UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

DETERMINACION DE LA PROTEINA BRUTA EN UNA MUESTRA SOLIDA CURSO : Tcnicas de anlisis de alimentos

PROFESOR

Ing. Cceres Almenara, Eduardo

INTEGRANTES

CHUQUIYURI CRISOSTOMO, Silvana. FERNANDEZ ROMERO, Mery. LOZA ESTEBAN, Anglica. SANDOVAL ESTELA, Dick

Tingo Mara Per 2013 - I

I.

INTRODUCCIN

El problema que representa proporcionar protenas adecuadas a la poblacin del mundo es un tanto secundario en el problema general de alimentacin mundial. Adems de su significado nutritivo las protenas juegan un papel importante en las propiedades organolpticas de los alimentos. Las protenas ejercen una influencia controladora en la textura de los alimentos provenientes de fuentes animales. El contenido proteico del trigo y su harina es considerado como uno de los mejores indicadores de la calidad de la panificacin. El anlisis para la determinacin de protenas, a pesar de no estar incluido generalmente como factor de clasificacin en los estndares de granos se acepta como un factor comercial. Las protenas existen en los alimentos en combinacin fsica o qumica con carbohidratos o lpidos. Las glucoprotenas y las lipoprotenas afectan las propiedades reolgicas de las soluciones alimenticias o poseen aplicaciones tcnicas como emulsificantes comestibles. Las protenas naturales puras poseen poco sabor. contenido protico El analista de alimentos comnmente desea saber el total de los alimentos, aunque dicho contenido est Actualmente todos los

conformado por una mezcla compleja de protenas.

mtodos para determinar el contenido proteico total de los alimentos son de naturaleza emprica. El aislamiento y pesado directo de la protena

proporcionara un mtodo absoluto, sin embargo, dicho mtodo es llevado a cabo slo a veces en investigaciones bioqumicas pero es completamente imprctico para el anlisis de alimentos.

II.

OBJETIVO

Determinar la concentracin de nitrgeno presente en la muestra para luego ser transformado a travs de un factor en protena.

III.

REV. BIBLIOGRAFICA

La Protena cruda se determina mediante vrios mtodos. El contenido de nitrgeno de las protenas vara entre lmites muy estrechos (promedio 16%). Para la determinacin analtica se determina por lo general el contenido de nitrgeno tras eliminar la materia orgnica con cido sulfrico, calculndose finalmente el contenido de protena con ayuda de un factor (6,25.) a. MTODOS PARA LE DETERMINACIN DE NITROGENO i. KJELDAHL Al hervir una muestra con cido sulfrico concentrado en presencia de un catalizador, el nitrgeno se convierte en amonaco, mientras que la materia orgnica se oxida hasta agua y CO2. El nitrgeno, en forma de sulfato amnico, se determina agregando un exceso de sosa (NaOH) y destilando el amonaco producido. Este amonaco es retenido por el cido brico y el borato amnico formado se neutraliza directamente con una disolucin de cido clorhdrico valorada y con la ayuda de un indicador de pH. Tcnica Digestin: Pesar alrededor de 1 g de muestra fresca (MF). Introducir en el

matraz Kjeldahl, aadir el catalizador (0,5 g) y 10 ml de cido sulfrico concentrado. Preparar simultneamente un matraz con un blanco (sin muestra, pero con el mismo 0,5 g de catalizador y 10 ml de sulfrico). Colocar los matraces en la batera de digestin bajo campana de extraccin de humos. Digerir durante un mnimo de hora y media, hasta que la muestra quede del todo transparente. Destilacin y valoracin: Una vez enfriados los tubos, aadir unos 60 ml de

agua destilada por tubo y proceder a la destilacin y valoracin automtica. Anotar el gasto de cido clorhdrico empleado (ml).

ii. MTODO BIURET El mtodo comprende un ensayo colorimtrico de un paso donde se cuantifica la formacin de un complejo estable entre protenas y cobre (II). El complejo presenta un color violeta caracterstico, que se puede observar a

310nm o 540-560nm, el cual se da por la coordinacin de un tomo de cobre con cuatro tomos de nitrgeno. El complejo se basa en la desprotonacin de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los tomos de oxgeno y de nitrgeno del pptido (Ver Figura 7). Despus de la adicin del reactivo de cobre se requiere de tiempo para desarrollar una coloracin de Biuret estable; es necesario considerar la posible influencia de aminocidos libres que forman buffer en configuracin tris y amoniaco. (Nollet, 1996)

iii. MTODO DE LOWY El mtodo de Lowry et al, 1951 combina la reaccin de Biuret con la reduccin del reactivo de Folin-Ciocalteu (cidos fosfomolbdico y fosfotngstico) por la oxidacin de tirosina, triptfano, cistena, cistina de las cadenas polipeptdicas (Nielsen, 1988). El proceso de xido-reduccin se acompaa de la formacin de un color azul caracterstico. Los quelatos de cobre en la estructura del pptido facilitan la transferencia de electrones de los grupos funcionales amino al cromforo cido. Este mtodo es til para determinar pequeas cantidades de protena en una disolucin. El desarrollo de color es dependiente en gran cantidad del pH, que se debe mantener entre 10 y 10.5. (Nollet, 1996).

iv. MTODO TURBIDIMETRICO La turbidez producida cuando una protena se mezcla con alguno de los precipitantes comunes (cido tricloroactico 3-10%, cido sulfosaliclico y ferrocianuro de potasio en cido actico) para protenas en bajas concentraciones se puede utilizar como un ndice de la concentracin de protenas. Las tcnicas turbidimtricas son rpidas y convenientes, sin embargo las principales desventajas que presentan es que las protenas difieren en la velocidad de precipitacin as como no permiten diferenciar entre protenas y compuestos insolubles en cidos

Tales como cidos nucleicos. (Layne, 1957). v. UNIN DE COLORANTES Controlando el pH y la fuerza inica del medio los grupos funcionales cidos y bsicos de las protenas pueden interactuar con grupos orgnicos de carga opuesta. Al realizarse la unin se presenta coloracin o bien un cambio de sta. Comnmente se usan colorantes sulfonados los cuales reaccionan a pH cido con el grupo e-amino de la lisina y el grupo guanidina de la arginina, el imidazol de la histidina y un nmero limitado de aamino terminales. (Nollet, 1996).

b. EXTRACCION DE PROTEINAS (Mtodo de Osborne y Mendel). El mtodo se fundamenta en la relacin estructura-solubilidad de las protenas. Por ejemplo, se sabe que la zena que es soluble en un alcohol fuerte o en disoluciones alcalinas diluidas, pero es insoluble en agua o en soluciones neutras inorgnicas. Las glutelinas por ejemplo es insoluble en agua, en soluciones salinas y en alcohol, y bastante soluble en sosa y potasa. Es importante notar que la mayora de nitrgeno proveniente de protenas es soluble en alcohol y en disoluciones alcalinas. Las globulinas, albminas y prolinas son solubles en disoluciones alcalinas diluidas. (Osborne, 1914)

c. PROPIEDADES FUNCIONALES DE LAS PROTENAS i. Capacidad de gelificacin Cuando las protenas desnaturalizadas se agregan para formar una red proteica ordenada, al proceso se le denomina gelificacin. La gelificacin es una propiedad funcional muy importante de algunas protenas, se utiliza, no slo para formar geles slidos visco elsticos, sino tambin para mejorar la Absorcin de agua, los efectos espesantes, la fijacin de partculas (adhesin) y pata estabilizar emulsiones y espumas. Los mecanismos y las interacciones responsables de la formacin de las redes tridimensionales proteicas son el despliegue y se desnaturaliza antes de la interaccin y agregacin ordenada protena-protena. La formacin de las

redes proteicas se considera el resultado de un balance entre las interacciones protena-protena y protena disolvente (agua) y entre las fuerzas atractivas y repulsivas entre cadenas polipeptdicas adyacentes. Entre las fuerzas atractivas implicadas se encuentran las interacciones hidrofbicas

(potenciadas por las temperaturas elevadas) electrostticas (como los puentes de calcio (II) y otros cationes divalentes), los puentes de hidrgeno (potenciados por el enfriamiento) y los enlaces disulfuro. (Fennema, 1993)

ii.

Capacidad de emulsificacin La Capacidad de emulsificacin es el volumen de aceite que puede ser

emulsificado por cada gramo de protena, antes de que se produzca la inversin de fases. Las caractersticas de una emulsin y los resultados obtenidos en los dos tipos de ensayos mencionados se ven influidos por mltiples factores: tipo y geometra del equipo utilizado, intensidad del input de energa, velocidad de adicin del aceite, volumen de la fase grasa, temperatura, pH, fuerza inica, presencia de azcares y agentes de superficie de bajo peso molecular, exposicin al oxgeno, tipo de grasa, concentracin de las protenas solubles. (Fennema, 1993)

iii.

Capacidad de espumado Las espumas suelen ser dispersiones de burbujas de gas en una

fase continua, lquida o semislida, que contiene un agente con actividad de superficie, soluble. En muchos casos, el gas es aire (y en ocasiones dixido de carbono) y la fase continua una disolucin o suspensin acuosa de protenas. Se puede producir espuma batiendo o agitando una disolucin proteica en presencia de abundante fase gaseosa. La formacin de espuma requiere la difusin de las protenas solubles hacia la interfase aire/ agua, donde deben desplegarse, concentrarse y extenderse rpidamente, para rebajar la tensin interfasial. El desplegamiento previo de las protenas globulares, a travs de un calentamiento moderado, la exposicin a agentes desnaturalizantes, como sustancias reductoras de los grupos

disulfuro, o la proteolisis parcial, mejoran la orientacin en la interfase y proporcionan a las protenas una mayor capacidad de formacin de espuma. Para estabilizar una espuma es preciso formar una pelcula proteica, impermeable al aire, gruesa, elstica, cohesiva y continua en torno a cada burbuja. La capacidad de espumado se define como los mililitros de espuma por mililitro de lquido. (Fennema, 1993)

iv.

Capacidad de retencin de agua Se determina la cantidad de agua necesaria para lograr un estado

de saturacin de la protena (cantidad mxima de agua retenida, medida por centrifugacin). En este mtodo se mide tanto el agua ligada (agua de hidratacin, no congelable) como el agua capilar, retenida fsicamente entre las molculas proteicas. La concentracin proteica, el pH, la temperatura, el tiempo, la fuerza inica y la Presencia de otros componentes afectan a las fuerzas que toman parte en las Interacciones protena-protena y protena-agua. La absorcin total de agua aumenta con la concentracin proteica. Los cambios de pH, a travs de su influencia sobre la ionizacin y la magnitud de la carga neta de la molcula proteica, alteran las fuerzas interactivas, atractivas o repulsivas, de la protena y modifican su aptitud para asociarse con el agua. La fijacin de agua por las protenas desciende generalmente a medida que se eleva la temperatura, debido a la disminucin de los puentes de hidrgeno. El calentamiento provoca la desnaturalizacin y la agregacin, pudiendo esta ltima reducir el rea superficial y el nmero de grupos amino polar disponible para fijar agua. Por otro lado, cuando se calientan protenas con una estructura muy compacta, la disociacin y el

Desplegamientoocasionados pueden exponer enlaces peptdicos y cadenas laterales polares previamente ocultas, lo que aumenta la fijacin. El tipo y la concentracin de iones ejercen un considerable efecto sobre la absorcin de agua. Generalmente, se establece una competencia en la

interaccin entre el agua, la sal y las cadenas laterales de los aminocidos. (Fennema, 1993)

IV.

MATERIALES Y METODOS

Materiales 1. Aparato semimicro kjendhal. 2. Balanza analtica. 3. Digestores elctricos. 4. Bureta de 25 ml. 5. Matraz erlenmeyer de 100ml o de 250ml. 6. Pipeta de 25 ml. 7. Probeta de 25 ml. Reactivos 1. cido clorhdrico 0'1 N, titulado. 2. cido sulfrico concentrado. 3. Agua destilada. 4. Disolucin de hidrxido de sodio 50% p/v. 5. Indicador mixto Shiro-Thasiro. 6. Mezcla cataltica. 7. Papel de fumar.

Metodologa

1. Pesar, en papel de fumar, al cual se le habr eliminado la parte engomada, una cantidad de muestra molturada y homogeneizada que contenga entre 100 y 120 miligramos de protena bruta. 2. Pasar la muestra, envuelta en el papel de fumar, al interior del matraz Kjeldhal. 3. Aadir alrededor de 2'5 gramos de mezcla cataltica y 6 ml de cido sulfrico concentrado. Tapar el matraz con un embudo pequeo.

4. Calentar la muestra con la batera calefactora en vitrina-campana y poner en marcha el extractor; el calentamiento ser suave durante los 5 primeros minutos y fuerte a continuacin. Continuar el calentamiento hasta que el lquido sea de color verde-azul claro y totalmente transparente. El tiempo de digestin varia segn el tipo de muestra (alrededor de de hora). 5. Enfriar, y cuando el lquido est fro, aadir entre 5 y 10 ml de agua destilada, lavando el cuello del matraz. 6. Pasar el lquido al destilador, lavando el matraz tres o cuatro veces con pequeas cantidades de agua destilada. 7. Con todas las llaves del aparato cerradas, aadir de 20 a 25 ml de disolucin de sosa; pasar al cuerpo del destilador dejando una pequea cantidad en el embudo que actuar como cierre hidrulico. 8. Lavar el embudo con agua destilada, dejando pasar todo el lquido de lavado, excepto una pequea porcin que actuar de cierre hidrulico. 9. Destilar y recoger el amonaco en un erlenmeyer de 100 ml, sobre 25 ml de HCl 0'1 N titulado, con unas gotas del indicador mixto. 10. Despus de recoger unos 40-50 ml de destilado, comprobar que ya no destila amonaco, mediante una tira de papel indicador. 11. Valorar el exceso de cido titulado con disolucin titulada de NaOH 0'1 N. 12. Peridicamente, efectuar un blanco con papel de fumar del tipo empleado en las determinaciones. El volumen correspondiente de cido titulado empleado se considera consumido como blanco. Es preciso que el papel de fumar sea siempre de la misma marca y tipo; en caso contrario, deber efectuarse una comprobacin en blanco. 13. Una vez finalizado el proceso, deber procederse a la limpieza del aparato, procediendo al efecto de la siguiente forma: continuando el paso de vapor y con las llaves cerradas, llenar con agua destilada el embudo; el extremo del refrigerante se sumerge en unos 100 ml de agua destilada. Se interrumpe la produccin de vapor y se abre ligeramente la llave del embudo, cerrndola antes que toda el agua pase al interior del

aparato. La reduccin de presin succiona el agua del vaso al interior del aparato, lavndolo. La llave del tubo de purga se abre a continuacin a fin de vaciar el lquido recogido en la camisa exterior. Se repite el proceso volviendo a permitir la produccin de vapor

V.

RESULTADOS

Datos obtenidos en el laboratorio de anlisis de alimentos para determinar el contenido de nitrgeno por el mtodo de Kjeldahl. Cuadro 01. Peso de la muestra inicial en gramos m 1 (g) 0.30056 m 2 (g) 0.3052

Cuadro 02. Gasto en la titulacin de la muestra. Gasto 1 1.6 ml Gasto 2 1.4 ml

Dada la ecuacin se determina el porcentaje de nitrgeno

Si:

Cuadro 03. Porcentaje de Nitrgeno que hay en la muestra.

% Nitrgeno 1 0.75 %

% Nitrgeno 2 0.64 %

Para expresar el resultado en contenido de protena bruta, se debe multiplicarse el contenido de nitrgeno por un factor que depende del tipo de muestra y que, en general, tiene un valor que oscila alrededor de 6.25.

Cuadro 04.Proteina bruta a partir del porcentaje de nitrgeno. Protena bruta 1 0.047 Protena bruta 2 0.04

VI.

CONCLUSION

Como resultado en el laboratorio de anlisis de alimentos a travs de esta tcnica se digieren las protenas y otros compuestos orgnicos de los alimentos en una mezcla con cido sulfrico en presencia de catalizadores. El nitrgeno orgnico total se convierte en sulfato de amonio mediante la digestin. La mezcla resultante se neutraliza con una base y se destila. El destilado se recoge en una solucin de cido brico. Los aniones de borato as formado se titulan con HCL estandarizado para determinar el nitrgeno contenido en la muestra. Se obtuvo el porcentaje de nitrgeno total de la muestra adems la protena bruta.

VII.

CUESTIONARIO

1. Describir las reacciones que tienen lugar en el curso de la practica El mtodo se basa en la determinacin de la cantidad de Nitrgeno orgnico contenido en productos alimentarios, compromete dos pasos consecutivos: a) La descomposicin de la materia orgnica bajo calentamiento en presencia de cido sulfrico concentrado. b) El registro de la cantidad de amoniaco obtenida de la muestra. DIGESTIN catalizadores (1) n - C -NH2 + mH2SO4 CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2 protena NEUTRALIZACIN Y DESTILACIN (2) (NH2) SO4 + 2 NaOH 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O (3) NH3 + H3BO3 (cido brico) NH4 + H2BO3- (in borato) TITULACIN El anin borato (proporcional a la cantidad de nitrgeno) es titulado con HCl (o H2SO4) estandarizado: (4) H2BO3- + H+ H3BO3 En la DIGESTIN se produce la descomposicin del nitrgeno que contienen las muestras orgnicas utilizando una solucin de cido concentrado. Esto se obtiene haciendo hervir la muestra en una concentracin de cido sulfrico. En la etapa de DESTILACIN se libera amoniaco, el cual es retenido en una solucin con una cantidad conocida de cido brico. Inicialmente se realiza una destilacin con vapor por el mtodo de arrastre de vapor de agua, mediante la cual acelera la obtencin del destilado. calor

Al final, se utiliza la TITULACIN para valorar finalmente la cantidad de amonio presente en la muestra destilada. 2. Hacer el esquema grafico del procedimiento analtico
A ebullicin durante hora Adicionar 25ml solucin Na2SO4 Enfriar + 90ml H2O A destilar Adicionar perlas de ebullicin + 80ml solucin NaOH

Muestra + 10g K2SO4 + 0.7g HgO + 20ml H2SO4

Mezclar

Colocar 50ml en 50ml solucin indicadora

Titular con HCl (vira de azul a canela)

CALCULAR

3. Deducir frmula utilizada en los clculos. La formula est relacionada con los volmenes del acido y base titulados, su respectiva normalidad dividida entre el peso de dicha muestra y para obtener lo en porcentaje se multiplica por cien.

4. Calcular el factor de conversin de nitrgeno a protena para una muestra de un pequeo pptido formado por las siguientes secuencias de aminocidos: glicina alanina glicina - glicina Mtodo de Kjeldahl. Para convertir el nitrgeno a protena se emplea el factor de 6.25 el cual proviene de la consideracin de que la mayora de las protenas tienen una cantidad aproximada de 16% de nitrgeno. Tabla. Factores de conversin de nitrgeno a protena para algunos alimentos

5. Para qu sirve cada una de ellos en el catalizador : Mayormente se utilizan para elevar las temperatura y el frecuentemente porque es toxico.

no se usa

VIII.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

http://www.fao.org/docrep/field/003/AB489S/AB489S03.htm http://www.fundacionfedna.org/tecnicas_de_analisis/proteina-brutam%C3%A9todo-kjeldahl http://es.scribd.com/doc/27368664/Determinacion-de-la-Proteina-Total http://nutricionanimalpracticas.blogspot.com/2010/02/practica-no6determinacion-de-proteina.html