Tcnicas de screening o rastreo para el anlisis de drogas en matrices biolgicas

Inmunoensayos

Q.F. Sergio Salas Ibnez Laboratorio de Anlisis Antidoping

Definicin:

Son test cientficos que utilizan anticuerpos para identificar y medir cantidades de sustancias qumicas.

Origen:

Dcada 50 (Rosalyn Yalow y Solomon Berson) Cuantificacin de AC en pacientes diabticos con respuesta inmune a la insulina bovina.

Se utilizo 131I para marcar a la insulina y as conocer si exista una formacin de AC en pacientes diabticos que reciban el tratamiento con insulina bovina. Esto fue apreciado por la disminucin en el numero de cuentas de radiacin (B) medidas en las muestras.

Entonces, la primera tcnica de inmunoensayo utilizada fue RIA

Luego se utilizo para la cuantificacin de diversas hormonas en sangre u otros fluidos biolgicos, que mejoraron el tratamiento de enfermedades de la tiroides, diabetes, hipertensin y esterilidad.

INMUNOLOGA BSICA

ANTIGENO

LINFOCITO mamferos

ANTICUERPO (inmunoglobulina)
Respuesta primaria IgM

ANTICUERPO
Respuesta secundaria > cant. IgG (90%)

IgG
IgG

uso en inmunoensayos
conc. mxima 14 das despus de exposicin al antgeno

FUNDAMENTO DE LOS INMUNOENSAYOS

Todos se basan en la interaccin antgeno (droga y/o droga marcada) con el anticuerpo y el proceso de enlace competitivo que existir por los mismos sitios de unin en los anticuerpos. Al conseguir un equilibrio qumico (factor temperatura, presin, efecto concentracin) se puede aplicar la ley de accin de masas (principio de Le Chatelier)

Enlace Competitivo

CARACTERISTICAS PARA LA UNIN ESPECIFICA ANTICUERPO ANTGENO a) Composicin molecular del antgeno o droga (presencia de diversos grupos funcionales: Aminas, carboxilos, hidroxilos, sulfidrilos, etc.)

b) Orientacin espacial de las molculas (las moleculas al igual que las protenas (AC) tienen una disposicin 3D)

DROGAS
Como fabricar un antgeno para una droga especfica? La mayora son pequeas molculas con PM < 1000 Da sin capacidad antignica. Ej: Anfetamina PM: 135 Da Entonces que hacer? 1) Diseo del hapteno 2) Sntesis del hapteno 3) Conjugacin proteca 4) Inmunizacin adecuada del husped 5) Anlisis AC producidos

CONJUGACION de DROGAS a MACROMOLECULAS

1.- Creacin de un intermediario reactivo

Depende del sitio de reactividad de la droga Ej: Grupos reactivos: - OH ; - CO ; - CHO

Droga OH
Droga CO Droga CHO

hemisuccinato
oxima oxima

Si la droga contiene un grupo NH2, este puede ser conjugado directamente a la protena

2.- Conjugacin del intermediario reactivo con protenas

Albminas:

BSA (Bovine Serum Albumine) HSA (Human Serum Albumine)

KHL (Key-Hole Limpet Hemocyanin) Poli-L-lisina Tiroglobulina inmungeno

Macromolculas:

Oxima Hemisuccinato de la droga (hapteno) + protena 3.- Produccin del anticuerpo inmungeno inmunizacin de animales

Anticuerpo (IgG)

PRODUCCIN DE ANTICUERPOS POLICLONALES Y MONOCLONALES

Policlonales: Se producen en animales , la amplia variedad de

anticuerpos producidos tendr diferente afinidad / especificidad por el compuesto de inters (heterogneos). Estos AC adems pueden diferir en las partes del compuesto (droga) que ellos reconocen. Adems los tipos de AC producidos pueden diferir en su produccin dependiendo del tipo de animal utilizado y el tiempo de inmunizacin de un mismo animal.

Monoclonales: Produccin in vitro de un Hibridoma (unin entre

un linfocito B que produce un nico tpico de AC y una clula tumoral (mieloma), el anticuerpo producido ser muy especifico para la droga.

ENLACE ESPECFICO ANTICUERPO ANTGENO

Especificidad: Capacidad del ensayo de detectar nicamente el

compuesto de inters.

Especificidad (%)= resultados ensayo verdadero negativo / resultados ensayo falsos positivos +
resultados ensayo verdadero negativo (x 100)

Reacciones cruzadas: grado de respuesta de un inmunoensayo a una

sustancia diferente al analito de inters, lo cual puede generar un falso positivo. Estas reacciones dependern de la sustancia analizada y su concentracin
Reacciones cruzadas (%)= concentracin analito / concentracin del analito con reaccin cruzada (x100)

COMPUESTOS MARCADOS

Caractersticas:
1.- Inmunologicamente similares al compuesto a ser ensayado, para que compitan por los sitios de unin de los anticuerpos.

2.- Los marcadores deben detectarse de un modo analticamente sensible (bajo lmite de deteccin), sin que exista interferencias de la matriz biolgica analizada.

MARCADORES O TRAZADORES
Molculas radioactivas, fluorescentes, enzimas o micropartculas que se unen al compuesto de inters (droga). La molcula marcada se agrega a la mezcla reactiva (AC mas la muestra) en el ensayo. Los cambios asociados al marcador se usan para medir la cantidad de compuesto marcado enlazado o unido al AC.

CLASES DE INMUNOENSAYOS

Heterogneos: Inmunoensayo que requiere la separacin del antgeno marcado que se encuentra libre del enlazado antes de realizar la medicin. Homogneos: Inmunoensayo que permite la medicin directa del antgeno marcado sin separar la fraccin libre de la conjugada o unida.

TCNICAS DE INMUNOENSAYO

RIA: Radio Immuno Assay EMIT: Enzyme Multiplied Immunoassay FPIA: Fluorescence Polarization Immunoassay CEDIA: Cloned Enzyme Donor Immunoassay KIMS: Kinetic Interaction of Microparticles In Solution ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent assay

FPIA (TDx, Adx, Axysm)

La fluorescena absorbe a una longitud de onda de 485 nm y puede emitir luz en una longitud de onda entre 525-550 nm.

Ventajas: Ensayo homogneo, el complejo droga-F es ms estable que el de droga-Enzima, LDD bajo, efecto matriz pequeo en los cambios de la intensidad de luz polarizada, lo cual lo hace mas confiable que la medicin de drogas en sangre y orinas de muchos das que el mtodo EMIT, larga duracin de los reactivos ( > 1 ao).
Desventajas: Ms costosa que los ensayos enzimticos, fluorescencia de las sales biliares (falsos positivos).

ELISA (Fundamento)

Enzima (peroxidasa del rbano) Sustrato TMB (Tetrametilbenzidina) Producto coloreado (azul) 450 nm

ELISA

Ventajas: el de menor LDD, menos efecto matriz con el lavado (heterogneo) , fcil de automatizar, larga duracin de los reactivos (>1 ao). Desventajas: Azida de sodio bloquea la actividad de la peroxidasa. Costo por muestra es mas alto que para un ensayo homogneo.

INMUNOCROMATOGRAFA
Enlace competitivo entre la droga y/o metabolito presente en la muestra y la droga conjugado inmovilizada en la zona test por el anticuerpo-colorante que est en la membrana soporte. Pasos: 1) Colocar la orina en la zona de la muestra (S), se deja migrar hacia arriba. Esperar 5 minutos.
2) Si

hay droga presente en la muestra, la droga se une al conjugado ANTICUERPO-colorante y lo satura, se bloquea as la formacin del enlace del conjugado con la droga marcada que est en la membrana en la zona test y no se forma la lnea prpura, por lo tanto el ensayo es positivo. Si no hay droga, el conjugado ANTICUERPO-colorante se une con la droga de la zona test formando una lnea prpura en la zona test (T) y el ensayo es negativo.

inmunocromatoplaca (inmunocromatografa)