.2 Utilidade Diferenciar bacilos Gram-negativos quanto ao tipo de metabolismo empregado em utilizar carboidratos.
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3.13.3 Frmula/Produto Meio comercial: Meio base de OF. Carboidratos (dextrose ou glicose, lactose, sacarose, xilose, maltose, manitol etc). Vaselina lquida estril. 3.13.4 Procedimentos Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Aquecer o meio at dissolver todo o gar. Separar volumes iguais em diferentes Bquer, dependendo do nmero de carboidratos que sero preparados . Adicionar 1g do carboidrato para cada 100 mL de meio base e homogeneizar. Distribuir 2 mL em tubos com tampa de rosca. Esterilizar em vapor fluente por 20 minutos (deixar a vlvula de presso da autoclave aberta e, quando estiver saindo bastante vapor, comear marcar o tempo. Vapor fluente s pode ser feito em autoclave com tampas regulveis para sada de vapor. Autoclaves horizontais no possuem controle de sada de vapor, so automticas). Pode-se tambm esterilizar a base e adicionar os acares esterilizados por filtrao em filtros Millipore 0,45 0,22m (90 mL de base autoclavada e 10 mL de acar esterilizado por filtrao). Deixar esfriar a temperatura ambiente na posio vertical. 3.13.5 Controle de qualidade
RESULTADO OF-GLICOSE Oxidador Fermentador Inalterado OF-FRUTOSE Oxidador Fermentador Inalterado OF-LACTOSE Oxidador Fermentador Inalterado OF-MALTOSE Oxidador Fermentador Inalterado CEPA Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumoniae Alcaligenes faecalis* Stenotrophomonas maltophilia Klebsiella pneumoniae Alcaligenes faecalis* Burkolderia cepacia Klebsiella pneumoniae Alcaligenes faecalis* Stenotrophomonas maltophilia Klebsiella pneumoniae Alcaligenes faecalis* Resultado Esperado A-amarelo, F-inalterado A/F-amarelo A/F-inalterado A-amarelo, F-inalterado A/F-amarelo A/F-inalterado A-amarelo, F-inalterado A/F-amarelo A/F-inalterado A-amarelo, F-inalterado A/F-amarelo A/F-inalterado
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RESULTADO OF-MANITOL Oxidador Fermentador Inalterado OF-SACAROSE Oxidador Fermentador Inalterado OF-XILOSE Oxidador Fermentador Inalterado
CEPA Burkolderia cepacia Klebsiella pneumoniae Alcaligenes faecalis* Stenotrophomonas maltophilia Klebsiella pneumoniae Alcaligenes faecalis* Burkolderia cepacia Klebsiella pneumoniae Alcaligenes faecalis*
Resultado Esperado A-amarelo, F-inalterado A/F-amarelo A/F-inalterado A-amarelo, F-inalterado A/F-amarelo A/F-inalterado A-amarelo, F-inalterado A/F-amarelo A/F-inalterado
A= tubo aberto; F= tubo fechado com vaselina lquida Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 * Alcaligenes faecalis ATCC 8750 ou Moraxella catarrhalis ATCC 25238
3.13.6 Inoculao Inocular densamente at o fundo do tubo com a agulha bacteriolgica, colnias provenientes de uma placa de crescimento de 18 a 24 h. Inocular dois tubos, em um dos tubos acrescentar 1,0 mL de vaselina lquida estril, no outro tubo no colocar vaselina. Incubar a temperatura de 35C por 48 horas ou mais. Se resultado negativo, pode ser necessrio at 4 dias, excepcionalmente 14 dias, observando diariamente. 3.13.7 Interpretao Cor original do meio: verde. Oxidador: tubo aberto desenvolvimento de cor amarela. Tubo fechado inalterado (verde). Fermentador: tubo aberto e fechado desenvolvimento de cor amarela. Assacaroltico: tubo aberto e fechado inalterado (verde). 3.13.8 Conservao e validade Conservar de 4 a 8C por at 6 meses. 3.13.9 Recomendaes Sempre antes de interpretar a reao verificar se h crescimento nos tubos, porque algumas bactrias no crescem no meio OF, sendo necessrio enriquecimento do meio, acrescentando 2% de soro de coelho ou cavalo. Importante deixar tampa frouxa no tubo aberto.
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3.14 M.E.V.A.G. (Milieu pour ltude de la voie dattaque ds glucides Hugh & Leifson, 1953)
As bactrias podem utilizar os acares por 2 diferentes vias metablicas: 1) Via fermentativa reaes que podem ocorrer na ausncia de oxignio. Os cidos que se acumulam, como produtos de degradao, abaixam sensivelmente o pH do meio. 2) Via oxidativa o oxignio do ar obrigatoriamente utilizado, e cidos so formados. O Mevag usado para o estudo dos acares que so utilizados pelas bactrias oxidativas. Tambm pode ser utilizado para a determinao da via de ataque da glicose.
Caldo Comum KCl gar Vermelho de fenol a 0,2% H2O destilada q.s.p. 50 mL 5g 3g 10 mL 1000 mL 25 mL 2,5 g 1,5 g 5 mL 500 mL 100 mL 10 g 6g 20 mL 2000 mL
Frmula: pH = 7,6-7,8 Distribuir em frascos.

Extrato de carne Peptona NaCl H2O dest. 0,5 g 1g 0,5 g 100 mL 2,5 g 5g 2g 500 mL
Esterilizar a 121C por 15 min. Caldo comum Distribuir em tubos de 12 x 120mm. Autoclavar a 121C/15 min. Soluo vermelho de fenol a 0,2%
Vermelho de fenol H2O destilada estril 0,2 g 100 mL
Utilizar NaOH para uma melhor dissoluo. Dissolver o vermelho de fenol aos poucos na gua.
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3.15 gar TSI Triplo Acar Ferro

3.15.1 Princpio Este meio contm trs acares: 0,1%glicose, 1,0% lactose, 1,0% sacarose, vermelho de fenol para deteco da fermentao de carboidratos e sulfato de ferro para deteco da produo de sulfato de hidrognio (indicado pela cor preta na base do tubo). A fermentao indicada pela mudana da cor do indicador de pH de vermelho para amarelo. O gar fundido deixado solidificar, formando uma superfcie inclinada. Essa configurao origina duas cmaras de reao dentro do mesmo tubo. A poro inclinada ou bico, exposta em toda sua superfcie ao oxignio atmosfrico, aerbia. A poro inferior, denominada profundidade ou fundo, est protegida do ar e relativamente anaerbia. Quando se prepara o meio, importante que o bico e a profundidade tenham o comprimento igual ao redor de 3 cm cada um, de modo que o efeito das duas cmaras seja conservado. 3.15.2 Utilidade Diferenciar bacilos Gram-negativos com base na fermentao de carboidratos, produo de sulfato de hidrognio e gs. 3.15.3 Frmula/Produto Meio comercial: TSI (trplice acar ferro). 3.15.4 Procedimentos Pesar o TSI conforme instrues do fabricante. Ajustar o pH para 7,3 0,2. Distribuir em tubos com tampas de rosca. Esterilizar em autoclave. Retirar os tubos da autoclave e inclin-los ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45). Deixar solidificar em temperatura ambiente. 3.15.5 Controle de qualidade
MICRORGANISMO Escherichia coli Shigella flexneri Edwardsiella tarda Pseudomonas aeruginosa ATCC 25922 12022 15947 27853 SUPERFCIE cido Alcalino Alcalino Alcalino BASE cido, gs cido cido Alcalino H2S Neg Neg Pos Neg
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3.15.6 Inoculao Inocular colnia pura de 18 a 24 horas. Semear por picada at o fundo e na superfcie do meio. Incubar 24 h a 35C, com a tampa semiaberta. 3.15.7 Interpretao Cor original do meio: vermelho laranja, levemente opalescente. Leitura: entre 18 e 24 horas. Cor prpura = alcalino. Cor amarelo = cido. Reaes pice/base: Prpura/amarelo = fermentao apenas da glicose (lactose e sacarose negativos). Amarelo/amarelo = fermentao da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 aucares). Presena de gs (CO2) = bolhas ou meio fragmentado. H2S positivo = presena de precipitado negro. Pos.: positivo; Neg.: negativo; V.: varivel. 3.15.8 Conservao e validade Conservar por at 6 meses de 2 a 8C.
PICE Vermelho Vermelho Amarelo Amarelo Amarelo BASE Vermelho Vermelho Vermelho Amarelo Amarelo H2S Neg Neg Neg Neg Pos GS Neg Neg Neg V V Interpretao mais provvel Sem crescimento: bactria exigente Crescimento na superfcie: no fermentador ou Gram + Crescimento na superfcie: Gram + ou esquecimento de picar a base Enterobactrias ou Aeromonas Lac neg Salmonella, Proteus, Morganella,
Providncia e Citrobacter
3.15.9 Recomendaes Quando h produo de HS significa que a base sempre cida. No realizar leitura com menos de 18 ou mais de 24 horas, podendo resultar em falsas reaes. No utilizar alas bacteriolgicas para no fragmentar o meio, ocasionando falsa reao de gs, utilizar fio bacteriolgico. Qualquer trao de escurecimento no meio deve ser indicado com HS positivo.
68
3.16 gar Base Uria (Christensen)

3.16.1 Princpio Determinar a habilidade do micro-organismo de degradar a ureia em duas molculas de amnia pela ao da enzima urease, resultando na alcalinizao do meio. 3.16.2 Utilidade Bacilos Gram-negativos fermentadores e no fermentadores, Staphylococcus e Haemophilus. 3.16.3 Frmula/Produto Meio comercial: gar Base Uria. Soluo de ureia a 40% (40 g ureia + 100 mL de gua destilada). 3.16.4 Procedimentos Pesar e hidratar o meio de ureia conforme instrues do fabricante. Esterilizar em autoclave. Resfriar at 50C e adicionar assepticamente 5 mL da soluo de ureia a 40% em 95 mL do meio base. Homogeneizar e distribuir 3 mL do meio assepticamente em tubos estreis com tampa de rosca. Inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45). Deixar solidificar em temperatura ambiente. Obs.: A soluo de ureia a 40% uma soluo hipertnica e o risco de contaminao baixo, porm, pode-se esterilizar a soluo por filtrao (filtro Millipore de 0,22 m). 3.16.5 Controle de qualidade Esterilidade: colocar 100% do lote preparado na estufa 35 1C por 24 horas. Se no houver mudana de cor liberar para uso. Positivo: Proteus vulgaris ATCC 13315. Negativo: Escherichia coli ATCC 25922. 3.16.6 Inoculao Inocular colnia pura de 18 a 24 horas. Fazer um inculo denso. Semear na superfcie do meio, no picar a base, pois a base pode servir como controle. Incubar 35C de 6 a 24 horas, podendo ser necessrio at 6 dias.
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3.16.7 Interpretao Cor original do meio: amarelo palha. Positivo: alterao do meio para cor de rosa, pink. Negativo: sem alterao de cor do meio. A) Diferentes graus de hidrlise da ureia podem ocorrer: Tubo inteiro cor pink. Superfcie do tubo cor pink, base no muda de cor. Fracamente positivo: pice cor pink, restante do tubo no muda de cor. Positivo rpido: 1 6 horas para Proteus spp. Positivo tardio: 24 horas a 6 dias ou mais tempo de incubao. Ex: algumas cepas de Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Haemophilus. 3.16.8 Conservao e validade Conservar de 4 a 8C por at 6 meses. Aps esse perodo realizar controle negativo e positivo semanalmente. 3.16.9 Recomendaes No aquecer a soluo base da ureia, pois a ureia pode se decompor se aquecida. No utilizar a ureia de Stuart porque menos sensvel para detectar a presena de urease. No deixar o meio em temperatura ambiente pode ocorrer autohidrlise.
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Captulo 4: Produtos para Provas de Identificao

4.1 Prova de catalase

4.1.1 Princpio A catalase uma enzima que decompe o perxido de hidrognio (H2O2) em gua e oxignio. Utilidade Para Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Listeria, Corynebacterium, Micrococcus, Bacillus, Moraxella catarrhalis. Frmula/Produto Perxido de Hidrognio (H2O2) 3%. Controle de qualidade Positivo: cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 ou Staphylococcus epidermidis ATCC 12228. Negativo: cepa de Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305. Conservao e validade Perxido de hidrognio deve ser mantido em local seco, ao abrigo de luz e calor. Validade: ver recomendaes do fabricante. Inoculao Colocar uma gota de perxido de hidrognio (gua oxigenada) 3% sobre uma lmina.
4.1.2
4.1.3
4.1.4
4.1.5
4.1.6
71
Com auxlio de fio bacteriolgico, agregar a colnia em estudo na gota de perxido de hidrognio.
4.1.7
Interpretao Positivo: Presena imediata de bolhas a produo de efervescncia indica a converso do H2O2 em gua e oxignio gasoso. Negativo: Ausncia de bolhas ou efervescncia. Recomendaes Evitar o uso de meios contendo sangue, pois os eritrcitos podem produzir reao fraca de catalase. Para uso de outra cepa de Staphylococcus para o controle positivo, no usar cepas de Staphylococcus saccharolyticus e Staphylococcus aureus subsp. anaerobius, pois so catalase negativos.
4.1.8
4.2 Prova de coagulase

4.2.1 Princpio Verificar a capacidade de micro-organismos reagirem com o plasma e formarem um cogulo, uma vez que a coagulase uma protena com atividade similar protrombina, capaz de converter o fibrinognio em fibrina, que resulta na formao de um cogulo visvel. Pode ser encontrada em duas formas que possuem diferentes propriedades: coagulase conjugada e coagulase livre. A coagulase conjugada (prova em lmina) tambm conhecida como fator de aglutinao, encontra-se unida parede celular bacteriana e no est presente em filtrados de cultivos. Quando as clulas bacterianas so suspensas em plasma (fibrinognio), formam-se cordes de fibrina entre elas, o que causa agrupamento sob a forma de grumos visveis. A coagulase livre (prova em tubo) uma substncia similar trombina e est presente em filtrados de cultivos. secretada extracelularmente e reage com uma substncia presente no plasma denominado Fator de Reao com a Coagulase CRF, para formar um complexo que, por sua vez, reage com fibrinognio, formando fibrina (cogulos). Quando uma suspenso em plasma do micro-organismo produtor de coagulase preparada em tubo de ensaio, forma-se um cogulo visvel aps o perodo de incubao.
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4.2.2
Utilidade Separar as espcies de Staphylococcus de importncia clnica, S. aureus coagulase positiva, das demais espcies coagulase negativa. Frmula/Produto Plasma de coelho com EDTA liofilizado. Controle de qualidade Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923. Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228. Conservao e validade Plasma antes e depois de reconstitudo, deve ser mantido refrigerado. Validade: ver recomendaes do fabricante. Inoculao A) Coagulase conjugada: Traar dois crculos com lpis de cera em uma lmina de vidro. Colocar duas gotas de gua destilada ou soluo fisiolgica estreis dentro de cada crculo. Com auxlio de um fio bacteriolgico agregar a colnia em estudo, homogeneizando delicadamente em cada crculo. Colocar uma gota de plasma para a prova de coagulase em um dos crculos. No outro crculo, adicionar outra gota de gua destilada ou soluo fisiolgica estreis, como controle. Homogeneizar com palito de madeira. Inclinar a lmina delicadamente, para frente e para trs. Observar presena de aglutinao. B) Coagulase livre: Com auxlio do fio bacteriolgico, suspender colnias em estudo em caldo BHI e colocar em estufa 37C at que turve. Se necessrio, acertar a turbidez at 0,5 da escala de MacFarland. Em um tubo de ensaio estril, colocar 0,5 mL de plasma reconstitudo e 0,5 mL do caldo BHI com crescimento bacteriano recm turvado. Incubar em estufa 35C 4 horas. Verificar se h presena de cogulo. Se no houver presena de cogulo, incubar o tubo em temperatura ambiente e repetir as leituras com 18 e 24 horas de incubao.
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.2.6
73
4.2.7
Interpretao A) Coagulase conjugada: Positiva: formao de precipitado branco e aglutinao dos micro-organismos da suspenso, aps 15 segundos, no crculo que contm o plasma. Negativa: ausncia de aglutinao no crculo que contm o plasma. Controle sem plasma: dever ser leitoso e uniforme, sem presena de precipitado ou aglutinao. A presena de precipitado ou aglutinao torna a prova inespecfica, devendo ser repetida a prova em tubo. B) Coagulase livre: Positiva: presena de qualquer grau de cogulo. Negativa: ausncia de cogulo.
4.2.8
Recomendaes Para a coagulase em tubo, as provas negativas aps 4 horas a 37C, os tubos devem ser mantidos em temperatura ambiente, pois a incubao prolongada a 37C podem produzir fibronolisinas, o que causa dissoluo do cogulo durante a incubao. Durante a leitura inclinar o tubo delicadamente e no agitar, pois a agitao pode desmanchar os cogulos parcialmente formados. Recomenda-se o uso de plasma de coelho com EDTA. No utilizar plasma citratado, pois os micro-organismos capazes de metabolizar o citrato (como os Enterococcus), daro resultados positivos se, forem confundidos com estafilococos. Plasma humano no recomendado, pois contm quantidades variadas de Fator de Reao com a Coagulase e de anticorpos antiestafilococos, podendo dar uma prova falso/negativa.
4.3 Prova de gelatinase

4.3.1 Princpio Determina a habilidade do micro-organismo de produzir enzimas proteolticas (gelatinase) que liquefaz/hidrolisa gelatina. Utilidade Identificar e classificar bactrias fermentadoras, no fermentadoras e bacilos Gram-positivos esporulados.
4.3.2
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4.3.3
Frmula/Produto Filme no revelado de Raio X. Salina 0,9 % estril ou gua destilada estril. Procedimentos Cortar a fita de filme de Raio X em tamanhos de aproximadamente 5 mm X 1 cm. Armazenar em frasco estril. Controle de qualidade Positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Negativo: Escherichia coli ATCC 25922. Inoculao Em um tubo 13 x 100 mm, colocar 1,0 mL de salina 0,9% estril ou gua destilada estril. Com o auxlio de uma ala bacteriolgica, fazer um inculo denso da bactria a ser testada, adicionar uma fita de Raio x. Fazer o inculo de colnias de crescimento de 18 a 24 horas. Realizar um tubo controle, com salina 0,9% estril ou gua destilada estril e a fita de Raio X, sem inculo. Interpretao Positivo: emulso de gelatina (cor verde) na poro submersa do filme torna-se transparente (clara). Negativo: fita permanece verde, emulso esverdeada permanece na poro submersa do filme. Conservao e validade Fitas: seguir instrues do fabricante. Recomendaes Utilizar filme de Raio X no revelado.
4.3.4
4.3.5
4.3.6
4.3.7
4.3.8
4.3.9
4.4 Prova de Lecitinase

4.4.1 Princpio Cepas produtoras de lecitinase produzem zona opaca ao redor do inculo. Utilidade Diferenciao de espcies de Bacillus e Clostridium.
75
4.4.2
4.4.3
Frmula/Produto A) Frmula meio base: Gema de ovo de galinha depende do volume de meio base a ser utilizado Proteose de peptona n 2 40 g Fosfato dissdico 5 g Fosfato de potssio 1 g Cloreto de sdio 2 g Sulfato de magnsio 0,1 g Glicose 2 g Soluo de hemina (5 mg/mL) 1 mL gar 20 g gua destilada 1000 mL pH: 7,6 B) Soluo de gema de ovo a 50%: Gema de ovo 1 mL Soluo fisiolgica estril 1 mL
4.4.4
Procedimentos A) Meio base: Pesar e hidratar todos os componentes, exceto a soluo de gema de ovo. Aquecer em bico de Bunsen at fundir o gar. Distribuir 20 mL por tubo. Esterilizar em autoclave. B) Meio para uso: Resfriar a 50C e adicionar 1 mL da soluo de gema de ovo a 50%. Homogeneizar bem e distribuir em placas de Petri de 90 mm.
4.4.5
Controle de qualidade Positivo: Bacillus cereus, Clostridium perfringens ATCC 13124. Negativo: Bacillus subtilis ATCC 6633, Clostridium difficile ATCC 9689. Conservao e validade Meio base (para estoque): 4 a 8C fechado, durante 6 meses. Meio para uso: 4 a 8C, embalado, durante 1 semana.
4.4.6
76
4.4.7
Inoculao Com auxlio de um fio bacteriolgico, tocar nas colnias em estudo e fazer um esfregao circular e denso sobre a superfcie do meio. Incubar 37C 24 horas em aerobiose para cepas de Bacillus spp. Incubar 37C 48 horas em anaerobiose para cepas de Clostridium spp. Interpretao Cor original do meio: amarelo. Positivo: formao de halo branco ao redor das colnias. Negativo: ausncia de halo, meio fica inalterada. Recomendaes No usar ovos velhos. No usar meio vencido.
4.4.8
4.4.9
4.5 Prova de oxidase

4.5.1 Princpio O teste de oxidase baseado na produo intracelular da enzima oxidase pela bactria. Utilidade Ajuda caracterizar espcies de Neisseria e diferenciar no fermentadores (oxidase positiva) de enterobactrias (oxidase negativa). Diferencia algumas bactrias fermentadoras oxidase positiva entre elas Plesiomonas shigelloides, Aeromonas spp. e Vibrio spp. Frmula/Produto Reativo para teste de oxidase preparado no laboratrio: N,N,N,N-tetrametil-p-fenileno diamina mono-hidrocloridrato 1g gua destilada 100 mL Tiras impregnadas com o reativo (comercial pronto para uso). Reativo de oxidase em ampolas (comercial pronto para uso), para ser revelado em papel de filtro. Procedimentos A) Reativo para teste de oxidase: Pesar 1g. de N,N,N,N-tetrametil-p-fenileno diamina mono-hidrocloridrato em um Bquer e adicionar 100 mL gua destilada, vagarosamente para no oxidar a soluo.
77
4.5.2
4.5.3
4.5.4
Colocar o papel de filtro cortado em tiras dentro do Bquer com o reativo. Deixar o papel de filtro absorver o reativo. Desprezar o reativo que sobrou. Colocar o papel na estufa a 35 1C para secar. Deixar o papel pendurado sobre um Bquer para juntar o excesso de reativo. Cortar a fita em tamanhos menores e guardar em frasco escuro. Obs.: No utilizar luvas para fazer o procedimento de preparo e corte das fitas.
4.5.5
Controle de qualidade Positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (desenvolvimento de cor roxa). Negativo: Escherichia coli ATCC 25922 (sem alterao da cor). Inoculao Com auxlio de um palito de madeira ou plstico, espalhar a colnia a ser testada sobre a fita de oxidase. Observar se h formao de cor roxa de imediato. Interpretao Cor original: branca ou levemente azulada. Oxidase positiva: produo de cor roxa imediatamente no local da inoculao da bactria. Oxidase negativa: no h mudana da cor do papel no local da inoculao da bactria. No considerar alterao de cor tardia. Conservao e validade Fitas: 3 meses, quando conservadas em frasco escuro de 4 a 8C. Reativo: deve ser preparado no momento de impregnar as fitas. Recomendaes No fazer o teste de colnias de crescimento de meios que contenham glicose, a fermentao inibe a atividade da oxidase, podendo resultar em falso negativo. No fazer teste de oxidase de colnias de crescimento de meios seletivos (Mac Conkey, XLD, EMB). No usar ala ou agulha porque pode conter traos de ferro, podendo oxidar a fita e resultar em falso positivo. Utilizar colnias de meios no seletivos tais como: gar sangue e gar chocolate.
4.5.6
4.5.7
4.5.8
4.5.9
78
Os reagentes para oxidase, se auto oxidam rapidamente com o ar, perdendo a sensibilidade. No cortar o papel de filtro com tesoura, pois podem conter traos de ferro.
4.6 Fermentao de carboidratos

4.6.1 Princpio A fermentao de carboidratos amplamente utilizada para a diferenciao de gneros e identificao de espcies bacterianas. A prova consiste em verificar a capacidade de o micro-organismo fermentar ou no um determinado carboidrato, permitindo assim verificar as suas caractersticas que auxiliaram na identificao. Utilidade Identificar e separar espcies de Enterococcus spp., Streptococcus spp. e Staphylococcus coagulase negativa. Frmula/Produto Produto: Caldo para fermentao de carboidratos. Carboidratos mais utilizados: arabinose, sorbitol, rafinose, trealose, manitol, entre outros. Frmula (base): (O BHI caldo comercial o Brain Heart Infusion Broth que contm glicose na sua composio. Usar o termo BHI caldo sem glicose ou HIB-Heart Infusion Broth que so os caldos indicados para prova de fermentao de carboidratos): BHI caldo 22,5 g Carboidrato 10 g Indicador * 1 mL gua destilada 200 mL gua destilada 900 mL * Indicador prpura de bromocresol: Prpura de bromocresol 1,6 g Etanol a 95% 100 mL Meio comercial: Caldo Base Vermelho de Fenol. Procedimentos (meio comercial): Esterilizar os carboidratos, separadamente, por filtrao e reservar. Pesar o BHI em bquer, acrescentar a gua e homogeneizar bem. Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Adicionar o indicador e homogeneizar novamente. Esterilizar em autoclave.
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4.6.2
4.6.3
4.6.4
Aps esfriar a base, adicionar o carboidrato esterilizado por filtrao. Distribuir 3 mL por tubo.
4.6.5
Controle de qualidade
POSITIVO Enterococcus faecium Enterococcus casseliflavus Enterococcus faecalis Staphylococcus epidermidis Staphylococcus lugdunensis NEGATIVO Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus gallinarum Staphylococcus schleiferi Staphylococcus epidermidis
CARBOIDRATOS Arabinose Rafinose Sorbitol Maltose Trealose
4.6.6
Conservao e validade Conservar entre 4 a 10 C por 3 meses. Inoculao Dissolver as colnias no caldo. Incubar 35C 24 horas. Interpretao (meio comercial): Cor original do meio: prpura. Positivo: Crescimento bacteriano (turvao do meio) com viragem do indicador para amarelo. Negativo: Ausncia de crescimento. O meio permanece com a cor original, prpura e sem turvao. Cor original do meio: alaranjado. Positivo: crescimento bacteriano (turvao do meio) com viragem do indicador para amarelo. Negativo: ausncia de crescimento. O meio permanece com a cor original, alaranjado e sem turvao. Recomendaes Para provas negativas, incubar um perodo maior (48 horas). No autoclavar a base com o carboidrato, pois a alta temperatura pode degradar o carboidrato.
4.6.7
4.6.8
4.6.9
4.7 Prova PYR

4.7.1 Princpio A prova de hidrlise PYR um teste enzimtico que consiste na hidrlise do substrato L-pyrrolidonyl-alfa-naftylamide por uma enzima bacteriana,
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a L-pyroglutamyl-aminopeptidase. A hidrlise do substrato libera -naphtylamide, que detectada com a adio do reagente, o N,N dimetilaminocinamaldedo, que forma uma base de Schiff, de colorao vermelha. 4.7.2 Utilidade Teste presuntivo para identificar Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo A de Lancefield (S. pyogenes) e Enterococcus spp. Identificao de algumas espcies Staphylococcus coagulase negativa. Identificao de bacilos Gram-negativos no fermentadores. Frmula/Produto Teste comercial: PYR test. Frmula Caldo base de PYR (caldo de Todd-Hewitt): Mod IV 50 BHI caldo 500 g Neopeptona 20 g Dextrose 2 g Cloreto de sdio 2 g Fosfato dissdico 0,4 g Carbonato de sdio 2,5 g gua destilada 1000 mL Para cada 100 mL de caldo base, adicionar 0,01 mL de L-pyrrolidonyl-alfa-naftylamide. Reagente de PYR comercial: N,N-dimetilaminocinamaldedo a 0,01%. Procedimentos Pesar os componentes em bquer. Adicionar a gua e homogeneizar bem at completa dissoluo. Adicionar o L-pyrrolidonyl-alfa-naftylamide e homogeneizar novamente. Distribuir 0,2 mL por tubo. Esterilizar em autoclave. Controle de qualidade Positivo: Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo A de Lancefield (S. pyogenes ATCC 19615) ou Enterococcus faecalis ATCC 29212. Negativo: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae. Conservao e validade Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses. Comercial: ver instrues do fabricante
4.7.3
4.7.4
4.7.5
4.7.6
81
4.7.7
Inoculao Dissolver as colnias no caldo OU. No caso de usar kits comerciais, com auxlio de uma pina flambada, colocar um disco impregnado com o substrato de PYR sobre as colnias em estudo recm-isoladas. Incubar 37C por 4 horas; ver instrues do fabricante de produtos comercializados. Adicionar 1 gota do reagente PYR (se caldo) OU. Retirar o disco e colocar sobre uma lmina e adicionar 1 gota do reagente PYR. Interpretao Positivo: Desenvolvimento de cor vermelho cereja em 1 minuto (aps adicionar o reagente de PYR). Negativo: Sem alterao de cor (permanece amarela ou alaranjada). Recomendaes Para identificaes presuntivas do Streptococcus pyogenes ou de Enterococcus spp., confirmar se realmente so cocos Gram-positivos/catalase negativos, pois algumas cepas de Staphylococcus spp., Aerococos e Arcanobacterium haemolyticum, podem ser PYR positivos. Raras cepas de Enterococcus spp. podem ser catalase positiva, confirmar com outras provas (como blis esculina) tratar de enterococo ou no. No utilizar colnias com crescimento superior a 24 horas, culturas velhas podem dar resultado falso negativo. No exceder o tempo de leitura.
4.7.8
4.7.9
4.8 Crescimento a 42 E 44C

4.8.1 Princpio Verificar a capacidade de o micro-organismo crescer em altas temperaturas. Utilidade Identificao de bacilos Gram-negativos no fermentadores. Frmula/Produto Meio comercial: Caldo BHI (infuso de crebro e corao). Indicador prpura de bromotimol (1,6 g de do indicador em 100 mL de lcool etlico 95%).
4.8.2
4.8.3
82
4.8.4
Procedimentos Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Distribuir 3,0 mL em tubos com tampa de rosca. Acrescentar o indicador prpura de bromotimol (1 mL de indicador em 1000 mL de meio). Esterilizar em autoclave. Retirar os tubos da autoclave e deixar esfriar em temperatura ambiente. Controle de qualidade Temperatura 42C: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Temperatura 44C: Acinetobacter baumannii. Inoculao Com o auxlio de uma ala ou fio bacteriolgico, inocular a colnia a ser testada. Realizar o teste com colnias puras de 18 a 24 horas. Incubar em banho maria na temperatura a ser testada, 42C ou 44C. Interpretao Cor original do meio: prpura. Positivo: presena de turvao e viragem do indicador de cor prpura para amarelo = crescimento bacteriano. Negativo: ausncia de turvao e permanncia da cor prpura = ausncia de crescimento bacteriano. Conservao e validade Conservar por at 6 meses de 2 a 8C. Recomendaes No fazer inculo muito denso, pode resultar em falsa turvao. Importante o controle da temperatura do banho, com termmetro de mxima e mnima.
4.8.5
4.8.6
4.8.7
4.8.8
4.8.9
4.9 Teste de motilidade

4.9.1 Princpio A bactria mvel atravs do seu flagelo. Flagelos ocorrem nos bacilos Gram-negativos, poucas formas de cocos so mveis. A bactria pode conter um ou muitos flagelos e sua localizao varia com a espcie da bactria e as condies de cultura.
83
4.9.2
Utilidade Determinar se o micro-organismo ou no mvel. Meios associados a outros testes: Meios SIM (Sulfato, Indol, Motilidade), MILI (Motilidade, Indol, Lisina), MIO (Motilidade, Indol, Ornitina) utilizados para testes enterobactrias. Meio motilidade em caldo utilizado para no fermentadores e Enterobacter cloacae (em casos de dvidas). Frmula/Produto Meio comercial: Motilidade Meio comercial: SIM Meio comercial: MILI Meio comercial: MIO Meio Comercial: BHI (brain heart infusion) Meio Comercial: Triptona Soluo de Vermelho de Tetrazlio. Procedimentos A) Meio Motilidade: Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Aquecer sob agitao, at fundir o meio. Distribuir aproximadamente 2,0 mL em tubos com tampas de rosca. Esterilizar em autoclave. Retirar os tubos da autoclave. Deixar solidificar em temperatura ambiente na posio vertical. B) Meio Motilidade com adio da soluo de Vermelho de Tetrazlio: Pesar e hidratar conforme instrues do fabricante. Aquecer sob agitao, at fundir o meio. Adicionar 0,1 mL para cada 100 mL de base de soluo de vermelho de tetrazlio 0,1% e homogeneizar bem. Distribuir aproximadamente 2,0 mL em tubos com tampa de rosca. Esterilizar em autoclave. Retirar os tubos da autoclave. Deixar solidificar em temperatura ambiente na posio vertical. C) Meio SIM/Meio MILI/Meio MIO Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Aquecer sob agitao, at fundir o meio. Distribuir aproximadamente 3,0 mL em tubos com tampa de rosca. Esterilizar em autoclave.
4.9.3
4.9.4
84
Retirar os tubos da autoclave. Deixar solidificar em temperatura ambiente na posio vertical.
D) Caldo BHI (motilidade em caldo) Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante. Distribuir 3,0 mL em tubos com tampa de rosca. Esterilizar em autoclave. Retirar os tubos da autoclave. Deixar esfriar em temperatura ambiente. E) Meio Caldo Triptona Pesar e hidratar conforme instrues do fabricante. Aquecer sob agitao, at fundir o meio. Distribuir aproximadamente 3,0 mL em tubos com tampas de rosca. Esterilizar em autoclave. Retirar os tubos da autoclave. Deixar esfriar em temperatura ambiente. 4.9.5 Controle de qualidade A) Meio Motilidade: Positivo: Escherichia coli ATCC 25922. Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923. B) Meio SIM:
MICRORGANISMO Proteus vulgaris Shigella sonnei Escherichia coli
H2S Pos Neg Neg Pos Neg Pos
INDOL Pos Neg Pos
MOTILIDADE
Proteus vulgaris ATCC 13315, Shigella sonnei ATCC 25931, Escherichia coli ATCC 25922.
C) Meio MIO:
MICRORGANISMO Escherichia coli Enterobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae
MOTILIDADE Pos Pos Neg Pos Neg Pos
INDOL Pos Pos Neg
ORNITINA
Eschericha coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883.
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D) Meio MILI:
MICRORGANISMO Escherichia coli K. pneumoniae P. alcalifaciens S. enteritidis S. flexneri
CRESCIMENTO Denso Denso Denso Denso Denso Pos Pos
LISINA
MOTILIDADE Pos Neg Pos Pos Neg Neg Neg Neg Neg Neg
INDOL
Neg Pos Neg
E. coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Providencia alcalifaciens ATCC 9886, Salmonella enteritidis. ATCC 13076, Shigella flexneri ATCC 12022.
E) Meio BHI/Caldo Triptona: Positivo: Escherichia coli ATCC 25922. Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923. Negativo: meio sem inocular. 4.9.6 Inoculao A) Meio Motilidade/Meio SIM/Meio MILI/Meio MIO Com o auxlio de um fio bacteriolgico inocular uma colnia pura de 18 24 horas, no meio na posio vertical, lentamente at a base. Afastar a agulha seguindo a linha inicial da incubao. Incubar a 35C por 18-24 horas. B) Meio Caldo BHI/Meio Caldo Triptona Com o auxlio de uma ala ou fio bacteriolgico, inocular colnia pura de 18 a 24 horas. Incubar a 352C por 24 a 48 horas. 4.9.7 Interpretao A) Meio de Motilidade: Motilidade positiva: organismos mveis migram pela linha do inculo e difundem-se no meio, causando turbidez. Motilidade negativa: bactria tem um crescimento acentuado ao longo da linha de inculo, em volta continua lmpido. B) Meio de Motilidade com Tetrazlio: Motilidade positiva: organismos mveis produzem uma nuvem cor pink e difundem-se completamente no meio.
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Motilidade negativa: h crescimento da bactria e produo de cor vermelho claro na linha do inculo e em volta do meio continua lmpido. Se resultado for negativo incubar a 21-25C por at 5 dias.
C) Revelao com reativo de Kovacs no meio SIM: Realizar a leitura da motilidade e do H2S. Em seguida adicionar 5 gotas do reativo de Kovacs pela parede do tubo no meio contendo o crescimento bacteriano. Agitar o tubo suavemente e proceder a leitura do indol. Motilidade positiva: micro-organismos mveis migram pela linha do inculo e difundem-se no meio causando turbidez. Motilidade negativa: bactria tem um crescimento acentuado ao longo da linha do inculo, em volta continua lmpido. HS positivo: ao longo da linha de inoculao aparecer a cor negra. HS negativo: linha ao longo da inoculao inalterada. Indol positivo aparecer um anel vermelho. Indol negativo permanecer um anel amarelo (cor original do reativo de Kovacs). D) Meio MILI: Interpretar as reaes da motilidade e lisina antes da adio do reagente de Kovacs para deteco do indol. Motilidade positiva: indicado pelo crescimento na linha e em volta do inculo. Motilidade negativa: crescimento somente na linha do inculo. Lisina decarboxilase positiva: indicado pela cor prpura no meio (essa cor pode variar de intensa ou mais leve, de acordo com a reduo do indicador). Lisina decarboxilase negativa: indicado pela cor amarela do meio. Indol positivo: indicado pela formao de cor pink/vermelho, aps a adio de 3 a 4 gotas de reagente de Kovacs na superfcie do meio e agitao suave no tubo. Indol negativo: reao negativa indicada pelo desenvolvimento de cor amarela. E) Meio MIO: Interpretar as reaes da motilidade e ornitina antes da adio do reagente de Kovacs para deteco do indol. Motilidade positiva: indicado pelo crescimento na linha e em volta do inculo. Motilidade negativa: crescimento somente na linha do inculo. Ornitina decarboxilase positiva: indicado pela cor prpura no meio.
87
Ornitina decarboxilase negativa: indicado pela cor amarela no meio. Indol positivo: indicado pela formao de cor pink/vermelho, aps a adio de 3 a 4 gotas de reagente de Kovacs na superfcie do meio e agitao suave no tubo. Indol negativo: reao negativa indicada pelo aparecimento da cor amarela.
F) Meio caldo BHI/Meio Caldo Triptona: Colocar uma gota do meio entre lmina e lamnula e observar ao microscpio com objetiva de 40 X. A motilidade verdadeira deve ser diferenciada do movimento browniano, verificando que o micro-organismo se desloca em vrias direes. Motilidade positiva: bactrias se movendo de um lado para outro. Motilidade negativa: bactria apresenta somente movimento browniano. 4.9.8 Conservao e validade Meios motilidade, SIM, MILI, MIO e BHI: conservar de 4 a 8 C por at 3 meses. Recomendaes A temperatura de incubao extremamente crtica, porque muitos micro-organismos so mveis a 15-25C e no mveis a 37C. Se houver suspeita que o micro-organismo pode exibir motilidade em baixa temperatura, inocular dois tubos simultaneamente, incubando um a 35C e outro a temperatura ambiente 22-25C. Uso do sal de tetrazlio no meio de motilidade desejvel, mas pode inibir certos micro-organismos fastidiosos. Flagelo o rgo locomotor e composto de protena, essa protena pode se desnaturar com excesso de calor. Por isso cultura testada em temperaturas acima do indicado para o teste de motilidade pode fornecer um resultado falso negativo. Flagelo pode ser destrudo tambm sob agitao violenta do tubo de cultura da bactria, podendo produzir um resultado de motilidade fraco positivo ou falso negativo. Micro-organismos mantidos em estoques de cultura em meios artificiais por longos perodos tendem a perder sua motilidade. Os testes de motilidade em anaerbios so difceis de serem interpretados, sendo significativos apenas os resultados positivos.
4.9.9
88
4.10 Prova de tolerncia ao NaCl 6,5%

4.10.1 Princpio A tolerncia ao NaCl a 6,5% uma prova utilizada para verificar a capacidade de alguns micro-organismos crescerem em presena do sal. Meio base utilizado o BHI caldo, que um meio nutritivo de uso geral, empregado para o cultivo de muitas bactrias. Esse meio normalmente contm 0,5 % de NaCl e aumenta-se a concentrao para 6,5 %, tornando um meio semi-seletivo para o desenvolvimento de alguns micro-organismos. 4.10.2 Utilidade Separa Enterococcus spp., que so NaCl 6,5 % positivo dos demais Streptococcus spp., que so NaCl 6,5% negativos. Na identificao de bacilos Gram-negativos no fermentadores. 4.10.3 Frmula/Produto No h meio pronto para uso. Frmula: BHI caldo 25 g NaCl 60 g Indicador * 1 mL Glicose 1 g gua destilada 1000 mL * Indicador prpura de bromocresol: Prpura de bromocresol 1,6 g Etanol a 95% 100 mL Observao: o uso de indicador opcional. 4.10.4 Procedimentos Pesar o BHI, o NaCl e a glicose em um bquer. Adicionar a gua e homogeneizar bem at completa dissoluo. Adicionar o indicador e homogeneizar novamente. Distribuir 3 mL por tubo. Esterilizar em autoclave. 4.10.5 Controle de qualidade Positivo: Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou Enterococcus faecium. Negativo: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305.
89
4.10.6 Conservao e validade Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses. 4.10.7 Inoculao Dissolver as colnias no caldo. Incubar. 4.10.8 Interpretao Cor original do meio: amarelo ou prpura (dependendo do uso do indicador na composio). Positivo: Crescimento bacteriano (turvao do meio) com ou sem viragem do indicador. Negativo: Ausncia de crescimento. O meio permanece com a cor original, prpura e sem turvao. 4.10.9 Recomendaes Provas negativas com 24 horas de incubao, recomenda-se perodo de incubao maior (48 horas). Verificar a quantidade de NaCl contido na frmula do meio de BHI, pois a concentrao poder ser outra, dependendo do fabricante do meio, e a concentrao final do meio de NaCl a 6,5 % poder ser superior ou inferior concentrao desejada. No carregar no inculo, pois o excesso poder ser interpretado como crescimento e dar resultados falso positivos (para os meios utilizados sem o indicador). Antes da leitura, agitar delicadamente o tubo, pois pode haver sedimentao das clulas bacterianas formadas; Os Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo B de Lancefield (S. agalactiae) e ocasionalmente os Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo A de Lancefield (S. pyogenes) podem ser tolerantes ao NaCl 6,5%. Utilizar outras provas para confirmar a identificao destas espcies.
90
Captulo 5: Discos para Identificao

5.1 Bacitracina
5.1.1 Princpio Streptococcus beta hemoltico do grupo A so sensveis a concentraes baixas de bacitracina. Utilidade Identificao presuntiva de Streptococcus beta hemoltico do grupo A (S. pyogenes). Produto Discos de bacitracina de 0,04 unidades/disco. Controle de qualidade Positivo (Sensvel): Streptococcus pyogenes ATCC 19615. Negativo (Resistente): Streptococcus agalactiae ATCC 13813. Conservao e validade Manter 4C. Validade: ver recomendaes do fabricante. Inoculao A partir de caldo BHI ou TSB recm-turvado, semear na superfcie do meio Mueller hinton sangue, com auxlio do swab. Colocar um disco de bacitracina e pressionar levemente. Incubar 35C 18 a 24 horas.
5.1.2
5.1.3
5.1.4
5.1.5
5.1.6
91
5.1.7
Interpretao Positivo (Sensvel): Presena de qualquer halo ao redor do disco. Negativo (Resistente): ausncia de halo ao redor do disco. Recomendaes Streptococcus alfa hemolticos so sensveis a baixas concentraes de bacitracina. No existem dados disponveis que indiquem a necessidade de medir os halos de inibio. O inculo bacteriano deve ser confluente, inculo muito diludo pode permitir que os Streptococcus no pertencentes ao grupo A paream sensveis bacitracina.
5.1.8
5.2 Novobiocina
5.2.9 Princpio Separa espcies de Staphylococcus coagulase negativa que podem ser sensveis ou no a Novobiocina.
5.2.10 Utilidade Separa cepas de Staphylococcus saprophyticcus (Novobiocina resistente) das demais cepas de Staphylococcus coagulase negativa de importncia clnica. 5.2.11 Frmula/Produto Discos de Novobiocina de 5 g. 5.2.12 Controle de qualidade Positivo: Staphylococcus saprophyticcus ATCC 15305. Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228. 5.2.13 Conservao e validade Refrigerado. Validade: ver recomendaes do fabricante. 5.2.14 Inoculao Preparar uma suspenso do micro-organismo em estudo com crescimento recente (at 24 horas) em caldo BHI, TSA ou soluo fisiolgica estril, acertando a turvao na escala 0,5 de MacFarland. Com auxlio de um swab, semear na superfcie de uma placa de gar Mueller Hinton.
92
Com uma pina previamente flambada, colocar um disco de Novobiocina na superfcie do meio e pressionar delicadamente. Incubar.
5.2.15 Interpretao Resistente: Ausncia de halo de inibio ou halos <= 15 mm. Sensvel: Presena de halo de inibio igual ou superior a 16 mm. 5.2.16 Recomendaes No usar cepas velhas (com crescimento superior a 24 horas) para fazer a suspenso. Se necessrio usar cepas velhas, semear em caldo BHI ou TSA e incubar 37C at turvar, acertar a turvao na escala 0,5 de MacFarland para fazer o teste. Cepas isoladas de outros materiais biolgicos que no urina, fazer identificao complementar com fermentao de acares para confirmar espcie.
5.3 Optoquina
5.3.1 Princpio Cloridrato de etil-hidroxicuprena (optoquina), um derivado da quinina, inibe de forma seletiva o crescimento de Streptococcus pneumoniae em concentraes muito baixas (5 g/mL ou menores). As clulas do Streptococcus pneumoniae que rodeiam o disco sofrem lise, devido variao da tenso superficial, e produzida uma rea de inibio. Utilidade Separa Streptococcus pneumoniae dos demais Streptococcus alfa hemolticos. Frmula/Produto Discos de optoquina de 5 g Controle de qualidade Positivo (Sensvel): Streptococcus pneumoniae ATCC 6305. Negativo(Resistente): Enterococcus faecalis ATCC 29212. Conservao e validade Manter 4C.
93
5.3.2
5.3.3
5.3.4
5.3.5
Validade: ver recomendaes do fabricante.
5.3.6
Inoculao A partir de caldo BHI ou TSB recm-turvado, semear na superfcie do meio Mueller hinton sangue, com auxlio do swab. Colocar um disco de optoquina e pressionar levemente. Incubar 35C 18 a 24 horas em jarra com vela acesa ou estufa com 5 a 7 de CO2. Interpretao Positivo (Sensvel): Disco de 6 mm: halo de inibio de 14 mm ou mais. Disco de 10 mm: halo de inibio de 16 mm ou mais. Negativo (Resistente): Disco de 6 mm: halo de inibio inferior 14 mm ou ausncia de halo. Disco de 10 mm: halo de inibio inferior 16 mm ou ausncia de halo. Recomendaes A optoquina pode inibir outros Streptococcus do grupo viridans, mas apenas em concentraes muito elevadas.
5.3.7
5.3.8
94
Referncias Bibliogrficas
BALOWS A., HAUSLER, W.J. Jr., HERRMANN, K.L., ISENBERG, H.D., SHADOMY, H.J. Manual of clinical microbiology. 5th Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1991. BD (Becton Dickinson and Company). Manual of BBL products and laboratory procedures. 6th Ed. United States of America, 1988. BD (Becton Dickinson and Company). Product catalog for microbiology 1996/1997, Canada,1997. DIFCO manual. 10th Ed. Detroit, 1984. KONEMAN, E.W., ALLEN, S.D., JANDA, W.M., SCRECKENBERGER, P.C., WINN, W.C. Diagnostic Microbiology. 6th ed., 2005. LARONE, D.H. Medically Important Fungi: a guide to identification. 3rd. Ed., Washington: American Society for Microbiology, 1994. MC FADDIN, J.F. Biochemical tests for identification of medical bacteria: Ed. William & Wilkins Co., Baltimore, 2000. MERCK. Manual de medios de cultivo. Darmstadt, 1990. BRASIL. Ministrio da Sade, Fundao Nacional de Sade, Centro de Referncia Professor Hlio Fraga. Manual de Bacteriologia da Tuberculose. 2a. Ed., Rio de Janeiro, 1994. MURRAY, P.R., BARON, J.E., PFALLER, A.M., TENOVER, C.F., YOLKEN, H.R. Manual of Clinical Microbiology: American Society for Microbiology, 8th Ed., Washington. D.C., 2003. OPLUSTIL, C.P., ZOCCOLI, C.M., TOBOUTI, N.R., SINTO, S.I. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clinica: Sarvier, So Paulo, 2000. MANUAL Oxoid. 8a. Edio em ingls. 1a Ed. em portugus. 2000.
95
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3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14

1.1 Procedimentos gerais para preparao e distribuio de meios de cultura

1.2 Controle de qualidade de esterilidade e crescimento

1.3 Recomendaes gerais

Captulo 1: Meios de Cultura para Transporte e Conservao

1.1 Cary Blair

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1.2 Salina tamponada

1.3 Meio Stuart

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1.4 gar nutriente

Captulo 2: Meios para Crescimento e Isolamento

2.1 gar chocolate

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2.2 gar Thayer-Martin chocolate

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2.3 gar Salmonella-shigella (SS)

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2.4 Caldo selenito com novobiocina

2.5 Caldo tetrationato

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2.6 Meio de Tioglicolato com indicador

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2.7 Meio de Tioglicolato sem indicador

2.8 gar Mac Conkey

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2.9 gar sangue

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2.10 gar Cled Cystine Lactose Electrolyte Deficient

2.11 Caldo BHI Brain Heart Infusion

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2.12 Lwenstein Jensen

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2.13 Meio bifsico: Lwenstein e Middlebrook

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2.14 gar Mycosel

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2.15 gar Sabouraud Dextrose

Captulo 3: Meios Comerciais para Provas de Identificao

3.1 Base de nitrognio para leveduras Yeast Nitrogen Base

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3.2 gar Citrato Simmons

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3.3 gar Bile-Esculina

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gua destilada 1000 mL pH = 6,8 +/- 0,2 (25C)

3.4 gar Sangue CAMP

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3.5 Caldo Base de Moeller

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Negativo: Tubos controle e com aminocido: prpura.

3.6 gar Dnase

(Peso molecular do soluto) (Volume da soluo)

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3.7 gar Esculina

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3.8 gar Fenilalanina

Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.

3.9 CTA Cystine Tryticase gar

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3.10 Caldo Triptona e SIM