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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL FACULTAD DE INGENIERA QUMICA

Tesis presentada como parte de los requisitos de la Universidad Nacional del Litoral, para la obtencin del Grado Acadmico de: Doctor en Tecnologa Qumica Ttulo de la Tesis: "Caracterizacin Reolgica y Reomtrica de Soluciones Macromoleculares Elctricamente Cargadas: Aplicacin a Gelatinas Comerciales" Autora: Bioq. Mara Laura Olivares

Director: Dr. Julio A. Deiber Co-Directora: Lic. Marta B. Peirotti Institucin donde se realiz: Instituto de Desarrollo Tecnolgico para la Industria Qumica Universidad Nacional del Litoral Miembros del Jurado de Tesis: Dra. Noem Zaritzky Dra. Mara Cristina An Dra. Amelia Rubiolo

Ao de presentacin: 2007

A mis padres y a mi esposo

Agradecimientos

En primer lugar quiero expresar mi gratitud a mis directores el Dr. Julio Deiber y a la Lic. Marta Peirotti por sus invalorables aportes, estmulo y gua permanente y por sus apreciables sugerencias durante la realizacin de la Tesis. A mis padres y a mi esposo por el constante apoyo recibido durante estos aos. A mis compaeros, y muy especialmente a Gustavo Imoberdorf y a Mara Lucila Satuf, por brindarme su constante apoyo y colaboracin. A todos los integrantes del grupo de Reologa y Fenmenos de Transporte del INTEC por su cooperacin en la realizacin de tareas informticas y de laboratorio, en especial a la Lic. Dafna Eluk y su esposo Diego Vietto. A los integrantes del Grupo de Ingeniera de Alimentos y Biotecnologa del INTEC por facilitarme equipamiento para la realizacin de algunas

determinaciones experimentales realizadas en este trabajo de Tesis y muy especialmente, al Dr. Guillermo Shiufe y al profesional Daniel Depiante por el asesoramiento brindado. Al Dr. Claudio Berli, por sus valiosos aportes y estmulo permanente. A la Ctedra de Bioqumica Bsica de las Macromolculas de la Facultad de Bioqumica y Ciencias Biolgicas, UNL, por su apoyo permanente. Al Dr. Ivn Marcipar y a la memoria del Dr. Alberto Marcipar por iniciarme en la labor cientfica y por brindarme su sincera amistad. Al personal del INTEC y CERIDE en general por los importantes servicios prestados.

A la empresa PB-Leiner (Argentina) por la donacin de las muestras de gelatina estudiadas en esta tesis. A los miembros del jurado por su inters y disposicin para participar en la evaluacin de esta tesis. Al Concejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tcnicas (CONICET), por otorgarme apoyo financiero, mediante una Beca de Formacin de Posgrado. Finalmente, a todas las personas que de alguna manera colaboraron para la concrecin de esta Tesis.

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Resumen Prefacio

i vi

Captulo 1: Conceptos de reologa y reometra

1.1 Introduccin 1.2 El problema fluidodinmico no-Newtoniano 1.3 Funciones reomtricas y flujo de corte 1.4 Clasificacin de los fluidos segn su respuesta reolgica 1.5 Bibliografa

1 3 6 11 14

Captulo 2: Conceptos estructurales asociados a macromolculas

2.1 Introduccin 2.2 Estructura de fluidos polimricos 2.3 Conformaciones macromoleculares en estado de equilibrio termodinmico 2.4 Fenmenos electrocinticos: Teora de la doble capa elctrica 2.5 Protenas 2.6 Carga elctrica de las protenas 2.7 Hidratacin de las protenas

16 17

22

26 31 38 42

ndice

2.8 Bibliografa

44

Captulo 3: Colgeno y gelatina

3.1 Introduccin 3.2 Colgeno 3.3 Gelatina 3.4 Aplicaciones de la gelatina 3.5 Propiedad gelificante de las soluciones de gelatina 3.6 Propiedades pticas de las soluciones de gelatina 3.7 Mtodos de anlisis de uso industrial para medir las propiedades mecnicas de la gelatina 3.8 Estabilidad y seguridad de la gelatina 3.9 Bibliografa

47 48 53 55 59 61

63 64 67

Captulo 4: Caractersticas microestructurales de las soluciones de gelatina

4.1 Introduccin 4.2 Anlisis de las soluciones de gelatina en las diferentes zonas de concentracin y temperatura 4.3 Cintica de regeneracin de la triple hlice de gelatina 4.4 Conclusiones 4.5 Bibliografa

73

74 80 83 85

ndice

Captulo 5: Obtencin de la MWD* de gelatina mediante electroforesis en gel de poliacrilamida

5.1 Introduccin 5.2 Descripcin breve de la tcnica de PAGE-SDS 5.3 Anlisis de muestras de Gelatina por PAGE-SDS 5.4 Densitometra computacional de las bandas obtenidas por PAGE-SDS 5.5 Conclusiones 5.6 Bibliografa

89 90 99

101 105 107

Captulo 6: Mtodos reomtricos experimentales utilizados en esta tesis

6.1. Introduccin 6.2 Reometra capilar 6.3 Reometra rotacional 6.4 Bibliografa

109 111 120 124

Captulo 7: Viscosidad intrnseca de gelatina para diferentes historias trmicas

7.1 Introduccin 7.2 Conceptos asociados a viscosidad intrnseca de macromolculas

125

126

ndice

7.3 Viscosidad intrnseca de gelatina para diferentes historias trmicas 7.4 Resultados 7.5 Conclusiones 7.6 Bibliografa 130 132 140 142

Captulo 8: Agregacin de molculas de gelatina en solucin diluida

8.1 Introduccin 8.2 Protocolo experimental para la medicin de la viscosidad especfica 8.3 Viscosidad especfica en funcin del tiempo de maduracin 8.4 Agregacin de molculas de gelatina 8.5 Anlisis de la influencia del primer efecto electro viscoso en el radio hidrodinmico de las molculas de gelatina 8.6 Estabilidad de soluciones diluidas de gelatina 8.7 Soluciones ultra-diluidas ( C < Cc ) 8.8 Conclusiones 8.9 Bibliografa

144

145

146 149

164 168 180 183 185

Captulo 9: Estudio de soluciones diluidas y concentradas de gelatina a diferentes pH y fuerzas inicas

ndice

9.1 Introduccin 9.2 Teora de polianfolitos en solucin diluida: escalas caractersticas

188

190

9.3 Aplicacin de la teora de polianfolitos a molculas de gelatina 205 9.4 Viscosidad reducida de soluciones diluidas de gelatina para diferentes pH y fuerzas inicas 9.5 Viscosidad aparente de soluciones concentradas de gelatina para diferentes pH y fuerzas inicas 9.6 Conclusiones 9.7 Bibliografa 224 231 234 218

Conclusiones

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Apndices

I. Algoritmo numrico propuesto para la obtencin de las funciones y parmetros de los modelos tericos utilizados en esta tesis II. Valores de tiempos experimentales para las distintas experiencias de viscosidad Intrnseca III. Valores de tiempos experimentales para las distintas experiencias de agregacin Browniana IV. Valores de tiempos experimentales promedios para las distintas experiencias de viscosidad reducida en funcin del pH 255 253 245 241

Resumen

Resumen

La caracterizacin e interpretacin reolgica y fisicoqumica del comportamiento microestructural de soluciones de gelatina es fundamental para el diseo y control de diferentes procesos de la elaboracin de alimentos, de la ingeniera biomdica y de la biotecnologa. En trminos generales, es pertinente mencionar que la gelatina, la cual es un biopolmero soluble en agua, se obtiene a partir de tejidos de colgeno mediante un proceso de hidrlisis cida y/o alcalina que destruye la estructura terciaria, secundaria y tambin, en parte, la estructura primaria del colgeno nativo. En consecuencia, luego de la degradacin al nivel tropo-colagnico se obtienen cadenas polidispersas que dan origen a un producto con una amplia distribucin de pesos moleculares. Debido a la presencia de aminocidos bsicos y cidos en la secuencia peptdica, las molculas de gelatina en solucin se encuentran cargadas elctricamente. La carga neta de cadena vara ampliamente con el pH. En efecto, el estado conformacional que adoptan estos polianfolitos es significativamente dependiente del medio fisicoqumico en el que se encuentran disueltos, donde intervienen diferentes tipos de fuerzas inter e intramoleculares. Por consiguiente, el sistema solvente macromolcula puede presentar una diversidad de comportamientos y evoluciones, entre ellas, la que se conoce como proceso de maduracin el cual conduce al estado de gel. Las variables representativas en este marco de referencia son: temperatura, fuerza inica, pH, concentracin de protena, historias trmicas y mecnicas.

Resumen

Considerando los problemas brevemente mencionados arriba, en esta tesis se estudian aspectos relevantes y no resueltos al presente de las soluciones de gelatina desde el punto de vista reolgico y fisicoqumico en los regmenes de concentracin ultra-diluido, diluido y concentrado, considerando otras fenomenologas estudiadas previamente en la literatura. Se analiza el efecto que tienen sobre la microestructura formada por el par solvente macromolcula la variacin de parmetros tales como temperatura, tiempo de maduracin, velocidad de corte, pH y fuerza inica. Para la interpretacin terica de los ensayos reomtricos llevados a cabo en los distintos regmenes de concentracin, se requiere conocer la distribucin de pesos moleculares de las cadenas de la gelatina utilizada. En tal sentido, esta funcin de distribucin se obtiene mediante la tcnica experimental de electroforesis en geles de poliacrilamida y, a travs de ella, se calculan los pesos moleculares promediados en fracciones msicas y en nmero de moles usando densitometra computacional. Se analiza la viscosidad de soluciones de gelatina en los regmenes de concentracin ultra-diluido y diluido utilizando un viscosmetro capilar gravitatorio (no disponible comercialmente) que permite, primero, evaluar la velocidad de corte lo cual no es posible en los dispositivos comunes y, segundo, obtener velocidades de corte relativamente bajas, donde los resultados tericos reolgicos, en relacin a la microestructura de los fluidos, estn bien establecidos. Por consiguiente, mediante los resultados

experimentales obtenidos, y a travs de la interpretacin terica de los mismos, se valida y se concluye que el comportamiento microestructural de las soluciones de gelatina es fuertemente dependiente del rango de concentracin,

ii

Resumen

de la temperatura de maduracin y de la composicin electroltica del solvente aportando, a su vez, nuevos conocimientos no descriptos previamente. En efecto, a travs de ensayos de viscosidad intrnseca de soluciones diluidas, es decir para concentraciones inferiores a la concentracin crtica de gelificacin de 10-2 g/cm3 aproximadamente, se observa que por debajo de la temperatura de gelificacin este tipo de soluciones experimentan agregacin intermolecular. Este fenmeno se produce por la formacin de zonas de triples hlices intermoleculares donde las cadenas de gelatina tienden a regenerar parcialmente la estructura tropocolagnica formando estructuras fractales. La agregacin de molculas de gelatina en el rgimen diluido tambin se estudia aqu mediante la medicin de la viscosidad especfica de soluciones diluidas maduradas a distintas temperaturas. La interpretacin de los resultados experimentales obtenidos se realiza a travs de la teora de agregacin de Smoluchowski, observndose que a medida que el tiempo de maduracin aumenta, los agregados que se producen son ms polidispersos con propensin a formar una funcin densidad de distribucin de tamao de partcula de alta dispersin. Adems, a travs de los valores de dimensin fractal obtenidos se observa que estos agregados son ms desordenados y ocluyen mayor cantidad de solvente cuanto menor es la temperatura de maduracin (cinticas de agregacin menos lentas). En efecto, la menor dimensin fractal obtenida es de 1,79 y se registra a la menor temperatura de maduracin evaluada de 5C. Asimismo, el mayor valor de dimensin fractal obtenido a la mayor temperatura de maduracin es de 2,43. Mediante la evaluacin del factor de estabilidad coloidal se observa que el proceso de agregacin es lento debido a que las molculas de gelatina

iii

Resumen

deben vencer una barrera energtica de alrededor 25 veces la energa trmica estimada como el producto entre la constante de Boltzman y la temperatura absoluta. Por otro lado, mediante la evaluacin reomtrica de soluciones ultradiluidas, es decir para concentraciones inferiores a 10-5 g/cm3 se concluye que en este rango de concentracin el sistema no experimenta agregacin sino que las molculas de gelatina regeneran la estructura tropocolagnica mediante plegado intramolecular. Los resultados obtenidos se discuten en el marco de las teoras cinticas de macromolculas. Asimismo, se analiza el estado de carga que poseen las molculas de gelatina a los diferentes pH y se obtiene informacin referente a la conformacin que pueden adoptar estas macromolculas en solucin diluida antes de que comience el proceso de agregacin, las cuales dependen, principalmente, de interacciones intramoleculares de naturaleza electrosttica acopladas al movimiento Browniano. En efecto, mediante un estudio reomtrico de soluciones de gelatina a distintos pH y fuerzas inicas se observa que en el rgimen diluido las molculas de gelatina adquieren diferentes radios hidrodinmicos debido a la modificacin de las interacciones intramoleculares mencionas arriba. Por otro lado, los ensayos reomtricos realizados en el rgimen concentrado, muestran que la variacin del estado de carga de las macromolculas a travs del cambio de pH y de la fuerza inica del medio condicionan la formacin y estabilizacin de redes debido a la modificacin de las interacciones electrostticas intermoleculares, generando mecanismos disipativos sustancialmente diferentes a los encontrados en soluciones diluidas, los cuales se reflejan a travs de la medicin de la viscosidad. Asimismo, mediante el anlisis terico del estado de cargas de una secuencia peptdica

iv

Resumen

perteneciente a gelatina de vaca se observ que las cadenas de gelatina presentan un punto isoelctrico pI 4,48 y que sta es un polianfolito dbilmente cargado, debido a que nunca (es decir para ningn pH) posee ms de un 20% de aminocidos cargados.

Prefacio

Prefacio

En esta tesis se estudia el comportamiento microestructural que presentan las macromolculas de gelatina en solucin cuando se disuelven en condiciones fisicoqumicas diferentes. El anlisis cientfico formal se realiza en el marco de la reologa y la fisicoqumica de macromolculas donde las propiedades fsicas de los sistemas fluidos se expresan, en general, a travs de funciones materiales bien definidas. Por consiguiente, este estudio consiste en establecer la correlacin existente entre las funciones reomtricas y los fenmenos fisicoqumicos que ocurren en las soluciones de gelatina considerando, principalmente, la agregacin de macromolculas en soluciones diluidas, adems del plegado intra-molecular en soluciones ultra-diluidas y la formacin de redes en soluciones concentradas las cuales conducen al estado de gel. En esta propuesta de trabajo, los resultados cientficos obtenidos se presentan en el contexto de nueve captulos, cuyos contenidos se describen brevemente a continuacin. En efecto, en el Captulo 1 se incluyen los fundamentos bsicos de la reolga y la reometra de inters en el desarrollo de esta tesis, contemplando el problema fluidodinmico no-Newtoniano, las definiciones de las funciones reomtricas y de flujo de corte. El Captulo 2 contiene conceptos estructurales asociados a las macromolculas en solucin. ste incluye una descripcin de la estructura de fluidos polimricos y de los fenmenos electrocinticos que presentan estas soluciones cuando los polmeros poseen cargas en su estructura primaria. Asimismo, se describen algunas caractersticas estructurales y fisicoqumicas

vi

Prefacio

de las protenas, las cuales son biopolmeros naturales dentro de las que se incluye a la gelatina. El Captulo 3 presenta, en particular, una breve descripcin de la estructura del colgeno (material de donde se extrae la gelatina) y de la gelatina. Asimismo, se describen algunas propiedades y aplicaciones de la gelatina que motivaron los objetivos planteados para este estudio. En este sentido, considerando la diversidad de usos y aplicaciones de la gelatina, queda claro que se deben conocer las distintas fenomenologas que presentan las soluciones de estas macromolculas para lograr un diseo adecuado de los distintos procesos tecnolgicos involucrados en cada aplicacin en particular. Por consiguiente, en el Captulo 4 se realiza un anlisis detallado de la bibliografa donde se contemplan las caractersticas microestructurales que presentan las soluciones de gelatina en las diferentes zonas de concentracin y temperatura. Para el anlisis experimental llevado a cabo en esta tesis se utiliz una muestra de gelatina la cual se caracteriz desde el punto de vista estructural a los fines de obtener la distribucin de pesos moleculares MWD y los pesos moleculares promediados en fracciones msicas M w y en nmero de moles
M n . En tal sentido, en el Captulo 5 se describe la tcnica experimental

desarrollada y llevada a cabo. Esta consiste en hacer uso de las cargas elctricas de la gelatina y realizar una electroforesis en geles de poliacrilamida para separar las distintas fracciones polipeptdicas en funcin del peso molecular. Las fracciones separadas en bandas bien definidas, debido a la accin de un campo elctrico, se ponen en evidencia mediante la tincin con colorantes especficos para protenas y se analizan mediante densitometra

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Prefacio

computacional obtenindose, de esta forma la MWD y los pesos moleculares promedios. El Captulo 6 presenta los mtodos reomtricos utilizados en esta tesis, donde se incluye el diseo y la construccin de un viscosmetro capilar gravitatorio (no disponible comercialmente) para obtener datos de viscosidad de soluciones de gelatina diluidas y ultra-diluidas a velocidades de corte relativamente bajas. Asimismo, en este captulo se describe el mtodo reomtrico rotacional de celda cono-plato utilizado para el estudio de soluciones concentradas de gelatina. El Captulo 7 comprende el estudio de soluciones de gelatina diluidas sometidas a diferentes historias trmicas mediante el anlisis de la viscosidad intrnseca. Este estudio permite obtener informacin referente a la naturaleza fisicoqumica de las interacciones macromoleculares que ocasionan la agregacin de las molculas de gelatina en esta zona de concentracin y temperatura. En el Captulo 8 se lleva a cabo un estudio experimental de la maduracin de soluciones diluidas de gelatina en condiciones fisicoqumicas diferentes. Los resultados experimentales obtenidos se interpretan en el marco de la teora de agregacin de Smoluchowsky contemplando la estructura y la distribucin de tamao de los agregados que se forman durante el proceso de maduracin. Asimismo, se analiza la naturaleza de las fuerzas que mantienen a estas macromolculas en solucin y se arriba a conclusiones concernientes a la estabilidad de estos sistemas. Finalmente, el Captulo 9 incluye un estudio terico de los distintos estados de carga que presentan las molculas de gelatina a los diferentes pH y

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Prefacio

fuerzas inicas y se infiere acerca de la conformacin que pueden adoptar estas macromolculas en solucin diluida antes de que comience el proceso de de agregacin (es decir, a tiempo de maduracin cero), el cual se describe y analiza en el Captulo 8. Adems, se realizan estudios reomtricos de soluciones diluidas y concentradas de gelatina a diferentes pH y fuerzas inicas. A travs de ellos, es posible arribar a conclusiones concernientes a la naturaleza de las interacciones intra e intermoleculares en funcin del estado de carga de las molculas de gelatina.

ix

Captulo 1

Conceptos de Reologa y Reometra

Captulo 1

1 Conceptos de reologa y reometra

1.1 Introduccin

En este captulo se realiza una descripcin breve de algunos conceptos bsicos de reologa y reometra, cuyo objetivo es precisamente facilitar la lectura de los contenidos especficos de esta tesis. En este marco terico, esta tesis involucra la caracterizacin reolgica y reomtrica de soluciones de gelatina en distintos medios fisicoqumicos. Por lo tanto, se describen a continuacin algunos fundamentos de la reologa que se utilizan en los captulos siguientes (ver, por ejemplo, Bird et al., 1960 y 1977; Walters, 1975; Schowalter, 1978; Barnes et al., 1991 y Macosko, 1994). Desde el punto de vista de la mecnica del continuo material, los fluidos compuestos por molculas chicas, los gases y las mezclas de ellos, presentan una relacin lineal entre la velocidad a la que se deforman y la tensin en el material a una temperatura y presin determinada. Estos fluidos, denominados Newtonianos, se pueden caracterizar mediante dos constantes materiales: la densidad y la viscosidad . De esta manera, en el marco de la mecnica de fluidos clsica, es posible calcular los campos de velocidad y de presin en cualquier sistema de flujo, usando la ecuacin de Navier Stokes. El resto de los materiales, como por ejemplo, fluidos polimricos, slidos fundidos,

suspensiones de partculas, soluciones de macromolculas y coloides en general, presentan respuestas no lineales entre la tensin y la velocidad de deformacin cuando son sometidos a flujos relativamente simples. Estos

Captulo 1

fluidos, denominados en general no-Newtonianos son el objeto de estudio de la reologa. En efecto, el anlisis terico y experimental del comportamiento mecnico de estos materiales en flujos cinemticamente simples conduce a un conjunto de funciones reomtricas, las cuales indican que se requiere ms que una constante

para caracterizarlos reolgicamente. Estas funciones

dependen de la velocidad de deformacin, de la frecuencia y del tiempo, y se utilizan como identificadores de los fluidos no-Newtonianos. En este contexto, se puede decir que la reologa estudia la deformacin y el flujo de los materiales fluidodinmicamente complejos, mediante la caracterizacin del estado de tensiones en funcin de historias mecnicas, trmicas y qumicas (Deiber, 1983). En este sentido, el proceso de caracterizacin es abordado mediante dos metodologas: (1) anlisis reomtrico experimental y (2) seleccin de un modelo o ecuacin constitutiva que describe apropiadamente la relacin entre el tensor de tensiones y los tensores deformacin y velocidad de corte (Walters, 1975, Deiber, 1983). En los comienzos de esta disciplina cientfica, los estudios reolgicos se orientaban a caracterizar principalmente materiales tales como asfaltos, lubricantes, pinturas, plsticos y gomas desde un punto de vista

predominantemente fenomenolgico. Sin embargo, en las ltimas dcadas, la reologa presenta un marco terico consolidado y en continuo crecimiento. De esta forma, esta disciplina logra producir significativos avances en temas de alto inters tecnolgico, como por ejemplo, en la biorreologa donde se estudian las macromolculas naturales, en reologa de polmeros sintticos involucrando as a la industria de materiales modernos y en la reologa de suspensiones donde intervienen diferentes tipos de fases discretas. Asimismo,

Captulo 1

ltimamente surgieron importantes aplicaciones de la reologa en la industria biotecnolgica y en la produccin de materiales biomdicos (ver, por ejemplo, Barnes et al., 1991; Macosko, 1994; Young et al., 2005; Kiessling et al., 1999; Pompe et al., 2003).

1.2 El problema fluidodinmico no-Newtoniano

El problema fluidodinmico no-Newtoniano, en la forma ms simple, se formula mediante las ecuaciones de balance de propiedades de medios continuos homogneos. Por consiguiente, el planteo del problema

fluidodinmico requiere de las ecuaciones de balance de materia, cantidad de movimiento y energa interna, las cuales se expresan respectivamente,

+ .( v ) = 0 t

(1.2.1)

v + v .v = .T + g t

(1.2.2)

u + v .u = .q + T : v t

(1.2.3)

donde es la densidad y v es el campo de velocidades. En el caso de fluidos incompresibles, la ecuacin (1.2.1) se reduce a .v = 0 . En la ecuacin (1.2.2),

Captulo 1

g representa un campo vectorial conservativo, tpicamente la gravedad, y T es


un tensor simtrico que comprende los campos de presiones y de tensiones en el material. En la ecuacin (1.2.3) la energa interna u vara debido al flujo calrico q y a la generacin interna por efecto viscoso, expresada en el segundo trmino del lado derecho. En particular, el problema fluidodinmico se reduce a las ecuaciones (1.2.1) y (1.2.2) cuando el sistema es isotrmico. En tal sentido, en esta tesis se realizan anlisis tericos-experimentales de soluciones de gelatina en estado isotrmico. Las tensiones en el material provienen de dos contribuciones, una del estado isotrpico y la otra debida a las tensiones extras que se generan como consecuencia de la deformacin. En este sentido, el tensor T se expresa,

T = p +

(1.2.4)

donde p es la presin, es el tensor identidad y es el tensor extra de tensiones. Asimismo, si no existen cuplas internas en el material, a travs del balance del momento angular se demuestra que es simtrico (ver, por ejemplo, Schowalter, 1978; Macosko, 1994). En el marco simple de la reologa y la reometra, el tensor se puede expresar en funcin del tensor velocidad de deformacin & , el cual se define como la suma del gradiente de velocidad v ms su transpuesto v T ; es decir,

Captulo 1

& = v + v T

(1.2.5)

De esta manera, el tensor & tambin es simtrico. Para evaluar el campo de tensiones del material que fluye se requiere una ecuacin constitutiva. En este sentido, el modelo reolgico ms simple corresponde al fluido Newtoniano, para el cual se cumple,

= ( v + v T )

(1.2.6)

donde el factor de proporcionalidad es la viscosidad de Newton o viscosidad Newtoniana. En este caso, la divergencia del tensor T resulta,

.T = p + 2 v

(1.2.7)

Incorporando este resultado en la ecuacin (1.2.2) se obtiene la ecuacin de Navier-Stokes, la cual gobierna la mecnica de los fluidos Newtonianos. En cambio, los fluidos no-Newtonianos requieren expresiones ms complejas del tensor , las cuales en general involucran relaciones no lineales entre las tensiones del material y la velocidad de deformacin.

Captulo 1

1.3 Funciones reomtricas y flujo de corte

Como se mencion anteriormente, el estudio reolgico de los fluidos complejos comprende el anlisis experimental de los mismos en condiciones de flujos simples. Dentro del anlisis reomtrico, pueden diferenciarse dos clases bien definidas de flujo; el flujo de corte y el flujo elongacional. Para el desarrollo de este trabajo de tesis los ensayos experimentales fueron realizados en celdas reomtricas que operan bajo flujo de corte. El flujo de corte resulta importante en reologa debido a varias razones: (a) muchos flujos de inters prctico pueden aproximarse a un flujo de corte, (b) las funciones reomtricas reportadas en la literatura con mayor frecuencia se definen para el flujo de corte y (c) el flujo de corte simplifica las ecuaciones reolgicas. El flujo de corte se visualiza fcilmente considerando dos platos paralelos separados por una distancia d , y el fluido que llena el espacio entre ellos. De acuerdo al esquema de la Figura 1.3.1, el plato inferior se mantiene fijo y el superior se mueve a la velocidad constante v 0 .

vo y x

Figura 1.3.1 Flujo de corte entre dos platos paralelos separados por una distancia d (Barnes et al., 1991). El plato superior se mueve en la direccin x con una velocidad constante v o .

Captulo 1

Si la dimensin de los platos es mucho mayor que la separacin d y el fluido se adhiere a las superficies slidas, se establece un perfil de velocidad con la siguiente cinemtica,

vx(y ) =

v x y; y

vy = vz = 0

(1.3.1)

donde {x , y , z} son las componentes del sistema de coordenadas cartesianas que se ilustra en la Figura 1.3.1. En estas circunstancias, el tensor - velocidad de deformacin resulta,

0 & = & yx 0

& xy
0 0

0 0 0

(1.3.2)

donde las nicas componentes no nulas se expresan,

& xy = & yx =

v x y

(1.3.3)

De esta manera, la velocidad de corte & definida a travs del segundo invariante del tensor & resulta,

Captulo 1

& =

1 & : & 2

( )

(1.3.4)

En el caso particular de la Figura 1.3.1, la velocidad de corte se expresa

& = v o d , compatiblemente con las ecuaciones (1.3.3) y (1.3.4) es decir, & es


constante respecto de la coordenada y , y por la ecuacin de continuidad se observa que tampoco vara en la coordenada x . Por estas caractersticas en particular, el perfil de velocidad propuesto v x =
vo y genera un flujo de corte d

homogneo. Cuando el gradiente de velocidad vara punto a punto en el campo de flujo, recibe el nombre de flujo de corte no-homogneo. La forma general del tensor de tensiones en flujo de corte se obtiene a partir de la condicin de simetra del material o, ms formalmente, a travs del principio de objetividad material (ver por ejemplo, Truesdel, 1977; Bird et al., 1977, Schowalter, 1978). En efecto, la expresin para en este flujo resulta,

xx = yx 0

xy yy
0

0 0 zz

(1.3.5)

donde las componentes fuera de la diagonal son iguales porque es simtrico y se denominan tensiones de corte ( = xy = yx ) y las componentes de la diagonal se denominan tensiones normales. A partir del flujo de corte en estado

Captulo 1

estacionario, donde la velocidad de corte no vara con el tiempo, se define la viscosidad aparente o viscosidad de corte ( & ) ,

( & ) =

&

(1.3.6)

y los coeficientes de la primera 1 ( & ) y segunda 2 ( & ) diferencias de tensiones normales,

1 ( & ) =

N1

& 2

xx yy & 2

(1.3.7a)

2 ( & ) =

N2

& 2

yy zz & 2

(1.3.7b)

Las ecuaciones (1.3.6) a (1.3.7) representan las tres funciones reomtricas bsicas del flujo de corte en estado estacionario. Otras funciones reomtricas de inters provienen de ensayos

reomtricos basados en flujo de corte transitorios. En este sentido, se utiliza frecuentemente el flujo de corte oscilatorio con una frecuencia genrica , el cual se logra imponiendo al plato superior de la Figura 1.3.1 una velocidad unidireccional que vara en el tiempo de acuerdo a v 0 sen ( t ) . Si adems se

Captulo 1

cumple 2 0 <<1, donde 0 es la viscosidad a velocidad de corte nula, entre los platos se establece un perfil de velocidad con la siguiente cinemtica,

v x (y ) = &o ysen ( t ) ;

vy = vz = 0

(1.3.8)

En estas condiciones, el cociente entre la tensin y la velocidad de corte dado por la ecuacin (1.3.6) tiene la siguiente expresin,

= ' ( ) sen ( t )

G( )

cos ( t )&o

(1.3.9)

donde ' ( )

es la viscosidad dinmica y

G' ( )

es el mdulo de

almacenamiento elstico. En efecto, el primer trmino del lado derecho de la ecuacin (1.3.9) es la contribucin viscosa y el segundo trmino representa la contribucin elstica del material a la tensin de corte . En general, los ensayos y funciones reomtricas del flujo de corte y elongacional se ilustran en la Tabla 1.3.1 (Bird et al., 1977). En particular, la funcin reomtrica definida anteriormente por la ecuacin (1.3.6) se utiliza para evaluar las soluciones de gelatina de inters en esta tesis. El flujo de corte se obtiene mediante celdas cono-plato y capilar. Estas celdas reomtricas, se describen oportunamente en las secciones siguientes conjuntamente con las expresiones que permiten evaluar & y .

10

Captulo 1

Tabla 1.3.1 Ensayos reomtricos frecuentemente utilizados para la evaluacin de fluidos complejos (Bird et al., 1977).
Tipo de Ensayo Flujo de Corte con Estacionario velocidad de & deformacin Funciones Reomtricas (& ) : viscosidad aparente

1 (& ) : coeficiente de la primera diferencia de


tensiones normales. 2 (& ) : coeficiente de la segunda diferencia de tensiones normales. & ) : viscosidad elongacional e (

Flujo elongacional con velocidad de & deformacin Transitorio

& ) : viscosidad elongacional biaxial eb ( & ) : viscosidad elongacional planar sb (

Ensayo de arranque + (t , &o ) : viscosidad aparente de arranque. en flujo de corte con velocidad de 1 + (t ,&o ) : coeficiente de primera diferencia deformacin de tensiones normales de arranque. &o constante 2 + (t ,&o ) : coeficiente de segunda diferencia de tensiones normales de arranque. Ensayo de parada (t , &o ) : viscosidad aparente de parada. en flujo de corte con velocidad de 1 (t ,&o ) : coeficiente de primera diferencia deformacin de tensiones normales de parada. &o constante 2 (t ,&o ) : coeficiente de segunda diferencia de tensiones normales de parada. Ensayo de relajacin para deformacin G(t , o ) : mdulo de relajacin constante o Ensayo de cedencia para tensin de J (t , o ) : Funcin de cedencia corte constante o Ensayo oscilatorio para frecuencia constante y deformacin o pequea

' ( ) : viscosidad dinmica


G' ( ) : mdulo de almacenamiento elstico

1.4 Clasificacin de fluidos segn la respuesta reolgica

Considerando la ecuacin (1.2.6) y las definiciones reolgicas descriptas en la Seccin 1.3 es interesante visualizar al fluido Newtoniano como aquel que cumple con las siguientes condiciones: (1) la viscosidad no vara con la

11

Captulo 1

velocidad de corte ( = ) , (2) las diferencias de tensiones normales son nulas en flujo de corte ( 1 = 2 = 0 ) y (3) La viscosidad no vara con la frecuencia (' = y G' = 0 ). Sin embargo, como se mencion anteriormente, muchos materiales desde el punto de vista de la reologa, no cumplen estas condiciones y, por lo tanto, se encuadran dentro de los fluidos no-newtonianos. Asimismo, estos se clasifican de acuerdo a las funciones reomtricas y a las propiedades particulares que presentan. Los materiales que presentan diferencias de tensiones normales en flujo de corte involucran cierto comportamiento elstico. En este sentido, se denominan viscoelsticos a aquellos fluidos cuyo coeficiente 1 (& ) es diferente de cero. Por supuesto, otras propiedades tambin caracterizan a un fluido viscoelstico, como por ejemplo, la presencia del mdulo elstico G' ( ) . Adems, las funciones reomtricas que varan con el tiempo para historias mecnicas transitorias en general son de inters. No obstante, se debe mencionar aqu que las respuestas reomtricas dependientes del tiempo pueden tener un origen microestructural. En efecto, los materiales tixotrpicos presentan una disminucin de la viscosidad en funcin del tiempo cuando estn sujetos en forma prolongada a una velocidad de corte constante. En estos materiales se observa una recuperacin de la estructura cuando el flujo se detiene. Asimismo, se estima que los fluidos complejos pueden presentar un comportamiento tixotrpico-viscoelstico (Mewis, 1979; Cheng, 1987; Barnes, 1997). A partir de la forma en que vara la funcin (& ) , los fluidos se pueden clasificar en dos grandes grupos: aquellos cuya viscosidad disminuye al

12

Captulo 1

incrementar la velocidad de corte se denominan seudoplsticos, y aquellos donde la viscosidad crece con la velocidad de corte se denominan dilatantes. El comportamiento pseudoplstico aparece en la mayora de los casos, principalmente en los materiales polimricos y en las suspensiones coloidales. Asimismo, algunos fluidos presentan respuestas excepcionales en relacin a lo descrito en esta seccin, es decir, que pueden presentar varias de las propiedades mencionadas anteriormente (Barnes et al., 1991).

13

Captulo 1

1.5 Bibliografa

Barnes, H. A. (1997). Thixotropy A Review. Journal of Non-Newtonian Fluids Mechanics, 70,1-33. Barnes, H. A.; Hutton, J. F. y Walters, K. (1991). An Introduction to Rheology. Elsevier, Amsterdam. Bird, R. B.; Armstrog, R. y Hassager, O. (1977). Dynamics of Polymeric Liquids. Vol. I, John Wiley & Sons, New York. Bird, R. B.; Steward, W. y Lightfoot, E. (1960). Transport Phenomena. John Wiley & Sons, New York. Cheng, D. C. H. (1987). Thixotropy. International Journal of Cosmetic Science, 9,151-191. Deiber, J. A. (1983). Caracterizacin Reolgica de Fluidos Polimricos. En Transferencia de calor y materia y tecnologa de polmeros. Comit Argentino de Transferencia de calor y materia (SIN 0326-2731), pp 289-351. Macosko, C. W. (1994). Rheology principles, measurements and applications. VCH Publishers, Inc., New York. Mewis, J. (1979). Thixotropy A general review. Journal of Non-Newtonian Fluids Mechanics, 6, 1-20. Schowalter, W. (1978). Mechanics of non-Newtonian Fluids. Pergamon Press, Oxford. Walters, K. (1975). Rheometry. John Wiley & Sons, New York. Young, S.; Wong, M.; Tabata, Y. y Mikos, A. (2005). Gelatin as a delivery vehicle for controlled release of bioactive molecules. Journal of Controlled Release, 109, 256-274.

14

Captulo 1

Truesdel, C. (1977). A first course in rational continium mechanics. Vol 1, Academic Press, New York. Kiessling, L.; Degrado, W. F. y Eckstein, F. (1999). Biopolymers Modulation of nucleic acids, carbohydrates and proteins for different task. Current Opinion in Chemical Biology, 3, 641-642. Pompe, W.; Worch, H.; Epple, M.; Friess, W.; Gelinsky, M.; Greil, P.; Hempel, U.; Scharweber, P. y Schulte, K. (2003). Functionally graded materials for biomedical applications. Materials Science and Engineering A, 362, 40-60.

15

Captulo 2

Conceptos estructurales asociados a macromolculas

Captulo 2

2 Conceptos estructurales asociados a macromolculas

2.1 Introduccin

A nivel molecular, existen diferencias estructurales relevantes entre las soluciones polimricas y los fluidos compuestos por molculas chicas. Estas diferencias son responsables de las fenomenologas adicionales que presentan las soluciones polimricas bajo flujo y deformacin, las cuales pueden ser descriptas por una mecnica de fluidos Newtoniana clsica. En este sentido, es apropiado visualizar que la arquitectura macromolecular de las soluciones polimricas presentan caractersticas fcilmente diferenciables, como por ejemplo: (a) el peso molecular de las macromolculas disueltas vara entre 104 a 109 g/mol; (b) la poblacin de macromolculas puede ser tanto monodispersa como polidispersa, en este ltimo caso se requiere definir como variable adicional la funcin densidad de distribucin de pesos moleculares; (c) las macromolculas pueden presentar un nmero muy grande de configuraciones (secuencias monomricas) y conformaciones tanto en el estado de equilibrio como en flujo, el cual cambia las conformaciones macromoleculares como consecuencia del estiramiento y la re-orientacin provocada por el solvente; (d) las microestructuras formadas por las macromolculas en solucin diluida y concentrada son substancialmente diferentes puesto que las primeras pueden presentar agregados moleculares con estructuras definidas (por ejemplo fractales) mientras que las segundas forman redes temporales (temporary entangled networks). En ambos casos, las microestructuras pueden

evolucionar con el tiempo debido a fenmenos adicionales, como aquellos que

16

Captulo 2

involucran reacciones qumicas covalentes (curado, vulcanizado, etc) o asociaciones fsicas (maduracin, coagulacin, floculacin, etc.) (Tanford, 1961; Flory, 1969; Aklonis et al., 1972; Bird et al., 1977; Creighton, 1993). Debido a que en esta tesis se estudia la caracterizacin reolgica y reomtrica de soluciones de gelatina, es apropiado introducir en este captulo conceptos estructurales asociados a polmeros sintticos que puedan extenderse a macromolculas biolgicas cargadas elctricamente. Por consiguiente, se presenta a continuacin una descripcin breve de la estructura polimrica bsica. Asimismo, se analizan aqu conceptos asociados a los fenmenos electrocinticos que se originan como consecuencia de la presencia de cargas elctricas en las macromolculas, como es el caso de la gelatina. Finalmente, se realiza una descripcin breve de estructuras y conformaciones tpicas de protenas, con el fin de generar un marco conceptual de referencia para el anlisis de las propiedades reolgicas y fisicoqumicas de la gelatina.

2.2 Estructura de fluidos polimricos

Desde el punto de vista morfolgico, un polmero es una molcula relativamente grande (macromolcula) compuesta por unidades qumicas estructurales llamadas monmeros. En este sentido, algunos polmeros estn compuestos por monmeros bifuncionales y, por lo tanto, dan lugar a la formacin de molculas lineales. En otras macromolculas, sin embargo, los monmeros pueden tener una funcionalidad mayor a dos dando origen a polmeros ramificados (Flory, 1969). Muchos polmeros sintticos estn construidos por monmeros de la misma clase y en este caso se denominan

17

Captulo 2

homopolmeros. Por otro lado, los copolmeros se construyen de dos o ms unidades estructurales diferentes. Asimismo, segn la forma en que se combinan las unidades estructurales, los copolmeros pueden ser clasificados como copolmeros aleatorios o copolmeros por bloques (Flory, 1969; Rodrguez, 1970; Bird, et al., 1977). Lo antes mencionado resulta importante como marco de referencia para el estudio de las macromolculas biolgicas, las cuales son designadas distintivamente como biopolmeros. En contraste con los polmeros sintticos, los biopolmeros generalmente estn compuestos de una diversidad de monmeros y adems frecuentemente poseen carga elctrica, como ocurre con las protenas y, en particular, para las cadenas polidispersas de gelatina en solucin acuosa. Ms especficamente, las cadenas polipeptdicas que forman las protenas estn compuestas por aproximadamente veinte unidades estructurales diferentes que son los aminocidos. Particularmente, la gelatina es un biopolmero que posee una distribucin de peso molecular como consecuencia de la degradacin del tropocolgeno utilizado como materia prima. La descripcin de la estructura de la gelatina y la de su precursor, el colgeno, se detalla posteriormente en el Captulo 3. Para caracterizar una muestra macromolecular polidispersa compuesta de diferentes fracciones monodispersas se usan pesos moleculares

promediados. En este sentido, denominando M i al peso molecular de cada fraccin genrica y N i al nmero de moles de la misma, se define el peso molecular promediado en nmero de moles M n mediante la siguiente

expresin (Flory, 1969; Rodrguez, 1970; Bird, et al., 1977; Morawetz, 1975; Allen y Bevington, 1989),

18

Captulo 2

Ni Mi Mn = i Ni
i

(2.2.1)

Este peso molecular tiene un valor desplazado hacia las fracciones de bajo peso molecular (ver, por ejemplo, Flory, 1969; Morawetz, 1975; Allen y Bevington, 1989). Debido a que la masa de la fraccin i es mi = N i M i la cual corresponde a una fraccin msica w i = mi

mi , es posible obtener el peso

molecular promediado en fracciones msicas Mw ,

N i M i2 Mw = w i M i = i Ni Mi
i

(2.2.2)

Este peso molecular tiene un valor desplazado hacia las fracciones de alto peso molecular en contraposicin a lo que se observa con el M n . Cuando
M w M n = 1 la muestra es monodispersa mientras que en el caso que M w M n > 1 la muestra es polidispersa. Esta relacin se denomina ndice de

polidispersidad y frecuentemente es tomado como una medida del grado de dispersin de la muestra (ver, por ejemplo, Rodrguez, 1970; Morawetz, 1975; Bird, et al., 1977). No obstante, el ndice de polidispersidad no define completamente este aspecto microestructural de la muestra. Por ejemplo, dos muestras pueden arrojar ndices de polidispersidad aproximados y, sin embargo, poseer distribuciones de peso molecular muy diferentes. En este

19

Captulo 2

sentido, la distribucin de pesos moleculares (designada MWD en esta tesis) resulta ms representativa del grado de dispersin de una muestra polimrica. En efecto, la MWD se puede expresar a travs de la funcin densidad de distribucin de pesos moleculares, fw (M ) , la cual se describe seguidamente (ver, por ejemplo, Deiber et al., 1993 y 1997; Peirotti et al., 1998). Dada una muestra polimrica compuesta por N fracciones de fraccin msica w i y peso molecular M i , la funcin acumulativa W (M I ) queda definida de la siguiente manera,

W (M I ) =

I <N i =1

w i < 1

(2.2.3)

Si se consideran las N fracciones se obtiene que W (M N ) = 1 . Asimismo, cuando la funcin acumulativa W (M ) es continua se puede expresar de la siguiente forma,

lim W (M ) = 1

(2.2.4)

En este contexto, la funcin de densidad de distribucin continua f (M ) se obtiene a partir de la derivada de la funcin acumulativa W (M ) (Kendall y Stuart, 1977),

dW (M ) = f (M ) dM

(2.2.5)

20

Captulo 2

Por consiguiente, W (M ) tambin se puede se expresar en forma integral de la siguiente manera,

W (M ) = f (M )dM
0

(2.2.6)

Definiendo una nueva funcin densidad de distribucin de pesos moleculares fw (M ) = f (M )M y realizando un cambio de variables la ecuacin (2.2.6) se puede expresar,

f (M ) W (M ) = MdM = M
M 0

ln M

fw (M )d ln M

(2.2.7)

Considerando valores de M cercanos a infinito se obtiene,

W ( ) = 1 = f (M )dM =
0

fw (M )d ln M

(2.2.8)

Cabe aclarar aqu que para obtener fw (M ) a partir de datos experimentales se genera un problema del tipo ill posed en el sentido que infinitas soluciones satisfacen la ecuacin (2.2.7) (Baker, 1977). No obstante, existen algoritmos que permiten obtener una expresin adecuada de fw (M ) para cada caso particular y que puede ser validada con datos experimentales (ver, por ejemplo, Deiber et al., 1993 y 1997; Peirotti et al., 1998; Peirotti y Deiber, 2003).

21

Captulo 2

Mediante fw (M ) se pueden obtener los pesos moleculares promediados


Mw y M n , definidos previamente en las ecuaciones (2.2.1) y (2.2.2) (ver, por

ejemplo, Deiber et al., 1993 y 1997; Peirotti et al., 1998). En este sentido, la expresin continua equivalente a la ecuacin (2.2.2) resulta,

M w = Mf (M )dM =
0

Mfw (M )d ln M

(2.2.9)

Asimismo, la expresin continua equivalente a la ecuacin (2.2.1) es,

Mn =

1 fw (M ) M d ln M

(2.2.10)

En esta tesis se obtiene fw (M ) de una muestra de gelatina comercial haciendo uso de la tcnica de electroforesis en gel de poliacrilamida con agregado del detergente duodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS) y a partir de sta se obtienen los pesos moleculares promedios a travs de las ecuaciones (2.2.9) y (2.2.10). Este procedimiento se detalla en el captulo 5.

2.3

Conformaciones

macromoleculares

en

estado

de

equilibrio

termodinmico

Uno de los modelos frecuentemente utilizados para describir las conformaciones de soluciones macromoleculares en equilibrio termodinmico es el de la cadena con rotacin libre (freely jointed chain). Este modelo consiste

22

Captulo 2

en N puntos de masa o esferas idnticos, conectados por (N 1) varillas rgidas o conectores de longitud L como se muestra en la Figura 2.3.1. La posicin de las esferas con respecto al centro de masas se encuentra especificada por el vector R siendo = 1, 2, ...N y el vector unitario k indica

la direccin desde la esfera hacia la esfera siguiente + 1. Cada segmento de la cadena posee rotacin libre, es decir, no hay restricciones de movimiento (Bird et al., 1977).

+1

3
k R

2 1

Figura 2.3.1 Seccin de una cadena con rotacin libre compuesta por N cuentas conectadas por (N 1) varillas de longitud L (Flory, 1969; Bird et al., 1977; Bohdaneck y Kovr, 1982 ).

A partir de estos conceptos, se define la distancia entre los extremos de la cadena r (end-to-end distance) a travs de la siguiente expresin (Bird et al., 1977, Bohdaneck y Kovr, 1982),

r 2 = (R N R 1 ) (R N R 1 ) = R R = R N R 1

(2.3.1)

Asimismo, el radio de giracin s se expresa,

23

Captulo 2

1 N 1 N s = R R = R N =1 N =1
2

(2.3.2)

Las macromolculas flexibles varan continuamente su conformacin en un modo altamente errtico debido al movimiento Browniano. Como resultado de este fenmeno, tanto r como s fluctan en el tiempo. Debido a que no es simple medir valores instantneos de estos parmetros, es necesario la obtencin de valores promedios. Por consiguiente, un sistema de esferas, como el despcrito anteriormente, queda definido a travs de un conjunto de coordenadas generalizadas que indican la posicin Q = Q1,Q2 ,...,Qg
momentos generalizados P = P1, P2 ,..., Pg

y los

de las mismas en el cual, si no

existen restricciones, g = 3N . No obstante, si estas restricciones existen, como en el caso en que las esferas se encuentran unidas por conectores, entonces

g < 3N . En este contexto, la probabilidad de que a cada instante el sistema


tenga coordenadas y momentos en el rango dQ dP se describe con la funcin densidad de probabilidad f (Q, P ) , la cual debe cumplir con la siguiente condicin,

f (Q, P )dQ dP = 1

(2.3.3)

Integrando f (Q, P ) en todo el espacio de momentos se obtiene la funcin de distribucin de conformacin,

(Q ) = f (Q, P )dP
24

(2.3.4)

Captulo 2

donde (Q )dQ representa la probabilidad de que a cada instante de tiempo el sistema tenga coordenadas en el rango dQ . Por consiguiente, si se consideran parmetros dinmicos, por ejemplo, r 2 (Q ) y s 2 (Q ) stos tienen valores promedios definidos de la siguiente manera,

r 2 = ((R N R 1 ) (R N R 1 )) (Q )dQ

(2.3.5)

s2 =

1 N R R (Q )dQ N =1

(2.3.6)

Utilizando un sistema coordenado esfrico y suponiendo que la orientacin del conector ith es aleatoria e independiente de la orientacin de los otros conectores, la probabilidad de que ste tenga una orientacin en el rango
d i d i es (ver, por ejemplo, Bird et al., 1977),

i d i d i =

1 sen i d i d i 4

(2.3.7)

En efecto, mediante esta aproximacin la funcin de distribucin para la cadena completa es el producto de las funciones de distribucin de los conectores individuales (Bird, et al., 1977),

= i =
i =1

N 1

1 4

N 1 N 1 i =1

sen i

(2.3.8)

25

Captulo 2

Finalmente, introduciendo la ecuacin (2.3.8) en las ecuaciones (2.3.5) y (2.3.6) se obtiene (Bird, et al., 1977; Bohdaneck y Kov, 1982),

r 2 = L2 (N 1)

(2.3.9)

s2 =

1 2 (N 1)(N + 1) L N 6

(2.3.10)

Para valores grandes de N se obtiene que s 2


r 2 = 6 s2 .

1 2 L N y, por consiguiente, 6

2.4 Fenmenos electrocinticos: Teora de la doble capa elctrica

Como se mencion anteriormente, las macromolculas presentan distintas conformaciones en solucin las cuales, frecuentemente, se

caracterizan a travs de promedios estadsticos, como se mostr en la seccin 2.3. Por este motivo, resulta conveniente visualizar estas macromolculas como partculas esfricas que poseen un radio promedio. Por consiguiente, a continuacin se realiza una revisin de algunos conceptos pertenecientes a la ciencia de coloides que refieren a fenmenos electrocinticos de partculas cargadas. Estos conceptos resultan apropiados para el anlisis de los resultados obtenidos en esta tesis cuando en ciertas condiciones fisicoqumicas las cadenas de gelatinas son consideradas como entidades hidrodinmicas cargadas semejantes a partculas coloidales.

26

Captulo 2

Muchas macromolculas que se disuelven en solucin acuosa (o en otros solventes polares), poseen cargas elctricas en su secuencia monomrica. Se incluyen dentro de este grupo a las protenas, los cidos nucleicos, ciertos polisacridos y los polielectrolitos sintticos. Asimismo, las soluciones de estos electrolitos se suelen formular con sales formadas por iones pequeos. En este sentido, las interacciones electrostticas que se generan entre los macro-iones y los pequeos iones no desaparecen ni en condiciones de dilucin infinita. Estas interacciones electrostticas tienen un importante efecto en la conformacin de las macromolculas y en las propiedades cido-base de los grupos disociables que la componen. En este contexto, se considera un sistema de partculas esfricas con la carga uniformemente distribuida en la superficie. Las partculas se encuentran suspendidas en un medio donde estn disueltos los contra-iones de las cargas superficiales y, eventualmente, iones adicionales como se muestra en forma esquemtica en la Figura 2.4.1.

Figura 2.4.1 Esquema de una partcula de radio a con carga neta positiva (pH inferior al pI) y su doble capa elctrica de iones, que posee una longitud caracterstica de 1 .

27

Captulo 2

Este problema electrocintico se describe a partir de la ecuacin de Poisson, que relaciona la variacin espacial del campo elctrico con la densidad de carga e (Hiemenz, 1986; Probstein, 1989; Russel et al., 1989),

2 =

(2.4.1)

donde y son la permitividad elctrica y el potencial elctrico del medio. La densidad de carga e depende de la concentracin numrica de iones n i en las cercanas de la superficie de la partcula la cual puede ser expresada a travs de la funcin de distribucin de Boltzman (Hiemenz, 1986),

Z i e ni = exp k T no B

(2.4.2)

donde no es la concentracin numrica de iones evaluada en el seno de la solucin y Z i es la valencia. Asimismo, k B es la constante de Boltzman y T es la temperatura absoluta. Por consiguiente, la densidad de carga se relaciona con la concentracin numrica de iones mediante la siguiente expresin,

e = Z i en i = e Z i no exp
i i

z i e k BT

(2.4.3)

Incorporando la ecuacin (2.4.3) en la ecuacin (2.4.2) se obtiene la ecuacin de Poisson-Boltzman. Esta ecuacin se puede simplificar para las situaciones

28

Captulo 2

donde se cumple Z i e < k BT . En estos casos la ecuacin (2.4.3) se puede expandir en series de potencia y considerar slo el primer trmino, procedimiento conocido como aproximacin de Debye-Hckel. De esta forma se obtiene la siguiente expresin,

2 = 2

(2.4.4)

donde el parmetro resulta ,

e 2 Z i no

k BT

(2.4.5)

En el caso particular de una esfera de radio a se asigna un valor de potencial en la superficie, es decir, (0 ) = o y ste adems resulta cero en el seno de la solucin. En este sentido, integrando la ecuacin (2.4.4) y aplicando las condiciones de contorno mencionadas se obtiene la siguiente expresin para el potencial elctrico,

(r ) = o

a exp[ (r a )] r

(2.4.6)

Esta ecuacin permite visualizar el significado fsico del parmetro , el cual tiene dimensiones de m 1 . Se observa que 1 es la longitud caracterstica de decaimiento del potencial (r ) , a partir de su valor mximo en la superficie o .

29

Captulo 2

En efecto, 1 se denomina longitud caracterstica de la doble capa difusa de iones, o simplemente longitud de Debye. La ecuacin (2.4.6) tambin es til para encontrar una relacin entre el potencial de superficie o y la carga neta eZ en la superficie de la partcula (Tanford, 1961; Hiemenz, 1986; Hunter, 1992). En este sentido, a partir de la ecuacin de Poisson en forma integral, y aplicando el teorema de la divergencia de Gauss, es posible obtener el campo elctrico en la superficie de la partcula en funcin de la carga,

eZ (r ) = r r = a 4 a 2

(2.4.7)

Por consiguiente, de las ecuaciones (2.4.6) y (2.4.7) se obtiene,

o =

eZ 4 a(1 + a )

(2.4.8)

Para el caso de las protenas suspendidas en agua, consideradas como una partcula coloidal, es posible estimar el estado de carga en funcin del pH, como se describe en las prximas secciones (ver, por ejemplo, Piaggio et al., 2005). La longitud de Debye es frecuentemente expresada en funcin de la fuerza inica I de la solucin la cual se expresa,

I=

1 c i Z i2 2

(2.4.9)

30

Captulo 2

donde c i es la concentracin molar de la especie i . Teniendo en cuenta que


n i = c i 10 3 N A siendo N A el nmero de Avogadro, la longitud de Debye 1 se

expresa,

k T = 3 B 10 N 2Ie 2 A

1 2

(2.4.10)

Asimismo, cuando se trata de electrolitos monovalentes y simtricos (1:1) la longitud de Debye se reduce a (Hiemenz, 1986),

k T = 2 B 2e c N o A

12

(2.4.11)

donde c o es la concentracin de iones. Para el caso particular donde no se agrega sal al medio se puede suponer que los nicos iones presentes en solucin son los contra-iones de las cargas superficiales de las protenas.

2.5 Protenas

Considerando que el biopolmero utilizado en esta tesis es la gelatina, resulta til aqu revisar en forma breve algunos conceptos fisicoqumicos asociados a las protenas en general. Como se adelant en la seccin 2.2, las protenas son biopolmeros cuyos monmeros son los aminocidos. Tales monmeros poseen un grupo carboxilo, un grupo -amino y un grupo residual

31

Captulo 2

que los diferencia entre s. Los aminocidos se unen mediante enlaces covalentes denominados enlaces peptdicos. stos son enlaces amida sustituida que se obtienen por eliminacin de una molcula de agua entre el grupo carboxilo de un aminocido y el grupo amino de otro para formar la cadena lineal. Dichos enlaces se estabilizan por la resonancia de dos formas mesomricas, la unin C N con la caracterstica parcial de doble enlace y el
C = O con la caracterstica de enlace simple. El enlace peptdico est formado

por cuatro tomos, los cuales se encuentran en un mismo plano con dos carbonos . Asimismo, los tomos de oxgeno e hidrgeno del grupo CO NH se encuentran en posicin trans, debido a la estabilizacin por resonancia. En la Figura 2.5.1 se muestra un esquema de la disposicin espacial de los tomos en una secuencia polipeptdica.

H C

R1

H
1.32

H
120

R3 C C O

1.53

C
117 120

N H

C
1.24

R2

Figura 2.5.1 Esquema de un fragmento de una cadena -L-polipeptdica. Distancia interatmica () y ngulos entre enlaces (). y representan los ngulos de rotacin en torno al carbono . R i (i= 1, 2, ..., n) representan los diferentes residuos de aminocidos cualesquiera y estn en posicin trans (Cheftel et al., 1989).

En efecto, la cadena polipeptdica que conforma una protena puede representarse como una serie de planos rgidos separados por grupos HCR i ,

32

Captulo 2

donde los enlaces covalentes simples de cada tomo de carbono son los nicos que pueden rotar libremente (ver, por ejemplo, Cheftel et al., 1989, Fennema, 1993). A la secuencia lineal de aminocidos de la cadena proteica se la denomina estructura primaria o configuracin proteica (Lehninger, 1975). Adems de la estructura primaria, es tambin relevante mencionar la estructura secundaria. En este sentido, la hlice es una estructura helicoidal dextrgira particularmente estable y contiene 3.6 restos de aminocidos por vuelta. Las cadenas laterales se proyectan hacia el exterior de la hlice, como se muestra en la Figura 2.5.2.

O R N H C C H C O C R

H N O H C C N H

H O

R N H

H O C R H O H N C N O H C C H

0.54

R N H

H O C R H O H N O H C C C H N H

0.6
Figura 2.5.2 Esquema de la estructura de una hlice dextrgira (Cheftel et al., 1989). Las lneas de trazos indican enlaces puente hidrgeno.

33

Captulo 2

En esta estructura, se establecen mltiples enlaces puente-hidrgeno intracatenarios, principalmente, entre el grupo NH CO y el oxgeno ms prximo al enlace peptdico situado en el giro inferior de la hlice. Debido a que cada enlace peptdico se estabiliza mediante la formacin de enlaces puentehidrgeno y los dipolos elctricos formados se orientan en la direccin axial, la estructura helicoidal es muy estable (Morrison y Boyd, 1987, Fennema, 1993). Sin embargo, la prolina (Pro) y la hidroxiprolina (Hyp) como consecuencia de las estructuras pirrolidnicas, pueden interrumpir la conformacin helicoidal generando, por ejemplo, un plegamiento particular de la cadena. Estos plegamientos reciben el nombre de giros . Ejemplos de protenas donde esto ocurre son la casena y el colgeno. Este fenmeno se produce tambin con otros aminocidos debido a las propiedades electrostticas y/o estricas de sus cadenas laterales. Cuando esto ocurre, la cadena polipeptdica posee una estructura en la cual la distancia entre los grupos portadores de carga idntica es mxima y entonces la energa libre de repulsin electroesttica se minimiza, se generndose, entonces, zonas desestructuradas de cadenas errticas o random coils (Cheftel et al. 1989, Fennema, 1993). Otra conformacin secundaria relevante en las protenas es la estructura

, en la cual las cadenas polipeptdicas se ordenan en forma de zig-zag


unindose por enlaces puente-hidrgeno intercatenarios para formar las denominadas hojas plegadas; todos los enlaces peptdicos intervienen en dicha formacin. Asimismo, como se observa en la Figura 2.5.3, de acuerdo a la orientacin de las cadenas peptdicas stas pueden ser paralelas o antiparalelas.

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Captulo 2

Adems de las hlices y las estructuras , las protenas pueden presentar otros tipos de estructuras secundarias no tan frecuentes. Por ejemplo, las hlices 10 ( a veces se encuentran en ciertas regiones de las protenas globulares) son una variedad de hlice con tres restos de aminocidos por vuelta. Con menor frecuencia, es posible tambin encontrar en las protenas las hlices y las hlices , las cuales se diferencian de las anteriores en el nmero de restos aminoacdicos por vuelta (ver, por ejemplo, Fennema,1977, 1993; Cheftel et al., 1989).

R H H N C O H H C R C O H C R H N C O N R C H O C R C H N H N H O C H C R N H H C R C O O C C H C R C H O C N H H C R C O H N R C H O C R N H N H O C H C R R H N C H O C N H H C R H C R H N C O H N C O H N C O R C H R C H R C H

AP

Figura 2.5.3 Esquema de la estructura de tres cadenas polipeptdicas en hojas plegadas, denominada estructura . P: dos cadenas paralelas y AP: dos cadenas antiparalelas (Cheftel et al., 1989).

Para finalizar esta seccin referida a las estructuras secundarias de protenas, es preciso mencionar otra estructura helicoidal de relevancia en esta tesis denominada poli-L-prolina. Esta estructura presenta un elevado nmero de aminocidos prolina e hidroxiprolina, lo que genera repetidos giros (ver, por ejemplo, Neurath y Hill, 1979). Este tipo de estructuras son de particular

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Captulo 2

inters en esta tesis porque se encuentran presentes en las molculas de colgeno y consecuentemente en las cadenas de gelatina, debido al alto contenido de aminocidos prolina e hidroxiprolina que poseen. Recordando que la estructura terciaria de las protenas es la organizacin tridimensional de la cadena polipeptdica que comprende regiones con estructuras secundarias bien definidas y otras zonas desestructuradas, es interesante mencionar que, por ejemplo, en la mayora de las protenas globulares que son solubles en agua, los aminocidos hidrofbicos tienden a colocarse hacia el interior de la molcula, mientras que los aminocidos hidroflicos se reparten especialmente, en la superficie de la misma de manera bastante uniforme (ver, por ejemplo, Fennema,1977; Morrison y Boyd, 1987; Cheftel et al., 1989). Aunque la gelatina no presenta estructura cuaternaria, la cual resulta de asociaciones de unidades proteicas, se puede mencionar que estas unidades no necesariamente presentan una organizacin simtrica y que las fuerzas o enlaces que estabilizan las estructuras cuaternarias son del tipo van der Waals, electroestticas y puente-hidrgeno. Asimismo, los enlaces disulfuro, que son importantes en la formacin de estructura terciaria, tambin pueden generar estructuras cuaternarias. A lo largo de esta tesis, para designar el resultado de la combinacin de las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria de una macromolcula se utiliza el trmino conformacin. Es claro entonces que, la conformacin de una macromolcula est estabilizada por diferentes tipos de fuerzas

intramoleculares. Los enlaces o interacciones que mantienen la conformacin nativa de una protena son (Lehninger,1975): (a) enlaces puente-hidrgeno 36

Captulo 2

entre grupos peptdicos de la cadena; (b) enlaces puente-hidrgeno entre grupos residuales; (c) interaccin hidrofbica entre residuos no polares; (d) enlaces inicos entre grupos cargados; e) puentes disulfuro entre residuos de cistena; (f) interaccin dipolo-dipolo entre grupos polares; (g) interacciones protena - solvente. Corresponde mencionar que la conformacin de las protenas es altamente dependiente del ambiente en el que se encuentran y se altera con los cambios de la temperatura, constante dielctrica, pH, fuerza inica, presencia de otras molculas, etc (Lehinger, 1975, Fennema, 1993). Dependiendo de la conformacin, las protenas pueden clasificarse en dos grandes grupos: las protenas fibrosas, como el colgeno y la queratina, que consisten en polipptidos lineales, los cuales se ordenan generando estructuras en forma de fibras u hojas. Estas protenas constituyen elementos estructurales en los seres vivos y son generalmente insolubles en agua. El otro grupo corresponde a las protenas globulares, las cuales presentan estructuras tridimensionales muy complejas, que involucran un plegamiento ordenado y preciso de la cadena polipeptdica. Estas

macromolculas presentan formas que, en general, responden a funciones biolgicas especficas en los seres vivos. Dentro del grupo de protenas se pueden citar, por ejemplo, enzimas, transportadores en el suero sanguineo, inmunoglobulinas, factores de crecimiento, interleuquinas, hormonas, etc, tan solo para mencionar algunos (Lehninger, 1975).

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Captulo 2

2.6 Carga elctrica de las protenas

Las protenas pueden considerarse como polianfolitos debido a que pueden cargarse positiva o negativamente de acuerdo al pH del medio, como consecuencia de la presencia de aminocidos bsicos y cidos en la secuencia peptdica. En este sentido, resulta relevante analizar la estructura de los aminocidos de manera de visualizar el origen de la carga elctrica en una cadena polipeptdica (Lehinger, 1975; Dickinson y Stainsby, 1982). Los aminocidos contienen en su estructura molecular un grupo amino (NH2) y un grupo carboxilo (-COOH) unidos al denominado carbono alfa. Asimismo, los aminocidos poseen una cadena lateral de composicin variable, frecuentemente denominada con la letra R y tambin unida covalentemente al carbono alfa. La prolina y la hidroxiprolina, que derivan de la pirrolidina, no responden a esta estructura general debido a que el grupo -amino se encuentra dentro del anillo pirrlico y, en este caso, esta estructura particular hace que los enlaces peptdicos en los que participan estos aminocidos den lugar a los giros , como fue descripto en la Seccin 2.5 (Lehinger, 1975; Fennema, 1993). En efecto, cada aminocido tiene una cadena lateral R, caracterstica que influye en sus propiedades fisicoqumicas, y por lo tanto, en las de la protena de la cual forma parte. Debido a la presencia del grupo amino y del grupo -carboxilo y de los grupos disociables presentes en los residuos R. Un aminocido disuelto en agua puede comportarse como un cido o como una base dependiendo del pH de la solucin como se esquematiza en la Figura 2.6.1.

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Captulo 2

(1) Comportamiento como base H R


+

H COO
-

C NH 3

+ H

R
+

C NH 3

COOH

(2 ) Comportamiento como cido H R


+

H COO
-

C NH 3

H+ + R

C NH 2

COO

Figura 2.6.1 Comportamiento cido y bsico de los aminocidos (Fennema, 1993).

Por lo tanto, cada grupo tiene un valor caracterstico de pK a en la escala ascendente de pH. En este sentido, es apropiado recordar que el pK a se define el logaritmo de la constante de disociacin afectado por el signo menos. Por consiguiente, los pK a en la escala ascendente de pH quedan definidos a travs de las siguientes expresiones,

pK a1 = log

[H + ][a min ocido ] [a min ocido + ]

(2.6.1)

pK a 2 = log

[H + ][a min ocido ] [a min ocido ]

(2.6.2)

Cuando el aminocido posee una cadena lateral cargada, adems de los valores de pK a asociados a los grupos -amino y -carboxilo, se requiere

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Captulo 2

tambin el pK aR correspondiente a la disociacin del grupo lateral cargado. En la Tabla 2.6.1 se listan los valores de pK a1 , pK a 2 y pK aR para los grupos ionizables de los distintos aminocidos. En esta tabla tambin se citan los valores de punto isoelctrico (pI) de cada aminocido recordando que ste es el valor de pH en el que la carga neta del aminocido en solucin es cero (Fennema, 1993).

Tabla 2.6.1 Valores de pK a1 , pK a 2 , pK aR y pI de los aminocidos (Fennema, 1993). Aminocido Smbolo pk a1 pk a 2 pk aR + (-COO ) (- NH3) (R = cadena lateral) Alanina Ala 2,35 9,69 Arginina Arg 2,17 9,04 12,48 Asparagina Asn 2,02 8,80 cido Asprtico Asp 2,09 9,82 3,86 Cistena Cys 1,96 10,28 8,18 Glutamina Gln 2,17 9,13 cido Glutmico Glu 2,19 9,67 4,25 Glicina Gly 2,34 9,78 Histidina His 1,82 9,17 6,00 Isoleucina Ile 2,36 9,68 Leucina Leu 2,36 9,64 Lisina Lys 2,18 8,95 10,53 Metionina Met 2,28 9,21 Fenilalanina Phe 1,83 9,24 Prolina Pro 1,99 10,6 Serina Ser 2,21 9,15 Treonina Thr 2,71 9,62 Triptfano Trp 2,38 9,39 Tirosina Tyr 2,20 9,11 10,07 Valina Val 2,32 9,62 Ornitinaa Orn 1,94 8,65 10,76
a

a 25C

pI
6,02 10,76 5,41 2,97 5,07 5,65 3,22 6,06 7,58 6,02 6,00 9,74 5,75 5,53 6,30 5,68 6,16 5,89 5,65 5,97 9,70

La ornitina no es uno de los 20 aminocidos codificados por el ADN celular sino que se produce por decarboxilacin de la arginia. Este aminocido es de particular inters en esta tesis debido a que se genera durante el proceso de extraccin alcalino de la gelatina luego de la liberacin de rea (Ward y Courts, 1977).

Adems, segn la polaridad de la cadena lateral R es posible clasificar a los aminocidos en cuatro clases (Fennema, 1993): (a) aminocidos con

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Captulo 2

cadenas laterales no polares o hidrofbicas, (b) aminocidos con cadenas laterales polares no cargadas o hidroflicas, (c) aminocidos con cadenas laterales cargadas positivamente (para un pH alrededor de 7) y (d)

aminocidos con cadenas laterales cargadas negativamente (para un pH alrededor de 7). Por lo antes mencionado, las protenas poseen una carga neta en su configuracin o estructura primaria debido a que en el equilibrio cido-base participan los grupos ionizables de las cadenas laterales de algunos aminocidos (ver Tabla 2.6.1) y los grupos -amino y -carboxilo de los aminocidos terminales. En este sentido, se define como carga neta la diferencia entre cargas positivas y cargas negativas de la protena tomadas en valor absoluto. No obstante, la ionizacin de un determinado grupo se ve afectada por la proximidad de otros grupos ionizados, por grupos hidrofbicos o por enlaces puente-hidrgeno (Piaggio et al., 2005 y 2006). En solucin acuosa, la mayor parte de los grupos ionizables estn localizados en la superficie de la protena. Asimismo, como se mencion anteriormente, la protena posee una carga neta cero en el punto isoelctrico (pI); a este pH los polianfolitos no migran cuando se sitan en un campo elctrico externo como ocurre, por ejemplo, en la electroforesis. Es interesante mencionar que el pI de una protena se puede estimar basndose en los aminocidos que la constituyen. Para esta evaluacin se requiere despreciar los efectos descriptos anteriormente. Asimismo, el pI vara segn el medio en el que se encuentra disuelta la protena. En efecto, ciertos iones pueden ligarse a la protena y modificar el pK a de los grupos ionizables (Tanford, 1961; Dickinson y Stainsby, 1982; Fennema, 1993).

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Captulo 2

2.7 Hidratacin de las protenas

Las protenas interaccionan con el agua a travs de sus enlaces peptdicos (mediante interacciones dipolo dipolo o puente hidrgeno) o a travs de las cadenas laterales de los aminocidos (mediante interacciones con grupos ionizados polares e incluso no polares). En este contexto, el agua asociada a las protenas se puede clasificar en: (a) agua constitucional, localizada en la parte interna de la macromolcula; (b) agua interfacial, localizada en las superficies y en las cavidades; (c) agua perifrica, que tiene disminuida la movilidad por la presencia de la macromolcula (Fennema, 1977, 1993). Es conveniente mencionar que el agua asociada no est totalmente inmovilizada. La temperatura en general aumenta la hidratacin, pero la solubilidad de las protenas aumenta en un rango estrecho. Asimismo, los iones de sales neutras a molaridades del orden de 0,5 - 1 M aumentan la hidratacin y la solubilidad de las protenas (efecto de saltingin) al aumentar la ionizacin de los grupos residuales de la cadena. Cuando la fuerza inica es elevada (mayor a 1 M aproximadamente) la solubilidad de la protena disminuye y puede ocurrir la precipitacin total (efecto de salting-out). ste es un fenmeno complejo pero se debe fundamentalmente a que la alta concentracin salina puede remover el agua de hidratacin (debido a la competencia entre los iones salinos y la protena, por el agua) con la consecuente prdida de solubilidad (Tanford, 1961; Lehninger, 1975; Fennema, 1993; Israelachvili, 1995). En lo que respecta a esta tesis, donde se estudia la hidrodinamia de las protenas en soluciones diluidas a travs de mediciones de viscosidad

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Captulo 2

intrnseca, viscosidad reducida y viscosidad especfica (ver Captulos 7, 8 y 9) es importante mencionar que slo resulta de inters considerar el agua total inmovilizada por la protena, sin necesidad de distinguir los mecanismos de inmovilizacin. En efecto, desde este punto de vista cientfico interesa describir a la protena a travs de un radio hidrodinmico efectivo, el cual es el resultado de la masa acuosa y proteica.

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Captulo 2

2.8 Bibliografa

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Captulo 2

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Captulo 3

Gelatina y Colgeno

Captulo 3

3 Colgeno y gelatina

3.1 Introduccin

En el presente captulo se realiza una descripcin breve de las caractersticas estructurales y fisicoqumicas de la gelatina (la cual es el biopolmero que se estudia en esta tesis) y de las de su precursor el colgeno. Asimismo, seguidamente se mencionan algunas de las aplicaciones de la gelatina en las industrias alimenticia, fotogrfica y biomdica siendo posible evidenciar de esta manera la versatilidad que posee esta macromolcula y el amplio panorama de situaciones que requieren un mayor estudio. Debido a que en los siguientes captulos (ver, por ejemplo el Captulo 4) se realiza una discusin de las diferentes fenomenologas que presentan las soluciones de gelatina en los distintos rangos de concentracin y temperatura, tambin se consignan brevemente aqu algunas propiedades fsicas de las soluciones de gelatina que frecuentemente se utilizan como herramienta para el estudio y caracterizacin de estos sistemas macromoleculares. Finalmente, se detallan en este captulo los mtodos de ensayo utilizados en la industria para determinar las propiedades mecnicas del gel de gelatina mostrndose de esta forma la necesidad de nuevos desarrollos y tcnicas que permitan una mejor caracterizacin de este producto.

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Captulo 3

3.2 Colgeno

El colgeno es la fibra ms abundante del tejido conectivo. Las fibras colagnicas son flexibles y tienen una notable resistensia a la fuerza tensional. Si se examinan con el microscopio ptico, las fibras de colgeno se caracterizan por aparecer como estructuras onduladas de espesor variable y longitud indeterminada. Con la ayuda de la microscopa electrnica se observa que estas fibras estn compuestas por haces de delgadas subunidades filamentosas, designadas fibrillas colagnicas, las cuales se observan en la Figura 3.2.1 (Ross et al., 1992).

Figura 3.2.1 Microfotografa electrnica de tejido conectivo denso. En el crculo aparecen con mayor aumento cortes longitudinales de fibrillas colagnicas paralelas. Ntense las bandas transversales. Las flechas indican el espacio de periodicidad de 68 nm (Ross et al., 1992). Las fibrillas colagnicas cuando se tien con osmio u otro metal pesado presentan una secuencia de bandas transversales espaciadas que se repiten

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Captulo 3

cada 68 nm en toda su longitud (ver, detalle en la Fig. 3.2.1). Las bandas son un reflejo de la disposicin estructural, especficamente del tamao y de la forma de las molculas de colgeno que forman la fibrilla. Esta disposicin se esquematiza en la Figura 3.2.2. La estructura bsica del colgeno, la cual se denomina tropocolgeno, es una protena fibrosa de un peso molecular algo menor a 300.000 Da, mide unos 300 nm de longitud por 1,5 nm de espesor. Para formar la fibrilla, las molculas de colgeno se alinean empalmando extremo con extremo, en hileras que se superponen presentando brechas entre las molculas de cada hilera. La secuencia en bandas que se observa con el microscopio electrnico se debe al depsito de osmio en el espacio entre los extremos de las molculas de cada hilera. Cada molcula de tropocolgeno est compuesta de tres cadenas polipeptdicas entrelazadas. Cada uno de estos polipptidos se denomina cadena alfa y posee un peso molecular de 90.000 Da, aproximadamente. Estas cadenas se entrelazan para formar una triple hlice dextrgira (ver, Figura 3.2.2.d). Cada cadena alfa se enrolla como hlice levgira de tres residuos de aminocidos por giro, y se ubican en las esquinas de un tringulo equiltero de 0,5 nm de lado. Las tres cadenas juntas forman una sper hlice dextrgira con un paso repetido de 8,6 nm y una traslacin de 0,286 nm (Ledward, 1986). Las cadenas del tipo alfa poseen una composicin y secuencia aminoacdica caracterstica donde la glicina aparece cada tres residuos de aminocidos, salvo en las terminales de la cadena. A menudo, a cada glicina le precede una hidroxiprolina y le sigue una prolina. Esta estructura de glicina con

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Captulo 3

Figura 3.2.2 Diagrama que muestra las caractersticas moleculares de una fibrilla de colgeno en orden decreciente de estructura. (a) La fibrilla de colgeno presenta bandas transversales con una periodicidad de 68 nm (D). (b) Disposicin en escalera de las molculas de colgeno. (c) Triple hlice de colgeno de 300 nm de longitud y 1,5 nm de dimetro. (d) Composicin de la triple hlice. (e) Secuencia tpica de una cadena , la glicina aparece cada tres aminocidos. En la posicin X suele haber una prolina y en la posicin Y una hidroxiprolina (Ross et al., 1992).

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Captulo 3

hidroxiprolina y prolina es esencial para la conformacin de la triple hlice (ver Figura 3.2.2e) debido a que esto permite un acercamiento entre las cadenas del tipo alfa y la existencia de enlaces del tipo puente-hidrgeno intercatenarios entre el grupo carboxilo de la glicina y el grupo hidroxilo de la hidroxiprolina (Cheftel et al., 1989; Ross et al., 1992). El contenido de grandes cantidades de residuos de prolina e hidroxiprolina, genera un impedimento estrico a la rotacin alrededor de las uniones peptdicas. En consecuencia, se favorece la configuracin trans-poli-L-prolina II frente a la configuracin cis. A los residuos hidroxilos de la hlice se le asocian grupos hidrocarbonados, por lo cual el colgeno se considera una glucoprotena (Ross et al., 1992). Las cadenas denominadas alfa difieren en la secuencia y en el nmero de aminocidos. Basndose en estas diferencias, se han encontrado hasta el momento, 20 tipos distintos de molculas de colgeno. Los cinco tipos de colgeno ms comunes y mejor caracterizados se describen a continuacin (Ross et al., 1992): El colgeno Tipo I est formado por dos cadenas (1) cuya secuencia de aminocidos es idntica mientras que la tercera (2) es diferente. Por consiguiente se designa [1(I)]22(I). El colgeno Tipo II posee las tres cadenas equivalentes y se representa por [1(II)]3. El colgeno Tipo III es similar al colgeno tipo II y se designa como [1(III)]3. El colgeno Tipo IV est formado por tres cadenas iguales y existen dos subtipos denominados [1(IV)]3 y [2(IV)]3. El colgeno Tipo V est formado por dos cadenas iguales y una diferente, es decir [1(V)]22(V).

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Captulo 3

Considerando la revisin realizada por Ledward (1986 y 1992), no se sabe si existen uno o dos enlaces puente-hidrgenos por tripptido. Tampoco hay seguridad de que exista una molcula de agua involucrada en estos puentes. Adems, los enlaces puente-hidrgenos formados por hidroxilos de hidroxiprolina proporcionan estabilidad adicional a la molcula, y forman una extensa red cooperativa de enlaces puente-hidrgenos en la molcula final de colgeno. Es tambin interesante mencionar que el contenido de prolina e hidroxiprolina en el colgeno vara marcadamente entre especies. Por ejemplo, la composicin en aminocidos de colgenos provenientes de tejidos de mamferos y aves es aproximadamente constante. Para estos tipos de colgeno, la glicina comprende aproximadamente el 33% del total del contenido de aminocidos, la prolina e hidroxiprolina representan el 20% y la alanina el 11% aproximadamente (te Nijenhuis, 1997). En efecto, estos cuatro aminocidos representan las dos terceras partes de los residuos de aminocidos que conforman el colgeno. No obstante, los colgenos provenientes de pescados muestran una mayor variacin en su composicin de aminocidos, especialmente en el contenido de prolina e hidroxiprolina. Este contenido es menor cuanto menor es la temperatura del agua donde los peces viven (te Nijenhuis, 1997; Gmez-Guilln et al., 2002; Fernndez-Daz et al., 2003). La composicin de los colgenos de anfibios y reptiles es algo variable tambin, pero, generalmente se encuentra entre la variabilidad de los mamferos y los peces (te Nijenhuis, 1997). El contenido de pirrolidinas (prolina e hidroxiprolina) es un factor determinante en la estabilidad trmica de la estructura del colgeno. La

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presencia de una hidroxiprolina en la tercera posicin, despus de una prolina en la segunda posicin determina significativamente la estabilidad de la estructura molecular. En efecto, esta configuracin tiene la habilidad de formar enlaces del tipo puente-hidrgeno (te Nijenhuis, 1997).

3.3 Gelatina

Cuando los tejidos que contienen colgeno se someten a procesos degradativos que, usualmente, involucran hidrlisis alcalina o cida seguido de una extraccin acuosa en caliente, la estructura fibrosa del colgeno se rompe irreversiblemente y se obtiene la gelatina. Por consiguiente, el proceso de manufactura involucra la destruccin de la estructura terciaria, secundaria, y en alguna medida tambin la estructura primaria del colgeno nativo (Ward y Courts, 1977; Ledward, 1986). En efecto, tres tipos predominantes de cadenas se pueden encontrar despus de la degradacin tropo-colagnica: la cadena alfa, compuesta por una sola cadena peptdica, la cadena beta, formada por dos cadenas peptdicas conectadas y la gamma, que resulta del vnculo entre tres cadenas. Debido a la presencia de las mismas y sus fragmentos intermedios, una muestra de gelatina comercial tiene una amplia distribucin de pesos moleculares ( MWD ). En menor cantidad se detectan fracciones de pesos moleculares pequeas y muy altas (Normand et al., 2000). En este sentido, debido a la diversidad de gelatinas que se pueden producir y ofrecer en el mercado, resulta relevante desarrollar mtodos que permitan caracterizar la MWD de cada una de ellas. (Benguigui et al., 1991 Braidot y Deiber, 1999; Tromp et al., 2002).

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Captulo 3

La gelatina se puede extraer de tejido colagnico proveniente de diversas fuentes animales tales como piel de vaca, piel de cerdo, polvo de hueso, piel de pescado, y de otros recursos naturales de menor uso (Harrington y Rao, 1970; Harrinton y Karr, 1970; Ward y Court, 1977; Ledward, 1986). En principio, la composicin en aminocidos de la gelatina obtenida es similar a la del material colagnico del cual se obtiene y, por lo tanto, la diferencia de especies y de tipos de tejido da origen a productos distintos. Asimismo, los diferentes materiales colagnicos requieren variaciones en la naturaleza y severidad del tratamiento durante el proceso de obtencin lo cual da lugar a variabilidades en el producto obtenido. Por ejemplo, el proceso alcalino, a travs de la remocin de grupos amida, provee una gelatina con una alta densidad de grupos carboxilos que la hacen negativamente cargada a pH neutro es decir, el punto isoelctrico pI es relativamente bajo. Por el contrario, la naturaleza elctrica del colgeno no es sustancialmente modificada mediante el proceso de extraccin cido y como resultado se obtiene una gelatina con un punto isoelctrico relativamente alto (Ward y Courts, 1977). La gelatina posee propiedades caractersticas, por ejemplo, forma una solucin de elevada viscosidad en agua y produce un gel cuando esta solucin se enfra. Asimismo, como se mencion anteriormente en el Captulo 2, estas macromolculas en solucin se comportan como polianfolitos debido a la composicin de aminocidos bsicos y cidos (Dobrynin et al., 2004). En general, el estado conformacional de las cadenas de gelatina es altamente dependiente del medio fisicoqumico en el que se encuentran disueltas, teniendo en cuenta que estas molculas tienden a estabilizarse mediante diferentes tipos de fuerzas inter e intra-moleculares, en las que intervienen

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Captulo 3

principalmente los enlaces del tipo puente-hidrgeno, (ver, por ejemplo, Pezron et al., 1991; Herning et al., 1991; Djabourov et al., 1993; Bohidar y Jena, 1994; Bohidar, 1998; Tromp et al., 2002).

3.4 Aplicaciones de la gelatina

En el presente existe una amplia variedad de hidropolmeros que se utilizan en diferentes formulaciones dentro del mbito de la industria alimenticia y farmacutica. Ejemplos tpicos de esto son los distintos polisacridos y la gelatina. Por tal motivo, es importante resaltar en esta tesis la relevancia del uso de esta ltima. La lista de aplicaciones de la gelatina es muy grande y hasta el presente siguen apareciendo nuevos usos. Entre ellos se puede observar que, la gelatina se utiliza como conservante, agregndose en forma seca a productos de carnes enlatadas; el ejemplo ms comn es el jamn embutido. De este modo, la gelatina se disuelve en la conserva y forma un gel con los jugos exudados de la carne (ver Hoffman, 1991). Asimismo, la gelatina se usa normalmente como agente gelificante en alimentos elaborados con carnes, en alimentos enlatados y en sopas y caldos de los mismos. Adems, se utiliza en embutidos como jamn, lengua y otras carnes rojas. Tambin se aplica a pollos y pescados congelados para absorber el jugo de la carne. En estos ltimos casos tambin acta como conservante (Poppe, 1999). Para cada producto, se recomienda que la gelatina tenga un grado de bloom (ver Seccin 3.7) y una concentracin tpica. Tambin se usan mezclas de gelatina, glicerina y cido benzoico como preservante y antioxidante en

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Captulo 3

recubrimientos no comestibles de alimentos. Estos recubrimientos son adecuados para productos como jamn, tocino, embutidos y quesos (Poppe, 1999). La gelatina se utiliza para hacer mermeladas sin azcar debido a la alta capacidad que posee de ligar agua. Asimismo, soluciones con grandes cantidades de azcar, con una concentracin de gelatina entre 2 a 3% y 18 a 20% de agua se utilizan en la produccin de golosinas como bombones y piezas dulces con formas bien definidas. La forma final de estos productos se obtiene mediante: (a) cortes a partir de planchas del gel formado, (b) moldes de almidn donde se vierte la solucin o (c) extrudado. Soluciones de gelatina con ingredientes adicionales se utilizan en la fabricacin de turrones y caramelos masticables. Algunos postres comunes tambin se fabrican con gelatina y agregados de leche, huevo y cacao tales como mousse, soufl y merengue (Poppe, 1999). No obstante, se debe sealar que algunas frutas como el anan y la papaya contienen enzimas proteolticas como la bromelana, la cual hidroliza la gelatina y destruye su capacidad gelificante. En estos casos, resulta esencial cocer las frutas antes de mezclarlas con las soluciones de gelatina de manera de destruir trmicamente la proteasa (Ward y Courts, 1977). La gelatina tambin se utiliza como agente estabilizante y una de las aplicaciones tpicas es la fabricacin de helados. En este producto la solucin de gelatina inhibe el crecimiento de la cristalizacin y la formacin de diferentes fases cuando el helado se congela, previniendo la formacin de cristales gruesos de hielo. Adems, la gelatina provee una textura adecuada al paladar

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Captulo 3

(Ward y Courts, 1977). Tambin se usa como estabilizante y para reducir la sinresis en el yogurt y en postres con leche (Poppe, 1999). Asimismo, se puede citar la propiedad emulsificante de la gelatina en el contexto de la industria alimenticia. En efecto, se utiliza en la fabricacin de algunos pastas de carnes y en las denominadas sopa - cremas. Asimismo, las propiedades adhesivas y de agente de compactacin de la gelatina se aprovechan para la fabricacin de productos de repostera como cremas y recubrimientos de tortas (Poppe, 1999). La gelatina es un eficiente estabilizante de espumas y, por lo tanto, esta propiedad se explota en la fabricacin de distintos productos de repostera. Es tambin un excelente clarificante debido a que reacciona con los polifenoles (taninos) y con otras protenas de los jugos de fruta y vinos, formando un precipitado que deja un sobrenadante lmpido y estable en el tiempo (Ward y Courts, 1977). La gelatina tambin se utiliza en el desarrollo de emulsiones fotogrficas y aunque ltimamente se han descubierto muchos polmeros sintticos, para esta funcin sta sigue siendo el principal agente de unin de las pelculas y papeles fotogrficos. El proceso fotogrfico hace uso de muchas propiedades fsicas de la gelatina tales como la gelificacin, la solvatacin y la capacidad de formacin de pelculas delgadas. Para elegir el tipo de gelatina que se utiliza en fotografa se tiene en cuenta principalmente el efecto fotogrfico indeseado que produce el contenido de impurezas en la muestra (Poppe, 1999). Adems de las industrias fotogrfica y alimenticia, la industria farmacutica hace un intensivo uso de la gelatina. En efecto, esta industria utiliza aproximadamente el 10% del total de la produccin de gelatina y la

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Captulo 3

mayor parte se destina a la fabricacin de cpsulas. En la actualidad, la elaboracin de cpsulas se realiza en gran escala por medio de moldes que permiten incluir la cantidad exacta de cualquier medicamento. Las cpsulas se llenan higinicamente y no tienen inclusiones de aire; se evita as la oxidacin. Estas caractersticas son importantes en el encapsulado de vitaminas que pueden ser conservadas en forma estable por varios aos (Ward y Courts, 1977; Poppe, 1999). Por otra parte, la gelatina acta como agente de unin en la produccin de comprimidos y pastillas. Para este fin, los componentes del medicamento se disuelven en soluciones de gelatina, luego se seca la mezcla y a continuacin se muele hasta obtener un polvo con el que se elaboran los comprimidos. En algunos casos se realiza un recubrimiento de los comprimidos con gelatina para la proteccin de los componentes que contiene. La gelatina se utiliza como adhesivo con agregados de medicamentos, xido de zinc, glicerol y agua en muchos vendajes de proteccin. Adems, se fabrican esponjas a partir de hidrogeles estriles de gelatina que se hacen insolubles mediante un tratamiento con aldehdos o mediante tratamiento enzimtico (Bigi et al., 1998; Bigi et al., 2001; Crescenzi et al., 2003). Estas esponjas se confeccionan de varios tamaos y grados de flexibilidad y se utilizan en cirugas substituyendo tejidos. Luego, las enzimas proteolticas digieren el material que posteriormente es reabsorbido completamente. Estos hidrogeles tambin se utilizan como sistemas para liberacin controlada de drogas. Para una liberacin controlada local, se utilizan como sistemas de implantacin y para la liberacin controlada generalizada se utilizan en forma de microesferas inyectables (Tabata e Ikada, 1998; Tabata et al., 1998; Bigi et

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Captulo 3

al., 1998; Bigi et al., 2001; Chiellini et al., 2001; Einerson et al., 2002; Crescenzi et al., 2003; Bigi et al., 2004; Pannier et al., 2004).

3.5 Propiedad gelificante de las soluciones de gelatina

Como se mencion anteriormente, una de las propiedades ms conocidas de la gelatina es la capacidad que posee este producto de formar geles. Los geles de gelatina existen en un pequeo rango de temperatura y las propiedades mecnicas son muy sensibles a las variaciones trmicas, y aun a una temperatura constante dependen del tiempo y de la historia trmica previa (Ward y Courts, 1977; Joly-Duhamel et al., 2002b; van den Bosch y Gielens, 2003). En efecto, las soluciones de gelatina son lquidas para temperaturas relativamente altas pero en la medida que la temperatura desciende por debajo de cierto valor crtico, se producen cambios que transforman ese lquido en un gel, si la concentracin es mayor a C 1% p/v (Bohidar y Jena, 1993; RossMurphy, 1997; Tosh et al., 2003). El fenmeno denominado gelificacin involucra un nmero de eventos, los cuales tienen sus propias caractersticas distintivas. En efecto, cuando la solucin se enfra se produce la agregacin parcial de molculas de gelatina. Este fenmeno tiene lugar an si la solucin es tan diluida como para no formar gel (Bohidar y Jena, 1993). Luego, los agregados se unen formando una red dbil y si se contina enfriando o se mantiene la temperatura constante se forma un gel cuyo mdulo elstico se incrementa continuamente (Ledward, 1986; Ross-Murphy, 1992; te Nijenhuis, 1997). Durante este ltimo perodo, se desarrollan diferentes estructuras de acuerdo a la historia trmica utilizada, a

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Captulo 3

travs de la continua reformacin (annealing) de las uniones en la red (Ferry, 1948; Djabourov y Papon, 1983; Clark y Ross-Murphy, 1987; Djabourov et al. 1988; te Nijenhuis, 1997). El cambio microestructural que lleva a la produccin de esa red tridimensional es la reformacin parcial de la estructura tropocolagnica original donde las zonas de unin entre las cadenas de gelatina se producen mediante la generacin de estructuras de triple hlice, formndose una extensa red cooperativa de enlaces del tipo puente-hidrgeno que estabiliza esta estructura (Ledward, 1986; Djabourov et al., 1993; te Nijenhuis, 1997; Ross-Murphy, 1997). Las condiciones de maduracin de los geles de gelatina afectan las propiedades mecnicas, como por ejemplo los mdulos dinmicos, G' y G' ' (Carvalho y Djabourov, 1997; Ross-Murphy, 1997; Joly-Duhamel et al., 2002b; Ottone et al., 2005; Ottone y Deiber, 2005). En este sentido, Ferry (1948) realiz mediciones del mdulo dinmico durante el tiempo de maduracin y hall un marcado crecimiento al principio, seguido de un crecimiento adicional progresivamente ms suave. Estos resultados fueron corroborados

posteriormente por otros autores (ver, por ejemplo Djabourov et al., 1985, 1993; te Nijenhuis, 1997; Ross-Murphy, 1997; Normand, 2000). El mdulo elstico tambin vara con el pH y con la presencia de electrolitos en el gel (Ward y Courts, 1977; Ledward, 1986; Haug et al., 2004). Asimismo, la adicin de agentes que inhiben la formacin de este tipo de enlace, tales como la rea, el tiocianato de potasio (KSCN) y el bromuro de litio (LiBr) tambin debilitan la red y pueden ser considerados equivalentes a un aumento de temperatura (Ledward, 1986).

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Captulo 3

3.6 Propiedades pticas de las soluciones de gelatina

Debido a que muchos estudios referidos a la cintica de regeneracin parcial de la triple hlice de soluciones de gelatina se realizaron mediante medidas de la rotacin ptica especfica (ver Captulo 4), en este punto se realiza una breve descripcin las caractersticas microestructurales que provocan cambios en la rotacin ptica especfica de soluciones de gelatina maduradas a distintas concentraciones cuando la temperatura es inferior a la temperatura de gelificacin. La rotacin ptica especfica [ ] para una dada longitud de onda se especifica de la siguiente manera (Djabourov y Papn, 1983),

[ ]

Cl

(3.6.1)

donde es el ngulo de rotacin ptica en grados, C es la concentracin en g 100 cm-3 y l es el paso ptico de la celda en dm. Cuando en una muestra de gelatina se produce la regeneracin parcial de la estructura tropocolagnica, la rotacin ptica de esa muestra cambia debido a que es sensible a la presencia de la triple hlice dextrgira. Usualmente, se admite que el colgeno en su estructura nativa se encuentra en un estado de 100% helicoidal con una rotacin ptica especfica

[ ]589 nm = 400 20 .

Por otro lado, para el colgeno completamente

desnaturalizado o para una solucin de gelatina a altas temperaturas se obtiene una rotacin ptica especfica [ ]589 nm = 120 5 . Por consiguiente,

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Captulo 3

es posible establecer la fraccin de cadenas en la conformacin de hlices mediante la siguiente expresin,

medida izada [ ] [ ]desnatural % hlice izada [ ]100 [ ]desnatural

(3.6.2)

izada es la rotacin ptica especfica medida, [ ] desnatural es la donde [ ]medida

rotacin

ptica

especfica

de

una

muestra

de

gelatina

totalmente

% hlice desnaturalizada (por ejemplo a T > 50C ) y [ ]100 es la rotacin ptica

especfica de una solucin de colgeno, es decir, una muestra con un contenido de 100% de hlices (Djabourov y Papn, 1983). Cuando se produce la gelificacin de una muestra de gelatina se observa un rpido crecimiento de la fraccin de hlices . Luego, a medida que transcurre el tiempo,

disminuye gradualmente la velocidad de

crecimiento pero nunca toma un valor constante (Djabourov y Papn, 1983; Djabourov et al., 1985; Djabourov et al., 1993; Joly-Duhamel et al., 2002a). En este sentido, Djabourov y Papn (1983) describen el proceso de gelificacin para tiempos cortos de maduracin mediante la ecuacin cintica de Avrami,

= 1 e kt

(3.5.3)

donde k es la constante de velocidad, t es el tiempo de maduracin y n es el exponente de Avrami.

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Captulo 3

3.7 Mtodos de anlisis de uso industrial para medir las propiedades mecnicas de la gelatina

Una de las tcnicas ms utilizadas a nivel industrial para estandarizar muestras de gelatina es la fuerza de gel o ensayo de bloom . Este ensayo de laboratorio, consiste en medir la fuerza en g necesaria para producir una depresin de 4 mm de profundidad en un gel con un pistn de 12.7 mm de dimetro. Dicho gel tiene un tiempo de maduracin de 18 horas a 10 C y una concentracin de 6,66 % p/p. Adems, la viscosidad estndar es otro parmetro que usa la industria para caracterizar a sus productos. Este mtodo consiste en medir la viscosidad en mPs de una solucin de gelatina estndar (al 6,66 % p/v) a 60C (Ward y Courts, 1977). Los parmetros antes mencionados resultan tiles para una clasificacin grosera de las gelatinas, sin embargo, sus valores no pueden globalizar todos los comportamientos reolgicos y fisicoqumicos asociados a los diferentes tipos de gelatina que se producen en los distintos procesos. Es claro que estos ensayos normalizados y en cierto sentido muy prcticos, no necesariamente se encuadran en los ensayos reomtricos para estandarizar materiales (Deiber, 2002). En la actualidad existe un alto consenso en la prctica de la ingeniera que indica que la medida emprica de bloom no es un valor suficientemente representativo y adecuado, tanto del poder gelificante como de la calidad de las otras propiedades funcionales de las gelatinas producidas para diferentes usos industriales. Por consiguiente, aparte de la medicin del bloom se requiere aplicar tcnicas reolgicas y fisicoqumicas modernas en la caracterizacin de

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Captulo 3

gelatinas para lograr productos de alta calidad y con capacidad de captacin de mercados nacionales e internacionales, donde los factores de competitividad tienen como punto de referencia la excelencia, aparte de la produccin eficiente (Deiber, 2002). En un contexto ms amplio, la caracterizacin reolgica - reomtrica de una solucin de gelatina implica evaluar en principio las propiedades viscoelsticas lineales
G ( , t m )

y G ( , t m ) y la viscosidad aparente

( pH , I,&,C%,T , t m ) en funcin de los siguientes parmetros: frecuencia ,


velocidad de corte & , tiempo de maduracin t m , temperatura T , concentracin
C y pH

como variables significativas, en el contexto de los modelos

reolgicos, cuyas funciones reomtricas son a su vez funciones de la distribucin de pesos moleculares ( MWD ) (Deiber, 2002). En este sentido, apuntando a las necesidades actuales mencionadas, en esta tesis se obtiene la MWD de una muestra de gelatina haciendo uso de la tcnica de electroforesis en gel de poliacrilamida seguida de una densitometra y anlisis computacional (ver Captulo 5). Asimismo, se realiza un estudio detallado del comportamiento de soluciones diluidas (ver Captulos 7, 8 y 9) y concentradas de gelatina (ver Capitulo 9) y se evalan los diferentes comportamientos de las mismas al ser expuestas a distintas condiciones fisicoqumicas.

3.8 Estabilidad y seguridad de la gelatina

La gelatina se considera como un ingrediente alimenticio ms que como un aditivo y es un producto GRAS (Generally Regarded as Safe) y puede ser

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Captulo 3

traducido como producto generalmente considerado seguro. En 1993 la FDA (Food and Drug Administration) reiter el estatus de GRAS de la gelatina y estableci que no haba objecin en el uso de la misma proveniente de ninguna fuente y de ningn pas. Sin embargo, con el advenimiento de la Encefalopata Espongiforme Bovina (BSE) en Europa se desarroll temor por la transmisin de la enfermedad a humanos por parte de los productos bovinos. Actualmente se reconoce que la BSE es un problema neurolgico y cerebral y que no est asociado con el cuero o piel del animal. Adems, se reconoce que el proceso de manufactura de gelatina hace casi imposible la supervivencia del prion si este estuviera presente. Por lo tanto, la gelatina conserva todava su estatus de sustancia GRAS. La gelatina es un excelente medio de crecimiento para la mayora de las bacterias, por lo tanto se debe tener especial cuidado durante la manufactura para evitar contaminaciones (Ward y Courts, 1977). Estos cuidados se pueden evidenciar en los programas documentados de HACCP (Hazard Analysis and

Critical Control Points) utilizados por los fabricantes de todo el mundo.


Asimismo, para asegurar la reproducibilidad del producto la mayora de las compaas han implementado recientemente los sistemas de gestin de calidad ISO 9000. La gelatina seca posee una vida til aproximadamente infinita, siempre y cuando la temperatura de almacenamiento se encuentre por debajo de la temperatura de transicin vtrea, la cual es de aproximadamente 190C (Ward y Courts, 1977). En cuanto a la estabilidad de las soluciones de gelatina, esta depende de la temperatura y del pH. Generalmente, para minimizar la prdida de la fuerza de gel y de viscosidad en el tiempo, el pH de las soluciones

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Captulo 3

debera encontrarse en un rango de 5 a 7 mientras que la temperatura debera ser lo mas baja posible. Usualmente la degradacin o hidrlisis es causada por la proliferacin microbiana, por lo tanto las soluciones de gelatina no deben ser almacenadas durante tiempos ms prolongados a los estrictamente necesarios (Ward y Courts, 1977).

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Captulo 3

3.9 Bibliografa

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Captulo 3

Te Nijenhuis, K. (1997). Gelatin thermoreversible networks. Viscoelastic properties and structure of gels. In: Duek K. (Ed.). Advances in Polym. Sci. (Vol. 130) (pp.1-267). New York: Springer. Tosh, S. M.; Marangoni, A. G.; Hallett, F. R. y Britt, J. I. (2003). Aging dynamics in gelatin gel microstructure. Food Hydrocolloids, 17(4), 503-513. Tromp, R.; ten Grotenhuis, E. y Olieman, C. (2002). Self-aggregation of gelatin above the gelling temperature analyzed by SEC-MALLS. Food Hydrocolloids, 16, 235-239. Van den Bosh, E. Y Gielens, C. (2003). Gelatin degradation at elevated temperature. Int. J. Biol. Macromol, 32, 129-138. Ward, A. G. y Courts, A. (1977). The Science and Technology of Gelatin. London: Academic Press.

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Captulo 4

Caractersticas microestructurales que presentan las soluciones de gelatina

Captulo 4

Caractersticas microestructurales que presentan las soluciones de

gelatina

4.1 Introduccin

Las soluciones de gelatina han sido ampliamente estudiadas durante los ltimos aos. Por consiguiente, es posible encontrar en la literatura diversos estudios reolgicos y fisicoqumicos que conciernen al comportamiento de estas soluciones para diferentes valores de concentracin C , temperatura T , fuerza inica I , pH y formulaciones de solvente. En efecto, la caracterizacin de soluciones de gelatina en los diversos rangos o zonas de concentracin y temperatura condujo a la interpretacin de fenmenos especficos presentes en cada una de ellas. En este contexto de anlisis, el principal objetivo de este captulo (ver tambin Olivares et al., 2006) es brindar un marco conceptual que permita visualizar la variedad de comportamientos reolgicos y fisicoqumicos que presentan las soluciones de gelatina, los cuales son causados por fenmenos microestructurales especficos de las diferentes zonas de concentracin y temperatura mencionadas arriba. Al mismo tiempo, se pretende ubicar en este contexto de anlisis los estudios realizados en la presente tesis. Por ello se realiza, a continuacin, una discusin tomando como base la revisin bibliogrfica de los principales trabajos donde se estudian las soluciones de gelatina.

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Captulo 4

4.2 Anlisis de las soluciones de gelatina en las diferentes zonas de concentracin y temperatura

Una de las zonas estudiadas con mayor frecuencia es aquella donde se produce la gelificacin. Este fenmeno ocurre a un determinado tiempo de maduracin t m cuando la concentracin de gelatina supera la concentracin crtica de gelificacin C g 10-2 g/cm3 y cuando la temperatura de maduracin es inferior a la temperatura de gelificacin Tg , por encima de la cual el gel no se forma (ver zona I en Figura 4.2.1). Asimismo, la temperatura de gelificacin es una funcin de la concentracin C (ver, por ejemplo, Bohidar y Jena, 1993; te Nijenhuis, 1997); de esta manera, una funcin Tg (C ) existe para C > C g con
* una temperatura crtica Tg C g . A los fines de definir las diferentes zonas de
* concentracin y temperatura se usan como gua Tg y Tg Cg

( )

( )

sin introducir

consideraciones adicionales que involucren, por ejemplo, la temperatura de transicin Tch desde la conformacin de cadena errtica a hlice o la temperatura de fusin Tmelt (transicin sol-gel) (ver, por ejemplo, Joly-Duhamel et al., 2002a y 2002b para el anlisis de estos parmetros cuando se utilizan distintas fuentes de gelatina). Actualmente, en la literatura se encuentran revisiones detalladas y trabajos especficos que consideran fundamentalmente la zona de gel (ver, por ejemplo, Ledward, 1986; Clark y Ross-Murphy, 1987; te Nijenhuis, 1997; RossMurphy, 1997; Djabourov y Papn 1983; Djabourov et al.; 1985, 1988 y 1993; Tosh et al., 2003). En este sentido, las caractersticas ms relevantes de los geles de gelatina fueron revisadas en forma breve en el Captulo 3.

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Captulo 4

Cuando la temperatura es superior a Tg y C > Cg , las soluciones de gelatina se encuentran en una zona de redes o entaglements (ver, por ejemplo, Pezron et al., 1991 y Herning et al., 1991 quienes estudian soluciones semidiluidas de gelatina a 50C mediante tcnicas de dispersin de luz). Una de las conclusiones ms relevantes de esta zona es que las soluciones muestran movimientos colectivos y presentan dos modos de difusin dinmicos como fenmenos especficos: un modo rpido debido a la difusin cooperativa de redes transitorias de cadenas de gelatina y un modo lento, el cual estara asociado a la difusin de pequeos grupos de cadenas con radio hidrodinmico constante, tambin llamados clusters (ver zona II en Figura 4.2.1). Bohidar y Jena (1993) realizaron un estudio de soluciones de gelatina (la concentracin de gelatina utilizada fue de 4 % (p/p)) abarcando las dos zonas de concentracin y temperatura antes mencionadas (es decir, la zona de

T < Tg y C > Cg y la zona de T > Tg y C > Cg ) mediante calorimetra


diferencial de barrido (DSC) y tcnicas de dispersin de luz. En este trabajo los autores proponen la existencia de cuatro dominios en diagramas de temperatura versus concentracin. En el dominio de temperaturas ms elevadas, y especficamente cuando sta disminuye desde 60 a 50C, los autores modelan a las soluciones de gelatina con una cintica de agregacin de Smoluchowski. En este caso, no se concluye acerca de cules son las fuerzas responsables de la agregacin. Cuando la temperatura disminuye an ms, se concluye que las soluciones de gelatina presentaran una transicin de fase conformacional que implicara la formacin de hlices simples en los agregados formados previamente a mayores temperaturas formados por cadenas en conformacin errtica (random coils). Descendiendo an ms la

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Captulo 4

temperatura, los autores concluyen que las soluciones entran en el dominio del gel, el cual se formara mediante la generacin de triples hlices interconectadas por segmentos de cadenas errticas.
* Otra de las zonas estudiadas es aquella en la cual C < Cg y T > Tg

donde tambin se evidencia la formacin de clusters (ver zona III en Figura 4.2.1). En tal sentido, se encuentran importantes trabajos referentes a este tema donde las soluciones de gelatina son evaluadas mediante tcnicas de dispersin de luz (ver, por ejemplo, Pezron et al., 1991; Herning et al., 1991). Mediante estos estudios, se obtuvo que el modelo de worm-like es apropiado para representar a las cadenas de gelatina en solucin a elevadas temperaturas (50C) que poseeran una longitud de persistencia de 20 . Tambin se encontr que la adicin del surfactante duodecyl sulfato de sodio (SDS) remueve la formacin de los clusters, los cuales probablemente se estabilizan en esta zona ( C < Cg
* y T > Tg ) por interacciones del tipo

hidrofbicas entre residuos no polares de las cadenas de gelatina. Asimismo, Bohidar y Jena (1994) y Bohidar (1998) estudiaron las soluciones diluidas de gelatina en solventes neutros sin agregado de sales y en un rango de temperatura comprendido entre 30C y 60C mediante las tcnicas de dispersin de luz y viscosidad intrnseca [ ] . Los autores observaron que el radio de giracin s , el peso molecular promediado en fracciones msicas M w y la viscosidad intrnseca [ ] fueron mayores a medida que la temperatura disminua, debido a la agregacin de las cadenas de gelatina. A los fines de explicar el anlisis terico realizado, los autores concluyen que las soluciones de gelatina estudiadas en este rango de temperatura no slo presentan

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Captulo 4

cadenas en la conformacin del tipo errtica sino que tambin existen sectores con estructuras de helicoidales. Otro estudio relevante realizado en esta zona fue presentado por Tromp et al. (2002) para C 2 10-3 g/cm3, en donde se analiza la distribucin de la masa molar de gelatina de cerdo mediante cromatografa de exclusin molecular combinada con las tcnicas de dispersin de luz, ndice de refraccin y rotacin ptica. Se observaron cambios en la distribucin de la masa molar a
* temperaturas por encima de la temperatura crtica Tg . La distribucin de pesos

moleculares muestra la existencia de una agregacin reversible de las cadenas de gelatina cuando la temperatura decrece de 80 a 40C. En este sentido, se reporta que se produce una interaccin entre pares de cadenas las cuales pueden llevarse a cabo por diferentes mecanismos; por ejemplo, dos reas hidrofbicas atradas entre s pueden unir localmente a dos cadenas de gelatina con una energa del orden de k BT . En este trabajo los autores concluyen que en el rango de concentracin y temperatura determinado por
* C < C g y T > Tg las cadenas de gelatina no interaccionan mediante la

formacin de zonas de triples hlices debido a que no se registraron cambios en la rotacin ptica de estas soluciones. Las ltimas conclusiones se oponen a lo reportado por Bohidar y Jena (1994) y Bohidar (1998) quienes, como se expres ms arriba, proponen la presencia de zonas de triples hlices . Es claro que, tanto en esta zona como en la zona analizada previamente se arriba a conclusiones relevantes, muchas de ellas bien comprendidas y validadas por distintos autores mientras que otras todava se encuentran bajo anlisis.

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Captulo 4

Se puede definir una cuarta zona que comprende el rango de


* concentracin Cc < C < C g y temperatura T < Tg (ver zona IV en Figura 4.2.1).

A estas temperaturas, en principio, la transicin conformacional de cadena


* < Tch aleatoria a hlice de poliprolina es posible, teniendo en cuenta que Tg

(Harrington y Rao, 1970; Bohidar y Jena, 1993). Aqu, Cc 10-4 g/cm3 define el lmite por debajo del cual la regeneracin de la estructura de triple hlice es intramolecular en el estado ultra-diluido. En estas zonas, Harrington y von Hippel (1961), Harrington y Rao (1970) y Harrington y Karr (1970) estudiaron la cintica de regeneracin de la triple hlice de cadenas de gelatina. ste es un mecanismo que consiste en tres procesos simultneos de nucleacin, crecimiento y estabilizacin (annealing) de la triple hlice. De estos trabajos se concluye que, dependiendo principalmente de la concentracin y la temperatura, el proceso de maduracin de las soluciones de gelatina puede generar diferentes estructuras macromoleculares, las cuales son el resultado de la reversin del estado conformacional desordenado a la estructura de triple hlice (ver tambin, Busnel et al., 1989; Benguigui et al., 1991). En este sentido, durante el proceso de maduracin, las cadenas de gelatina en solucin experimentan una transicin del estado desordenado aleatorio a la

conformacin de poli-L-prolina (ver Captulo 3) en algunas porciones de la molcula, las cuales se estabilizan mediante la agregacin intermolecular formando zonas de triple hlice. Horsk y Svantner (1993) evaluaron soluciones diluidas de gelatina mediante la medicin de la viscosidad reducida a diferentes tiempos de maduracin en un rango de temperatura comprendido entre 5 y 30C. Los autores observaron que la viscosidad reducida aumenta con el tiempo de maduracin, y que este efecto es mayor cuanto menor es la 78

Captulo 4

temperatura a la que estas soluciones se maduran. Tambin, es interesante mencionar que la adicin de tiocianato de potasio (KSCN) en una concentracin de 500 mM logr inhibir la agregacin parcialmente, indicando esto que en este rango de concentracin y temperatura los agregados formados estaran compuestos por zonas de unin de triples hlices estabilizadas por interacciones del tipo puente-hidrgeno.
* Existe una zona ultra-diluida para C < Cc 10-4 g/cm3 y T < Tg donde la

regeneracin de la triple hlice sera intramolecular (Boedker y Doty, 1954; Harrington y Rao, 1970; Busnel et al., 1989) (ver zona V en Figura 4.2.1). Asimismo, este plegamiento intramolecular sera ms ordenado cuando la
* temperatura de maduracin Tm se acerca a Tg favoreciendo la formacin de

estructuras con conformacin de varillas rgidas (Harrington y Rao, 1970). Con el fin de esquematizar los conceptos revisados en esta seccin, la Figura 4.2.1 especifica las estructuras y fenomenologas que experimentan las soluciones de gelatina en las distintas zonas de concentracin y temperatura analizadas. Luego del anlisis realizado, queda claro que la concentracin y temperatura seleccionadas para la formulacin y maduracin de soluciones de gelatina condiciona fuertemente la microestructura formada. Adems, estos cambios microestructurales provocan comportamientos fisicoqumicos y reolgicos diferentes que se deben considerar en los procesos y productos tecnolgicos donde se utiliza la gelatina.

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Captulo 4

Cadenas errticas

Agregacin mediante interacciones hidrofbicas

Redes

Zona II

Zona III

* Tg

Hlices Intramoleculares

Agregacin mediante hlices Intermoleculares

Geles

Zona V

Zona IV

Zona I

Cc

Cg

Figura 4.2.1 Esquema donde se indican las estructuras y fenomenologas que experimentan las soluciones de gelatina en las diferentes zonas de concentracin y temperatura.

4.3 Cintica de regeneracin de la triple hlice de gelatina

Dentro de este amplio contexto fenomenolgico descripto en la Seccin 4.2, el mecanismo cintico de regeneracin de la triple hlice fue estudiado principalmente en las zonas comprendidas entre C > Cc y T < Tg , teniendo en cuenta que la regeneracin intramolecular sera de primer orden. Por lo tanto, la mayora de los autores concluyen que, en general, el mecanismo es de segundo orden para estos rangos de concentracin y temperatura a intervalos de tiempos de maduracin cortos e intermedios. Asimismo, se propone que un

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Captulo 4

mecanismo posible es aquel en el cual una cadena en la conformacin de poliL-prolina (ver Captulo 3) se pliega sobre s misma (hairpin folding) y a su vez, interacta con otra cadena en la misma conformacin de poli-L-prolina estabilizndose mediante la formacin de una zona de unin o ncleo de triple hlice (Busnel et al., 1989; Benguigui et al., 1991; Ross-Murphy, 1992; te Nijenhuis, 1997; Normand et al., 2000). No obstante, los ncleos de triple hlice formados mediante la agregacin de tres cadenas diferentes no puede ser excluido y, por consiguiente, tambin sera posible encontrar un orden cintico mayor a 2 (te Nijenhuis, 1997). En este sentido, Busnel et al. (1989) reportaron que para un rango de concentracin de C = 10-3 a 10-2 g/cm3 el orden cintico es de 2.2 indicando que el proceso es mayormente bimolecular. Por su parte, Benguigui et al. (1991) estudiaron el mecanismo de maduracin de una solucin de gelatina de 2 10-3 g/cm3 mediante digestin enzimtica. Los autores encontraron que las zonas de unin eran ms resistentes al ataque enzimtico que las regiones donde las cadenas se encontraban en la configuracin desordenada y que, adems, el mecanismo cintico de formacin de la estructura de triple hlice ms probable es el bimolecular donde una de las cadenas se encontrara plegada sobre s misma (hairpin folding). Djabourov y Papn (1983) y Djabourov et al. (1985) obtuvieron una expresin cintica para un amplio tiempo de maduracin y a travs del anlisis de la misma los autores concluyen que la cantidad de hlices formadas muestran una evolucin en el tiempo que comprende dos procesos: el primero, obedece a la ecuacin de Avrami y el segundo, para tiempos de maduracin ms prolongados, presenta una dependencia logartmica con el tiempo. Ms recientemente, Tosh et al. (2003) estudiaron el desarrollo y evolucin de la estructura de geles de gelatina

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Captulo 4

durante el proceso de gelificacin y observaron dos regiones donde el mdulo de almacenamiento en funcin del tiempo obedece a leyes del tipo potencial: una, donde gobierna el proceso de agregacin y otra, en la cual es predominante el ordenamiento de las zonas de unin previamente formadas. Es claro que las zonas de unin aumentan su longitud debido al proceso de crecimiento de los sitios de triple hlices formados durante la nucleacin y que esta estructura de red es susceptible a un ordenamiento (annealing) el cual se manifiesta, por ejemplo, mediante un pequeo crecimiento en el tiempo del mdulo de almacenamiento (Ross-Murphy, 1997). Asimismo, la diferencia entre la temperatura de maduracin Tm y la temperatura de gelificacin Tg para una dada concentracin controla la microestructura que se forma durante el proceso de transicin de estado aleatorio desordenado al nuevo estado ordenado. En consecuencia, cuando la temperatura de maduracin es cercana
* a Tg el proceso de crecimiento y el de ordenamiento se veran favorecidos

frente al proceso de nucleacin (Harrington y Rao, 1970). Guo et al. (2003) tambin estudiaron la reversin al estado de estructura de triple hlice en soluciones acuosas mediante medidas de rotacin ptica para cortos tiempos de maduracin ( t m 0.08 horas). Los resultados de estos autores mostraron que el proceso cintico de reversin era predominantemente de segundo orden para C 0.12 g/cm3 y 5 T 20 C aunque un pequeo corrimiento en la velocidad inicial de la rotacin ptica en funcin de la concentracin indica tambin la presencia de un mecanismo de primer orden. Actualmente, existe un amplio consenso en los grupos de investigacin de que el orden cintico de reaccin depende de la concentracin de gelatina y de los rangos de tiempo y temperatura de maduracin. En este sentido, en la

82

Captulo 4

Figura 4.3.1 se esquematizan los diversos mecanismos de regeneracin de la triple hlice tropocolagnica propuestos para los diferentes casos discutidos arriba.

* Tm Tg

C < Cc

Plegamiento triple
* Tm << Tg

Triple hlice intramolecular ordenada en forma de varilla rgida

Cadena aleatoria

Triple hlice intramolecular desordenada C > Cc Plegamiento doble Cc < C < Cg

C > Cg T Tg T << Tg Hlice simple

agregacin (ms probable) Agregado

Tropocolgeno (tiempo infinito)

Cc < C < Cg agregacin (menos probable) Gel

Figura 4.3.1 Esquema de los diversos mecanismos de regeneracin de la triple hlice tropocolagnica propuestos para los diferentes rangos de concentracin y temperatura de maduracin. 4.4 Conclusiones

A partir de la revisin bibliogrfica realizada, resulta relevante remarcar que el proceso de nucleacin es, en principio, un mecanismo de interaccin entre pares de cadenas. El mismo es susceptible a ser interpretado durante los

83

Captulo 4

primeros estadios de agregacin mediante la teora cintica de Smoluchowski y cualquier desviacin experimental de este contexto terico puede introducir informacin adicional que concierne al mecanismo de agregacin. Asimismo, del anlisis de la literatura pertinente se concluye que las cinco zonas que se han descripto aqu a travs de regmenes de concentracin y temperatura, fueron estudiadas mediante diferentes herramientas tericas y tcnicas experimentales. Mientras que la mayora de estos estudios se focalizan en la zona donde se producen los geles (es decir, para C > Cg y

T <T g ), las fenomenologas que se producen en las zonas diluidas y ultradiluidas han sido menos estudiadas hasta la actualidad. En tal sentido, en esta tesis se estudian las soluciones de gelatina en la zona diluida (es decir para
* Cc < C < C g ) y ultra-diluida a temperaturas de maduracin inferiores a Tg .

84

Captulo 4

4.5 Bibliografa

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Captulo 4

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88

Obtencin de la MWD de gelatina mediante Captulo 5 electroforesis en gel de poliacrilamida

Captulo 5

Obtencin de la MWD de gelatina mediante electroforesis en gel de

poliacrilamida

5.1 Introduccin

Como se mencion en el Captulo 3, una de las caractersticas microestructurales relevantes para la formulacin de productos a base de gelatina es la distribucin de pesos moleculares MWD de la mezcla polimrica obtenida luego del proceso de extraccin y los promedios en fracciones molares M n y fracciones msicas MW . Dentro de las tcnicas utilizadas para la determinacin de la MWD de una mezcla polimrica de naturaleza proteica se pueden mencionar a la cromatografa de tamiz molecular o GPC (Bettelheim, 1971; Benguigui et al., 1991; Tromp et al., 2002; Meyer y Morgenstern, 2003; Haug et al., 2004) y a la electroforesis en geles de poliacrilamida con agregado del surfactante duodecil sulfato de sodio (PAGESDS) (ver, por ejemplo, Mizuta et al., 2002a; Mizuta et al., 2002b; Tosh et al., 2003; Fernandez-Daz et al., 2003; Chang et al., 2000). En esta tesis se realiz la determinacin de la funcin densidad de distribucin de pesos moleculares fw (M ) de la muestra de gelatina comercial que se us en el programa experimental detallado en los Captulos 7, 8 y 9 mediante PAGE-SDS y densitometra computacional de los electroferogramas obtenidos. En este sentido, los conceptos generales asociados a la fw (M ) y a los pesos moleculares M n y M w se presentaron en el Captulo 2. A continuacin se realiza una descripcin detallada de la tcnica de PAGE-SDS usada y adaptada en esta tesis. En particular se hace nfasis en 89

Captulo 5

los fundamentos fisicoqumicos que hacen posible la separacin, identificacin y cuantificacin de los fragmentos polipeptdicos de la gelatina. Luego, se describe la metodologa experimental llevada a cabo para la separacin electrofortica de una muestra de gelatina y los procedimientos experimentales y numricos utilizados en la densitometra computacional para la obtencin de
fw (M ) y de los pesos moleculares promedios. Finalmente, se discuten los

resultados obtenidos y se arriba a conclusiones relevantes que conciernen a la distribucin de pesos moleculares de la muestra de gelatina provista por la empresa PB Leiner (Santa Fe Argentina).

5.2 Descripcin breve de la tcnica PAGE-SDS

En trminos generales, resulta relevante recordar que las tcnicas de electroforesis se basan en la migracin de molculas cargadas cuando stas son expuestas a un campo elctrico. Como se detall previamente en el Captulo 2, las protenas poseen cargas como resultado de su composicin en aminocidos bsicos y cidos y, por consiguiente, pueden migrar cuando se someten a un campo elctrico. Las primeras aplicaciones de los mtodos electroforticos fueron realizadas en soluciones de sacarosa, luego, surgieron los mtodos de electroforesis sobre medios de soporte que permitieron minimizar los efectos de difusin y conveccin natural. En este sentido, uno de los medios de soporte ms utilizados son los geles de poliacrilamida (Cooper, 1977).

90

Captulo 5

Cuando una molcula que posee un carga neta Ze se sita en un campo elctrico E unidireccional, se ejerce sobre ella una fuerza F que se puede expresar de la siguiente forma (Cooper, 1977),

F = E Ze =

V Ze d

(5.2.1)

donde V es la diferencia de potencial, e es la unidad elemental de carga y d es la distancia entre los electrodos. Asimismo, si el fenmeno se lleva a cabo en solucin, una fuerza de arrastre o de friccin se opone al movimiento de la molcula. Esta fuerza de arrastre se puede describir mediante la ecuacin de Stokes vlida para flujo reptante (nmero de Reynolds es pequeo) y depende del tamao y de la forma de la macromolcula, y tambin de la viscosidad del medio donde sta se mueve, es decir,

F = 6 a v

(5.2.2)

En la ecuacin (5.2.2) a es el radio de la macromolcula y v es la velocidad a la cual sta se mueve. Realizando un balance de las fuerzas que actan sobre la macromolcula, es decir igualando (5.2.1) y (5.2.2), se obtiene la siguiente expresin para la velocidad electrofortica,

v=

VZe EZe = d 6 a 6a

(5.2.3)

91

Captulo 5

De la ecuacin (5.2.3) se observa que la velocidad a la cual una macromolcula se mueve es proporcional al campo elctrico aplicado y a la carga neta que posee la misma e inversamente proporcional a su tamao (expresado a travs del radio esfrico equivalente) y a la viscosidad de la solucin. Por consiguiente, como cada molcula posee una carga neta y tamao caracterstico para condiciones de pH y fuerza inica determinadas, sta puede migrar una distancia especfica bajo un campo elctrico en un determinado perodo de tiempo. Mas an, si una mezcla de protenas se somete a electroforesis, al cabo de un cierto tiempo cada fraccin de igual carga neta y tamao se habr desplazado una distancia determinada bajo ese campo elctrico y se concentrar en una banda. Como se mencion ms arriba, para lograr una buena resolucin de la tcnica de electroforesis se requiere situar a la muestra en estudio en un medio de soporte estable que minimice o elimine los efectos difusivos y convectivos y que adems no reaccione ni retarde su movimiento unindose a ella. Uno de estos soportes qumicamente inertes son los geles de poliacrilamida (Cooper, 1977). En efecto, la electroforesis en gel de poliacrilamida es uno de los mtodos que por su alta resolucin, variedad de aplicaciones y relativo bajo costo de equipamiento y de reactivos ha sido utilizada con frecuencia creciente en los trabajos de anlisis y separacin de macromolculas. Los compuestos utilizados para construir esta matriz polimrica son la acrilamida, la N,Nmetilen-bisacrilamida, la tetrametilendiamina, frecuentemente denominada TEMED y el persulfato de amonio. El persulfato de amonio forma radicales libres cuando se disuelve en agua. Estos radicales libres se preservan dentro de la molcula de acrilamida cuando ambos reactivos se ponen en contacto. La

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Captulo 5

molcula activada de acrilamida puede reaccionar con sucesivas molculas de acrilamida para producir una cadena larga de polmero. No obstante, una solucin de estos polmeros no forma necesariamente un gel, debido a que estas cadenas pueden deslizarse unas sobre las otras. La formacin del gel requiere del anudamiento entre las cadenas, lo cual es posible si la polimerizacin se realiza en presencia de N,N-metilen-bisacrilamida la cual est compuesta por dos molculas de acrilamida unidas entre si por sus extremos no reactivos (Cooper, 1977). El tamao de los poros en la red de poliacrilamida es determinado por dos parmetros: (a) la cantidad de acrilamida por unidad de volumen y b) por el grado de anudamiento (que depende del contenido de bisacrilamida). En la mayora de las formulaciones el contenido de bisacrilamida se fija en 5% p/v y, por lo tanto este reactivo no controla el tamao de los poros que se forman luego de la gelificacin. El tamao promedio de poro se fija variando el contenido total de acrilamida. No obstante, la naturaleza aleatoria del fenmeno de formacin del gel, genera una distribucin de tamaos de poro. Asimismo, para acelerar el proceso de gelificacin, se agrega TEMED en una concentracin del 0,4% debido a que este compuesto posee la capacidad existir en la forma de radical libre. Asimismo, se usa la rivoflavina para favorecer la polimerizacin. En presencia de oxgeno y de luz ultravioleta, sta sufre una descomposicin formando radicales libres. Para lograr este resultado se posiciona una lmpara de luz ultravioleta cerca de la reaccin (Weber y Osborn, 1969; Cooper, 1977). Asimismo, el sistema de soluciones reguladoras utilizadas en PAGESDS debe mantener un pH constante dentro de los reservorios y dentro del gel

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Captulo 5

y adems los electrolitos que lo componen actan como conductores a travs del campo elctrico. La solucin reguladora no debe interactuar con la macromolcula que se desea separar y el pH se fija de forma tal que sta se encuentre cargada pero no desnaturalizada. En el caso de separacin de protenas se trabaja en el rango de pH 4,5 - 9. Finalmente, la fuerza inica y la concentracin de la solucin reguladora tambin se deben considerar y se deben fijar en valores ptimos. En efecto, si la concentracin de electrolitos es muy baja, las macromolculas conducen una gran porcin de la corriente y, por consiguiente, stas no se concentran en bandas finas, sino que generan zonas difusas. Por otro lado, si la concentracin de electrolitos dentro del gel es muy elevada, la cantidad de corriente conducida aumenta mientras que el voltaje decrece. Este fenmeno produce una disminucin de la velocidad de migracin y la generacin de calor que puede desnaturalizar y mezclar las macromolculas. La ecuacin (5.2.3) resulta til para visualizar el fenmeno de electroforesis pero no es adecuada para describir el movimiento electrofortico de un in a travs de un gel de poliacrilamida debido a que no tiene en cuenta la existencia de los poros. La migracin de la macromolcula en el gel depende del tamao de la macromolcula y del tamao promedio de poro del gel. En efecto, si la mayora de los poros poseen un dimetro menor que el radio de las protenas, a pesar de la carga proteica y de la fuerza elctrica stas no se movern en el gel. Este efecto se denomina efecto tamiz, y es el que aumenta la resolucin en este tipo de geles. Rodbard y Chrambach (1970) desarrollaron una serie de relaciones matemticas para describir los efectos de la concentracin de gel sobre la movilidad de las macromolculas. En este

94

Captulo 5

sentido los autores propusieron la siguiente expresin que relaciona la movilidad electrofortica m de una macromolcula con la concentracin total del gel CT ,

log m = log m0 K R CT

(5.2.4)

donde m0 es la movilidad electrofortica libre en una solucin de sacarosa y


K R es el coeficiente de retardo. Asimismo, K R est relacionado con el radio de

la macromolcula a travs de la siguiente expresin (Cooper, 1977; Rodbard y Chrambach, 1970),

K R = A(a + r )

(5.2.5)

donde A es una constante, a es el radio medio de la macromolcula y r es el radio de las fibras del gel, las cuales se consideran mucho ms largas que la macromolcula. No obstante, dos macromolculas de diferentes pesos moleculares, pueden migrar a la misma velocidad si su diferencia de tamao es balanceada o compensada por su diferencia de carga en un ensayo de electroforesis en gel de poliacrilamida nativa. En virtud de solucionar este problema Shapiro et. al (1967) intentaron separar una mezcla de protenas en presencia del detergente aninico duodecil sulfato de sodio (SDS); los resultados de estos esfuerzos preliminares fueron obtenidos por Weber y Osborn (1969). Estos investigadores observaron en forma emprica que la movilidad era una funcin lineal del logaritmo del peso molecular M , y a su vez demostraron que esta movilidad

95

Captulo 5

era proporcional a la distancia relativa

X = x0 x

migrada por las x 0 . Por

macromolculas respecto de la distancia inicial de migracin consiguiente, validaron la siguiente relacin,

log M = p b X

(5.2.6)

donde p y b son constantes. El SDS se une a las protenas en una proporcin constante de aproximadamente 1,4 gramos por gramo de protena, con lo que la carga intrnseca de la macromolcula es despreciable frente a la carga ligada con SDS mientras que la densidad de carga ( Coulomb g de protena ) es la misma para todos los componentes (Creighton, 1993). Generalmente se usa con algn reductor de enlaces disulfuro como el 2- mercaptoetanol, ditiotreitol y la disociacin se obtiene por calentamiento a 90 grados centgrados (Cooper, 1977, Margni et al., 1996). Debido a que todas las protenas poseen la misma densidad de carga, stas se separan solo en funcin de su tamao. La tcnica de PAGE-SDS se utiliza frecuentemente para la

determinacin del peso molecular de protenas, para esto tambin se incluyen en el ensayo patrones de peso molecular conocido. Estos patrones deben poseer pesos moleculares por encima y por debajo del peso molecular de la muestra incgnita de manera de poder construir un grfico involucrando el logaritmo de peso molecular versus la distancia migrada por los analitos, como lo describe la ecuacin (5.2.6). Una vez obtenida esta relacin se ingresa al grfico con la distancia migrada por la muestra incgnita y se obtiene el peso molecular correspondiente.

96

Captulo 5

Otra variante de esta tcnica es la electroforesis discontinua, donde adems del gel de corrida o gel de separacin se utiliza un gel espaciador de poro grueso el cual se interpone entre la muestra y el gel de corrida. En estos sistemas discontinuos las soluciones reguladoras de los geles y de los reservorios que contienen los electrodos son diferentes. Las muestras a analizar se siembran en un gel de poro grueso (gel de poro rpido o de apilamiento) en una solucin reguladora Tris-ClH de pH 6,8. Este gel se polimeriza sobre el gel de corrida o resolucin que se encuentra a pH 8,8. La solucin reguladora del recipiente que contiene el ctodo en la parte superior del gel es Tris-Glicina de pH 8,3. Al pH del gel de apilamiento y de la muestra que en ambos casos es de 6,8, la glicina, la cual forma parte de la solucin reguladora del reservorio catdico, se encuentra muy poco disociada debido a que este pH est muy prximo a su pI = 6,06 (ver Tabla 2.6.1 en el Captulo 2). Como consecuencia de esta situacin, la movilidad en el campo elctrico es reducida. No obstante, los iones cloruro a ese pH poseen una movilidad mayor, mientras que las protenas tienen una movilidad intermedia. Cuando se aplica la diferencia de voltaje los iones cloruros migran alejndose de la glicina, dejando atrs de ellos una zona de menor conductividad. Como sta es inversamente proporcional a la fuerza del campo aplicado, esta zona genera un gradiente de voltaje mayor que acelera la migracin de la glicina, que se aproxima a los iones cloruros. Estos se mueven ahora a la misma velocidad con un estrecho lmite de separacin entre ellos. Cualquier protena que se mueva por delante de la banda inica es rpidamente atrapada debido a que su movilidad es menor que la de los iones cloruros, pero mayor que la de la glicina. Como resultado las diferentes protenas se apilan en una delgada

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Captulo 5

banda por detrs de los iones cloruros y delante de la glicina para acumularse en el lmite del gel de resolucin. En el momento que las protenas llegan al gel de resolucin, a un pH 8,8, el aumento de pH hace que la glicina incremente su disociacin y por consiguiente su movilidad efectiva sobrepasa a la movilidad de la protena haciendo que sta se mueva junto con los iones cloruros. Al mismo tiempo, al disminuir el tamao del poro del gel, el desplazamiento de las molculas proteicas depende de sus respectivas cargas y tamaos moleculares, lo que posibilita la separacin de las diferentes protenas dentro de la mezcla. En el caso de PAGE-SDS, la densidad de carga de las molculas es prcticamente la misma, por lo que su separacin se realiza en funcin del tamao molecular (Margni et al., 1996). Una vez finalizado el ensayo de electroforesis las macromolculas separadas en el gel se deben visualizar mediante una tcnica de coloracin. El colorante Coomassie Blue es frecuentemente utilizado para protenas (Creighton, 1993; Margni et al., 1996). El procedimiento requiere la fijacin de las protenas (desnaturalizacin a bajo pH) y luego los geles se tien en una solucin acuosa del colorante. El exceso de colorante es luego removido mediante sucesivos lavados del gel en una solucin compuesta por etanol y cido actico. Una variante ampliamente utilizada consiste en colorear y fijar las protenas simultneamente. Para esto, los geles se sumergen en una solucin de colorante disuelto en una mezcla de metanol y cido actico glacial. Finalmente, el remanente se remueve lavando los geles con una solucin que tambin posee agua, metanol y cido actico glacial (Margni et al., 1996).

98

Captulo 5

5.3 Anlisis de muestras de Gelatina por PAGE-SDS

Preparacin de las muestras

Se realiz el ensayo de PAGE-SDS a la muestra de gelatina comercial provista por la empresa PB Leiner (Santa Fe Argentina) cuya materia prima

es cuero de vaca. Esta muestra posee un valor de Bloom de 227 g y una viscosidad standard al 6.66 % w/w y 60C de 39 mps (datos suministrados por el proveedor). Para este ensayo las muestras fueron preparadas con una concentracin de 5 mg/ml. La cantidad de gelatina requerida se dej hidratar a temperatura ambiente durante diez minutos en un volumen de agua aproximado al volumen final. Posteriormente se procedi a la disolucin total durante 40 minutos a 50C en agitacin. Esta solucin se mezcl en una proporcin de tres partes de solucin de gelatina y una parte de solucin reguladora de muestra, la cual posee una solucin tris-ClH pH= 6,8, 8% de SDS y 20% de 2-mercaptoetanol. Los patrones de peso molecular tambin se prepararon de la misma manera. Se utiliz albmina (67 KDa), fosforilasa b (94 KDa), betagalactosidasa (116 KDa) y myosina (212 KDa). Tanto las muestras como los patrones de peso molecular se calentaron durante cinco minutos a 90C (Laemli, 1970).

99

Captulo 5

Ensayo de PAGE-SDS

Se utiliz para el ensayo un equipo LKB 2001-001 vertical y se desarroll la tcnica descripta por Laemmli (1970) utilizando un gel de resolucin con 5% de acrilamida a pH=8,8 y un gel de apilamiento de 4% de acrilamida y pH=6,8. Se sembraron 150 g de protena en cada carril con un 2% de SDS. Asimismo, la temperatura de la cuba electrofortica se fij en 20C. Posteriormente los geles se colorearon con Coomasie Brillant Blue R 250 y el exceso de colorante se retir utilizando una mezcla de agua, metanol y cido actico glacial. En la Figura 5.3.1 se observa la imagen del gel obtenida donde es posible observar tres zonas de mayor intensidad de color en torno a los 100 y 200 KDa.

Figura 5.3.1 Imagen del gel de poliacrilamida obtenido. En el primer carril a la izquierda se observan los patrones de peso molecular albmina y fosforilasa b, en el segundo se observa la galactosidasa, en el tercer carril se localiza la miosina y, finalmente, en el ltimo carril se encuentra la muestra de gelatina ensayada.

100

Captulo 5

5.4 Densitometra Computacional de las bandas obtenidas por PAGE-SDS.

Se analiz la imagen del gel coloreado mediante densitometra computacional. Para este fin, se gener un programa numrico que permite obtener la funcin densidad de distribucin de pesos moleculares fw (M ) a partir de los datos densitomtricos de intensidad de color Ir en funcin de la posicin
x de las macromolculas en cada carril de siembra. Estos datos fueron

obtenidos con el programa pixi.exe y, posteriormente, fueron procesados como se detalla a continuacin. Los datos bsicos densitomtricos que consisten en la posicin en funcin de la intensidad de color, es decir el par ordenado

(x ,I r )

fueron

normalizados a las nuevas variables X = x x o e I = I r I rmax donde x o es la distancia de iniciacin de la migracin de las macromolculas dentro del gel de resolucin e I rmax es la intensidad de color mxima detectada en cada carril de siembra. Se obtuvo, de esta manera, un espectro de valores ( X , I ) a lo largo de cada carril de siembra en el gel de poliacrilamida. Definiendo el rea de intensidad de color de cada carril de siembra hasta la posicin X como,

A( X ) = I ( X )dX
X 0

(5.4.1)

y considerando que el rea total AT de intensidad de color en todo el carril de siembra se expresa,

101

Captulo 5

AT = I ( X )dX
0

(5.4.2)

la intensidad de color I ( X ) se re-normaliza tomando como referencia el rea total de intensidad de color AT . De esta manera, se obtiene la intensidad de color normalizada i ( X ) = I ( X ) AT la cual cumple con la siguiente condicin,

0 i ( X )dX = 1

(5.4.3)

Por consiguiente, se obtiene un nuevo espectro de pares de valores ordenados de coordenadas ( X , i ) . La variable X se puede relacionar con el peso molecular de la macromolcula que ha migrado hasta esa posicin. En efecto, X es una funcin del peso molecular M como lo muestra la ecuacin (5.2.6). En tal sentido, se hace uso de esta ecuacin y de los valores

( X ,M )

correspondientes a la migracin de los patrones de peso molecular para la obtencin de las constantes p y b de la ecuacin (5.2.6) mediante un ajuste lineal de estos datos experimentales. De esta forma, se obtienen los siguientes valores p = 5,624 y b = 0,00588. En la Figura 5.4.1 se observa la recta de calibracin obtenida con los cuatro patrones de peso molecular. En consecuencia, a travs de la ecuacin (5.2.6) la variable X se puede expresar de la siguiente manera,

X=

p log M b

(5.4.4)

102

Captulo 5

Por consiguiente, derivando ambos miembros de la ecuacin (5.4.4) y utilizando la constante de conversin que permite pasar de logaritmo decimal a logaritmo natural n = 2,3025 se obtiene,

dX =

d ln M bn

(5.4.5)

5,4

Miosina
5,3

5,2

Log M

5,1

-galactosidasa
5,0

Fosforilasa-b
4,9

4,8

Albmina

4,7 40

60

80

100

120

140

X
Figura 5.4.1 Logaritmo del peso molecular en funcin de la distancia relativa de migracin X de los patrones de peso molecular: miosina, galactosidasa, fosforilasa-b y albmina ensayados mediante PAGE-SDS.

Reemplazando X y dX en la ecuacin (5.4.3) y realizando un cambio de variables se obtiene,

i ( X )dX =

10 p

p log M dM =1 i b bnM

(5.4.6)

103

Captulo 5

teniendo en cuenta que cuando

X 0 se cumple que log M = p

y,

consecuentemente, M = 10 p . Asimismo, cuando

X se cumple que

log M y, por lo tanto M 0 . Asimismo, sabiendo que ln M = p ln(10 ) la ecuacin (5.4.6) tambin se puede expresar de la siguiente forma,

pn

1 p 1 i ln M d ln M = 1 nb b nb

(5.4.7)

p log M Por consiguiente, debido a que la funcin i bn satisface los b requerimientos de la funcin densidad de distribucin para la variable ln M (ver en Captulo 2 la ecuacin (2.2.8)), fw (M ) queda determinada por,

p log M i b fw (M ) = bn

(5.4.8)

Por lo tanto, el procedimiento de clculo consiste en tomar los valores de X , i ( X ) , M y ln M de los electroferogramas de las muestras de gelatina detectados en cada calle de siembra de los geles de poliacrilamida y con ellos se obtiene fW (M ) . En la Figura 5.4.2 se muestra la funcin densidad de distribucin de pesos moleculares fw (M ) obtenida, donde es posible observar tres picos principales correspondientes a las fracciones de cadena alfa (menos de 100 KDa), beta ( entre 100 y 200 KDa) y gamma (entre 200 y 300 KDa).

104

Captulo 5

Posteriormente se obtuvieron los pesos moleculares promediados en fracciones msicas Mw y en nmero de moles M n haciendo uso de las ecuaciones (2.2.9) y (2.2.10) respectivamente. En este sentido, los valores obtenidos fueron M w = 136650 g/mol y M n = 133000 g/mol. Asimismo, una estimacin de la polidispersidad de la muestra Po (ver Captulo 2) arroj un valor de Po = 1,027.

2,5

2,0

1,5

fw (M)

1,0

0,5

0,0 100000

M(g/mol)

Figura 5.4.2 Funcin densidad de distribucin de pesos moleculares fw (M ) en funcin del peso molecular para una muestra de gelatina comercial.

5.5 Conclusiones

Se concluye que la tcnica de electroforesis en gel de poliacrilamida desarrollada en esta tesis logra mostrar adecuadamente la composicin de la

105

Captulo 5

mezcla polimrica que se obtiene luego del proceso de extraccin de gelatina. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Fernndez-Daz et al. (2003), Gmez-Guilln et al. (2002) y Tosh et al. (2003) quienes, entre otros, reportan imgenes similares de geles de poliacrilamida. Asimismo, el anlisis por densitometra computacional propuesto permiti obtener fw (M ) , Mw y M n , los cuales son necesarios para posteriores clculos en este trabajo de tesis. En este sentido, la tcnica experimental y la metodologa de anlisis propuestas para la determinacin de los parmetros antes mencionados resultaron apropiadas para el estudio de este tipo de muestras polimricas polidispersas cargadas de naturaleza proteica.

106

Captulo 5

5.6 Bibliografa

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Captulo 5

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108

Captulo 6

Mtodos reomtricos experimentales utilizados en esta tesis

Captulo 6

6 Mtodos reomtricos experimentales utilizados en esta tesis

6.1. Introduccin

Como se describi previamente en el Captulo 3, la gelatina est compuesta por tres tipos predominantes de cadenas alfa, beta y gamma que, en solucin diluida, presentan radios hidrodinmicos caractersticos. En tal sentido, el estudio de este sistema macromolecular en condiciones diluidas resulta de fundamental importancia debido a que las teoras fisicoqumicas y reolgicas que permiten interpretar los resultados experimentales se

encuentran ms desarrolladas en este rango de concentracin. Por consiguiente, en esta tesis se evala va reometra el comportamiento reolgico de soluciones diluidas de gelatina y a partir de la interpretacin de estos datos experimentales se arriba a conclusiones concernientes a la microestructura y al estado conformacional de estas macromolculas. En general, las soluciones acuosas y diluidas de macromolculas producen torques chicos a bajas velocidades de corte en los remetros comerciales. Por ejemplo, mediante el uso de viscosmetros del tipo Brookfield de celda cono-plato se pueden generar velocidades de corte relativamente bajas de alrededor de 1.1 s-1 pero los datos experimentales que se obtienen con este tipo de instrumentos resultan poco precisos. Por lo tanto, para el anlisis reomtrico de soluciones macromoleculares diluidas se utiliza, generalmente, la viscosimetra capilar aunque esta reometra, tal como usualmente se la propone, no sera lo suficientemente adecuada para la aplicacin de las teoras moleculares. En efecto, los dispositivos capilares

109

Captulo 6

disponibles comercialmente (por ejemplo, viscosmetros del tipo OstwaldCannon Fenske) no permiten establecer en forma precisa ni el valor ni el rango de velocidad de corte alcanzado durante el ensayo reomtrico. Mediante clculos estimativos realizados en esta tesis se obtuvo que la velocidad de corte alcanzada dentro de estos viscosmetros comerciales es de 1000 a 3000 s
1

. De esta forma, haciendo uso de los viscosmetros capilares comerciales

no es posible detectar reolgicamente los comportamientos macromoleculares en solucin diluida de inters en esta tesis como, por ejemplo, la respuesta newtoniana estricta o la presencia de pseudoplasticidad. Por lo mencionado arriba, y en base a un trabajo previo (Berli y Deiber, 2004) se construy un dispositivo capilar (no disponible comercialmente) que permite ensayar soluciones diluidas y ultra-diluidas de gelatina a bajas velocidades de corte. En este sentido, resulta relevante realizar en este captulo una descripcin del dispositivo diseado, de la metodologa experimental utilizada y del algoritmo de clculo empleado para la obtencin de las funciones reomtricas (ver, tambin Olivares et al., 2006). Asimismo, en este captulo se realiza una revisin breve de la celda capilar clsica, la cual constituye la base para el desarrollo de la reometra capilar gravitatoria. En la derivacin de las ecuaciones que permiten obtener las funciones reomtricas se siguen los conceptos bsicos de reometra descriptos en los libros clsicos de Walters (1975), Bird et al. (1977) y Schowalter (1978). Debido a que en esta tesis tambin se estudia mediante reometra rotacional el comportamiento reolgico de soluciones concentradas de gelatina en distintas condiciones fisicoqumicas de pH y fuerza inica, en este captulo

110

Captulo 6

se describe brevemente la teora bsica de la reometra cono-plato utilizada para estos ensayos reomtricos.

6.2 Reometra capilar

Reometra capilar clsica

La reometra capilar permite, en general, calcular la viscosidad aparente

en funcin de la velocidad de corte & , a partir de los datos experimentales


del gradiente de presin y caudal en el tubo capilar. Si la muestra fluye debido a su propio peso desde un depsito directamente conectado al capilar se obtiene una variacin continua de la presin de entrada. En este caso, el gradiente de presin y el caudal se calculan a partir de los datos de la altura del fluido en el depsito en funcin del tiempo. El tubo capilar, como geometra de flujo reomtrico, se analiza en un

, r , z} . En tubos donde la longitud sistema coordenado cilndrico de variables {


L es mucho mayor que el radio R , el flujo es unidireccional. Luego, interesa en
particular, la componente axial (direccin z ) de la ecuacin de cantidad de movimiento. La misma se expresa,

v z p 1 (r rz ) + g + = z r r t

(6.2.1)

donde v z es la velocidad axial del fluido, la cual es funcin de la coordenada radial r y p es la presin que depende solo de la posicin axial z medida a

111

Captulo 6

partir de la entrada del tubo. Asimismo, es la densidad del fluido, g es la aceleracin de la gravedad y rz es la tensin de corte, de ahora en ms denominada simplemente . Debido a que p es una funcin lineal de z , en la ecuacin (6.2.1) se puede definir un gradiente de presin generalizado de la siguiente manera,

P = (p gz ) L z

(6.2.2)

donde P es la diferencia de presin aplicada al fluido en el tubo capilar. La ecuacin (6.2.1) en estado estacionario genera una tensin de corte de acuerdo a la siguiente expresin,

(r ) =

Pr r = w 2L R

(6.2.3)

donde w es la tensin de corte en la pared del tubo, es decir w = (R ) . Para obtener la funcin (& ) se requiere conocer la velocidad de corte & adems de la tensin . En el tubo cilndrico & se expresa,

& = & rz =

dv z (r ) dr

(6.2.4)

En el capilar no se obtiene un flujo de corte homogneo debido a que & no es uniforme en todo el dominio de r . Asimismo, la funcionalidad de & (r ) depende del tipo de fluido. En consecuencia, no es posible obtener una expresin
112

Captulo 6

general de & (r ) en el tubo. En reometra capilar, la velocidad de corte se debe calcular a partir del caudal volumtrico Q . En efecto, las magnitudes medibles en el tubo son Q y el gradiente P L , a partir del cual se obtiene [ecuacin (6.2.3)]. La expresin para calcular el caudal del fluido en el tubo capilar se obtiene a partir del balance de materia, de donde resulta,

Q = 2 v z (r )rdr
R 0

(6.2.5)

Si se cumple la condicin de no resbalamiento v z (R ) = 0 en la pared del tubo el caudal se puede expresar entonces en funcin de & (r ) de acuerdo a,

Q = & (r )r 2 dr
R 0

(6.2.6)

Realizando un cambio de variables apropiado mediante la ecuacin (6.2.3) se obtiene,

3 Q w

R3

w
0

2 d

(6.2.7)

La ecuacin (6.2.7) expresa el vnculo que existe entre el caudal Q y la tensin de corte w en la pared del capilar. En la misma se observa que los valores experimentales Q versus w estn relacionados por una ecuacin integral de primera especie (Hildebrand, 1965). Luego, determinar & a partir de la

113

Captulo 6

ecuacin

(6.2.7)

constituye

matemticamente

un

problema

ill

posed

(Honerckamp, 1989) debido a la inevitable dispersin de los datos experimentales asociados a Q y w . Por tal motivo, la determinacin correcta de (& ) es an materia de debate en la literatura (ver, por ejemplo, Baker, 1977; Berli y Deiber, 2001). El mecanismo ms utilizado para obtener & se basa en transformar la ecuacin (6.2.7) a la forma diferencial. Esto se logra diferenciando la ecuacin (6.2.7) respecto de w , haciendo uso de la regla de derivacin de Leibnitz. De esta manera se obtiene la velocidad de corte en la pared del tubo &w . Esto es,

w =

w 2

3 Q w 3 w R

(6.2.8)

Esta expresin se conoce como la ecuacin de Weissemberg-Rabinowitsch y permite el clculo de la velocidad de corte en la pared del tubo a partir de datos de tensin y caudal. Posteriormente, se obtiene la funcin viscosidad

= w &w . No obstante, el valor de &w es muy sensible a la forma de calcular


el lado derecho de la ecuacin (6.2.8) debido a la dispersin de los datos de Q versus w como se mencion anteriormente. Es decir, la transformacin no evita las infinitas soluciones que provee el problema ill posed. Como se mencion ms arriba, con los dispositivos tradicionales los cuales poseen el capilar en posicin vertical no se logran velocidades de corte bajas y, por consiguiente, resulta necesario realizar una adaptacin de esta celda reomtrica que permita alcanzar velocidades de corte ms bajas como se describe a continuacin. 114

Captulo 6

Viscosimetra capilar para bajas velocidades de corte

Como se mencion en la seccin 6.1, con el fin de obtener un rango de velocidad de corte relativamente bajo, se construy un viscosmetro capilar en el cual la velocidad de corte alcanzada fue minimizada colocando el capilar en forma horizontal. De esta forma, el peso del lquido en el capilar no interviene en la presin efectiva (ver, por ejemplo Osorio y Deiber, 1986; Berli y Deiber, 2004). Este dispositivo se dise principalmente para atender a las necesidades experimentales de este trabajo de tesis. El mismo se construy en el Taller de vidrio de la facultad de Ingeniera Qumica (UNL). Con este instrumento se pudo realizar un programa experimental que consisti en la medicin de soluciones diluidas y ultra - diluidas de gelatina en diferentes condiciones fisicoqumicas. La metodologa experimental llevada a cabo para estos estudios se detalla en los captulos 7, 8 y 9. El dispositivo capilar diseado (la Figura 6.2.1 muestra una

representacin simple del dispositivo) permite obtener la funcin reomtrica

(& ) en un amplio rango de velocidades de corte y calcular los diferentes


parmetros reolgicos de distintos modelos a partir de la variacin de la altura del fluido en los reservorios.

115

Captulo 6

2Ro

4 2
H(t)

1
Figura 6.2.1 Viscosmetro gravitatorio con el capilar en posicin horizontal. (1) Capilar de radio R , (2) Reservorio de radio Ro y escala de lectura graduada en cm, (3-4) Entrada y salida del fluido de termostatizacin.

El viscosmetro gravitatorio consta de un reservorio cilndrico de radio


Ro el cual alimenta la muestra al capilar de radio R y longitud L . Al final del

capilar, la muestra ingresa y sube por otro tubo cilndrico que en este caso particular tambin es de radio Ro . Ambos reservorios poseen una escala graduada en centmetros que permite registrar con un cronmetro el tiempo en el cual el menisco de lquido atraviesa cada graduacin. Este dispositivo se coloca en una cmara de termostatizacin, que permite mantener la temperatura constante con una precisin de 0,01C (Olivares et al., 2006). Cuando el fluido se encuentra a temperatura constante, se inicia el flujo a travs del capilar abriendo la llave situada en uno de los reservorios. Una vez establecido el estado estacionario se comienza a registrar la diferencia de

116

Captulo 6

altura efectiva en los reservorios H (t ) = h1 (t ) h2 (t ) en funcin del tiempo (ver Figura 6.2.1). A partir de los balances de materia y de cantidad de movimiento en el dispositivo, se deducen la tensin de corte y la velocidad de deformacin en el capilar. Para este caso, se desprecia la friccin en los reservorios respecto de la friccin dentro del capilar debido a que Ro >> R . Asimismo, mediante un balance de materia dentro del dispositivo el caudal se puede expresar de la siguiente manera (Osorio y Deiber, 1986; Berli y Deiber, 2004),

Q =

2 R 0 dH

dt

(6.2.9)

Debido a que la diferencia de presin P aplicada al fluido en el tubo capilar es P = gRH (t ) y considerando la ecuacin (6.2.3), la tensin de corte en la pared del capilar, es decir para r = R en estado estacionario es,

w =

gRH (t )
2L

(6.2.10)

Asimismo, la velocidad de corte en la pared del capilar se puede obtener de la ecuacin (6.2.8) introduciendo las expresiones para Q y w [ecuaciones (6.2.9) y (6.2.10) respectivamente]. De esta forma, es posible obtener la velocidad de corte de acuerdo a la siguiente expresin,

w =

R0 2 H'' 3 H ' H + H' 2R 3

(6.2.11)

117

Captulo 6

donde H ' y H ' ' son la primera y segunda derivada de la altura efectiva en funcin del tiempo respectivamente. Una vez que se obtienen los datos de altura efectiva del fluido en el recipiente H (t ) en funcin del tiempo t , es posible calcular las varialbes w y

&w y para cada tiempo registrado se evala la funcin viscosidad aparente = w &w
.

Las ecuaciones (6.2.10) y (6.2.11) se pueden resolver para cada modelo de fluido. En particular, para fluidos newtonianos se obtiene (Berli y Deiber, 2004),

tgR 4 H = H o exp 4LR 2 o

(6.2.12)

donde H o = H (0 ) en este caso particular. Aplicando el logaritmo a ambos trminos de la ecuacin (6.2.12) es posible realizar un ajuste lineal de los datos experimentales de H (t ) versus t y, de este modo, se calcula la viscosidad del valor correspondiente a la pendiente. Asimismo, se pueden obtener otras expresiones de H (t ) para los fluidos Newtonianos generalizados (Berli y Deiber, 2004). En este sentido, el mejor ajuste de los datos experimentales de
H (t ) versus t define qu tipo de modelo describe el comportamiento de la

solucin sometida a flujo de corte. En este trabajo se utiliz un dispositivo capilar con las siguientes caractersticas: Ro = 1 cm, R = 0,03724 cm y L = 10,048 cm. Para todas las

118

Captulo 6

determinaciones realizadas en esta tesis el dispositivo se trat previamente con solucin sulfocrmica con el fin de eliminar restos proteicos. Tambin se realizaron mltiples lavados con agua destilada con una solucin de detergente no inico al 0,01% para remover grasas y otros contaminantes. Antes de obtener las mediciones de H versus t con cada muestra se realizaron dos lavados con agua deionizada para dejar la superficie libre de iones. Para el procesamiento de E datos experimentales, el error relativo de ajuste se evalu de la siguiente manera (Olivares et al., 2006),

1 E H exp (t i ) H (t i ) H exp (t ) E i =1 i

(6.2.13)

donde t i son los valores de tiempo a los cuales se realizan las medidas experimentales H exp (t i ) , mientras que H (t i ) son los valores de alturas efectivas tericas obtenidas a t i para cada modelo de fluido considerado. El programa de clculo de la viscosidad aparente y el correspondiente anlisis del error relativo de ajuste se realiz en lenguaje de programacin Fortran. En este sentido, el algoritmo correspondiente se describe en el Apndice I. Asimismo, para determinar la precisin de la tcnica experimental se realizaron 20 mediciones independientes de la viscosidad del agua y luego de un anlisis estadstico de los datos de viscosidad evaluados, se obtuvo una desviacin Standard de 4,5 10-6 poise.

6.3 Reometra rotacional

119

Captulo 6

Para el estudio reomtrico de soluciones concentradas de gelatina (es decir para C > Cg ) se utiliz un remetro digital Brookfield modelo DV-III, controlado a partir de una computadora mediante el software Rheocalc de Brookfield. La celda reomtrica es de tipo cono-plato, la cual se ubica en una cavidad cerrada como se esquematiza en la Figura 6.3.1 permitiendo as mantener la temperatura constante con una precisin de 0,01C. Las dimensiones de la celda admiten conos de radio Rc de 24 mm y diferentes ngulos c . En este trabajo se utiliz un cono de c = 1.565 donde se requiere un volumen de muestra de 1 cm3 de acuerdo a las recomendaciones del manual del instrumento (N M/91-210-D493, Brookfield Eng. Labs. Inc. USA). El modelo de remetro utilizado tiene control cinemtico, es decir, la variable de entrada es la velocidad de rotacin. El censor mide el torque M necesario para rotar el cono a una velocidad angular w . A continuacin se realizan se describe la teora bsica de la reometra cono-plato (ver, por ejemplo, Walters, 1975 y Bird et al., 1977).

w
Circulador termosttico

Cono Plato

Rc
Figura 6.3.1 Esquema de la celda cono-plato utilizada en este trabajo

Considerando la geometra de flujo en un sistema de coordenadas esfricas {r , , } , se resuelve la ecuacin de cantidad de movimiento del fluido

120

Captulo 6

(ecuacin (1.2.2)) para el caso donde el cono gira a una velocidad angular w . Si el ngulo del cono es suficientemente pequeo, el perfil de velocidades en estado estacionario se puede expresar,

v ( r , ) =

w r ( / 2 )

(6.3.1)

Exceptuando las situaciones en las cuales existen flujos secundarios, la velocidad del fluido tiene solo la componente tangencial . Asimismo, la nica componente no nula del tensor de velocidad de deformacin es,

& = & =

1 v r

(6.3.2)

Luego, a partir de las ecuaciones (6.3.1) y (6.3.2), es posible obtener la velocidad de corte en la celda,

& =

(6.3.3)

Debido a que los conos empleados en este tipo de celdas reomtricas presentan la particularidad de tener ngulos pequeos, la velocidad de corte obtenida es uniforme, produciendo una velocidad de corte constante en todo el dominio de flujo. Esta caracterstica particular de la celda cono-plato es una ventaja debido a la simplificacin que resulta en los clculos de la velocidad de corte. En efecto, si & depende de la posicin dentro de la celda (velocidad de

121

Captulo 6

corte no uniforme) el estudio de los fluidos no-Newtonianos requiere consideraciones adicionales. El torque que mide el instrumento se debe a la fuerza viscosa que realiza el fluido sobre el cono. El mismo se puede calcular a partir de la componente de corte del tensor de tensiones,

M = r 2 dr
0

Rc

(6.3.4)

Luego, para ngulos de cono pequeos, la tensin de corte = en la celda resulta,

3M
3 2Rc

(5.3.5)

Corresponde remarcar que las ecuaciones (6.3.3) y (6.3.5) son vlidas para ensayos con flujos de corte estacionarios, transitorios y dinmicos. En particular, en condiciones de flujo de corte estacionario ( w = constante) la funcin reomtrica viscosidad se obtiene de la siguiente relacin,

&

(5.3.6)

122

Captulo 6

como se indica en la ecuacin (1.3.6). Esta funcin es sensible a la velocidad de corte, la temperatura y el tiempo transcurrido desde la imposicin de un valor de velocidad angular w . En esta tesis este instrumento se utiliza para evaluar la viscosidad aparente de soluciones concentradas de gelatina a diferentes pH y fuerzas inicas. En este sentido, la metodologa experimental y los resultados obtenidos se discuten en el captulo 9.

123

Captulo 6

6.4 Bibliografa

Baker, C. T. H. (1977). The numerical treatment of integral equations. Clarendon, Oxford. Berli, C. L. A. y Deiber, J. A. (2001). A procedure to determine the viscosity function from experimental data of capillary flow. Rheol. Acta, 40, 272-278. Berli, C. L. A. y Deiber, J. A. (2004). Theoretical analysis of the gravity-driven capillary viscometers. Review of Scientific Instruments, 75(4), 976-982. Bird, R. B., Armstrog, R. y Hassager, O. (1977). Dynamics of Polymeric Liquids. Vol I . J. Wiley &Sons: New York. Hildebrand, F. (1965). Methods of Applied Mathematics. Prentice Hall, New Jersey. Honerkamp, J. (1989). Ill-posed problems in rheology. Rheologica Acta, 28,263371. Olivares, M. L.; Peirotti, M. B. y Deiber, J. A. (2006). Analysis of gelatin chain aggregation in dilute aqueous solutions through viscosity data. Food
Hydrocolloids, 20, 1039 - 1049.

Osorio, J. y Deiber, J. A. Medicin de la viscosidad aparente mediante un flujo capilar gravitacional y cuasiestacionario. Boletn de la Asociacin Argentina de
Reologa, IV, 16-25.

Schowalter, W. (1978). Mechanics of Non-Newtonian Fluids. Pergamon Press, Oxford. Walters, K. (1975). Reometry. J. Wiley & Sons: New York.

124

Captulo 7

Viscosidad intrnseca de gelatina para diferentes historias trmicas

Captulo 7

7 Viscosidad intrnseca de gelatina para diferentes historias trmicas

7.1 Introduccin

Siguiendo los objetivos planteados en esta tesis, en el presente captulo se realiza un estudio terico y experimental de soluciones de gelatina en el rango de concentracin diluido (es decir, para C c < C < C g ) maduradas a
* temperaturas inferiores a Tg (ver Captulo 4 en el cual se detallan los

fenmenos microestructurales asociados a esta zona de concentracin y temperatura). En el contexto de este anlisis, las soluciones de gelatina se estudian experimentalmente mediante la evaluacin de la viscosidad intrnseca, haciendo uso de un viscosmetro capilar gravitatorio, especialmente diseado para tal fin, el cual permite medir la viscosidad aparente en un rango de velocidades de corte relativamente bajas ( para ms detalles, ver Captulo 6). En este sentido, primeramente se introduce al lector en el contexto terico-experimental que se requiere para el estudio de soluciones

macromoleculares diluidas mediante la evaluacin de la viscosidad intrnseca. Luego, se realiza una descripcin de los ensayos experimentales llevados a cabo para el estudio de la maduracin de soluciones diluidas de gelatina a diferentes historias trmicas y, finalmente, se exponen los resultados obtenidos en los cuales se concluye acerca del fenmeno de agregacin que experimentan las cadenas de gelatina bajo las condiciones fisicoqumicas impuestas en cada experiencia.

125

Captulo 7

7.2 Conceptos asociados a la viscosidad intrnseca de macromolculas

Cuando una suspensin de partculas, las cuales poseen un tamao significativamente mayor que el de las molculas del solvente, se somete a flujo a travs de un tubo capilar o en alguna otra celda reomtrica utilizada para la medida de viscosidad, se observa un aumento de esta funcin reomtrica con respecto a la viscosidad del solvente puro. Dicho fenmeno se produce debido a que las partculas se sitan entre las capas que forman las molculas del solvente distorsionando, de esta manera, el patrn de flujo (Tanford, 1961). El primer anlisis fluidodinmico de estos sistemas fue realizado por Einstein en 1906, quien obtuvo una expresin de la viscosidad aparente para un sistema diluido de esferas rgidas. De esta manera se demostr que la viscosidad bajo condiciones diluidas se puede evaluar con la siguiente expresin (Tanford, 1961; Hiemenz, 1986; Barnes et al., 1991),

= s (1 + 2 ,5 )

(7.2.1)

donde s es la viscosidad del solvente y es la fraccin volumtrica de las partculas. Extendiendo este anlisis a suspensiones de partculas asimtricas se concluye que la viscosidad depende de la orientacin de las mismas (Tanford, 1961). En efecto, si stas se orientan paralelamente a las lneas de corriente, lo cual se producira a gradientes de velocidad relativamente grandes, se registrara un menor valor de la viscosidad contrapuesto a aquel que se observa cuando stas se disponen en forma aleatoria a bajos valores de velocidad de corte. En este ltimo caso, algunas de estas partculas se

126

Captulo 7

ubicaran en forma perpendicular a las lneas de corriente. En otras palabras, algunas soluciones o suspensiones macromoleculares pueden mostrar comportamientos no-Newtonianos aun cuando el solvente es Newtoniano (Tanford, 1961). No obstante, cuando el gradiente de velocidad es lo suficientemente bajo, la orientacin de las partculas es despreciable. Para esta situacin Simha, en 1940, extendi el tratamiento a suspenciones de partculas que son elipsoides de revolucin para gradientes de velocidad bajos (Tanford, 1961; Bohdaneck y Kovr, 1982),

= s (1 + )

(7.2.2)

donde el parmetro toma el valor de 2,5 en el caso de partculas esfricas y valores mayores a 2,5 cuando stas son elipsoides. Muchas veces, resulta conveniente expresar los datos experimentales en trminos de la viscosidad especfica sp = ( s ) s y, de esta forma, en el lmite de dilucin infinita, las ecuaciones (7.2.1) y (7.2.2) indican que sp es proporcional al nmero de partculas suspendidas por unidad de volumen. Por consiguiente, se puede esperar que sp sea proporcional a la concentracin
C . La cantidad sp C se conoce como viscosidad reducida red y en el lmite

de concentracin cero se obtiene la viscosidad intrnseca [ ] (Tanford, 1961; Bird et al., 1977; Bohdaneck y Kovr, 1982),

[ ] =

c 0

lim

sp
C

= lim

s c 0 s C

(7.2.3)

127

Captulo 7

La viscosidad intrnseca es de inters para estudiar las soluciones macromoleculares diluidas. sta se determina midiendo red a varias

concentraciones y extrapolando la secuencia a valores de concentracin cero.

Efecto de la concentracin

La viscosidad reducida red (la cual se extrapola a concentracin cero para obtener la viscosidad intrnseca) es fuertemente dependiente de la concentracin. Esta dependencia se expresa frecuentemente a travs de la ecuacin de Huggins (Tanford, 1961; Bird et al., 1977; Bohdaneck y Kovr, 1982),

sp
C

= [ ] + k1[ ]2 C

(7.2.4)

donde

k1

representa una medida de la interaccin entre molculas

suspendidas (Bohdaneck y Kovr, 1982; Flickinger et al., 1999). Asimismo, la dependencia de la viscosidad con la concentracin de soluciones

macromoleculares diluidas tambin se describe con la ecuacin de Kraemer (Bohdaneck y Kovr, 1982),

ln

r
C

= [ ] k 2 [ ]2 C

(7.2.5)

128

Captulo 7

donde r = s es la viscosidad relativa a la viscosidad del solvente s y k 2 es una constante que se debe determinar a partir de los datos experimentales junto con la viscosidad intrnseca. Adems, k1 y k 2 deben satisfacer la condicin k1 + k 2 1 2 (Bohdaneck y Kovr, 1982). Excepto en el caso de macromolculas de pesos moleculares muy grandes, frecuentemente se supone que las medidas de viscosidad en el rgimen diluido ( C 10 2 g / cm 3 ) se describen apropiadamente por las ecuaciones (7.2.4) y (7.2.5) (Bohdaneck y Kovr, 1982). Por consiguiente, la viscosidad intrnseca de una solucin macromolecular diluida se puede obtener considerando las siguientes condiciones,

sp lim ln r = lim C 0 C C 0 C

= [ ]

(7.2.6)

Efecto de la velocidad de corte

Como se mencion arriba, las molculas muy asimtricas o fcilmente deformables tienden a orientarse o deformarse a elevados gradientes de velocidad siendo este efecto muy importante en molculas que poseen valores de viscosidad intrnseca elevados (Tanford, 1961). Por tal motivo, resulta importante realizar mediciones de viscosidad intrnseca a velocidades de corte lo ms bajas posibles para evitar cuantificaciones errneas de [ ] en un rango de velocidad de corte desconocido y para poder realizar una extrapolacin confiable de los valores de viscosidad a velocidad de corte nula.

129

Captulo 7

7.3 Viscosidad intrnseca de gelatina para diferentes historias trmicas

Maduracin de soluciones de Gelatina

Para este estudio se utiliz una gelatina comercial (materia prima de cuero vacuno) provista por la empresa PB Leiner Gelatin (Santa Fe- Argentina)
r con un Bloom de 227 g y una viscosidad de norma (6,66 % p/p a 60 C) de 39

mps cuyo peso molecular promediado en nmero de moles M n = 133 kDa fue determinado mediante la tcnica de PAGE-SDS (ver Captulo 5). Para la determinacin de la viscosidad intrnseca se prepararon soluciones de gelatina con concentraciones de 10-3 a 4 10-3 g/cm3 fijando la fuerza inica en 110 mM con cloruro de sodio (NaCl) y tambin el pH en 9,8 con hidrxido de sodio. En este sentido, es relevante mencionar que en ausencia de sal, los nicos iones mviles presentes en la solucin son los contra-iones que acompaan a la macromolcula cargada. Por lo tanto, la concentracin de estos contra-iones y, consecuentemente, la fuerza inica del medio caen a medida que la concentracin de gelatina disuelta disminuye causando, de esta manera, una mayor expansin de la cadena polimrica (Tanford, 1961). Por consiguiente, el valor de fuerza inica seleccionado para las determinaciones de viscosidad intrnseca (I=110 mM) fue lo suficientemente alto como para que la contribucin a la misma por parte de los contra-iones de la cadena de gelatina elctricamente cargada sea despreciable. De esta forma, se logra que las soluciones preparadas a cuatro concentraciones de gelatina diferentes para la determinacin de [ ] , posean el mismo valor de fuerza inica determinado por el NaCl adicionado.

130

Captulo 7

Para la disolucin de la gelatina se realiz, primero, una etapa de hidratacin de diez minutos con agua deionizada a 50C y luego, otra etapa de disolucin total en un volumen cercano al volumen final con el contenido de NaCl a la misma temperatura. Esta etapa se realiz con agitacin durante cuarenta minutos. Seguidamente, se ajust el pH con NaOH y se complet el volumen final verificando el pH requerido. Asimismo, se adicion azida sdica en una concentracin de 0.02% para prevenir degradaciones bacterianas durante el perodo de maduracin. Luego, las soluciones se filtraron, se almacenaron en botellas de vidrio color caramelo para evitar el contacto con la luz y se sometieron a procesos de maduracin a diferentes temperaturas como se describe ms abajo. Una vez finalizado el proceso de maduracin se midi la viscosidad intrnseca a 25C para todas las experiencias que se describen a continuacin (Olivares et al., 2006): Experiencia 1 (E1): Las soluciones de gelatina a las cuatro concentraciones requeridas para la medicin de viscosidad intrnseca se maduraron por 20 horas a las siguientes temperaturas de maduracin: 5, 15, 25, 30 y 35C. Experiencia 2 (E2): Las soluciones de gelatina a las cuatro concentraciones requeridas para la medicin de viscosidad intrnseca se maduraron por 20 horas a 5C. Posteriormente se calentaron a 50 C, durante una hora, antes de ser evaluadas. Experiencia 3 (E3): Las soluciones de gelatina de la experiencia (E2) se remaduraron por 20 horas a 5 C. Experiencia 4 (E4): Las soluciones de gelatina a las cuatro concentraciones requeridas para la medicin de viscosidad intrnseca se maduraron por 20

131

Captulo 7

horas a 5C; en este caso una fuerza inica de 110 mM se estableci con tiocianato de potasio (KSCN). Experiencia 5 (E5): Las soluciones de gelatina a las cuatro concentraciones requeridas para la medicin de viscosidad intrnseca con adicin de urea 5, 20, 50 y 500 mM se maduraron por 20 horas a 5C. Para los ensayos reomtricos se utiliz un viscosmetro capilar gravitatorio que posee el capilar en posicin horizontal, el cual se describe en el Captulo 6. Aqu tambin se presenta la metodologa experimental llevada a cabo y el procesamiento de los datos obtenidos de cada experiencia.

7.4 Resultados

Viscosidad aparente de las soluciones diluidas de gelatina

Se observ que todas las soluciones diluidas de gelatina estudiadas aqu presentaron un comportamiento Newtoniano en el rango de velocidad de corte comprendido entre 2800 y 50 seg-1. En efecto, los datos experimentales obtenidos de H versus t se ajustaron satisfactoriamente con la ecuacin (6.2.12). En la Figura 7.4.1 se observa, a modo de ejemplo, el ajuste de los datos experimentales con un error relativo de ajuste = 0,019 (ver ecuacin (6.2.13)) correspondiente a un coeficiente de regresin lineal cuadrado de
r 2 0,999. Asimismo, en el Apndice II se resume en forma de tablas los datos

experimentales de H versus t obtenidos en cada experiencia.

132

Captulo 7

&w

2800

0,0

2400

ln(H/Ho )
-0,5 -1,0

2000

1600

-1,5

1200

-2,0

-2,5 800 -3,0 400 -3,5 0 0 100 200 300 400 500 600 700

t(s)
Figura 7.4.1. Comportamiento Newtoniano de una solucin de gelatina de concentracin 1.10-3 g/cm3. La historia trmica corresponde a la experiencia E1 a 25C. Los smbolos () representan los valores experimentales y la lnea slida es el ajuste realizado con la ecuacin. (6.2.12). La lnea de trazos muestra la variacin de la velocidad de corte en la experiencia.

El comportamiento Newtoniano se observ en todas las experiencias realizadas a las diferentes concentraciones de gelatina, temperaturas de maduracin y en presencia de KSCN y urea. Consecuentemente, la microestructura que presentan las soluciones diluidas de gelatina evaluadas estara compuesta de molculas individuales de gelatina y de agregados que poseen conformaciones relativamente simtricas (debido a que no se detectaron comportamientos pseudoplsticos). En este sentido, es sabido que las estructuras no esfricas (por ejemplo, las estructuras con conformacin de varillas rgidas) pueden presentar comportamientos pseudoplsticos (Fox et al., 1951; Bird et al., 1977; Bohdaneck y Kovr, 1982).

133

Captulo 7

Viscosidad intrnseca e historia trmica

Luego de comprobar el comportamiento Newtoniano de las soluciones


* y en el diluidas de gelatina en la zona comprendida en C c < C < C g y T < Tg

rango de velocidades de corte ensayadas, se procedi a la evaluacin de la viscosidad intrnseca de estas soluciones con el objetivo de inferir sobre el tamao de las estructuras generadas durante el proceso de maduracin. En las Figuras 7.4.2 a y b se muestran los resultados obtenidos con las experiencias E1 y E2 respectivamente donde se observa que las ecuaciones (7.2.4) y (7.2.5) proveen consistentemente el valor de [ ] . El resto de las experiencias se reportan el en Apndice II. Asimismo, en la Tabla 7.4.1 se resumen los resultados de viscosidad intrnseca obtenidos para todas las experiencias realizadas a las distintas historias trmicas. Se observa que la temperatura de maduracin tiene un efecto significativo en estos resultados. El menor valor promedio de [ ] 56.5 cm3/g corresponde a la experiencia E2 donde la posible agregacin ocurrida durante la maduracin a 5C durante 20 horas fue destruida calentando la solucin a 50C durante una hora antes de llevar a cabo el ensayo reomtrico. Este estado desagregado se obtuvo solamente para temperaturas de
* . calentamiento substancialmente mayores a Tg

Adems, es importante indicar que los valores de viscosidad intrnseca obtenidos tienen el orden de magnitud esperado. Por ejemplo, Boedtker y Doty (1954), Bohidar y Jena (1994) y Haug et al. (2004) reportaron valores de viscosidad intrnseca desde 39 a 42 cm3/g en un rango de temperatura de 25 a 50C con otras muestras de gelatina. 134

Captulo 7

(a)

(b)

130

130

red
120

ln r / C
120

red65
60

65

ln r / C
60

110

110

55

55

100

100

50

50

90 0,000

0,002

0,004
-3

90

45 0,000 0,001 0,002 0,003


-3

45 0,004 0,005

C (g cm )

C (g cm )

Figura 7.4.2. Valores experimentales de red () y de ln r c () para las distintas concentraciones de gelatina. Los datos experimentales corresponden a: (a) la experiencia E1 a 5C y (b) la experiencia E2. Asimismo, la lnea slida representa al ajuste de los datos experimentales con la ecuacin de (7.2.4) y la lnea de trazos representa al ajuste de los mismos con la ecuacin (7.2.5).

Adems, la concentracin de superposicin (overlap concentration)


C * = 1 [ ] (ver, por ejemplo, Bohdaneck y Kovr, 1982), estimada a travs de

los resultados de la experiencia E2 (correspondiente a cadenas de gelatina sin agregar) es de 1,78 %, lo cual coincide con lo estimado por Bohidar y Jena (1994) quienes reportan valores de C * de 2,09 % a 3,31 % cuando la temperatura aumenta de 35C a 60C respectivamente. La Tabla 7.4.1 tambin muestra los valores de los parmetros k 1 y k 2 calculados en forma separada a travs de las respectivas pendientes (ver Figura 7.4.2), validando que k 1 + k 2 0,5 . Debido a que el parmetro k 1 est relacionado en general con las interacciones partculapartcula y partculasolvente, se encontr que los valores de k 1 obtenidos indican que estas interacciones decrecen substancialmente a medida que la temperatura se

135

Captulo 7

* aproxima a Tg (ver Captulo 4) generando estructuras de menor tamao. Este

resultado indicara que la transicin de cadena errtica a hlice disminuye o, eventualmente, termina alrededor de los 30C.

Tabla 7.4.1 Viscosidad intrnseca en cm3/g y coeficientes k1 y k 2 obtenidos a travs de los ajustes experimentales con las ecuaciones (7.2.4) y (7.2.5) (Olivares et al., 2006). Experiencia Tm Urea [ ] [ ] k1 k2 3 -1 3 -1 3 -1 (C) (mM) (cm g ) (cm g ) (cm g ) (cm3 g-1) Ec. (7.2.4) Ec. (7.2.5) Ec. (7.2.4) Ec.(7.2.5) 0.23 0.22 115.5 116.2 E1 5 0.23 0.23 92.3 92.6 15 0.31 0.14 62.4 62.6 25 0.44 0.03 59.2 59.5 30 0.32 0.14 56.7 56.8 35 E2 56.5 56.4 0.13 0.32 E3 110.3 110.0 0.28 0.20 E4 77.7 77.3 0.11 0.31 0.17 0.33 94.1 94.3 E5 5 0.15 0.33 84.5 84.6 20 0.19 0.29 85.5 85.7 50 0.23 0.22 85.5 85.8 500

Debido a que k 1 aumenta nuevamente por encima de 30C, se podra


* esperar que superando esta temperatura ( T > Tg ) se produzcan otros tipos de

interacciones entre cadenas (por ejemplo, las interacciones hidrodinmicas), donde las unidades hidrodinmicas bsicas se encuentran bajo un movimiento Browniano ms intenso, el cual es proporcional a k BTm , y probablemente no contienen triples hlices (Olivares et al., 2006). Este resultado es consistente
* 26C estimado por Braidot y Deiber (1999). con el valor de Tg

Es claro que el aumento de la viscosidad intrnseca para valores menores de temperatura de maduracin (ver Tabla 7.4.1) puede estar asociado a la agregacin de cadenas de gelatina mediante la formacin de zonas de

136

Captulo 7

triples hlices; de esta manera el volumen hidrodinmico ocupado por estos agregados es mayor que el correspondiente a la experiencia E2. La Figura 7.4.3 muestra la evolucin de la viscosidad intrnseca con la temperatura de maduracin y permite evidenciar claramente estos resultados. Adems, el fenmeno de agregacin se refleja en el aumento de k1 para las soluciones de gelatina maduradas a bajas Tm . Ms an, a travs de la experiencia E3 se concluye que el proceso de agregacin es trmicamente reversible debido a que el valor de viscosidad intrnseca obtenido en E1 a 5C fue prcticamente reproducido. Por consiguiente, el proceso de agregacin en la zona diluida involucra interacciones termo-reversibles entre cadenas diferentes de gelatina asociadas mediante la formacin de zonas de triples hlices (Boedtker y Doty, 1954; Harrington y Rao, 1970; Harrington y Karr, 1970; Busnel et al., 1989).

150

[] (cm g )
3 -1

100

50

10

15

20

25

30

35

40

Tm (C)
Figura 7.4.3. Viscosidad Intrnseca en funcin de la temperatura de maduracin de las experiencias descriptas en E1.

137

Captulo 7

Con el fin de verificar el fenmeno de agregacin, en las experiencias E4 y E5 se utilizaron inhibidores de enlaces del tipo puente-hidrgeno. Tanto el tiocianato de potasio (KSCN) como la urea inhibieron el proceso de agregacin debido a que los valores de viscosidad intrnseca obtenidos fueron menores que aquellos realizados en las mismas condiciones experimentales pero en ausencia de estos agentes qumicos. No obstante, los valores obtenidos fueron mayores que en el caso de la experiencia E2 (ver Tabla 7.4.1). En E4 el proceso de inhibicin fue logrado parcialmente y, a una concentracin de 110 mM de KSCN, las cadenas de gelatina tuvieron poca agregacin. Este resultado es consistente con el reportado por Horsk y vanter (1993) quienes trabajaron con soluciones diluidas de gelatina a 15C en presencia de una concentracin de 500 mM de KSCN. En nuestro anlisis experimental se evit la variacin de la concentracin de KSCN debido a que el cambio en la fuerza inica afecta, por supuesto, los valores de viscosidad intrnseca (ver Captulo 9, Figura 9.4.1). De E5 se observa que la viscosidad intrnseca decrece a medida que aumenta la concentracin de urea. Para concentraciones de urea mayores a 20 mM se obtiene un valor constante de viscosidad intrnseca de 85 cm3/g aproximadamente. La Figura 7.4.4 muestra estos resultados. En lo referente a este tema, Boedtker y Doty (1954) obtuvieron valores de viscosidad intrnseca a 40,2 C y encontraron resultados similares en presencia de urea 9 M (este valor es muy superior al valor de saturacin encontrado en esta tesis y reportados en la Tabla 7.4.1). Dichos autores argumentaron que las cadenas de gelatina presentan una expansin en presencia de urea y, por lo tanto, el valor de viscosidad intrnseca que se obtiene es mayor. Por consiguiente, se podra inferir que el mismo fenmeno

138

Captulo 7

de expansin estara presente en la experiencia E5. En este sentido, la urea no permitira la estabilizacin de las zonas de triples hlices formadas durante el proceso de agregacin. No obstante, las bases moleculares por las cuales la urea posee la habilidad de desnaturalizar una protena (o inhibir la estructura secundaria) todava se encuentra bajo estudio (Bennion y Daggett, 2003). Es as como, se observa que la estabilizacin de la triple hlice de poli-L-prolina se debe a la formacin de enlaces del tipo puente-hidrgeno entre el grupo -C=0 de la prolina o hidroxiprolina y el grupo H de la glicina produciendo una unin intercatenaria (Ward y Courts, 1977). En consecuencia, el efecto de inhibicin de la urea y del KSCN se producira a este nivel molecular.

125 120 115 110

[] (cm /g)
3

105 100 95 90 85 80 75 0 100 200 300 400 500

Urea (mM)
Figura 7.4.4. Viscosidad Intrnseca en funcin de la concentracin de urea (mM) de las experiencias descriptas en E5.

139

Captulo 7

7.5 Conclusiones

Los resultados obtenidos muestran que para C c < C < C g la temperatura de maduracin afecta los valores de viscosidad intrnseca debido a la agregacin de las cadenas de gelatina. As, cuando la temperatura de
* , las cadenas de maduracin se encuentra por debajo del valor crtico Tg

gelatina evolucionan a la conformacin de poli-L-prolina y se estabilizan mediante la generacin de zonas de triples hlices, dando lugar a la formacin de agregados o clusters. Estos agregados son termo-reversibles y se destruyen calentando las soluciones a 50C. La urea y KSCN inhibieron el proceso de agregacin y arrojaron valores de viscosidad intrnseca inferiores a los obtenidos en las mismas condiciones de tiempo y temperatura de maduracin en ausencia de estos agentes qumicos. Para una concentracin de urea mayor a 20 mM se obtuvieron valores de viscosidad intrnseca ms grandes que para el caso en el que se elimin la formacin de agregados mediante calentamiento trmico

(Experiencia E2). Es claro que este tipo de ensayo macroscpico, como es la determinacin de la viscosidad intrnseca, permite obtener conclusiones relevantes que conciernen a la evolucin de las molculas de gelatina en el rango de concentracin diluido. En tal sentido, haciendo uso de esta tcnica reomtrica y tomando como base estos resultados, en el Captulo 8 se realiza un estudio cintico del proceso de agregacin de cadenas y se obtienen conclusiones acerca de la microestructura de los clusters que se forman durante la maduracin a distintas temperaturas.

140

Captulo 7

En general se concluye que el estudio de la evolucin de las soluciones diluidas de gelatina provee informacin relevante sobre la dinmica de las cadenas que, a concentraciones ms elevadas, generan el gel.

141

Captulo 7

7.6 Bibliografa

Barnes, H. A.; Hutton, J. F. and Walters , K. (1991). An Introduction to

Rheology, Elsevier, Amsterdam.


Bennion, B. J. y Daggett, V. (2003). The molecular basis for the chemical denaturation of proteins by urea. PNAS, 100(9), 5142-5147. Bird, R.; Armstrong, C. y Hassager O. (1977). Dynamic of Polymeric Liquids, vol I, John Wiley & Sons, New York. Boedtker, H. y Doty, P. (1954). A study of gelatin molecules, aggregates and gels. J. of Chem. Phys., 5, 968-982. Bohdaneck, M. y Kovr, J. (1982). Viscosity of Polimer Solutions, Elsevier Scientific Publishing Company. New York. Bohidar H. B. y Jena S. S. (1994). Study of sol-state properties of aqueous gelatin solutions, J. Chem. Phys.100, 6888-6895. Braidot, A. A. A. y Deiber, J. A. (1999). Linear viscoelastic model of a maturing gelatin solution. Biorheology, 36, 267-284. Busnel, J. P., Morris, E. R. y Ross Murphy, S. B. (1989). Interpretation of renaturation kinetics of gelatin solutions. Int. J. Biol. Macromol., 11(2), 119-125. Einstein A. (1906). Investigation on the Theory of the Brownian Movement. Dover Publications, New York. Flickinger, G. L.; Dairanieh, I. S. y Zukoski, C. F. (1999). The rheology of aqueous polyurethane dispersions. J. Non-Newtonian Fluid Mech., 87(2&3), 283-305.

142

Captulo 7

Harrington, W. F. y Karr, G. M. (1970). Collagen structure in solution II. Analysis of refolding kinetics in terms of nucleation and growth processes. Biochemistry, 9(19), 3725-3733. Harrington, W. F. y Rao N. V. (1970). Collagen structure in solution: I. Kinetics of helix regeneration in single-chain gelatins. Biochemistry, 9(19), 3714-3724. Haug, I. J.; Draget, K. I. y Smidsrod, O.(2004). Physical and rheological properties compared to mammalian gelatin. Food Hydrocolloids, 18, 203-213 . Hiemenz, P. C. (1986). Principles of Colloid and Surface Chemistry. Marcel Dekker, Inc., New York. Horsk, J. y vantner, J. (1993). Gelatin renaturation and viscosity of dilute gelatin solutions. Polymer International, 32(2), 159-164. Olivares, M. L.; Peirotti, M. B. y Deiber, J. A. (2006). Analysis of gelatin chain aggregation in dilute aqueous solutions through viscosity data. Food

Hydrocolloids, 20, 1039 - 1049.


Simha R. (1940). The Influence of Brownian Movement on the viscosity of solutions. J. Phys. Chem.,44,25- 42. Tanford, Ch. (1961). Fisical Chemistry of Macromolecules, Wiley, New York. Ward, A. G. y Courts, A. (1977). The Science and Technology of Gelatin. London: Academic Press.

143

Captulo 8

Agregacin de molculas de gelatina en solucin diluida

Captulo 8

8 Agregacin de molculas de gelatina en solucin diluida

8.1 Introduccin

En el presente captulo se estudia la agregacin de cadenas de gelatina en las zonas de concentracin diluida ( Cc < C < C g ) y ultra-diluida C < Cc , a
* ). Para este temperaturas inferiores a la temperatura de gelificacin ( T < Tg

estudio, las soluciones de gelatina se someten a distintas temperaturas de maduracin Tm durante diferentes tiempos de maduracin t m y se evalan a travs de medidas de viscosidad especfica sp . Para los ensayos experimentales se utiliza el viscosmetro capilar gravitatorio, diseado y construido especialmente para obtener un rango de velocidades de corte bajas (ver Captulo 6). En este sentido, es relevante recordar que mediante el estudio realizado a travs de medidas de viscosidad intrnseca, se concluye que para la zona de
* la agregacin de cadenas concentracin comprendida en Cc < C < C g y T < Tg

de gelatina es debida a la formacin de zonas o ncleos de triples hlices. Estos ncleos se estabilizan principalmente por enlaces del tipo puentehidrgeno, y dan lugar a una agregacin termo-reversible (para mayores detalles ver Captulo 7). Asimismo, considerando lo discutido en el Captulo 4, donde se concluye que el mecanismo de formacin del ncleo de triple hlice es predominantemente bimolecular, los resultados experimentales obtenidos se interpretan con la teora cintica de Smoluchowski. Mediante este anlisis terico se arriba a conclusiones que conciernen al tamao de los clusters

144

Captulo 8

formados durante la agregacin y a las caractersticas microestructurales de los mismos. Adems, se obtiene informacin acerca del nmero promedio de cadenas de gelatina presentes en estos clusters para diferentes tiempos y temperaturas de maduracin.

8.2 Protocolo experimental para la medicin de la viscosidad especfica

Para este estudio se utiliz la misma muestra de gelatina analizada a travs de los ensayos de viscosidad intrnseca (ver caractersticas de dicha muestra de gelatina en el Captulo 7) la cual posee un peso molecular promedio M n = 133 KDa obtenido mediante PAGE-SDS (ver los detalles de este estudio en el Captulo 5). Para la determinacin de la viscosidad especfica a distintos tiempos y temperaturas de maduracin se prepararon soluciones de gelatina con una concentracin de 10-3 g/cm3. La fuerza inica se estableci en 110 mM con cloruro de sodio (NaCl) y el pH en 9,8 con hidrxido de sodio (NaOH). Para la disolucin de la gelatina se realiz, primero, una primera etapa de hidratacin de diez minutos con agua deionizada a 50C y luego, otra etapa de disolucin total en un volumen cercano al volumen final con el contenido de NaCl a la misma temperatura. Esta etapa se realiz con agitacin durante cuarenta minutos. Seguidamente, se ajust el pH con NaOH, se complet el volumen final verificando el pH requerido. Por otra parte, se adicion azida sdica en una concentracin de 0,02 % para prevenir degradaciones bacterianas durante el perodo de maduracin. Las soluciones se filtraron, se almacenaron en botellas de vidrio color caramelo y se sometieron a maduracin durante 24

145

Captulo 8

horas, evalundose la viscosidad especfica sp a 25C a los tiempos de maduracin 0, 2, 8, 11, 20 y 24 horas. Este procedimiento se realiz para las temperaturas de maduracin 5, 15, 20 y 25 C. Asimismo, se prepar una solucin de gelatina de concentracin 10-3 g/cm3 (fuerza inica 110 mM y pH 9,8) a la cual se le adicion una concentracin de 6 10 4 M de duodecyl sulfato de sodio (SDS) y, posteriormente, se madur durante 24 horas a 15C, evaluando la viscosidad especfica a 25C a los tiempos de maduracin 0, 2, 8, 11, 20 y 24 horas. Es preciso aclarar aqu, que la concentracin de surfactante es inferior a la concentracin micelar crtica (8 10-3 M) (ver tambin Herning et al., 1991). Esta experiencia se realiz con el objetivo de evaluar si las interacciones hidrofbicas tambin participan en el fenmeno de agregacin en la zona diluida. Para el estudio de las soluciones ultra-diluidas ( C < Cc ), se prepar una solucin de gelatina de concentracin 10-5 g/cm3 en idnticas condiciones fisicoqumicas que las establecidas para las soluciones diluidas (pH= 9,8 y I= 110 mM). La misma se madur a 25C durante 168 horas (siete das) a un
* promoviendo, de esta manera, la formacin de valor de Tm cercano a Tg

estructuras ordenadas con la conformacin del tipo varillas rgidas (Harrington y Rao, 1970).

8.3 Viscosidad especfica en funcin del tiempo de maduracin

Antes de comenzar la discusin concerniente a la evolucin de la viscosidad especfica con el tiempo y la temperatura de maduracin, es preciso aclarar que, al igual que en las experiencias de viscosidad intrnseca, en todos 146

Captulo 8

los casos las soluciones se comportaron como fluidos newtonianos en el rango de velocidad de corte comprendido entre 2800 y 50 s-1. En efecto, los datos experimentales de H versus t se ajustaron satisfactoriamente con la ecuacin 6.2.12 y arrojaron coeficientes de regresin lineal cuadrado r 2 0,999 y errores relativos de ajuste 0,02. A esta conclusin solamente se arriba mediante el uso de un dispositivo como el que se propone en esta tesis. Ms an, mediante el uso de los viscosmetros comerciales no es posible al presente determinar si la solucin macromolecular presenta pseudoplasticidad en mayor o menor grado. Tanto es as que en las bibliografas previas sobre el tema no se reportan las velocidades de corte a las cuales se ensayaron las soluciones macromoleculares. Sorprende que la nica excepcin a esta crtica sea el trabajo de Fox et al., (1951) el cual est referenciado en el conocido libro de Tanford (1961). En la Figura 8.3.1 se observa la evolucin de la viscosidad especfica a medida que transcurre el tiempo de maduracin en las experiencias realizadas a las distintas Tm . Los datos experimentales muestran que en todas las experiencias sp aumenta en forma lineal en el rango de tiempo de maduracin evaluado arrojando coeficientes de regresin lineal cuadrados r 2 0,98 . Asimismo, mediante la evaluacin de la viscosidad especfica de la solucin de gelatina con agregado de SDS, se obtuvieron los mismos valores de sp que en la experiencia realizada a la misma temperatura de maduracin ( Tm = 15C) en ausencia de este surfactante. Estos resultados sugieren que las interacciones hidrofbicas no son responsables de la agregacin de cadenas
* de gelatina en la zona de temperaturas inferiores a Tg (ver tambin Herning et

147

Captulo 8

al.,

1991,

quienes

sugieren

que

las

interacciones

hidrofbicas

son,

posiblemente, las responsables de la agregacin de cadenas de gelatina en la


* zona diluida C < C g pero a temperaturas elevadas ( T > Tg )).

0,14

0,12

sp

0,10

0,08

0,06 0 5 10 15 20 25 30

tm (h)
Figura 8.3.1 Viscosidad especfica sp en funcin del tiempo de maduracin. Las temperaturas de maduracin Tm evaluadas fueron: 5C (+), 15C (), 20C (), 25C (). Por consiguiente, se podra concluir que en la zona diluida los clusters se forman por la agregacin de cadenas de gelatina mediante la formacin de uniones fsicas con estructuras de triple hlice, como tambin lo revelan los resultados obtenidos de viscosidad intrnseca (ver discusin referente a este tema en el Captulo 7).

148

Captulo 8

8.4 Agregacin de molculas de gelatina

Antes de comenzar con el anlisis de la agregacin de cadenas de gelatina en solucin diluida, es preciso indicar que al inicio de la maduracin, los valores de sp C a todas las temperaturas de maduracin son cercanos al valor de viscosidad intrnseca obtenido cuando las soluciones de gelatinas son tratadas trmicamente durante una hora a 50C (ver experiencia E2 descripta en el Captulo 7). En efecto, estos valores no difieren de los valores de sp C obtenidos en E2 para la misma concentracin en ms de 0,41%. Como se explic en el Captulo 7, mediante este tratamiento trmico se destruyen las zonas de unin entre cadenas de gelatina, y se obtiene una solucin libre de agregacin. Por consiguiente, estos resultados muestran que para la concentracin de gelatina utilizada en estas experiencias ( C = 10-3 g/cm3) las macromolculas no se encuentran asociadas o agregadas al inicio de la maduracin. Asimismo, es preciso aclarar que esta concentracin es lo suficientemente baja como para obtener valores cercanos a los de la viscosidad Intrnseca pero lo suficientemente elevada como para evitar la zona ultra-diluida ( C > Cc ), donde se producira la formacin de hlices

intramoleculares (ver en el Captulo 4 una discusin ms detallada de esta fenomenologa). Teniendo en cuenta los estudios previos realizados por distintos autores, los cuales fueron discutidos en el Captulo 4, se considera que las cadenas de gelatina en solucin diluida ( Cc < C < C g ) se encuentran inicialmente en la conformacin de cadena errtica (random coils) y que durante el transcurso de la maduracin, cuando la temperatura es lo suficientemente baja, experimentan 149

Captulo 8

una conversin por tramos a la conformacin de hlice de poli-L-prolina. Estas estructuras pueden, en principio, visualizarse como esferas equivalentes compuestas por la cadena proteica y el solvente ocluido (Tanford, 1961), teniendo en cuenta que el nmero de uniones virtuales (Flory, 1969) en la cadena polipeptdica es mayor a 200 para la muestra estudiada. Por otra parte, para el rango de concentracin comprendido entre 10-3 y 10-4 g/cm3 la formacin de ncleos se puede considerar bimolecular (Busnel et al., 1989; Benguigui et al., 1991, Ross-Murphy, 1992), por consiguiente, este mecanismo de asociacin se adopta como vlido para el proceso de maduracin descripto en la Seccin 8.2. Adems, debido a que la formacin de los ncleos es el mecanismo que controla la cintica del proceso de agregacin (Harrington y von Hippel, 1961; Harrington y Rao, 1970; Busnel et al., 1989), se infiere que el fenmeno de agregacin de cadenas de gelatina se puede interpretar mediante la teora cintica de Smoluchowski, a los efectos de explorar la validez del mecanismo de agregacin bimolecular propuesto por diversos autores. Este contexto terico se describe en trminos de fracciones de agregados donde cada uno posee k molculas con un radio equivalente
ak . En este sentido, el proceso de crecimiento es controlado por la velocidad

de colisin J ij de pares de agregados (ver, por ejemplo, Russel et al., 1989),

J ij =

2 k BTm ai + a j 3 s

1 ) a

1 aj

ni n j Wij

(8.4.1)

150

Captulo 8

donde n i y n j son el nmero de agregados por unidad de volumen que contienen i y j molculas, respectivamente y, Wij es el factor de estabilidad coloidal. Luego, el balance de masa se expresa,

dn k 1 k 1 = J ij J ki dt m 2 i =1 i =1 j =k i

(8.4.2)

con la condicin inicial n1 (0 ) = n0 y n k (0 ) = 0 para k > 1. Aqu, n0 es el nmero inicial de molculas de gelatina. Es posible obtener una solucin analtica de este problema suponiendo que: (a) La colisin se produce entre pares de agregados de tamaos aproximadamente iguales, esto es,

1 (ai + a j ) a

1 aj

=4

(8.4.3)

y (b) El factor de estabilidad coloidal es independiente del tamao de los agregados, es decir W ij = W . Luego, aplicando las hiptesis (a) y (b) a las ecuaciones (8.4.1) y (8.4.2) se obtiene,

nk =

(1 + t m

n0 t m t p

)k 1 t p )k +1

(8.4.4)

151

Captulo 8

donde el tiempo caracterstico es t p = 3sW 4n0 k BTm . En este contexto, el

nmero total de agregados por unidad de volumen n tot = n i se utiliza para


i =1

definir el nmero promedio de molculas por agregado N = n0 ntot al tiempo de maduracin t m ; por consiguiente,

N =1+

tm tp

(8.4.5)

En la ecuacin (8.4.5) el tiempo caracterstico se puede expresar como


t p = 1 k a n0 , donde k a = 4 k BTm 3 sW = k d W es la constante de velocidad

de agregacin y k d es la constante de agregacin limitada por difusin (Hunter, 1992). Es bien conocido que cuando la agregacin es rpida W = 1 y k a = k d . Por otro lado, cuando existe una barrera energtica en la interaccin entre las unidades cinemticas la frecuencia de colisin disminuye. En efecto, la estabilidad de una suspensin coloidal depende de la presencia de fuerzas repulsivas que superen a las fuerzas atractivas (siempre presentes) entre molculas. En estas circunstancias, k a k d y el factor de estabilidad coloidal adquiere valores mayores. Este rgimen se conoce como agregacin lenta o difusin limitada por reaccin (Overbeek, 1977; Hunter, 1992). La ecuacin (8.4.5) se puede vincular con la viscosidad de soluciones diluidas de gelatina bajo las hiptesis establecidas anteriormente mediante la viscosidad especfica sp como sigue,

152

Captulo 8

s sp = s

= a

(8.4.6)

donde a es la fraccin volumtrica efectiva de la fase discreta en el estado agregado y es el factor de forma, el cual, como ya se expres en el Captulo 7, para macromolculas esfricas toma el valor de 2,5. Asimismo, es necesario una relacin entre a y la fraccin volumtrica inicial de cadenas simples de gelatina , expresada como,

4 3 NA a C Mn 3

(8.4.7)

donde a es el radio promedio inicial de las cadenas simples, teniendo en cuenta que este biopolmero es a su vez polidisperso. En este sentido, dentro del marco de la teora utilizada aqu, se supone que los agregados en el rgimen diluido forman estructuras fractales a temperaturas de maduracin
* . De esta manera, los agregados constituyen clusters que inferiores a Tg

ocluyen solvente en su interior. Luego, el nmero de molculas de gelatina promedio por agregado N , se relaciona con la dimensin fractal f 3 a travs de la siguiente relacin (Russel et al., 1989),

R N = a

(8.4.8)

153

Captulo 8

donde R es el radio promedio de la poblacin de agregados a un valor especfico del tiempo de maduracin. Es apropiado indicar que f representa la estructura interna de los agregados y depende de la velocidad de agregacin. Por ejemplo, para velocidades de agregacin altas f = 1,75 mientras que para velocidades de agregacin bajas, f = 2,0 2,2. Adems, cuando ocurren reordenamientos internos dentro de los agregados, este parmetro se aproxima cada vez ms al valor 3 debido a que ese arreglo interno condiciona la formacin de estructuras ms compactas removiendo solvente ocluido (Russel et al., 1989). Haciendo uso del peso molecular promediado en nmero de moles obtenido mediante PAGE-SDS (ver procedimiento en el Captulo 5), el radio equivalente promedio inicial de las cadenas simples de gelatina a se puede estimar a partir del valor experimental de viscosidad intrnseca de la experiencia E2 descrita en el Captulo 7 utilizando la siguiente ecuacin (Tanford, 1961),

[ ] =

4 a 3 N A
3Mn

(8.4.9)

obtenindose un valor de a 106 . Luego, dentro de este contexto terico, a travs de la ecuacin (8.4.8) la fraccin volumtrica efectiva promedio

a = ntot

n 4 4 R 3 = o R 3 se puede expresar de la siguiente manera, 3 N 3

a = N

(3 f )

(8.4.10)

154

Captulo 8

para obtener a partir de las ecuaciones (8.4.6) y (8.4.10) la siguiente ecuacin,

sp N =

(3 f )

(8.4.11)

El valor de la fraccin volumtrica efectiva de la fase discreta en ausencia de agregacin se puede estimar realizando = sp a t m = 0 debido a que, como se mostr ms arriba, a este tiempo de maduracin las molculas de gelatina todava no han sufrido agregacin. De este modo, el valor obtenido es

= 0,023 para C = 10-3 g/cm3.


A los efectos de cuantificar el parmetro t p a cada temperatura de maduracin se evalu el valor de f requerido en la ecuacin (8.4.11). Para esto, se realiz un proceso iterativo dando diferentes valores de f en la ecuacin (8.4.11) para obtener valores de N a los distintos tiempos de maduracin t m . Luego, con los pares de valores de N versus t m obtenidos en este proceso iterativo se evalu t p a travs de la ecuacin (8.4.5). El valor definitivo de t p fue aquel que arroj el mejor coeficiente de regresin lineal cuadrado en la ecuacin (8.4.5) de todo el proceso iterativo. Para la ejecucin de este procedimiento se realiz un programa numrico en lenguaje de programacin Fortran cuyo diagrama de flujo se presenta en el Apndice I. Estos resultados se muestran en la Figura 8.4.2.

155

Captulo 8

4,0

N=no/ntot

3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0 5 10 15 20 25

tm (h)

Figura 8.4.2. Nmero promedio de molculas de gelatina por agregado ( N ) en funcin del tiempo de maduracin t m a las siguientes temperaturas de maduracin: 5C (), 15C (), 20C () y 25C ().

Debido a que n0 = C

NA = 4,53.1015 molculas/cm3 en la Tabla Mn

8.4.1 se reportan los valores obtenidos de f , t p , k a y W . Tambin se reportan en esta tabla los coeficientes de regresin lineal cuadrado obtenidos con los ajustes de los datos experimentales de cada experiencia. Siguiendo la evolucin de k a o t p en la Tabla 8.4.1 se observa que la velocidad de reaccin aumenta a medida que la temperatura de maduracin disminuye. En este sentido, W aumenta con la temperatura de maduracin consistentemente. Estos resultados muestran en forma cuantitativa que menores temperaturas promueven la agregacin en la zona de concentracin diluida (para Cc < C < C g ). Los valores grandes de W reportados en la Tabla 8.4.1 permiten concluir que la agregacin es lenta en todo el rango de

156

Captulo 8

temperatura ensayado. Asimismo, para 5, 15 y 20C la dimensin fractal obtenida es relativamente baja. Estos valores probablemente indican que el fenmeno de nucleacin, el cual se promueve a bajas temperaturas, produce agregados desordenados que ocluyen gran cantidad de solvente. Dicha situacin cambia para la temperatura de maduracin de 25C donde la dimensin fractal obtenida es f = 2.43. En efecto, a temperaturas de
* maduracin mayores ( Tm cercanas a Tg ) es esperable que los procesos de

nucleacin y de crecimiento ocurran simultneamente (ver, por ejemplo, Harrington y Rao, 1970; Harrington y Karr, 1970) generando estructuras fractales ms compactas. Adems, es posible observar que para Tm = 25 C el coeficiente de regresin lineal cuadrado es r 2 0.84 , y que este valor es menor que el obtenido para las otras temperaturas de maduracin. Este resultado se debe a que, probablemente, el modelo de agregacin se basa en la formacin de un ncleo de triple hlice bimolecular y a esta temperatura el proceso de crecimiento de los ncleos formados comienza a ser relevante.

Tabla 8.4.1 Dimensin fractal f , tiempo caracterstico t p , constante

de velocidad de agregacin k a , factor de estabilidad coloidal W y coeficiente de regresin cuadrado r 2 obtenidos mediante la teora de agregacin de Smoluchowsky. f W Tm (C) t p (horas) k a (cm3 seg-1) r2 5 15 20 25 1,79 1,79 1,82 2,43 10,8 18,7 26.5 60.2 5,7 10-21 3,3 10-21 2,3 10-21 1,0 10-21 5,8 108 1,4 109 2,3 109 6,0 109 0,99 0,99 0,98 0,84

157

Captulo 8

Estas conclusiones son consistentes con los resultados obtenidos por Harrington y Karr (1970) quienes predijeron, mediante mediciones de rotacin ptica de soluciones diluidas de gelatina, que el proceso de crecimiento aumenta a mayores temperaturas de maduracin. En la Figura 8.4.3 se analiza el fenmeno de agregacin a un mismo tiempo de maduracin de 24 horas. Se observa que el nmero promedio de partculas por agregado N disminuye a medida que aumenta la temperatura de maduracin variando de 1,38 partculas en promedio por agregado para la temperatura de 25C a 3,20 partculas en promedio por agregado para la temperatura de maduracin de 5C.

N=no/ntot
4

10

15

20

25

Tm (C)
Figura 8.4.3 Nmero promedio de partculas por agregado N en funcin de la temperatura de maduracin Tm para un tiempo de maduracin de 24 horas.

158

Captulo 8

Una vez conocido el tiempo caracterstico t p se analiz la variacin de la relacin n k n0 en funcin del tiempo de maduracin para diferentes valores k de molculas de gelatina, haciendo uso de la ecuacin (8.4.4). La Figura 8.4.4 muestra, a manera de ejemplo, los resultados obtenidos para la temperatura de maduracin de 5C. En todas las experiencias se observa que, a medida que transcurre el tiempo de maduracin, el nmero de molculas sin agregar ( k = 1) disminuye mientras que los agregados con diferentes cantidades de k molculas

aumentan en un principio, luego toman un valor mximo y posteriormente comienzan a disminuir nuevamente a expensas del crecimiento de agregados con mayor cantidad de molculas asociadas (en la Figura 8.4.4 se observa
n k no para k = 2 y k = 4 ).

10

nk/no

k=1 k=2 k=4

0,1 0,01 1E-3 1E-4 1E-5 1E-6 1E-7

10

15

20

25

tm (h)
Figura 8.4.4 Variacin de la relacin n k n0 en funcin del tiempo de maduracin para diferentes valores de k molculas de gelatina a una temperatura de maduracin de 5C.

159

Captulo 8

Asimismo, resulta relevante evaluar la distribucin de tamao de los agregados Sk = kn k n0 . Debido a que el nmero k de molculas de gelatina por agregado, las cuales poseen radio ak , satisface k = Ak f siendo

Ak = (ak a ) (Russel et al., 1989), es claro que S k puede ser expresada en

trminos del tiempo adimensional t m t p ; luego, de la ecuacin (8.4.4) se obtiene,


Sk = kn0 t m t p n0 1 + t m

)k 1 t p )k +1
k =1

(8.4.12)

La ecuacin (8.4.12) satisface

Sk

= 1 . La Figura 8.4.5 muestra la variacin

de S k en funcin de k para distintos tiempos de maduracin en la experiencia realizada a 5C.

0,7

Sk
0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

10

13

16

Figura 8.4.5 S k en funcin del nmero de molculas de gelatina por agregado k de la experiencia realizada a 5C. Los tiempos de maduracin son: 2 ( ) , 10 ( ) , 20 ( LL) y 24 ( ___ ) horas.

160

Captulo 8

Se observa que S k tiende a ser altamente polidispersa adoptando una forma del tipo gaussiana a medida que el tiempo de maduracin aumenta (ver Figura 8.4.5 para los tiempos de maduracin de 20 y 24 horas). Adems, en la Figura 8.4.6 se observa la variacin de S k en funcin de
ak para distintos tiempos de maduracin de la experiencia realizada a 5C. En

esta figura tambin se observa, a travs de la dispersin de la funcin S k , cmo a medida que transcurre el tiempo de maduracin la poblacin de agregados de distintos tamaos se vuelve ms heterognea.

0,8

Sk

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

-0,1

100

200

300

400

500

600

ak ()

Figura 8.4.6 Variacin de S k en funcin del tamao de los agregados ak de la experiencia realizada a 5C. Los tiempos de maduracin son: 2 ( ) , 10 ( ) , 20 ( LL) y 24 ( ___ ) horas.

El radio promedio de los agregados en solucin para valores especficos de tiempo y temperatura de maduracin se puede expresar,

161

Captulo 8

R=

k =1

S k ak
La Figura 8.4.7 muestra la evaluacin de R

(8.4.13)

en funcin de la

temperatura de maduracin mientras se mantiene constante el tiempo de maduracin.

R ()

280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 0 5 10 15 20 25 30

Tm (C)
Figura 8.4.7 Variacin del tamao promedio de agregado R en funcin de la temperatura de maduracin Tm . Los tiempos de maduracin son: 2 (), 5 (), 8 (V), 11(), 20 () y 24 () horas.

Se observa que el radio promedio R decrece linealmente a medida que aumenta la temperatura de maduracin, dentro del rango de tiempos y temperaturas evaluadas, lo que resulta claramente una consecuencia de la menor agregacin y de la formacin de estructuras ms compactas a medida que aumenta la temperatura. 162

Captulo 8

8.5 Anlisis de la influencia del primer efecto electroviscoso en el radio hidrodinmico de las molculas de gelatina

Como se mencion en el Captulo 2, las molculas de gelatina poseen cargas elctricas en la secuencia peptdica debido a la presencia de aminocidos bsicos y cidos generando, de esta forma, una doble capa difusa de iones de longitud caracterstica 1 , cuando estn disueltas en un medio donde se encuentran los contra-iones y eventualmente iones adicionales (ver Captulo 2 donde se discute la teora de la doble capa elctrica). Es por esto que cuando una solucin de macromolculas de estas caractersticas se somete a flujo de corte, existe una contribucin a la viscosidad de esta solucin debido a la distorsin de la nube inica que rodea a la macromolcula (Conway y Dobry-Duclaux, 1960). Este fenmeno de naturaleza electrosttica se denomina primer efecto electroviscoso y se debe analizar en el presente estudio de agregacin de cadenas de gelatina en el rgimen de concentracin diluido. Los primeros intentos por cuantificar la influencia del primer efecto electroviscoso sobre la viscosidad de soluciones diluidas fueron realizados por Smoluchowski en 1916. Una de las formas aceptadas actualmente fue obtenida por Booth en 1950 la cual consiste en agregar un factor de correccin pB a la ecuacin de Einstein (Conway y Dobry-Duclaux, 1960; Allison et al., 2003),

= s { 1 + 2.5 [1 + pB ]}

(8.5.1)

donde pB posee la siguiente expresin,

163

Captulo 8

pB = q * y 2

(8.5.2)

siendo a su vez,

2 1 C Z m k T B q* = 2 s e 2 C Z

(8.5.3)

y=

Ze 2

a 2 k BT

(8.5.4)

3 ( a ) 4 2

(8.5.5)

En la ecuacin (8.5.3) C , Z y m son la concentracin, valencia y movilidad de la especie respectivamente. Asimismo, en la ecuacin (8.5.4) Z es el nmero de carga neta o valencia de la partcula que posee un radio a . Tambin la movilidad de las especies m se puede calcular a partir de los radios inicos r de las especies de la siguiente manera (Allison et al., 2003),

m =

1 6s r

(8.5.6)

Debido a que en las experiencias de viscosidad especfica la fuerza inica se estableci utilizando NaCl, y considerando que los radios r de las especies

164

Captulo 8

sodio y cloruro son 1.837 y 1.206 respectivamente (Yamanaka et al., 1995; Allison et al., 2003) en la Tabla 8.5.1 se muestran los valores de pB obtenidos para cadenas simples y agregados de gelatina a distintos tiempos y temperaturas de maduracin para las condiciones fisicoqumicas (pH=9,8 y fuerza inica I=110 mM) establecidas en los ensayos experimentales de viscosidad especfica.
Tabla 8.5.1 Contribucin de primer efecto electroviscoso pB a la viscosidad de una solucin diluida de gelatina a distintos tiempos y temperaturas de maduracin. o Z Tm (C) t m (horas) N pB R ( A) 5 0 1.00 106.00 75.00 6.761 10-2 2 1.19 123.50 89.25 4.268 10-2 5 1.46 147.25 109.50 2.533 10-2 8 1.74 168.40 130.50 1.739 10-2 11 2.02 187.73 151.50 1.293 10-2 20 2.86 237.53 214.50 7.006 10-3 24 3.23 255.76 242.25 5.855 10-3 15 0 1.00 106.00 75.00 6.761 10-2 2 1.11 116.37 89.25 5.093 10-2 5 1.27 130.84 95.25 3.587 10-2 8 1.43 144.27 107.25 2.699 10-2 11 1.59 156.85 119.25 2.128 10-2 20 2.07 190.81 155.25 1.240 10-2 24 2.28 204.48 171 1.029 10-2 20 0 1.00 106.00 75.00 6.761 10-2 2 1.07 113.23 80.25 5.499 10-2 5 1.19 123.51 89.25 4.266 10-2 8 1.30 133.21 97.50 3.410 10-2 11 1.41 142.41 105.75 2.808 10-2 20 1.75 167.70 131.25 1.779 10-2 24 1.90 178.03 142. 5 1.512 10-2 25 0 1.00 106.00 75.00 6.761 10-2 2 1.03 108.29 77.25 6.371 10-2 5 1.08 111.63 81.00 5.889 10-2 8 1.13 114.84 84.75 5.477 10-2 11 1.18 117.95 88.50 5.120 10-2 20 1.33 126.69 99.75 4.292 10-2 24 1.40 127.51 105.00 4.401 10-2

165

Captulo 8

Para estos clculos se utiliz una carga neta promedio de las cadenas de gelatina de peso molecular M n = 133 KDa a pH= 9,8 de Z = 75 (ver, Piaggio, et al., 2005) y se tom como radio de partcula el radio equivalente promedio a R de las cadenas sin agregar y de los clusters formados durante el proceso de agregacin. Por otra parte, el valor de = 1,09 109 m-1 correspondiente a un valor de fuerza inica I = 110 mM se obtuvo con la ecuacin (2.4.10) (ver Captulo 2). A travs de los resultados obtenidos se observa que el primer efecto electroviscoso es despreciable para las soluciones de gelatina estudiadas en esta tesis. En tal sentido, es relevante mencionar que en todos los casos

a 12 y, en estas circunstancias, la longitud de la doble capa elctrica es


delgada en relacin al tamao de las molculas simples y clusters de gelatina. En efecto, Garcas-Salinas et al. (2000) y Allison et al. (2003) reportaron resultados similares concernientes al efecto de la fuerza inica sobre pB en partculas rgidas.

8.6 Estabilidad de soluciones diluidas de gelatina.

Factor de estabilidad coloidal

Como se mencion anteriormente en la Seccin 8.5, el factor de estabilidad coloidal W representa la relacin existente entre la velocidad de agregacin de partculas primarias en ausencia de interacciones repulsivas o atractivas y la velocidad de agregacin cuando estas interacciones se encuentran presentes. En este sentido, la manera ms conveniente de medir

166

Captulo 8

experimentalmente el valor de W es determinando la velocidad de formacin de dobletes a bajos tiempos de agregacin y en condiciones diluidas (Russel et al., 1989; Lattuada et al., 2003). En las experiencias realizadas en este trabajo se observ que, al tiempo mximo de maduracin evaluado, el nmero promedio de molculas por agregado N a la menor temperatura de maduracin fue N = 3,2. Por consiguiente, en estas condiciones, los valores de W obtenidos se pueden considerar apropiados. Luego de la evaluacin de W a las diferentes temperaturas de

maduracin, resulta relevante realizar una estimacin de la barrera energtica asociada con la agregacin de cadenas de gelatina en solucin diluida, la cual incluye fuerzas de largo alcance. Para este propsito, W se expresa (Russel, et al., 1989),

W = 2a

exp(UT (h ) k B Tm ) dh 2 ( ) ( ) h 2 a G h + 0

(8.6.1)

donde UT es la energa de interaccin total entre pares de la partculas y h es la distancia entre la superficie de las mismas. Asimismo, G(h ) es un factor de correccin que tiene en cuenta la resistencia adicional a la agregacin causada por la interaccin hidrodinmica. Una de las expresiones utilizadas de este factor G(h ) es (Hunter, 1992),

G (h ) =

1 + 3 h 2a 2h 2 2 a 1 + 13 h 2 a + 3 h a

(8.6.2)

167

Captulo 8

La energa de interaccin entre dos superficies o partculas coloidales est dada, fundamentalmente, por el resultado de las fuerzas de la doble capa elctrica y las fuerzas de van der Walls. La combinacin de estas dos interacciones es la esencia de la teora de Deryaguin-Landau-VerweyOverbeek conocida como DLVO (Hiemenz, 1986; Hunter, 1992; Israelachvili, 1995). En este contexto, la energa total de interaccin entre pares de partculas UT es,

UT = U R + U A

(8.6.3)

Sin embargo, el comportamiento de muchos sistemas no se puede explicar usando la teora de la DLVO. Numerosas experiencias sugieren la existencia de un trmino extra que aparece por la interaccin entre la superficie y las capas de solvente adyacente. En tal sentido, Hunter (1992) propone incluir un trmino debido a la estructura del solvente US en el clculo de la energa total de interaccin como se indica en la siguiente expresin,

UT = U R + U A + U S

(8.6.4)

Estas fuerzas adicionales pueden ser montonamente repulsivas, montonamente atractivas u oscilatorias y son mucho ms fuertes que las fuerzas DLVO a distancias cortas. Asimismo, Israelachvili (1995) las clasifica como fuerzas no-DLVO. Cuando el medio es agua, valores positivos de la energa de interaccin indican la presencia de fuerzas de hidratacin de

168

Captulo 8

naturaleza repulsiva y valores negativos indican la presencia de fuerzas hidrofbicas de naturaleza atractiva (Hunter, 1992). A los fines de estimar UT (h ) se describen a continuacin las distintas energas de interaccin que intervienen en el sistema macromolecular estudiado.

Energa repulsiva debida a la doble capa elctrica

Como se detall en el Captulo 2, debido a la presencia de cargas en las molculas de gelatina, (las cuales estn a su vez suspendidas en un medio donde estn disueltos los contraiones y los iones adicionales) el sistema se puede interpretar en trminos de la teora de la doble capa elctrica donde el potencial de superficie 0 y la longitud de Debye 1 son expresados a travs de las ecuaciones (2.4.8) y (2.4.10) respectivamente (ver Captulo 2). Adems, la energa repulsiva U R entre dos esferas separadas entre s por una distancia h se expresa (Tanford, 1961; Hunter, 1992),

UR

4 0 2 a 2 = exp[ h ] h + 2a

para

a < 5

(8.6.5)

U R = 2 0 2 a ln{ 1 exp[ h]}

para

a > 10

(8.6.6)

Para las condiciones de trabajo de pH=9,8 y fuerza inica I=110 mM, se obtiene que a 12, por lo tanto, se utiliz la ecuacin (8.6.6) de la energa repulsiva U R y un potencial de superficie de 0 = 10 169 mV . Para el clculo

Captulo 8

estimativo de este potencial se utiliz una valencia promedio de las cadenas de gelatina Z = 75 (ver, Piaggio, et al., 2005). No obstante, se verific que debido a que la fuerza inica del medio es considerablemente elevada, estas cargas se encuentran fuertemente apantalladas y la energa de interaccin total entre las molculas no cambia considerablemente si se vara el potencial en un rango de 5 a 30 mV.

Energa Atractiva debida a las fuerzas de van der Walls

Debido a que las fuerzas de van der Walls son siempre atractivas entre partculas de la misma naturaleza, en el caso especial de dos esferas en un lquido la energa de interaccin U A debida a este tipo de fuerzas es (Hunter, 1992),

UA

A = H 6

h 2 + 4 ah 2a 2 2a 2 + 2 + ln 2 2 2 h + 4 ah + 4 a 2 h + 4 ah h + 4 ah + 4 a

(8.6.5)

donde AH es la constante de Hamaker. Para sistemas protena-agua-protena la constante de Hamaker resulta AH 10k BT aproximadamente (Coen et al., 1995).

Energa repulsiva de hidratacin

Las fuerzas que dan origen a este tipo de energa repulsiva aparecen en superficies hidroflicas que tienen la capacidad de ligar agua fuertemente,

170

Captulo 8

mediante grupos hidroflicos (grupos inicos, suiterinicos o ligantes de hidrgeno) como ocurre con las protenas altamente solubles. Comnmente se conocen como fuerzas de hidratacin o fuerzas estructurales (Iraelachvili, 1992). La estabilizacin por solvatacin y por formacin de enlaces del tipo puente - hidrgeno origina una fuerza repulsiva entre dos superficies adyacentes. La fuerza de hidratacin repulsiva es de largo alcance, con una longitud efectiva de 3 a 5 nm y una longitud de decaimiento tpica de 0,6-1,1 nm. Dicha fuerza es de tipo estructural y surge a partir de los fuertes enlaces de tipo puente - hidrgeno entre los grupos superficiales y las molculas de agua. Esto modifica la red de enlaces puente - hidrgeno por molculas de agua en las cercanas de una superficie hidroflica que en el agua pura confiere la energa de estabilizacin y se traduce en una fuerza de repulsin. En efecto, al aproximarse dos superficies se deben liberar molculas de agua, las cuales pierden la posibilidad de formar puentes - hidrgeno. Si la superficie hidroflica es lisa, a distancias muy cortas la fuerza resultante es oscilatoria debido al ordenamiento de las molculas de agua muy cerca de la pared (Hunter, 1992). En cambio si las superficies son rugosas o semifluidas, las oscilaciones se pierden rpidamente y la interaccin es montonamente decreciente (Israelachvili, 1995). En forma general, los resultados indican que la fuerza es de largo alcance y decae exponencialmente con la distancia. Asimismo, la energa de interaccin por unidad de superficie para dos superficies hidroflicas en agua, est dada de acuerdo a la siguiente relacin experimental,

171

Captulo 8

w (+ ) = w 0 exp( h l )

(8.6.6)

donde w 0 es una energa por unidad de rea que representa el grado absoluto de hidrofilicidad, usualmente est entre 3 y 30 mJm-2 (Israelachvili, 1995). En el caso de biosuperficies en agua, la energa de interaccin puede ser de hasta 160 mJm-2 y la longitud de decaimiento l tpica de 1 nm (van Oss, 1997).

Energa atractiva hidrofbica

La interaccin hidrofbica describe la fuerte atraccin que se da entre molculas y superficies hidrofbicas en un medio acuoso. Una superficie hidrofbica es aquella que es inerte al agua; la orientacin de las molculas de agua en torno a una superficie de este tipo es entrpicamente desfavorable. Luego, la interaccin hidrofbica surge cuando hay dos o ms superficies hidrofbicas puestas en juego. En efecto, cuando ocurre solapamiento entre dos especies hidrofbicas aparece una fuerza netamente atractiva. En el caso de molculas de gelatina, grupos apolares de algunos aminocidos como prolina (12 %), alanina (10 %), leucina e isoleucina (3 %) proveen sitios especficos para la asociacin de cadenas (Herning et al. 1991). Israelachvili (1995) propone que la energa de interaccin hidrofbica por unidad de superficie entre dos superficies en agua en el rango de 0-10 nm se describe,

w ( ) = 2 i exp( h l )

(8.6.7)

172

Captulo 8

donde i = 10-50 mJm-2 es la energa interfacial de la superficie en agua y l =12 nm es la longitud de decaimiento exponencial.

Energa de interaccin debida a las fuerzas no DLVO

En principio, se puede realizar cierta simplificacin en relacin a la energa de interaccin ocasionada por las fuerzas estructurales U s . Teniendo en cuenta que para biosuperficies en agua las dos fuerzas debidas al solvente, hidroflicas e hidrofbicas, tienen la misma longitud de decaimiento l = 1 nm (van Oss, 1997), se puede escribir una energa de interaccin absoluta protena-agua-protena (Berli et al. 1999a y 1999b),

w = w ( + ) w ( )

w = (w 0 2 i )exp( h l )
w = G exp( h l )

(8.6.8)

donde G es la energa por unidad de rea que representa el grado absoluto de hidrofobicidad (G < 0 ) o hidrofilicidad (G > 0 ) . Asimismo, la aproximacin de Deryaguin (Hunter, 1992; Israelachvili, 1995) permite obtener la fuerza entre dos esferas de radio a separadas por una distancia h , a partir de la energa de interaccin por unidad de superficie
w (h ) ,

F (h ) = aw (h )

(8.6.9)

173

Captulo 8

Luego, la energa potencial de interaccin se obtiene integrando la fuerza en el dominio de inters,

U s (h ) = F (h' ) dh'

(8.6.10)

U s (h ) = Gal exp( h l )

(8.6.11)

Las fuerzas de hidratacin y las fuerzas hidrofbicas son probablemente importantes en la estabilidad de suspensiones de protenas en el rango diluido aunque son las menos comprendidas tericamente, entre todas las fuerzas que ocurren en estos fluidos complejos (Israelachvili, 1995). En el caso de protenas en agua se acepta el concepto de una capa de solvente estructural (Fennema, 1977). Asimismo, se reporta en la bibliografa la existencia de estas interacciones en sistemas proteicos, las cuales seran las principales responsables de la estabilidad de los mismos (Petsev y Vekilov, 2000).

Resultados obtenidos del anlisis del factor de estabilidad coloidal

El clculo del factor de estabilidad coloidal W a partir de la energa de interaccin total UT compuesta solamente por las energas de interaccin que conforman la teora de la DLVO, no verifica los valores encontrados experimentalmente (ver Tabla 8.4.1) debido a que, en las condiciones de ensayo, considerando las energas de interaccin U R y U A se obtiene un valor de W 1 . Por tal motivo, se propone la existencia de una fuerza resultante del

174

Captulo 8

tipo no-DLVO que dara origen a una energa neta repulsiva US . La Tabla 8.6.1 muestra los valores de G en mJ.m-1 necesarios para reproducir los valores experimentales de W reportados en la Tabla 8.4.1, tomando una longitud de decaimiento de l = 1nm = 10 y un radio de partcula a R = 106 .

Tabla 8.6.1 Energa libre en mJm-2 correspondientes a las energas no-DLVO presentes en las soluciones de gelatina maduradas a diferentes temperaturas. G (mJm-2) Tm (C) 5 10.5 15 11.2 20 11.6 25 11.9

Los valores de G obtenidos son del orden de magnitud esperados (ver, por ejemplo, Israelachvili, 1995). Adems, estos valores muestran que a medida que la temperatura de maduracin decrece, G es menor y la agregacin se ve favorecida. En la Figura 8.6.1 se observa, a modo de ejemplo, la variacin de las energas relativas a la energa trmica k BTm para la experiencia realizada a la temperatura de maduracin de 5C. Cuando una protena sufre un proceso de desnaturalizacin, se producen una serie de cambios estructurales que favorecen la unin de molculas de agua. Esto, estara favorecido por (Fennema, 1977): 1-Ruptura de uniones puente hidrgeno protena-protena. 2-Ruptura de uniones inicas. 3-Ruptura de uniones hidrofbicas mediadas por agua. 4-Disociacin de grupos hidrofbicos.

175

Captulo 8

Todos estos cambios favorecan colectivamente la generacin de un incremento en el rea interfacial de la protena, un decrecimiento en las interacciones intramolecular del tipo protena-protena y un incremento de las interacciones protena-agua (Fennema, 1977).

100

50

U/kBTm

-50

-100

0,00

0,25

0,50

h/a
Figura 8.6.1. Energas potenciales de interaccin relativas a la energa trmica k BTm en funcin de la distancia adimensional h a entre molculas correspondiente a la experiencia realizada a la temperatura de maduracin de 5C. Las lneas ( ) y ( ) corresponden a las interacciones del tipo DLVO U R y U A , respectivamente, mientras que la lnea (LL) corresponde a las interacciones del tipo no-DLVO U S . La lnea llena () corresponde a UT = U R + U A + U S .

Como se mencion anteriormente, el proceso de agregacin de molculas de gelatina estara favorecido por el cambio de conformacin que se produce cuando disminuye la temperatura, desde la estructura de cadena errtica (random coil) a hlice de poliprolina. Este cambio podra ser 176

Captulo 8

interpretado como un proceso de re-naturalizacin parcial de la estructura nativa helicoidal de las molculas de gelatina (ver Captulo 2), que estara favoreciendo la disminucin de la cantidad de molculas de agua unidas superficialmente a las protenas. De esta manera, la energa de hidratacin repulsiva disminuira y las molculas podran acercarse para agregar mediante la formacin de zonas de triple hlices intermoleculares.

25

UT / kBTm

20

15

10

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

h/a
Figura 8.6.2. Energas potenciales de interaccin total relativas a la energa trmica k BTm en funcin de la distancia adimensional entre molculas de gelatina. Las temperaturas de maduracin son: 5 (LL) , 15 ( ) , 20 ( ) y 25C ().

En la Figura 8.6.2 se observa la variacin de la energa de interaccin total UT relativa a la energa trmica para las experiencias realizadas a las distintas temperaturas de maduracin.Se observa que la barrera energtica que deben vencer la molculas de gelatina para agregar es ms chica a medida que la

177

Captulo 8

temperatura de maduracin disminuye. En efecto, esta barrera energtica presenta valores de 21 a 25 veces la energa trmica k BTm desde la menor temperatura de maduracin de 5C hasta la mayor de 25C, respectivamente.

8.7 Soluciones ultra-diluidas ( C < Cc )

Con el propsito de analizar la evolucin de cadenas de gelatina cuando la concentracin es mucho menor a Cc (zona ultra - diluida), se madur una solucin de gelatina de concentracin 10-5 g/cm3 a 25C durante 168 horas (siete das). Como se detall previamente en la Seccin 8.2, este valor de Tm
* es cercano a Tg y, por consiguiente, resulta apropiado para promover la

formacin de estructuras de triple hlice con conformacin de varillas rgidas que involucra una evolucin intramolecular (Harrington y Rao, 1970). La Figura 8.7.1 muestra la evolucin de la viscosidad especfica a lo largo de todo el tiempo de maduracin. Los resultados muestran que se produce un incremento relativamente pequeo de la viscosidad especfica durante el tiempo de maduracin. Solo se obtuvieron diferencias apreciables con respecto a la viscosidad del solvente a las 24 horas, y luego de las 72 horas la viscosidad de la solucin se mantuvo constante. Estos resultados indican que la evolucin de las cadenas de gelatina en el rgimen ultra diluido ( C < Cc ) es diferente al que se produce en el rgimen diluido ( Cc < C < C g ). En efecto, luego de las 72 horas se alcanza una microestructura definitiva que solamente se puede explicar mediante la

178

Captulo 8

formacin de hlices intramoleculares en cadenas individuales (ver en el Captulo 4 la Figura 4.2.1). Ms an, cuando se intent interpretar los datos experimentales de la zona ultra - diluida se mediante la teora de agregacin de Smoluchowski, se obtuvieron valores muy bajos de t p y W ( t p fue del orden de 10-4 horas lo que corresponde a un W < 1). Esto es fsicamente inadmisible teniendo en cuenta los pequeos incrementos de la viscosidad especfica durante un prolongado tiempo de maduracin hasta alcanzar un valor constante, lo que indica un proceso lento. Por consiguiente, dicho proceso no sera agregativo.

sp

0,014 0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,002

20

40

60

80

100 120 140 160 180

tm (h)
Figura 8.7.1 Viscosidad especfica sp en funcin del

tiempo de maduracin t m de una solucin de gelatina de concentracin 10-5 g/cm3 a una temperatura de maduracin de 25C. De estos resultados se podra inferir que la formacin de triple hlice intramolecular es el fenmeno bsico en estas circunstancias, donde las cadenas de gelatina evolucionan a estructuras ms compactas, como fue 179

Captulo 8

sugerido previamente (Harrington y Rao, 1970; Harrington y Karr, 1970; Busnel et al., 1989). El otro aspecto que se debe ser considerar en este anlisis de la zona de concentracin ultra-diluida es el hecho que podran aparecer efectos pseudoplsticos como consecuencia de la estructura de varilla rgida de las cadenas simples de gelatina. Por ejemplo, las teoras cinticas de dumbbells rgidos (Bird, et al, 1977) predicen una ecuacin del tipo,

18 2 1326 4 [ ] = [ ]o + 1 35 1925

(8.7.1)

donde =

[ ]o M
N A k BT

& la cual indica que las soluciones de estas macromolculas

del tipo de varillas rgidas deben presentar pseudoplaticidad. Se observ que esta solucin de gelatina se comporta como un fluido newtoniano en un rango de velocidad de corte comprendido entre 50 y 2600 s1

, a lo largo de todo el perodo de maduracin (los errores de ajuste de los

datos experimentales con la ecuacin (6.2.13) fueron 0,03 para todos los tiempos de maduracin, indicando que no se encuentran efectos

pseudoplsticos significativos en este rango de velocidad de corte). Desafortunadamente, resulta difcil aqu detectar pseudoplasticidad

experimentalmente debido a la respuesta dbil reolgica de las soluciones ultra-diluidas. En efecto, partiendo de la ecuacin (8.7.1) se encuentra que asintticamente

[ ] [ ]o

18 [ ]o s M n 1 35 N A k BT

& , indicando que la deteccin de

pseudoplasticidad,

la cual produce el decaimiento del 1% del valor de

180

Captulo 8

[ ]o 960

cm3/g, requiere de velocidades de corte mayores a 3000 s-1

aproximadamente, siendo estos valores significativamente ms grandes a los alcanzados en la prctica.

8.8 Conclusiones

Los resultados obtenidos muestran que para Cc < C < C g y para una
* se produce la agregacin de cadenas temperatura de maduracin menor a Tg

de gelatina mediante la formacin de clusters. Este proceso se puede interpretar haciendo uso de la teora de agregacin de Smoluchowski. En tal sentido, se observ que a medida que el tiempo de maduracin aumenta, se producen agregados ms heterogneos. Asimismo, los agregados son ms desordenados y ocluyen mayor cantidad de solvente cuanto menor es la temperatura de maduracin. Este resultado se refleja en los pequeos valores de dimensin fractal obtenidos en estas experiencias. En cambio, los agregados formados a mayores temperaturas son ms compactos y, por consiguiente, se obtiene un mayor valor de dimensin fractal, posiblemente debido a que los procesos de crecimiento y reordenamiento de las estructuras
* . formadas se ven favorecidos cuando Tm Tg

Mediante la evaluacin del factor de estabilidad coloidal W se observa que el proceso de agregacin es lento debido a que las molculas de gelatina deben vencer una barrera energtica en el rango de 21 a 25 veces la energa trmica k BTm . Tambin se observa que, en la zona ultra diluida, la agregacin sera excluida debido a que en esta zona slo se obtuvieron

181

Captulo 8

incrementos muy pequeos de la viscosidad especfica y luego de las 72 horas de maduracin la viscosidad de las soluciones se mantuvo constante. Los valores experimentales de esta zona de concentracin no se pudieron interpretar mediante la teora de agregacin de Smoluchowski. Estos resultados indicaran que se producira un plegamiento intramolecular debido a la formacin de estructuras de triple hlice.

182

Captulo 8

8.9 Bibliografa

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186

Captulo 9

Estudio de soluciones de gelatina a diferentes pH y fuerzas inicas

Captulo 9

9 Estudio de soluciones de gelatina a diferentes pH y fuerzas inicas

9.1 Introduccin

Como se mencion en el Captulo 2, las molculas de gelatina poseen en la secuencia primaria aminocidos bsicos y cidos y cada uno de ellos posee una constante de disociacin de protones diferente (Fennema, 1993; Dickinson y Stainsby, 1982). Por consiguiente, las cadenas de gelatina en solucin diluida pueden adoptar distintas conformaciones a diferentes pH dependiendo as del ambiente fisicoqumico en el que se encuentran disueltas. Sin embargo, las interacciones intermoleculares (entre cadenas de gelatina) las cuales se producen cuando stas se encuentran formando soluciones concentradas, estn condicionadas no solo por el estado de carga que posee cada macromolcula (debida a la composicin electroltica de la solucin), sino tambin por la red de entrampamiento generada por las macromolculas circundantes. El conocimiento de las distintas conformaciones que adoptan las cadenas de gelatina en solucin diluida y de las interacciones que se producen en soluciones concentradas debido al estado de carga total y neta es relevante para el diseo de muchos procesos tecnolgicos donde se utiliza esta macromolcula. En este sentido, cabe mencionar que la gelatina se usa en la confeccin de hidrogeles para la liberacin controlada de frmacos donde, en muchos casos, la inmovilizacin de estas drogas se basa en la induccin de interacciones electrostticas entre el compuesto farmacutico y el hidrogel de gelatina cargado. Adems, la capacidad de hinchamiento (swelling) de estos

187

Captulo 9

hidrogeles depende del pH y de la fuerza inica del medio fisicoqumico en el que se encuentran estos sistemas y de la malla formada por el entrecruzamiento covalente (Tabata e Ikada, 1998; Fukunaka et al., 2002; Einerson et al., 2002). Asimismo, entre otras aplicaciones, la gelatina se utiliza en productos donde estas macromolculas se mezclan con compuestos como, por ejemplo, otras protenas, carbohidratos y lpidos en condiciones de soluciones concentradas. En consecuencia, la interaccin elctrica que se lleva a cabo entre la gelatina y estos compuestos resulta relevante para la formulacin de nuevos alimentos. Por otra parte, la composicin de aminocidos de la gelatina que se obtiene mediante el proceso de extraccin alcalino es diferente a aquella que surge luego del proceso de extraccin cido (ver Captulo 3). Por lo tanto, el conocimiento de la naturaleza elctrica (es decir el estado de carga total y neta) de soluciones de gelatina provenientes tanto del proceso de extraccin cido como del alcalino constituye una herramienta de utilidad para el diseo de productos a base de gelatina. Con el objetivo de obtener informacin concerniente al comportamiento fisicoqumico de la gelatina a diferentes pH y fuerzas inicas, en este captulo primero se estudian tericamente mediante una teora de escalas los diferentes estados conformacionales que pueden adoptar las molculas de gelatina en solucin diluida antes de que comience el proceso de maduracin cuando estas varan en su estado de carga. Segundo, haciendo uso de la reometra capilar gravitatoria y la reometra rotacional descriptas en el Captulo 6 se evalan soluciones de gelatina en las zonas de concentracin diluida ( Cc < C < C g ) y concentrada ( C > C g ) a diferentes pH y fuerzas inicas (ver

188

Captulo 9

Captulo 4 donde se detallan las particularidades de cada zona de concentracin) y se arriba a conclusiones donde los resultados experimentales se interpretan en trminos de los conceptos tericos revisados

9.2 Teora aproximada de polianfolitos en solucin diluida: escalas caractersticas

Un polianfolito es una macromolcula cargada que posee grupos cidos, alcalinos y neutros en su secuencia primaria. Bajo condiciones apropiadas, como por ejemplo en solucin acuosa, estos grupos se disocian, generando iones en la cadena y arrojando los contraiones a la solucin. Como consecuencia de la ionizacin, la cadena polimrica posee cargas positivas y negativas por tramos y, en cierto grado, se puede atribuir una variabilidad en la distribucin de la carga lo cual permite un anlisis estadstico de las configuraciones que adoptan estas macromolculas. Son ejemplos de polianfolitos las protenas desnaturalizadas (dentro de las que se encuentra la gelatina), las protenas en estado nativo y los polmeros sintticos que poseen monmeros cidos y bsicos (Dickinson y Stainsby, 1982). Asimismo, si los grupos son cidos o bases dbiles (como es el caso de las protenas) la carga neta se puede variar cambiando el pH de la solucin (Dobrynin y Rubinstein, 1997; Dobrynin et al., 2004). En virtud de interpretar el comportamiento de los polianfolitos en soluciones diluidas desde el punto de vista descripto arriba, se puede visualizar a una cadena de este tipo de macromolculas como una secuencia de una mezcla de N monmeros positivos, negativos y neutros. En efecto, cada

189

Captulo 9

cadena posee una fraccin f+ de monmeros cargados positivamente y otra fraccin f cargada negativamente. Asimismo, la asimetra de carga del polianfolito Nf = f + N f N es igual a la diferencia entre el nmero de cargas positivas y negativas presentes en el mismo y la fraccin de carga total
f = f + + f es la suma de la fracciones de cargas positivas y negativas.

En solucin diluida, las molculas de polianfolitos se encuentran alejadas unas de otras y no interaccionan entre s. En estas circunstancias, la conformacin de las cadenas en solucin queda determinada por la competencia entre la repulsin ocasionada por cargas de igual signo dentro de la misma cadena (la cual tiende a expandirla) y la atraccin generada por cargas de signo opuesto que induce el colapso de la macromolcula. Muchos autores investigaron el comportamiento de polianfolitos a travs de estudios experimentales y de anlisis tericos computacionales. A partir de estas investigaciones, actualmente, existe cierto consenso de que cuando los polianfolitos poseen una carga neta elevada (esta puede ser tanto positiva como negativa), hay un predominio de la repulsin intramolecular y, de esta forma, la cadena se comporta como un polielectrolito (Dobrynin y Rubinstein, 1997, Dobrynin et al., 2004; Higgs y Joanny, 1991). El trmino polielectrolito a lo largo de esta tesis tiene un significado preciso en el sentido conformacional. En efecto, un polielectrolito presenta una conformacin significativamente extendida. Por otra parte, cuando los polianfolitos poseen carga neta cero, pueden colapsar debido a la atraccin electrosttica entre cargas de signo opuesto formando, de esta forma, estructuras globulares compactas (Edwards et al., 1980; Dobrynin et al., 1997; Srivastava y Muthukumar, 1996; Dobrynin et al., 1997; Dobrynin et al., 2004). No obstante, cuando las cadenas poseen una

190

Captulo 9

baja cantidad de grupos cargados, tanto las atracciones como las repulsiones son pequeas y, por consiguiente, permanecen en una configuracin gaussiana la cual se podra interpretar como una cadena errtica (Higgs y Joanny, 1991; Kantor et al., 1992; Dobrynin y Rubinstein, 1995; Srivastava y Muthukumar, 1996; Bratko y Chakraborty, 1996; Dobrynin et al., 1997; Dobrynin et al., 2004). Frecuentemente, la carga neta de un polianfolito no es cero. En el caso de los polianfolitos sintticos, que usualmente, se generan por medio de copolimerizacin aleatoria, esto es muy probable. En consecuencia, estas molculas poseen generalmente una carga neta (ver, por ejemplo, Mc Cormick y Jonson, 1988; McCormick y Salazar, 1992; Candau et al., 1997; Kudaibergenov, 1999). Por consiguiente, adems de las fenomenologas mencionadas arriba (comportamiento poliectrolito y formacin de glbulos compactos como se describe con ms detalle abajo), existe una variedad de conformaciones que dependen del estado de carga de las macromolculas las cuales merecen ser analizadas detalladamente en el marco de los estudios tericos reportados en la bibliografa. De lo expuesto anteriormente, Dobrynin et al. (2004) sugieren que cuando un polianfolito con un grado de polimerizacin N y una fraccin de carga total relativamente grande posee las cargas balanceadas ( f+ N = f N ) y a su vez las cadenas son lo suficientemente largas, este colapsa debido a las atracciones electrostticas entre cargas de signo opuesto formando un glbulo compacto. Los autores describen a una cadena de polianfolito en el estado colapsado como un arreglo denso de esferas de tamao y nmero g de monmeros de tamao b (en las protenas b podra ser considerado del orden

191

Captulo 9

de la longitud del enlace peptdico el cual es igual a 3,8 ). El tamao de las esferas separa dos dominios diferentes: (a) para longitudes menores a las interacciones electrostticas no alcanzan a perturbar la conformacin de la cadena conservando as una distribucin estadstica Gaussiana ( 2 b 2 g ); (b) para longitudes mayores a las atracciones electrostticas provocan el colapso de las cadenas formando la esfera. Cada esfera con una carga neta positiva tiene mayor probabilidad de estar rodeada de esferas con carga neta negativa. En este sentido, la energa cohesiva entre esferas en solucin es k BT y es proporcional a la energa de interaccin electrosttica entre dos esferas vecinas que poseen carga neta

eZ + y eZ las cuales estn separadas por una distancia . Esta energa de


interaccin electrosttica resulta,

k BTl B Z 2 e2 Z 2 U el (g ) 4

(9.2.1)

donde l B e 2 (4k BT ) es la longitud de Bjerrum que representa la distancia a la cual la energa de interaccin electrosttica entre dos elementos de carga e en un medio con una constante dielctrica es igual a la energa trmica k BT . Una esfera que posee g monmeros tiene una valencia neta promedio
eZ = e(gf + + gf )1 2 (donde gf + y gf son los nmeros promedios de cargas

positivas y negativas en una esfera). As, U el (g ) se puede expresar,

192

Captulo 9

e 2 gf U el (g ) k BTl B gf 4

(9.2.2)

En el equilibrio, esta atraccin electrosttica est balanceada con la repulsin debida a los contactos entre monmeros de la cadena (impedimento estrico). Esta energa repulsiva es g veces proporcional a la energa trmica k BT y al cuadrado de la fraccin volumtrica gb 3 b 3 de monmeros dentro de la esfera, siendo g 3 la densidad de monmeros dentro de una esfera. En este sentido, esta energa repulsiva se puede expresar de la siguiente manera,
3

U rep (g ) k BTg 2 k BTg b 3

( )

k BTg 3 b 6 6

(9.2.3)

El balance entre la repulsin estrica y las atracciones electrostticas determina el tamao de las esferas y el nmero de monmeros dentro de ellas,

b (uf )

(9.2.4. a)

g (uf )2

(9.2.4. b)

donde u = l B b es un parmetro de interaccin que es la relacin entre la longitud de Bjerrum y la longitud del monmero. De esta forma, las ecuaciones (9.2.4.a) y (9.2.4.b) determinan la densidad de polmero dentro de un glbulo,

193

Captulo 9

g 3 ufb 3

(9.2.5)

As, un glbulo (es decir una cadena de polianfolito en un estado de colapso total) con una densidad monomrica posee un tamao,

R (N )

13

N b uf

13

(9.2.6)

A travs de la ecuacin (9.2.6) se observa que a medida que aumenta la fraccin de monmeros cargados f en una cadena de polianfolito que posee las cargas balanceadas, el tamao de glbulo disminuye. Luego, la energa electrosttica de un glbulo es igual a la contribucin de la energa electrosttica de las N g esferas (Dobryning et al., 2004),

U glob (R ) k BT

N l B gf k BTu 2 f 2 N g

(9.2.7)

Por consiguiente, una cadena colapsa cuando la energa atractiva electrosttica U glob supera a la energa trmica k BT . Como lo muestra la ecuacin (9.2.7), esto sucede cuando se cumple la siguiente condicin (Yamakov, et al., 2000),

N > u 2 f 2

(9.2.8)

194

Captulo 9

Asimismo, es relevante mencionar que el tamao de una esfera dentro de un glbulo es del orden de la longitud de Debye, la cual se debe a los grupos cargados en la cadena (Dobryning et al., 2004),

2 = 4l B f b 2 (uf )2 2

(9.2.9)

Existe otra contribucin importante a la energa libre de un glbulo de polianfolito, la energa superficial. Cada esfera en la superficie del glbulo est rodeada por menos esferas que aquellas que se encuentran en el interior del mismo. Dado que dos esferas dentro de un glbulo interaccionan entre s con una energa del orden de la energa trmica k BT , entonces el costo energtico para llevar una esfera hacia la superficie tambin es proporcional a este valor. Si S es el rea superficial del glbulo, existen entonces S 2 esferas en la superficie del glbulo y cada una de ellas har una contribucin del orden de
k BT a la energa total del mismo. Este razonamiento conduce a la siguiente

estimacin de la energa superficial de un glbulo (Dobryning et al., 2004),

U sup (R ) k BT

k BT (uf )4 3 N 2 3

(9.2.10)

donde el rea superficial S se estima como R 2 (ecuacin (9.2.6)). Asimismo, la tensin superficial es la relacin entre la energa superficial U sup y el rea superficial S ,

195

Captulo 9

U sup S

k BT

k BT (uf b )2

(9.2.11)

Esta expresin es muy importante porque permite calcular la estabilidad de la estructura globular como se describe abajo. Luego del anlisis de las energas actuantes en las molculas de polianfolitos, es posible concluir que las atracciones inducidas por fluctuacin inducen al colapso de la molcula pero, por otro lado, la interaccin conjunta de la energa superficial y la repulsin entre cargas del mismo signo la desestabilizan produciendo una expansin de la misma. En efecto, la energa de interaccin electrosttica repulsiva entre el exceso de cargas del mismo signo resulta,

e 2 N 2 (f + + f )2 U rep (R ) 4 R

(9.2.12)

A partir de este razonamiento, es posible observar que un glbulo de polianfolito pierde la estructura globular cuando la energa de interaccin electrosttica repulsiva entre el exceso de cargas del mismo signo es comparable con la energa superficial globular U sup (R ) R 2 , este criterio de estabilidad es similar al aplicado por Rayleigh a gotas lquidas cargadas (Dobrynin et al., 2004), por consiguiente,

l B N 2 (f + f )2 R 2 2 R

(9.2.13)

196

Captulo 9

En este contexto, operando sobre la ecuacin (9.2.13), es posible estimar la carga neta crtica eZ crit a partir de la cual una cadena de polianfolito cargada en forma aleatoria rompe su estructura globular compacta, esto es (Dobrynin et al., 2004),

eZ crit e fN

(9.2.14)

De esta forma, un polianfolito se encuentra en estado colapsado cuando posee una carga neta menor a e fN . No obstante, cuando la carga neta es superior a la carga neta crtica la cadena de polianfolito se expande reduciendo su energa total mediante la disminucin de la energa de interaccin electrosttica por medio de la creacin de una mayor interfase polmero-solvente. Uno de los modelos ms utilizados para describir a un polianfolito que posee una carga neta mayor a la carga neta crtica es aquel que considera a la cadena con una conformacin del tipo de collar de perlas (necklase globule) como se muestra, en forma esquemtica, en la Figura 9.2.1 (Bratko y Chakraboty; 1996; Dobrynin y Rubinstein, 1997; Dobrynin et al., 2004). Las regiones globulares de la molcula poseen una carga neta baja y, por consiguiente, la energa atractiva electrosttica hace que en estas zonas la cadena colapse. Por otro lado, en las regiones con elevada asimetra de carga, la repulsin Coulmbica produce la elongacin de la cadena (Dobrynin et al., 1997; Dobrynin et al., 2004). En efecto, la cadena de polianfolito se puede visualizar como una secuencia de pequeas cuentas de dimetro D conectadas por delgados segmentos lineales denominados conectores de longitud l con (Dobrynin et al., 2004). 197

Captulo 9

El nmero de monmeros m en cada cuenta de dimetro D se encuentra determinado por la condicin de estabilidad de Rayleigh, es decir, cuando la energa superficial de una cuenta D 2 k BT (uf )2 D 2 b 2 es del orden de su energa electrosttica repulsiva (efm )2 4D (Dobrynin et al., 2004),

D 2 k BT (uf )2

D2 b2

(efm )2
4D

(9.2.15)

l con Figura 9.2.1 Esquema que muestra la conformacin en collar de perlas que posee cuentas de tamao D , conectores de longitud l con compuesto por esferas de tamao .

La tensin superficial se estima con la ecuacin. (9.2.11) y f es la asimetra de carga ( f = f+ f ). Las cuentas de densidad poseen un tamao

198

Captulo 9

D (m )1 3 . Mediante la sustitucin de esta relacin en la ecuacin (9.2.15) y

utilizando la ecuacin (9.2.5) para es posible estimar el nmero de monmeros en una cuenta, as,

m f (f )2

(9.2.16)

Mediante este anlisis terico es posible concluir que existe ms de una cuenta en la cadena cuando el nmero de monmeros en cada una de ellas es menor que el nmero de monmeros de la cadena de polianfolito N . Asimismo, el nmero de monmeros en una cuenta aumenta a medida que la asimetra de carga f decrece (ver ecuacin (9.2.16)). Como se detall anteriormente, las cuentas estn separadas por conectores compuestos de esferas de tamao (ver Figura 9.2.1). La longitud de equilibrio del conector l con se obtiene igualando la energa superficial de un conector l con k BT (uf ) l con b con la energa de repulsin electrosttica entre dos cuentas vecinas (efm )2 4 l con (Dobrynin et al., 2004) ,

l con (efm )2 k BT (uf ) b 4 l con

(9.2.17)

Por consiguiente, la longitud del conector se puede estimar resolviendo la ecuacin (9.2.17) cuando se hace uso de la ecuacin (9.2.16); es decir,

l con b f f b m

(9.2.18)

199

Captulo 9

A travs de la ecuacin (9.2.16) se observa que la longitud del conector aumenta a medida que la asimetra de carga decrece. Asimismo, cuando la asimetra de carga decrece las cuentas crecen en tamao acumulando mayor cantidad de carga. Este aumento de la carga obliga a que la longitud del conector tambin aumente en la misma proporcin para minimizar la repulsin electrosttica entre cuentas vecinas. Cuando la molcula se encuentra en el rgimen de polielectrolito, es decir que posee una asimetra de cargas mayor a Nf > Nuf 3 2 (Dobrynin et al., 1997) y que, adems, no existe adicin de sal sta se encuentra expandida en su mxima longitud debido a la repulsin creada por el exceso de carga (Kantor et al., 1994; Dobrynin et al., 1997 y Dobrynin et al., 2004). En la Tabla 9.2.1 resumen las energas que condicionan el estado conformacional de un polianfolito.

Tabla 9.2.1. Energas de interaccin que condicionan los estados conformacionales de una cadena de polianfolito. Tipo de Energa Expresin Matemtica Energa de interaccin e 2 gf ( ) U g k BTl B gf electrosttica atractiva entre el 4 esferas dentro de un glbulo Energa de interaccin 2 repulsiva debida a los U rep (g ) k BTg 2 k BTg b 3 k BTg 3 b 6 6 contactos entre monmeros de la cadena dentro de la esfera (impedimento estrico). Energa de interaccin N l B gf U glob (R ) k BT k BTu 2 f 2 N electrosttica atractiva de un g glbulo Energa superficial de un S U sup (R ) k BT 2 k BT (uf )4 3 N 2 3 glbulo

( )

Energa de interaccin electrosttica repulsiva entre el exceso de cargas del mismo signo en un glbulo

l B N 2 (f + f )2 U el (R ) R

200

Captulo 9

A partir del anlisis terico realizado en esta seccin, se observa que el tamao y la forma de un polianfolito en solucin diluida libre de agregado de sal queda determinado por el balance de cuatro factores: (1) la entropa de la cadena que tiende a mantener al polmero en una conformacin estadstica Gaussiana; (2) las atracciones entre cargas de signo opuesto inducidas por fluctuacin que tienden a colapsar la cadena en un glbulo; (3) las interacciones entre monmeros de la cadena (impedimento estrico) que estabilizan el tamao del glbulo; (4) cuando la cadena no posee carga neta cero (es decir si tiene carga neta positiva o negativa) la repulsin de tipo Coulmbica entre cargas del mismo signo tienden a expandirla. No obstante, la importancia relativa de estos factores depende de la fraccin de cargas positivas f+ y negativas f , de la secuencia de cargas, del grado de polimerizacin N y del parmetro u . La Figura 9.2.2 muestra un diagrama de los estados conformacionales de una cadena de polianfolito en funcin de la asimetra de carga y de la fraccin total de monmeros cargados reportados por Dobrynin et al. (1997). Debido a que esta teora permite obtener solamente valores que representan el orden de magnitud de las energas de interaccin intramoleculares, es preciso observar que los lmites cuantitativos que determinan la conformacin que presentan los polianfolitos (ver Figura 9.2.2) an dependen de la generacin de una teora ms precisa que permita evaluar las constantes de proporcionalidad. No obstante, esta teora resulta til como marco de referencia para el anlisis conformacional de polianfolitos en solucin diluida y permite comprender los cambios que se producen en la microestructura de estas macromolculas al variar el estado de carga.

201

Captulo 9

No obstante, la adicin de sal puede inhibir la repulsin debido al exceso de cargas del mismo signo y la atraccin entre cargas opuestas (Dobrynin et al., 2004). Como se mencion anteriormente, en el rgimen polielectrolito, y cuando no hay agregado de sal, la cadena de polianfolito se encuentra en su mxima longitud debido a la repulsin entre el exceso de cargas del mismo signo. Cuando se agrega sal a la solucin, la longitud de Debye decrece y la repulsin entre cargas disminuye. Este efecto produce una disminucin del tamao de la cadena. A medida que se agrega ms cantidad de sal la longitud de Debye en el seno de la solucin resulta menor que la longitud de Debye interna en el dominio del polianfolito debido a la presencia de monmeros cargados, por consiguiente, un mayor agregado de sal produce inhibicin de las atracciones inducidas por fluctuacin provocando el hinchamiento o expansin de la cadena. En el rgimen polianfolito el agregado de sal solo aumenta el tamao de la macromolcula debido a que las atracciones inducidas por fluctuacin son inhibidas por los iones salinos.

u f3/2
Polielectrolito Collar de perlas

f1/2N -1/2 u -1/2N -3/4


Coil Glbulo

u -1N -1/2

Figura 9.2.2 Esquema que muestra los distintos estados conformacionales de una cadena de polianfolito en solucin diluida en funcin de la asimetra de carga y la fraccin total de monmeros cargados (Dobrynin et al., 1997).

202

Captulo 9

9.3 Aplicacin de la teora de polianfolitos a molculas de gelatina

En esta seccin se presenta un anlisis terico de la conformacin de cadenas de gelatina en solucin diluida en distintos medios fisicoqumicos haciendo uso de la teora de polianfolitos descripta en la seccin 9.2. Como se mencion anteriormente en el Captulo 3, la gelatina es un biopolmero polidisperso que posee una distribucin de peso molecular MWD . En este sentido, en el Captulo 5 se describe en forma detallada la obtencin de dicha distribucin mediante la tcnica de PAGE-SDS y el clculo de los pesos moleculares promedios M n y Mw . A partir de una secuencia peptdica de una cadena de gelatina de vaca (Bos Taurus) reportada en el Protein Data Bank (PDB) que posee 779 aminocidos con un peso molecular de 71170 Da se construy una cadena genrica que posee esta misma composicin de aminocidos (igual proporcin) pero con un peso molecular correspondiente al M n de la gelatina caracterizada en esta tesis. En efecto, la cadena genrica de peso molecular M n = 133 KDa posee 1456 aminocidos en una proporcin equivalente a la reportada en el PDB. La Tabla 9.3.1 muestra el nmero de aminocidos cargados en un total de 1456 aminocidos de la cadena genrica.
Tabla 9.3.1. Composicin de aminocidos cargados de una gelatina de vaca extrada mediante el proceso alcalino. Aminocido Nmero sobre un total de 1456 aminocidos Tyrosina (Tyr) 9.35 Arginina (Arg) 71.06 Histidina (His) 5.61 Cistena (Cys) 0 Lysina (Lys) 54.23 cido Asprtico (Asp) 48.62 cido Glutmico (Glu) 63.58

203

Captulo 9

Asimismo, para este anlisis se tom un tamao de monmero b = 3,8


A el cual corresponde a la longitud del enlace petdico (Flory, 1969).
o

Considerando el nmero y la composicin de aminocidos de la cadena de gelatina y haciendo uso de los datos de pK a reportados en la Tabla 2.6.1 se calcul valencia neta Z = Nf y el nmero total de grupos cargados Z + + Z de la cadena para distintos pH comprendidos entre 2 y 12. Este procedimiento se llev a cabo considerando la cantidad de cada residuo de aminocido cargado presente en la cadena genrica (ver Tabla 9.3.1) y contemplando, adems, los
pK a de los grupos amino ( pk NH3 ) y carboxilo ( pk COOH ) terminales de la

misma. En efecto, la carga neta de una molcula de gelatina es (Piaggio et al., 2005),

eZ = eZ i
i =1

(9.3.1)

siendo eZ i la carga de los i-grupos cargados presentes en la molcula. Asimismo, el valor de Z i se puede obtener de la siguiente manera,

Zi =

ni 1 + 10 (pKai pH )

(9.3.2)

donde los signos (+) y (-) se definen de acuerdo a las propiedades cidas o bsicas de los grupos cargados. Asimismo, la ecuacin (9.3.2) contempla el pH de la solucin donde se encuentran disueltas las cadenas de gelatina. Luego, la asimetra de carga Z = Nf se obtiene considerando tanto los i = 7 tipos de 204

Captulo 9

aminocidos cargados como la cantidad de cada uno de ellos (ver Tabla 9.3.1) y los grupos amino y carboxilo terminales,

Z=

i =1 1 + 10

ni ( pKai pH )

1 + 10

pK NH3 pH

) 1 + 10 + (pKCOOH pH )

(9.3.3)

La Figura 9.3.1 muestra los resultados obtenidos donde se observa que el nmero neto de grupos cargados o asimetra de carga Z = Nf disminuye bruscamente desde el pH 2 hasta el pH 4,48 donde se alcanza una carga neta nula. Luego, la carga neta aumenta hasta un valor de pH 6. A partir de este valor de pH y hasta un valor de pH 9 el aumento de la carga neta es menos pronunciado. Resulta relevante destacar, que en este rango de pH se encuentra el pH fisiolgico en el cual las molculas de colgeno (material histolgico de donde se obtiene la gelatina) cumplen su funcin natural de sostn estructural. A partir de pH 9 la carga neta aumenta en forma ms pronunciada hasta el valor pH 12. Mediante este proceso de clculo se obtuvo el valor pI = 4.48 de la cadena. Este resultado es el esperado para una gelatina producida mediante un proceso de extraccin alcalino. En este marco de trabajo cuantitativo, la variacin de la fraccin de carga total f de la cadena se muestra en la Figura 9.3.2, donde se observa que f aumenta desde pH 2 hasta pH 6, a partir del cual f se mantiene aproximadamente constante hasta pH 9. Finalmente, a partir del pH 10, f desciende nuevamente hasta el ltimo valor de pH calculado (pH 12).

205

Captulo 9

160 140 120 100

Nf

80 60 40 20 0

10

12

pH
Figura 9.3.1. Asimetra de carga Z = Nf en funcin del pH de una cadena de gelatina en solucin diluida considerando la secuencia de aminocidos reportada en la Tabla 9.3.1.

La Figura 9.3.2 tambin permite observar que la gelatina es una macromolcula que posee entre un 9% a 21% de los aminocidos cargados dependiendo del pH de la solucin en la que se encuentre disuelta. En este sentido, se puede considerar a esta macromolcula como un polianfolito dbilmente cargado. De las Figuras 9.3.1 y 9.3.2 se observa que al variar el pH de la solucin las molculas de gelatina varan tanto su fraccin de carga total como la valencia neta simultneamente. Este aspecto debe ser tenido en cuenta cuando se desea conocer cul es la conformacin que presentan estas macromlculas en solucin a los distintos pH.

206

Captulo 9

0,22 0,20 0,18 0,16

f
0,14 0,12 0,10 0,08

10

12

pH
Figura 9.3.2. Fraccin total de carga f en funcin del pH para una cadena de gelatina en solucin diluida con la composicin de aminocidos reportada en la Tabla 9.3.1.

En la Tabla 9.3.2 se muestran los valores numricos obtenidos de f + ,


f , f y f obtenidos para la muestra de gelatina cuya composicin se reporta

en la Tabla 9.3.1.

Tabla 9.3.2. Fraccin de cargas positivas f + , fraccin de cargas negativas, fraccin total de cargas f y fraccin de cargas netas f a diferentes pH para una molcula de gelatina que posee la composicin de aminocidos reportada en la Tabla 9.3.1. f pH f f+ f 2 0.09059 0.00141 0.09199 0.08918 3 0.09058 0.01075 0.10133 0.07983 4 0.09055 0.05782 0.14836 0.03273 5 0.09024 0.11479 0.20503 0.02455 6 0.08866 0.12863 0.21729 0.03997 7 0.08707 0.13023 0.21731 0.04316 8 0.08665 0.13044 0.21709 0.04379 9 0.08552 0.13091 0.21643 0.04538 10 0.07759 0.13336 0.21095 0.05576 11 0.05670 0.13615 0.19285 0.07946 12 0.03788 0.13675 0.17464 0.09887

207

Captulo 9

La Figura 9.3.3 muestra la variacin del logaritmo de la fraccin de carga neta f = f+ f en funcin del logaritmo de la fraccin total de grupos

cargados f permitiendo, de esta manera, visualizar esta problemtica. Teniendo en cuenta el diagrama de estados conformacionales de molculas de polianfolitos en ausencia de sales reportados por Dobrynin et al. (1997) (ver Figura 9.2.2), analizando los distintos estados de carga que poseen las molculas de gelatina a los diferentes pH y aplicando los conceptos tericos revisados en la seccin 9.2 se puede realizar un anlisis cualitativo de las posibles conformaciones que pueden presentar las molculas de gelatina. Se observa que a los pH 2 y 3 las cadenas de gelatina probablemente se encuentran en una conformacin de polielectrolito debido a que stas poseen una fraccin total de carga f baja y una elevada asimetra de carga f . Por otra parte, a pH 4, las molculas podran encontrarse en una conformacin de cadena errtica (coil) o de glbulo debido a que tanto f como f son bajas. A pH 5, las cadena de gelatina poseen f medianamente elevada y f baja, por consiguiente, en esta situacin las cadenas de gelatina podran estar en la conformacin de glbulo. A los pH 6, 7, 8, 9 y 10 probablemente las cadenas de gelatina se encuentren en la conformacin de collar de perlas y, finalmente a los pH 11 y 12 nuevamente adoptaran la conformacin de polielectrolitos debido a que f toma valores de intermedios a elevados siendo a su vez f elevada (ver Figura 9.2.2). Asimismo, en la Figura 9.3.3 se realiz un reticulado o malla formado por rectas igualmente especiadas que poseen pendientes 0.5 y 1.5. Estos valores de pendientes se seleccionaron a partir de los valores crticos de corte mostrados en la Figura 9.2.2. En efecto, si se aplica el logaritmo decimal al

208

Captulo 9

lmite de corte entre la conformacin globular y la conformacin de collar de perlas se obtiene una recta con pendiente 0.5 y si el mismo procedimiento se realiza para el lmite de corte entre la conformacin de collar de perlas y la conformacin de polielectrolito se obtiene una recta de pendiente 1.5.

log f
-1,0

pH 2 pH 3

pH 12 pH 11

-1,2

pH 10 pH 9 pH 8 pH 7 pH 6 pH 4
-1,6

-1,4

pH 5

-1,10 -1,05 -1,00 -0,95 -0,90 -0,85 -0,80 -0,75 -0,70 -0,65 -0,60

log f

Figura 9.3.3. Fraccin de carga neta f = f+ f en funcin de la fraccin total de carga f de una cadena de gelatina en solucin diluida que posee la composicin de aminocidos reportada en la Tabla 9.3.1.

Al tratarse de una teora de escalas, no es posible obtener las constantes de proporcionalidad que permitiran obtener el par de rectas que determinan los lmites de corte exactos. No obstante, resulta til analizar algunos casos. En la Figura 9.3.4 se muestran cuatro ejemplos donde se establecen los lmites conformacionales. Claramente se observa que en todos los casos cuando la solucin posee pH 5 las cadenas de gelatina se encontraran en un estado globular y que tanto a los pH extremos tanto cidos

209

Captulo 9

(pH 2 y 3) como alcalinos (pH 11 y 12) las macromolculas se encontraran en la conformacin de polielectrolito. (a)
log f
-1,0

(b)
log f
pH 2 pH 3 pH 12 pH 11
-1,2 -1,0

pH 2 pH 3

pH 12 pH 11

-1,2

pH 10 pH 9 pH 8 pH 7 pH 6 pH 4
-1,6 -1,6

pH 10 pH 9 pH 8 pH 7 pH 6 pH 4

-1,4

-1,4

pH 5

pH 5

-1,10 -1,05 -1,00 -0,95 -0,90 -0,85 -0,80 -0,75 -0,70 -0,65 -0,60

-1,10 -1,05 -1,00 -0,95 -0,90 -0,85 -0,80 -0,75 -0,70 -0,65 -0,60

log f

log f

(c)
log f
-1,0

(d)
log f
pH 2 pH 3 pH 12 pH 11
-1,2 -1,0

pH 2 pH 3

pH 12 pH 11

-1,2

pH 10 pH 9 pH 8 pH 7 pH 6 pH 4
-1,6 -1,6

pH 10 pH 9 pH 8 pH 7 pH 6 pH 4

-1,4

-1,4

pH 5

pH 5

-1,10 -1,05 -1,00 -0,95 -0,90 -0,85 -0,80 -0,75 -0,70 -0,65 -0,60

-1,10 -1,05 -1,00 -0,95 -0,90 -0,85 -0,80 -0,75 -0,70 -0,65 -0,60

log f

log f

Figura 9.3.4: Logaritmo de la fraccin de asimetra de carga de cadenas de gelatina en funcin del logaritmo de la fraccin de carga total. Las figuras (a), (b), (c) y (d) muestran distintos lmites conformacionales posibles

Asimismo, en el rango de pH comprendido entre 6 y 10 se observa que las cadenas de gelatina podran estar formando estructuras con

conformaciones del tipo collar de perlas. En cuanto al la conformacin

210

Captulo 9

adoptada por las molculas de gelatina a pH 4 no se podra definir si estas se encontraran en conformacin errtica (ver Figura 9.3.4 a y d), globular (ver Figura 9.3.4 c) o de polielectrolito (ver Figura 9.3.4 b). Con el fin de obtener datos que permitan realizar una estimacin semicuantitativa de las diferentes conformaciones macromoleculares que pueden adoptar las molculas de gelatina a los distintos pH, se utilizaron los conceptos tericos revisados en la seccin 9.2 y se obtuvieron dimensiones, que aunque slo permiten estimar escalas u rdenes de magnitud, sirven como marco de referencia de la problemtica planteada la cual, actualmente, posee un grado de conocimiento poco desarrollado segn lo reportado en la literatura. Considerando las ecuaciones (9.2.4. a y b) se obtuvieron los valores del tamao de las esferas y el nmero de monmeros g en cada una de ellas para los diferentes estados de carga a los distintos pH. Estos resultados se muestran en las Figuras 9.3.4 y 9.3.5 respectivamente.

22 20 18

()

16 14 12 10 8

10

12

pH

Figura 9.3.5 Tamao de las esferas en funcin del pH de cadenas de gelatina en solucin diluida. La composicin de aminocidos se reporta en la Tabla (9.3.1).

211

Captulo 9

En la Figura 9.3.5 se observa que disminuye desde pH 2 hasta pH 6 y luego se mantiene constante hasta un pH de aproximadamente 9 a partir del cual aumenta nuevamente su tamao hasta el pH 12, aunque este aumento no es muy pronunciado. Consistentemente, la misma tendencia muestra el nmero de monmeros dentro de cada esfera g (ver, Figura 9.3.6). En este sentido, es relevante notar que a los pH 2 y 3, donde las esferas son ms grandes, las cadenas de gelatina estaran en una conformacin de polielectrolito y, de esta forma se formara una estructura ms rgida y expandida.

35 30 25 20 15 10 5 2 4 6 8 10 12

pH
Figura 9.3.6 Nmero de monmeros g en cada esfera en funcin del pH para cadenas de gelatina en solucin diluida. La composicin de aminocidos se reporta en la Tabla (9.3.1).

212

Captulo 9

La Figura 9.3.7 muestra la variacin del tamao de cuentas D y de la longitud de los conectores l con a los diferentes valores de pH. Se observa que en la zona del punto isoelctrico las cuentas alcanzan el tamao mximo y, consecuente como lo predice la teora para polianfolitos, la longitud del conector tambin aumenta debido a que la elevada carga acumulada en las cuentas fuerza a incrementar la longitud de los conectores en virtud de minimizar la repulsin electrosttica entre dos cuentas vecinas. Asimismo, en la zona de pH comprendido entre 6 y 10 se observa una zona estable donde ambas dimensiones se mantienen aproximadamente constantes.

70 60 50 () 40 30 20 10

lstr Db

6 pH

10

12

Figura 9.3.6 Longitud del conector () y tamao de las cuentas () en funcin del pH para cadenas de gelatina en solucin diluida. La composicin de aminocidos se reporta en la Tabla (9.3.1).

Teniendo en cuenta el nmero total de esferas N ET = N g , el nmero de esferas en cada conector N ECON = l con y el nmero de esferas en una 213

Captulo 9

cuenta N EC = m g , se obtiene el nmero de cuentas en una cadena nC , es decir,

nC =

N ET + N ECON N ECON + N EC

(9.3.4)

La Figura 9.3.8 muestra el nmero de cuentas en una cadena en funcin del pH.

50

40

30

nc
20 10 0

10

12

pH

Figura 9.3.8 Nmero de cuentas por cadena nc en funcin del pH para cadenas de gelatina en solucin diluida. La composicin de aminocidos se reporta en la Tabla (9.3.1).

Se observa que en los pH extremos cidos 2 y 3 las cadenas de gelatina estaran constituidas por un elevado nmero de cuentas mientras que en la zona del punto isoelctrico stas tendran una estructura ms compacta

214

Captulo 9

compuesta de cuatro cuentas aproximadamente. Por otro lado, en la zona comprendida entre los pH 6 y 9 las cadenas de gelatina estaran compuestas de 9 a 16 cuentas y para valores de pH mayores stas tendran un nmero de cuentas mayor a 30. Asimismo, es relevante notar que el nmero de conectores por cadena es ncon = nc 1 .

9.4 Viscosidad reducida de soluciones diluidas de gelatina para diferentes pH y fuerzas inicas

Preparacin de las soluciones

Con el objetivo de evaluar el comportamiento reomtrico de soluciones diluidas de gelatina a diferentes pH y fuerzas inicas se realizaron ensayos de reometra capilar gravitatoria. Estas experiencias se llevaron a cabo utilizando el viscosmetro capilar gravitatorio diseado especialmente para obtener un rango de velocidades de corte bajas (ver Captulo 6). Se evalu la viscosidad reducida red de las soluciones de gelatina a distintos pH y fuerzas inicas, donde en todos los casos los valores de red resultaron del orden de magnitud de la viscosidad intrnseca (ver Captulo 7 y 8 una discusin ms detallada de este aspecto). Para este estudio se utiliz la misma muestra de gelatina analizada a travs de los ensayos de viscosidad intrnseca a diferentes historias trmicas y viscosidad especfica en funcin del tiempo de maduracin (ver caractersticas de esta muestra de gelatina en el Captulo 7) la cual posee un peso molecular

215

Captulo 9

promedio M n = 133 KDa obtenido mediante PAGE-SDS (ver los detalles de este estudio en el Captulo 5). Para la determinacin de la viscosidad reducida a los distintos pH y fuerzas incas se prepararon soluciones diluidas de gelatina con una concentracin de 2 10-3 g/cm3. La fuerza inica se estableci en con cloruro de sodio (NaCl) y el pH con cido clorhdrico (HCl) e hidrxido de sodio (NaOH) para las soluciones con pH cidos o alcalinos respectivamente. Para la disolucin de la gelatina se realiz primero una etapa de hidratacin de diez minutos con agua deionizada a 50C y luego otra etapa de disolucin total en un volumen cercano al volumen final con el contenido de NaCl a la misma temperatura. Esta etapa se realiz con agitacin durante cuarenta minutos. Seguidamente, se ajust el pH con NaOH o HCl, se complet el volumen final verificando el pH requerido. Asimismo, se adicion azida sdica en una concentracin de 0,02% para prevenir degradaciones bacterianas. Mediante este procedimiento se prepararon soluciones con diferentes valores de pH (pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) y a fuerza inica (I= 6, 20, 110, 300 y 500 mM). Las soluciones se filtraron y se almacenaron en botellas de vidrio color caramelo para evitar el contacto con la luz. Antes de realizar los ensayos reomtricos las soluciones se calentaron a 50C durante una hora bajo agitacin con el objetivo de eliminar las posibles asociaciones producidas durante el tiempo

comprendido entre la preparacin de las mismas y los ensayos experimentales lo cual insume un cierto tiempo. Finalmente se midi la viscosidad aparente de las soluciones a 25C y se obtuvo el valor de la viscosidad reducida

red = s s C

considerando

la

viscosidad

del

solvente

la

concentracin de las soluciones diluidas.

216

Captulo 9

Resultados

Al igual que en las experiencias realizadas para obtener la viscosidad intrnseca (Captulo 7) y la viscosidad especfica en funcin del tiempo de maduracin (Captulo 8), en todos los casos (es decir para todos los pH y las fuerzas inicas) las soluciones se comportaron como fluidos newtonianos en el rango de velocidad de corte comprendido entre 50 y 2800 seg-1. En efecto, los datos experimentales de H versus t se ajustaron satisfactoriamente con la ecuacin (6.2.12) (ver Captulo 6) arrojando coeficientes de regresin lineal cuadrado r 2 0,999 y errores relativos de ajuste 0,02. La Figura 9.4.1 muestra el comportamiento de la viscosidad reducida de las soluciones diluidas de gelatina con el pH y la fuerza inica. Se observa claramente que en la zona de pH correspondiente a la zona del punto isoelctrico ( pI 4-5) la viscosidad reducida alcanza un mnimo en todos los valores de fuerza inica ensayados. Esto indica que con la variacin del pH en un pequeo rango alrededor del pI las atracciones electrostticas entre cargas de signo opuesto conducen al colapso de cada cadena de gelatina conduciendo a la formacin de estructuras con un radio hidrodinmico menor y, por consiguiente, una disminucin de la red . Por el contrario, para pH alejados de la zona del pI red aumenta gradualmente hacia valores de pH extremos. Esto se debera a que a medida que aumenta la carga neta de las macromolculas (estas sern positivas en las zonas de pH cidos y negativas en las zonas de pH alcalino) se produce la expansin de las mismas como consecuencia de la repulsin electrosttica entre cargas del mismo signo.

217

Captulo 9

65

60

55

red (cm /g)

50

45

40 2 4 6 8 10 12

pH

Figura 9.4.1. Efecto del pH y la fuerza inica en el comportamiento de soluciones diluidas de gelatina para una concentracin de 2 10-3 g/cm3 en un amplio rango de pH para las fuerzas inicas () 6 mM, () 20 mM, () 110 mM, () 300 mM and () 500 mM.

El efecto de la fuerza inica tambin se muestra en la Figura 9.4.1. donde se observa que la red y, por lo tanto, el tamao de las macromolculas disminuye a medida que se agrega mayor cantidad de sal en los rangos de pH donde las macromolculas poseen una asimetra de carga elevada (ver en Figura 9.4.1 a pH 10). En estas circunstancias, el agregado de sal inhibe las repulsiones electrostticas (mediante el apantallamiento de las cargas) provocando que la macromolcula adopte una estructura ms compacta disminuyendo, de esta manera, el radio hidrodinmico. Por otro lado, en la zona de pH del pI (ver en Figura 9.4.1 a pH 4-5) el tamao de las macromolculas y, consecuentemente, red aumentan a medida

218

Captulo 9

que se agrega mayor cantidad de sal. Esto se debera a que en la medida que las atracciones electrostticas entre cargas de signo opuesto y relativamente iguales en nmero se inhiben por el apantallamiento de las cargas por parte de los iones salinos. En las zonas de pH intermedios, se encuentran presentes tanto las atracciones entre cargas de signo opuesto como las repulsiones entre cargas del mismo signo. En este sentido, para un anlisis ms detallado de este fenmeno se presenta, a continuacin, la Figura 9.4.2 la cual muestra la variacin de la viscosidad reducida en funcin de la fuerza inica para valores constantes de pH. A pH 3, por ejemplo, por la fraccin de carga total y neta que posee la gelatina (ver Tabla 9.3.3) y considerando, adems, lo discutido en la seccin 9.3, las molculas de gelatina se encontraran, probablemente, en una conformacin de polielectrolito en ausencia de iones salinos. En este sentido, la adicin de sal obligara a las macromolculas a adoptar la conformacin de collar de perlas (necklace globule) mediante el apantallamiento de las repulsiones electrostticas. A fuerzas inicas mayores a 100 mM la adicin de mayores cantidades de sal induce a que las molculas de gelatina evolucionen a una transicin en cascada de conformaciones en collar de perlas con mayor nmero de cuentas (Dobrynin et al., 1996; Dobrynin y Rubinstein, 2004) y, por lo tanto, el tamao hidrodinmico de es estas estructuras aumenta nuevamente reflejndose en el aumento de la red . Un comportamiento similar se observa a pH 4.

219

Captulo 9

64 62 60 58

red (cm /g)

56 54 52 50 48 46 44 42 0 100 200 300 400 500

I (mM)

Figure 9.4.2 Viscosidad reducida de soluciones diluidas de gelatina a una concentracin de 2.10-3 g/cm3 en funcin de la fuerza inica a los pH 3 (), 4 (+), 5 (), 6 (), 7(*), 8 (), 9 () y 10 ().

Asimismo, la Figura 9.4.2 muestra que a pH 5 (cerca del punto isoelctrico) red aumenta para todos los valores de fuerza inica usados en las experiencias. En este caso, las molculas de gelatina en ausencia de sal se encontraran en un estado de globular. La adicin de sal solamente inducira una expansin de la molcula mediante el aumento progresivo del nmero de cuentas provocando, de esta forma, la expansin de la cadena y el aumento del radio hidrodinmico con el consecuente aumento de la red . Un fenmeno similar se observa a pH 6. A los pH 8 y 9 la Figura 9.4.2 muestra que red presenta un comportamiento similar que a pH 3. En este caso, primeramente, el tamao de las macromolculas disminuira (lo cual se refleja en la disminucin de red )

220

Captulo 9

debido a la inhibicin de las repulsiones electrostticas provocando, de esta forma, el aumento del tamao de las cuentas a expensas de la reduccin de la cantidad de las mismas presentes en cada cadena de gelatina. Luego, por encima de un valor de fuerza inica de 100 mM aproximadamente, la inhibicin de las atracciones electrostticas entre cargas opuestas producira la expansin de la cadena (y el consecuente aumento de red ) mediante el aumento del nmero de cuentas. Finalmente, a pH 10 red solamente disminuye con el agregado de sal. En este caso, las cadenas de gelatina evolucionaran a estructuras ms compactas a medida que la fuerza inica aumenta, debido a la inhibicin de las repulsiones entre cargas del mismo signo.

9.5 Viscosidad aparente de soluciones concentradas de gelatina para diferentes pH y fuerzas inicas

Con el objetivo de evaluar el comportamiento reomtrico de soluciones concentradas de gelatina a diferentes pH y fuerzas inicas se realizaron ensayos de reometra en flujo de corte con geometra rotacional. Los ensayos reomtricos se llevaron a cabo utilizando el viscosmetro rotacional de celda cono-plato cuyas caractersticas y metodologa para la obtencin de las funciones reomtricas se detallan en el Captulo 6. Para este estudio se utiliz la misma muestra de gelatina que se analiz en condiciones diluidas (ver Seccin 9.3). Se realiz la determinacin de la viscosidad aparente a los distintos pH y se evalu tambin el efecto del agregado de sal realizando experiencias en presencia de 300 mM de NaCl.

221

Captulo 9

Para esto, se prepararon soluciones concentradas de gelatina con una concentracin de 0,08 g/cm3 (8% p/v) siguiendo el mismo protocolo utilizado para la preparacin las soluciones diluidas. Se coloc la muestra en la celda reomtrica, se llev a 25C en 30 segundos y se midi la viscosidad aparente a una velocidad de corte de 76,8 s-1 (20 rpm) durante diez minutos tomando valores de a intervalos de 1 minuto. En este sentido, se seleccion una velocidad de corte baja para minimizar la destruccin de la microestuctura formada a elevadas velocidades corte (Carvalho y Djabourov, 1997; Eluk et al., 2005).

Resultados

Se observ en todos los casos (es decir para todos los pH ensayados tanto en ausencia como en presencia de sal) que aumenta progresivamente a medida que transcurre el tiempo de maduracin. En este sentido, la Figura 9.5.1 a y b muestra la evolucin de paramtricamente con los valores de pH. Como es esperable, el aumento de la viscosidad aparente a medida que transcurre el tiempo de maduracin cuando C > C g y T < Tg se debe a la regeneracin parcial de la estructura tropocolagnica de las cadenas de gelatina (Normand et al.; 2000. Joly-Duhamel et al., 2002a y 2002b). Es decir, se producen zonas de triples hlices intermoleculares que conducen a la formacin de una red cooperativa la cual provoca la gelificacin al tiempo t g (ver Captulo 4). Asimismo, la presencia de cargas en las cadenas de gelatina estabiliza las zonas de triples hlices formadas y, por consiguiente, la variacin

222

Captulo 9

del pH de la solucin (con el consecuente cambio del estado de cargas de las macromolculas) influye en la maduracin de estas soluciones.

(a)

(b)

300

(cp)
250 200 150 100 50 0

(cp)

60 55 50 45 40 35 30 25 20 15

10

10

10

Tiempo (min)

Tiempo (min)

Figura 9.5.1 Viscosidad aparente en funcin del tiempo de maduracin correspondiente a una solucin de gelatina con una concentracin C = 0,08 g/cm3 a 25C evaluada a una velocidad de corte de 76,8 s-1. La Figura (a) corresponde a la experiencia realizada en ausencia de sal y la Figura (b) corresponde a la experiencia realizada en presencia de 300 mM de NaCl. Los pH evaluados son: 3

(), 4 (), 5 (), 6 (), 7 (), 8 (+), 9 () y 10(*).

Se observa que en ausencia de sal (ver Figura 9.5.1a), las soluciones de gelatina que poseen valores de pH mayores a cinco experimentan un marcado aumento de la viscosidad aparente luego de los cinco minutos de maduracin, mientras que para valores de pH menores (pH 3 y 4) las soluciones no registran un aumento de viscosidad tan marcado. En tal sentido, es relevante recordar que la fraccin de grupos cargados f presenta un marcado aumento para valores de pH mayores a cinco (ver Figura 9.3.2), mantenindose constante hasta nueve aproximadamente y descendiendo nuevamente a pH

223

Captulo 9

mayores a este valor. Por consiguiente, a travs del anlisis reomtrico realizado se observa cuanto mayor es el estado de carga de las cadenas de gelatina ms rpida es la formacin de la red macromolecular debido a la estabilizacin mediante interacciones electrostticas atractivas entre las cadenas de gelatina. Mediante el agregado de sal (I= 300 mM) se observa que las soluciones de gelatina presentan una maduracin ms lenta, debido a que para un mismo tiempo y temperatura de maduracin se obtuvieron valores de menores respecto a los presentados por las soluciones de gelatina en ausencia de sal (ver Figura 9.5.1 b). En este sentido, los iones salinos apantallaran las cargas elctricas y, de esta forma, disminuira la estabilizacin mediada por cargas de las estructuras de triples hlices. Para analizar el efecto del pH y, consecuentemente, del estado de cargas en la formacin de triples hlices intermoleculares en soluciones concentradas de gelatina en la Figura 9.5.2 a y b se presenta la variacin de en funcin del pH a tiempos de maduracin constantes tanto para la experiencia donde no se adicion sal como para aquella que se evalu en presencia de 300 mM de NaCl. Se observa que presenta un mximo en la zona de pH comprendido entre 5 y 6. En este sentido, es preciso recordar que a estos pH las cadenas de gelatina poseen tanto cargas positivas como negativas y, de esta forma, la atraccin electrosttica entre cargas opuestas favorecera la estabilizacin de las zonas de triples hlices formadas. Por consiguiente, es esperable que en esta zona de pH, sea mayor que en las zonas de pH donde predominan las cargas igual signo en las cuales se

224

Captulo 9

producira repulsin entre las cadenas desfavoreciendo, de este modo, la formacin y estabilizacin de zonas de triple hlices intermoleculares.

(a)

(b)

(cp)

300 250 200 150 100 50

(cp)

70 60 50 40 30 20

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 10 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

pH

pH

Figura 9.4.2 Viscosidad aparente en funcin del pH correspondiente a una solucin de gelatina con una concentracin C = 0,08 g/cm3 a 25C evaluada a una velocidad de corte de 76,8 s-1. La Figura (a) corresponde a la experiencia realizada en ausencia de sal y la Figura (b) corresponde a la experiencia realizada en presencia de 300 mM de NaCl. Los tiempos de maduracin evaluados son: 1 (), 4 (), 8 () y10 () minutos.

Asimismo, resulta relevante analizar por qu el mximo de en las soluciones concentradas se registra entre los pH 5 y 6. Aunque el punto isoelctrico de las cadenas de gelatina analizadas en este trabajo se encuentra comprendido entre los pH 4 y 5 a estos valores de pH, la fraccin de grupos cargados f es menor que a pH 6 donde se alcanza el valor mximo de f (ver Figura 9.3.2). Por consiguiente, a pH 6 habra un mayor nmero de grupos cargados positivos y negativos que intervendran en la estabilizacin de las zonas de triples hlices intermoleculares. Asimismo, resulta relevante mencionar que las cadenas de gelatina a pH 5 poseen una conformacin del

225

Captulo 9

tipo globular debido a la presencia de interacciones electrostticas atractivas intramacromoleculares y, por consiguiente, las interacciones intermoleculares durante el proceso de maduracin no sera tan favorable como en los casos donde el pH de la solucin es mayor a 5 donde las cadenas estn ms expandidas. Por otro lado, es importante recordar que en el caso de

soluciones diluidas, donde las interacciones entre cargas son intramoleculares se observa que el mnimo de red (es decir el menor radio hidrodinmico de las molculas individuales de gelatina) se produce en la zona del punto isoelctrico como lo predice la teora de polianfolitos (ver Figura 9.4.1). Asimismo, en las Figura 9.5.2 a y b se observa que en la zona de pH comprendida entre 7 y 9 disminuye de una manera menos pronunciada. En este sentido, es interesante notar que en esta zona de pH tanto la asimetra de carga Nf (ver Figura 9.3.1) como la fraccin total de grupos cargados f (ver Figura 9.3.2) mantienen un valor aproximadamente constante. Por

consiguiente, en esa zona de pH la estabilizacin a travs de cargas de las estructuras de triple hlice sera semejante. Con el objetivo de analizar el efecto del agregado de sal en el comportamiento de soluciones concentradas de gelatina a los diferentes pH, en la Figura 9.5.3 se realiza una comparacin del comportamiento de estas soluciones a un tiempo de maduracin constante de 10 minutos. Se observa que el agregado de NaCl inhibe la maduracin de las soluciones de gelatina obtenindose valores de menores respecto de la misma experiencia (es decir al mismo pH y tiempo de maduracin) en ausencia de sal. No obstante, an a 300 mM de NaCl la presencia de las cargas influencia la maduracin de

226

Captulo 9

las soluciones concentradas de gelatina debido a que se observa que igualmente vara con el pH de la solucin.

300

(cp)
250 200 150 100 50 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

pH

Figura 9.4.3 Viscosidad aparente en funcin del pH correspondiente a una solucin de gelatina con una concentracin C = 0,08 g/cm3 a 25C evaluada a una velocidad de corte de 76,8 s-1 a un tiempo de maduracin de 10 minutos. Las experimencias se realizaron en ausencia de sal () y en presencia de 300 mM de NaCl ().

9.6 Conclusiones

Mediante el estudio terico y experimental de soluciones diluidas y concentradas de gelatina a diferentes pH se observ que stas presentan un comportamiento tpico de polianfolitos. En efecto, el anlisis del estado de cargas de la secuencia peptdica perteneciente a una gelatina de vaca (Bos Taurus) permiti observar que las cadenas de gelatina presentan un punto

227

Captulo 9

isoelctrico pI = 4,48 y que desde el valor de pH 6 hasta el valor de pH 9 la carga neta no aumenta considerablemente. Adems se observ que la fraccin total de carga aumenta desde el pH 2 hasta el pH 7 donde adquiere su valor mximo. En este sentido, resulta importante considerar en forma conjunta en el anlisis del estado elctrico de las soluciones de gelatina tanto la carga neta como la carga total. Adems, de este estudio tambin se concluye que la gelatina es un polianfolito dbilmente cargado debido a que nunca (es decir a ningn pH) posee ms de un 20% de sus aminocidos cargados. Mediante la aplicacin de la teora de polianfolitos a cadenas de gelatina se observ que este biopolmero en la zona del pI y en ausencia de sal estara formando un glbulo compacto y que en la zona de pH comprendida 6 y 10 formara estructuras ms expandidas (conformacin en collar de perlas) que ocluiran mayor cantidad de solvente. Asimismo, a los pH extremos cidos (pH 2 y 3) y alcalinos (pH 11 y 12) estas macromolculas se comportaran como polielectrolitos. A travs del anlisis reomtrico de soluciones diluidas de gelatina se observ que la viscosidad reducida alcanza un mnimo en la zona de pH entorno al pI mientras que en las zonas alejadas a este punto sta aumenta gradualmente. Estos resultados reflejan, claramente, que las fuerzas de interaccin en soluciones diluidas son intramoleculares, las cuales modifican el radio hidrodinmico de estas entidades. Asimismo, analizando el efecto de la fuerza inica en las soluciones diluidas de gelatina se observ que el tamao macromolecular y,

consecuentemente, la red disminuyen a medida que aumenta la cantidad de sal adicionada cuando las macromolculas poseen una carga neta elevada (es

228

Captulo 9

decir a pH alejados del pI ), debido a la inhibicin de las repulsiones electrostticas. Por otra parte, en la zona de entorno al pI el tamao macromolecular y la red aumentan con el agregado de sal debido a que la inhibicin de las atracciones entre cargas opuestas permite la expansin de las macromolculas. Mediante el estudio reomtrico de soluciones concentradas de gelatina, se observ que la variacin del estado de carga (que se produce al variar el pH de la solucin) influye en la formacin de zonas de triples hlices intermoleculares. A travs de este anlisis reomtrico se observ que cuanto mayor es el estado de carga (cuantificado a travs de la fraccin total de grupos cargados) de las cadenas de gelatina ms rpida es la formacin de la red macromolecular debido a la estabilizacin mediante interacciones electrostticas atractivas entre las cadenas de gelatina. A pH 6 las soluciones presentan un mximo de viscosidad aparente debido a que en estas condiciones fisicoqumicas las cadenas de gelatina presentan cargas de signo opuesto y adems se encuentran en el estado mximo de carga total. Adems, a este valor de pH las cadenas se encontraran en una conformacin ms expandida (respecto a la conformacin globular que se produce en el punto isoelctrico) que favorecera formacin de la red macromolecular que se produce durante el proceso de maduracin. Asimismo, se observ que el agregado de sal inhibe, parcialmente, la estabilizacin de las zonas de triple hlices formadas. Finalmente, resulta relevante observar en esta etapa de investigacin que el comportamiento de las cadenas de gelatina en condiciones diluidas es importante para la interpretacin de las fenomenologas que presentan estas

229

Captulo 9

macromolculas en soluciones concentradas. En efecto, la naturaleza elctrica de la gelatina es uno de los aspectos menos estudiados hasta la actualidad y a su vez una de las caractersticas ms importantes para el diseo de numerosas aplicaciones tecnolgicas.

230

Captulo 9

9.7 Bibliografa

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232

Captulo 9

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233

Conclusiones

Conclusiones

Conclusiones

Resultados particulares ms relevantes del trabajo 9

Haciendo uso de la tcnica de electroforesis en gel de poliacrilamida se

logr mostrar adecuadamente la composicin de la mezcla polimrica que se obtiene luego del proceso de extraccin de gelatina. Asimismo, el anlisis por densitometra computacional propuesto permiti obtener fw (M ) , Mw y M n . 9 Se construy un viscosmetro capilar en el cual la velocidad de corte

alcanzada fue minimizada colocando el capilar en forma horizontal. Con este instrumento se realiz un programa experimental adecuado para la medicin de soluciones diluidas y ultra - diluidas de gelatina en diferentes condiciones fisicoqumicas. El dispositivo capilar diseado permite obtener la funcin reomtrica viscosidad aparente en un amplio rango de velocidades de corte y calcular los diferentes parmetros reolgicos de distintos modelos a partir de la variacin de la altura del fluido en los reservorios. 9 Se observ que en el rgimen de concentracin diluido ( C c < C < C g ) la

temperatura de maduracin afecta los valores de viscosidad intrnseca debido a la agregacin de las cadenas de gelatina. As, cuando la temperatura de
* maduracin se encuentra por debajo del valor crtico Tg , las cadenas de

gelatina evolucionan a la conformacin de poli-L-prolina y se estabilizan mediante la generacin de zonas de triples hlices, dando lugar a la formacin de agregados o clusters. 9 El proceso de agregacin se interpret haciendo uso de la teora de

agregacin de Smoluchowski. En tal sentido, se observ que a medida que el tiempo de maduracin aumenta, se producen agregados ms heterogneos.

234

Conclusiones

Asimismo, los agregados son ms desordenados y ocluyen mayor cantidad de solvente cuanto menor es la temperatura de maduracin. 9 Mediante la evaluacin del factor de estabilidad coloidal W se observa

que el proceso de agregacin es lento debido a que las molculas de gelatina deben vencer una barrera energtica de aproximadamente 25 veces la energa trmica k BTm . 9 Tambin se observa que, en la zona ultra diluida, la agregacin sera

excluida debido a que en esta zona slo se obtuvieron incrementos muy pequeos de la viscosidad especfica y luego de las 72 horas de maduracin la viscosidad de las soluciones se mantuvo constante. Los valores experimentales de esta zona de concentracin no pudieron ser interpretados mediante la teora de agregacin de Smoluchowski. Estos resultados indicaran que se producira un plegamiento intramolecular debido a la formacin de estructuras de triple hlice. 9 Mediante el estudio terico y experimental de soluciones diluidas y

concentradas de gelatina a diferentes pH se observ que stas presentan un comportamiento tpico de polianfolitos. En efecto, el anlisis del estado de cargas de la secuencia peptdica perteneciente a una gelatina de vaca (Bos Taurus) permiti observar que las cadenas de gelatina presentan un punto isoelctrico pI = 4,48 y que desde el valor de pH 6 hasta el valor de pH 9 la carga neta no aumenta considerablemente. Adems se observ que la fraccin total de carga aumenta desde el pH 2 hasta el pH 7 donde adquiere su valor mximo. Adems, de este estudio tambin se concluye que la gelatina es un polianfolito dbilmente cargado debido a que nunca (es decir a ningn pH) posee ms de un 20% de sus aminocidos cargados.

235

Conclusiones

A travs del anlisis reomtrico de soluciones diluidas de gelatina se

observ que la viscosidad reducida alcanza un mnimo en la zona de pH entorno al pI mientras que en las zonas alejadas a este punto sta aumenta gradualmente. Estos resultados reflejan, claramente, que las fuerzas de interaccin en soluciones diluidas son intramoleculares, las cuales modifican el radio hidrodinmico de estas entidades. No obstante, la adicin de sal puede inhibir la repulsin debido al exceso de cargas del mismo signo y la atraccin entre cargas opuestas. 9 Mediante el estudio reomtrico de soluciones concentradas de gelatina,

se observ que la variacin del estado de carga (que se produce al variar el pH de la solucin) influye en la formacin de zonas de triples hlices intermoleculares. En la zona de pH entorno a 6 las soluciones presentan un mximo de viscosidad aparente debido a que a estos pH las cadenas de gelatina presentan cargas de signo opuesto y adems poseen se encuentran en el estado mximo de carga total. Adems la conformacin individual de las cadenas (respecto a la conformacin globular que presentan en el pI) favorecera las interacciones intermoleculares durante el proceso de

maduracin. Asimismo, se observ que el agregado de sal inhibe, parcialmente, la estabilizacin de las zonas de triple hlices formadas.

Conclusiones generales

Finalmente,

se

puede

concluir

que

este

trabajo

muestra

el

comportamiento reolgico de soluciones de gelatina en un rango amplio de concentracin, temperatura y bajo distintas condiciones fisicoqumicas.

236

Conclusiones

Se propone un marco terico apropiado para la comprensin de la

respuesta de estas soluciones y, en este aspecto, se realizan importantes esfuerzos. 9 Se relacionan las propiedades macroscpicas, como la viscosidad

aparente y la viscosidad intrnseca, con las variables principales de la microestructura de la solucin, como es el tamao y estructura de los agregados, el radio hidrodinmico de las cadenas individuales de gelatina a distintos pH y fuerza inica y la formacin de interacciones intermoleculares en soluciones concentradas.

237

Apndices

Apndice I

Apndice I: Algoritmo numrico propuesto para la obtencin de las funciones y parmetros de los modelos tericos utilizados en esta tesis

El algoritmo numrico propuesto para la obtencin de las funciones y parmetros de los modelos tericos utilizados en esta tesis se compone de tres partes fundamentales: (1) Clculo de la viscosidad aparente y viscosidad intrnseca, (2) Aplicacin de la teora de Smoluchowski para el procesamiento de los datos experimentales obtenidos en los ensayos de agregacin de molculas de gelatina en solucin diluida y (3) Anlisis de la estabilidad de las soluciones diluidas de gelatina para diferentes temperaturas de maduracin. Por consiguiente, se realiza un diagrama de bloques simple que permite visualizar estos procedimientos.

238

Apndice I

(1) Clculo de viscosidad aparente y viscosidad intrnseca

Se presenta a continuacin el procesamiento de datos obtenidos de tiempo de fluencia en funcin de la altura efectiva dentro del dispositivo capilar. Ingreso de datos experimentales t exp , H exp i , i=1,,M H o , L, R, Ro , , C

Clculo por regresin lineal de H (t ) H (t ) tgR 4 = ln 2 Ho 4LR o

Clculo de H (t ) , H (t )

Clculo de la viscosidad 2 Q = / 2R o H (t )

w = &w = =

gRH (t )
H (t ) 3H (t ) + H (t ) H (t ) 2R
2 Ro 3

2L

w &w

r =

red =

esp
C

esp =

r r

red = [ ] + k1[ ]2 C
ln r = [ ] + k1[ ]2 C C 3M n [ ] con [ ] sin agregar, a = 3 4a 3 N A

239

Apndice I

(2) Teora de Smoluchowski

Cambiar f para calcular otro t p

Ingreso de datos experimentales exp tm , esp i , i=1,,M, , f / (3 f ) esp N = para f dado

Clculo por regresin lineal de exp tm , N i , i=1,,M

N = 1+

tm tp

Se obtiene

f , N, t p que arroja el

mejor coeficiente de regresin lineal r 2

t p = 1 k a no

W =

4k BTm 3 s k a

Sk

)k 1 = n o (1 + t m / t p )k +1
kn o t m / t p

kn k Sk = no

a k = k a

B
240

R = S k ak
k =1

Apndice I

(3) Estabilidad de soluciones de gelatina

2 U R = 2 o a ln{ 1 exp[ h ]}

UA =

AH 6

h 2 + 4ah 2a 2 2a 2 + + ln 2 2 2 h 2 + 4ah + 4a 2 h + 4ah h + 4ah + 4a U S = Gal exp( h / l ) UT = U R + U A + U S

Cambiar G para calcular otro W

G (h ) =

2h 1 + 3h / 2a 2 2 a 1 + 13h / 2a + 3h / a

W = 2a
o

exp(UT (h ) / k BT )

(h + 2a )2 G(h )

dh

Obtencin de U S que reproduce los valores b) Teora de Smoluchowski de W a distintas Tm

241

Apndice II

Apndice II: Valores de tiempos experimentales para las distintas experiencias de viscosidad Intrnseca

Tabla II.1: Tiempos promedios experimentales registrados para experiencia E1 a 5 C de viscosidad intrnseca. H(t) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) C= 0,1 %p/v C= 0,2 %p/v C= 0,3 %p/v C= 0,4 %p/v 0 0 0 0 14 33 36 41 44 12 73 79 90,5 98 10 121 133 151 163,5 8 184,5 205,5 227,5 247,5 6 272,5 304 334 364,5 4 422 475 510,5 566,5 2 573 624 700 749,5 1 705 788 880 985 0.5 Tabla II.2: Tiempos promedios experimentales registrados para experiencia E1 a 15 C de viscosidad intrnseca. H(t) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) C= 0,1 %p/v C= 0,2 %p/v C= 0,3 %p/v C= 0,4 %p/v 0 0 0 0 14 32 35 39 43 12 71 77 86 93 10 119 131 142 152 8 179 197 214 228 6 265 288 311 336 4 410 445 483 524 2 556 603 653 712 1 699 763 831 898 0.5 Tabla II.3: Tiempos promedios experimentales registrados para experiencia E1 a 20 C de viscosidad intrnseca. H(t) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) C= 0,1 %p/v C= 0,2 %p/v C= 0,3 %p/v C= 0,4 %p/v 0 0 0 0 14 31 35 37 40 12 70 76 79 84 10 120 126 132 142 8 179 192 200 212 6 261 281 293 311 4 394 421 450 475 2 527 561 598 620 1 682 707 753 796 0.5

242

Apndice II

Tabla II.4: Tiempos promedios experimentales registrados para experiencia E1 a 25 C de viscosidad intrnseca. H(t) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) C= 0,1 %p/v C= 0,2 %p/v C= 0,3 %p/v C= 0,4 %p/v 0 0 0 0 14 31 35 37 40 12 70 76 79 84 10 120 126 132 142 8 179 192 200 212 6 261 281 293 311 4 394 421 450 475 2 527 561 598 620 1 682 707 753 796 0.5

Tabla II.5: Tiempos promedios experimentales registrados para experiencia E1 a 30 C de viscosidad intrnseca. H(t) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) C= 0,1 %p/v C= 0,2 %p/v C= 0,3 %p/v C= 0,4 %p/v 0 0 0 0 14 30 33 36 39 12 69 74 78 82 10 118 124 131 140 8 179 188 196 208 6 258 274 285 299 4 394 422 440 458 2 529 564 592 620 1 679 707 752 792 0.5

Tabla II.6: Tiempos promedios experimentales registrados para experiencia E1 a 35 C de viscosidad intrnseca. H(t) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) C= 0,1 %p/v C= 0,2 %p/v C= 0,3 %p/v C= 0,4 %p/v 0 0 0 0 14 30 32 36 39 12 70 72 78 82 10 118 124 131 140 8 179 187 196 206 6 255 274 283 296 4 392 422 437 456 2 528 561 590 619 1 679 704 748 791 0.5

243

Apndice II

Tabla II.7: Tiempos promedios experimentales registrados para experiencia E2 de viscosidad intrnseca. H(t) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) C= 0,1 %p/v C= 0,2 %p/v C= 0,3 %p/v C= 0,4 %p/v 0 0 0 0 14 30 32 36 39 12 69,5 72 77,5 82 10 118 123,5 131 140 8 179 187 195 206 6 255,5 274 282 296 4 392 422 437 456,5 2 527 561 589 618,5 1 679,5 703,5 748 790 0.5

Tabla II.8: Tiempos promedios experimentales registrados para experiencia E3 de viscosidad intrnseca. H(t) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) C= 0,1 %p/v C= 0,2 %p/v C= 0,3 %p/v C= 0,4 %p/v 0 0 0 0 14 33 36 41 44 12 72,5 78,5 90 96 10 121,5 132 150 162,5 8 182 204 223 245 6 268,5 301 327,5 360,5 4 414 464 502,5 561 2 571 622 691,5 754 1 709,5 788 872 962 0.5

Tabla II.9: Tiempos promedios experimentales registrados para experiencia E4 de viscosidad intrnseca. H(t) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) C= 0,1 %p/v C= 0,2 %p/v C= 0,3 %p/v C= 0,4 %p/v 0 0 0 0 14 32 35 39 40 12 118,5 78 83 90 10 178 128 136 151,5 8 178,5 193 205,5 211 6 262 284 301 314 4 407 433 460,5 492 2 537,5 580 621,5 667 1 692 738 793 847 0.5

244

Apndice II

Tabla II.10: Tiempos promedios experimentales registrados para experiencia E5 de viscosidad intrnseca para una concentracin urea 5 mM. H(t) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) C= 0,1 %p/v C= 0,2 %p/v C= 0,3 %p/v C= 0,4 %p/v 0 0 0 0 14 32 36 40 43 12 12 78 87 95 10 118 131 143 157 8 180 200 217 233 6 266 291 318 341 4 409 448 486 524 2 556 605 660 714 1 700 768 838 909 0.5

Tabla II.11: Tiempos promedios experimentales registrados para experiencia E5 de viscosidad intrnseca para una concentracin urea 20 mM. Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) H(t)
C= 0,1 %p/v C= 0,2 %p/v C= 0,3 %p/v C= 0,4 %p/v

14 12 10 8 6 4 2 1 0.5

0 32 71 118 179 260 406 551 696

0 35 79 131 194 284 438 597 765

0 39 86 143 216 302 474 647 815

0 41 90 149 221 331 513 697 883

Tabla II.12: Tiempos promedios experimentales registrados para experiencia E5 de viscosidad intrnseca para una concentracin urea 50 mM. Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) H(t)
C= 0,1 %p/v C= 0,2 %p/v C= 0,3 %p/v C= 0,4 %p/v

14 12 10 8 6 4 2 1 0.5

0 32 71,5 119 180 261 404 552 696

0 35 78,5 131 194 283 438 598 755 245

0 39 86 143,5 218 302 474 646,5 816

0 41 88,5 148 221 330 514,5 697 886

Apndice II

Tabla II.13: Tiempos promedios experimentales registrados para experiencia E5 de viscosidad intrnseca para una concentracin urea 500 mM. Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) Tiempo (s) H(t)
C= 0,1 %p/v C= 0,2 %p/v C= 0,3 %p/v C= 0,4 %p/v

14 12 10 8 6 4 2 1 0.5

0 32 71 117 178,5 262 407 552 696

0 35 79 131 193 283 436,5 596 754

0 39 85 138 212 303 473 645 815

0 41 88 148 220 328,5 513,5 696 880

246

Apndice II

(a)
red
130 125 130

(b)
110 110

ln r/C
125

red
105

ln r/C

120 115 110 105

120 100 115 95 110 90 105 85 90 100

100 95 90 0,000

100 95 90 0,005 80 80

0,001

0,002

0,003
-3

0,004

75 0,000

0,001

0,002

0,003
-3

0,004

0,005

C (g cm )

C (g cm )

(c)
70 70 68 66 64 62

(d)
red

68 66 64 62 60 58 56 54 52 50 0,000

ln r/C

64

64

red
62

ln r/C
62

60

60

58 60 58 56 54 52 52 50 0,005 50 0,000 0,001 0,002 0,003


-3

58

56

56

54

54

52

0,001

0,002

0,003
-3

0,004

0,004

50 0,005

C (g cm )

C (g cm )

(e)
62 62

red
60

ln r/C
60

58

58

56

56

54

54

52

52

50 0,000

0,001

0,002

0,003
-3

0,004

50 0,005

C (g cm )

Figura II.1: Valores experimentales de red y ln r / C para la experiencia E1 a: (a) 5 C, (b) 15 C, (c) 25 C y (d) 30 C y (e) 35 C.

247

Apndice II

red

130

130

ln r/C
125

125

120

120

115

115

110

110

105

105

100

100

95

95

90 0,001 0,002 0,003 0,004


-3

90

C (g cm )

Figura II.2: Valores experimentales de red y ln r / C para la experiencia E3

85

85

red

ln r/C
80

80

75

75

70

70

65 0,000

0,001

0,002

0,003
-3

0,004

65 0,005

C (g cm )

Figura II.3: Valores experimentales de red y ln r / C para la experiencia E4

248

Apndice II

(a)
110 110

(b)
100 100

red
105

ln r/C
105

red
95

ln r/C
95

100

100 90 90

95

95 85 85

90

90

85

85

80

80

80 0,001 0,002 0,003 0,004


-3

80

75 0,001 0,002 0,003 0,004


-3

75

C (g cm )

C (g cm )

(c)
100 100

(d)
100 100

red
95

ln r/C
95

red
95

ln r/C
95

90

90

90

90

85

85

85

85

80

80

80

80

75 0,001 0,002 0,003 0,004


-3

75

75 0,001 0,002 0,003 0,004


-3

75

C (g cm )

C (g cm )

Figura II.4: Valores experimentales de red y ln r / C para la experiencia E5 a las siguientes concentracioes de Urea: (a) 5 mM, (b) 20 mM, (c) 30 mM y (d) 500 mM.

249

Apndice III

Apndice III: Valores de tiempos experimentales para las distintas experiencias de agregacin Browniana Tabla III.1: Tiempos experimentales promedios de una solucin de gelatina de concentracin 10-3 g/cm3 a la temperatura de maduracin de 5C. Tiempo de Tiempos experimentales de fluencia dentro del maduracin dispositivo capilar (s) en funcin de la altura efectiva (h) H(t) 14 12 10 8 6 4 2 1 0.5 0 30 70 118 179 254 392 527 680 0 0 30 70 118 179 255 394 528 682 2 0 31 71 119 180 260 398 544 690 5 0 31 71 119 180 264 402 548 694 8 0 31 71 119 180 266 404 551 697 11 0 33 72 121 184 272 422 573 709 20 0 33 72 121 185 274 424 574 712 24 Tabla III.2: Tiempos experimentales promedios de una solucin de gelatina de concentracin 10-3 g/cm3 a la temperatura de maduracin de 15C. Tiempo de Tiempos experimentales de fluencia dentro del maduracin dispositivo capilar (s) en funcin de la altura efectiva (h) H(t) 14 12 10 8 6 4 2 1 0.5 0 30 70 118 179 254 392 527 680 0 0 30 70 118 179 255 394 528 681 2 0 30 70 118 179 256 396 534 684 5 0 30 70 118 179 259 401 537 690 8 0 30 70 118 179 262 403 544 691 11 0 30 70 118 180 266 409 556 699 20 0 30 70 118 180 267 411 558 703 24 Tabla III.3: Tiempos experimentales promedios de una solucin de gelatina de concentracin 10-3 g/cm3 a la temperatura de maduracin de 20C. Tiempos experimentales de fluencia dentro del Tiempo de maduracin dispositivo capilar (s) en funcin de la altura efectiva H(t) (h) 14 12 10 8 6 4 2 1 0.5 0 30 70 118 179 254 392 526 680 0 0 30 70 118 179 254 392 528 681 2 0 30 70 118 179 254 393 530 683 5 0 30 70 118 179 256 395 533 684 8 0 31 71 119 180 257 397 535 685 11 0 31 71 119 180 262 404 538 689 20 0 31 71 119 180 263 405 540 692 24

250

Apndice III

Tabla III.4: Tiempos experimentales promedios de una solucin de gelatina de concentracin 10-3 g/cm3 a la temperatura de maduracin de 25C. Tiempos experimentales de fluencia dentro del Tiempo de maduracin dispositivo capilar (s) en funcin de la altura efectiva H(t) (h) 14 12 10 8 6 4 2 1 0.5 0 30 70 118 179 254 392 526 680 0 0 30 70 118 179 254 392 527 681 2 0 30 70 118 179 254 393 528 681 5 0 30 70 118 179 254 392 528 682 8 0 30 70 118 179 254 393 528 683 11 0 30 70 119 179 254 394 529 685 20 0 30 70 119 179 254 394 530 686 24

251

Apndice IV

Apndice IV: Valores de tiempos experimentales promedios para las distintas experiencias de viscosidad reducida en funcin del pH.

Tabla IV.1: tiempos experimentales promedios de ensayos de viscosimetra capilar de soluciones de gelatina al 0,2 % p/v y I=0,006 M. Tiempos experimentales de fluencia dentro del dispositivo capilar (s) H(t)(cm) pH 10 pH 9 pH 8 pH 7 pH 6 pH 5 pH 4 pH 3 0 0 0 0 0 0 0 0 14 33 33 32 32 31 32 32 33 12 73 72 71 71 70 72 72 73 10 123 121 120 120 119 120 121 123 8 184 183 181 181 180 181 182 184 6 273 268 264 264 262 264 268 273 4 421 417 411 407 402 406 414 421 2 564 562 557 549 546 549 556 564 1 713 709 704 700 693 697 705 713 0.5 Tabla IV.2: tiempos promedios de ensayos de viscosimetra capilar de soluciones de gelatina al 0,2 % p/v y I=0,020 M. Tiempos experimentales de fluencia dentro del dispositivo capilar (s) H(t)(cm) pH 10 pH 9 pH 8 pH 7 pH 6 pH 5 pH 4 pH 3 0 0 0 0 0 0 0 0 14 33 33 33 32 32 31 32 32 12 74 73 72 71 71 70 72 72 10 124 123 121 120 120 119 120 121 8 186 184 183 181 181 180 181 182 6 275 272 268 265 264 263 264 267 4 423 420 416 412 407 404 405 413 2 566 564 560 557 548 547 548 556 1 714 712 708 704 698 694 695 704 0.5 Tabla IV.3: tiempos promedios de ensayos de viscosimetra capilar de soluciones de gelatina al 0,2 % p/v y I=0,110 M. Tiempos experimentales de fluencia dentro del dispositivo capilar (s) H(t)(cm) pH 10 pH 9 pH 8 pH 7 pH 6 pH 5 pH 4 pH 3 0 0 0 0 0 0 0 0 14 33 33 32 32 32 32 32 32 12 72 72 71 71 71 71 71 71 10 122 122 121 120 120 120 120 120 8 183 182 181 180 180 180 180 181 6 273 271 267 263 263 263 264 266 4 418 417 415 407 406 405 406 409 2 564 561 559 555 552 550 551 555 1 709 707 705 703 699 697 699 701 0.5

252

Apndice IV

Tabla IV.4: tiempos promedios de ensayos de viscosimetra capilar de soluciones de gelatina al 0,2 % p/v y I=0,300 M. Tiempos experimentales de fluencia dentro del dispositivo capilar (s) H(t)(cm) pH 10 pH 9 pH 8 pH 7 pH 6 pH 5 pH 4 pH 3 0 0 0 0 0 0 0 0 14 33 33 33 33 33 33 33 33 12 72 72 72 72 72 72 72 72 10 122 122 122 122 122 122 122 122 8 183 183 183 182 182 182 182 182 6 272 272 270 267 267 264 264 265 4 417 417 414 411 410 409 409 410 2 563 560 558 556 554 553 554 555 1 707 704 703 702 700 698 700 702 0.5 Tabla IV.5: tiempos promedios de ensayos de viscosimetra capilar de soluciones de gelatina al 0,2 % p/v y I=0,500 M. Tiempos experimentales de fluencia dentro del dispositivo capilar (s) H(t)(cm) pH 10 pH 9 pH 8 pH 7 pH 6 pH 5 pH 4 pH 3 0 0 0 0 0 0 0 0 14 33 33 33 33 33 33 33 33 12 72 72 72 72 72 72 72 72 10 122 122 122 122 122 122 122 122 8 183 183 183 182 182 182 182 182 6 272 272 271 268 267 266 266 266 4 417 416 415 413 411 410 410 411 2 562 561 560 558 557 556 557 558 1 706 705 705 704 703 702 702 703 0.5

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