09 Appendix ES

In touch with life
Appendix
El prctico apndice del
catlogo Eppendorf es un
valioso asistente de infor-
macin
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Datos vlidos en la fecha de impresin y salvo error tipogrfico.
Descripcin Pagina
I. Informacin general para el laboratorio
1. Abreviaturas, smbolos y unidades
1.1. Conversiones y unidades 291
1.1.1. Volumen y peso 291
1.1.2. Intervalos de tiempo 291
1.1.3. Unidades 291
1.2. Factores de conversin a unidades actuales 291
1.3. Prefijos mtricos 291
1.4. Alfabeto griego 291
2. Elementos, reactivos, productos qumicos e istopos
2.1. Nmeros atmicos y pesos atmicos de los elementos 292
2.2. cidos y bases 293
2.3. Istopos propiedades fsico-qumicas de los istopos usados comunmente 293
3. Normas bsicas de la dispensacin
3.1. Principio de cmara de aire (desplazamiento de aire) 294
3.2. Principio de desplazamiento positivo 296
4. Tcnicas de dispensacin
4.1. Pipetas de cmara de aire 297
4.2. Manejo ptimo de pipetas manuales 298
4.3. Posibilidad y prevencin de la contaminacin 299
5. Calibracin
5.1. Procedimiento de ensayo gravimtrico 300
6. Pautas de aplicacin en la manipulacin de lquidos
6.1. Descontaminacin y limpieza de pipetas de cmara de aire 301
6.2. Posibles fuentes de error para el pipeteo con pipetas de cmara de aire 302
6.3. Conversin de diferentes unidades de presin 302
6.4. Datos fsicos de los lquidos (ejemplos relevantes) 303
6.5. Resistencia qumica de desechables 304
6.6. Lmites de error segn EN ISO 8655 305
6.7. Declaracin de conformidad 306
7. Recomendaciones para la centrifugacin
7.1. Tabla de conversin rpm/rcf (nomogramo) 307
7.2. Factores K y tiempos de centrifugacin 308
II. Practical information for Molecular Biology: data, facts, tips and tricks 309
ndice

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Eppendorf Ibrica S.L. Avenida Tenerife, 2 Edificio 1 28700 San Sebastin de los Reyes (Madrid)
Tel. 91 651 76 94 Fax 91 651 81 44 Internet: www.eppendorf.es
1.1. Conversiones y unidades
1.1.1. Volumen y peso
Volumen: Peso:
1 nl 1 g
1 l 1 mg
1 ml 1 g
1 l 1.000 g (1 kg)
1.1.2. Intervalos de tiempo
Factores de conversin:
1 da = 1,44 x 10
3
min = 8,64 x 10
4
s
1 ao = 5,26 x 10
5
min = 3,16 x 10
7
s
1.1.3. Unidades
Longitudes:
1 inch (in) = 2,54 cm
1 foot (ft) = 12 inches = 30,48 cm
Volmenes (GB):
1 pint (pt) = 0,5679 litros
1 quart (qt) = 2 pints = 1,1359 litros
1 gallon (gal) = 4 quarts = 4,5435 litros
Volmenes (US):
1 pint (pt) = 0,4729 litros
1 quart (qt) = 2 pints = 0,9458 litros
1 gallon (gal) = 4 quarts = 3,7832 litros
Temperatura:
1 Kelvin (K) = C + 273,15
1 Fahrenheit (F) = [(C - 32) x 10] 18
1.2. Factores de conversin a unidades actuales
Tamao: Unidad antigua: Unidad actual:
Presin 1 at 0,980665 bar
1 Atm (=760 Torr) 1,01325 bar
1 Torr 1,3332 mbar
1 mWS 0,0980665 bar
1 mmWS 0,0980665 mbar
Energa 1 mkp 9,80665 J
1 kcal 4,1868 kJ
1 erg 10
-7
J
Unidad
radioactivi-
dad
1 dpm 60 Bq
1 Ci = 2,22 x 10
12
dpm 3,7 x 10
10
Bq
1 mCi = 2,22 x 10
9
dpm 3,7 x 10
7
Bq
1 Ci = 2,22 x 10
6
dpm 4,7 x 10
4
Bq
1.3. Prefijos mtricos
E = exa = 10
18
P = peta = 10
15
T = terra = 10
12
G = giga = 10
9
M = mega = 10
6

k = kilo = 10
3
h = hecto = 10
2
da = deca = 10
1
d = deci = 10
-1
c = centi = 10
-2
m = milli = 10
-3
= micro = 10
-6
n = nano = 10
-9
p = pico = 10
-12
f = femto = 10
-15
a = atto = 10
-18
z = zepto = 10
-21
1.4. Alfabeto griego
a A Alfa
b B Beta
g G Gamma
d D Delta
e E psilon
z Z Zeta
h H Eta
J Q Theta
i I Iota
k K Kappa
l L Lambda
m M My
n N Ny
x X Xi
o O micron
p P Pi
r R Rho
s S Sigma
t T Tau
u U psilon
j F Phi
c C Ji
y Y Psi
w W Omega
1. Abreviaturas, smbolos y unidades
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2.1. Nmeros atmicos y pesos atmicos de los elementos
Elemento Simbolo Numero atomico Peso atomico
Actinio Ac 89 227,03
Aluminio Al 13 26,98
Americio Am 95 243,06
Antimonio Sb 51 121,75
Argn Ar 18 39,95
Arsnico As 33 74,92
Astato At 85 210,99
Azufre S 16 32,06
Bario Ba 56 137,34
Berilio Be 4 9,01
Berquelio Bk 97 247,07
Bismuto Bi 83 208,98
Boro B 5 10,81
Bromo Br 35 79,9
Cadmio Cd 48 112,4
Calcio Ca 20 40,08
Californio Cf 98 249,07
Carbono C 6 12,01
Cerio Ce 58 140,12
Cesio Cs 55 132,91
Cinc Zn 30 65,37
Circonio Zr 40 91,22
Cloro Cl 17 35,45
Cobalto Co 27 58,93
Cobre Cu 29 63,55
Criptn Kr 36 83,8
Cromo Cr 24 52
Curio Cm 96 245,07
Disprosio Dy 66 162,5
Einstenio Es 99 254,09
Erbio Er 68 167,26
Escandio Sc 21 44,96
Estao Sn 50 118,69
Estroncio Sr 38 87,62
Europio Eu 63 151,96
Fermio Fm 100 252,08
Fluor F 9 18,99
Fsforo P 15 30,97
Francio Fr 87 223,02
Gadolinio Gd 64 157,25
Galio Ga 31 69,72
Germanio Ge 32 72,59
Hafnio Hf 72 178,49
Helio He 2 4
Hidrgeno H 1 1,01
Hierro Fe 26 55,58
Holmio Ho 67 164,93
Indio In 49 114,82
Iridio Ir 77 192,22
Iterbio Yb 70 173,04
Itrio Y 39 88,91
Khurchatovio Kh 104 260
2.1. Nmeros atmicos y pesos atmicos de los elementos
Elemento Simbolo Numero atomico Peso atomico
Lantano La 57 138,91
Laurencio Lr 103 256
Litio Li 3 6,94
Lutecio Lu 71 174,97
Magnesio Mg 12 24,31
Manganeso Mn 25 54,94
Mendelevio Md 101 255,09
Mercurio Hg 80 200,59
Molibdeno Mo 42 95,94
Neodimio Nd 60 20,183
Nen Ne 10 20,18
Neptunio Np 93 237,05
Niobio Nb 41 92,91
Niquel Ni 28 58,71
Nitrgeno N 7 14,01
Nobelio No 102 255
Oro Au 79 196,97
Osmio Os 76 190,2
Oxgeno O 8 16
Paladio Pd 46 106,4
Plata Ag 47 107,87
Platino Pt 78 195,09
Plomo Pb 82 207,2
Plutonio Pu 94 242,06
Polonio Po 84 208,98
Potasio K 19 39,1
Praseodimio Pr 59 140,91
Promecio Pm 61 145
Protactinio Pa 91 231,04
Radio Ra 88 226,03
Radn Rn 86 222,02
Renio Re 75 186,2
Rodio Rh 45 102,91
Rubidio Rb 37 85,47
Rutenio Ru 44 101,07
Samario Sm 62 150,4
Selenio Se 34 78,96
Silicio Si 14 28,09
Sodio Na 11 22,99
Talio Tl 81 204,37
Tantalio Ta 73 180,95
Tecnetio Tc 43 98,91
Teluro Te 52 127,6
Terbio Tb 65 158,93
Titanio Ti 22 47,9
Torio Th 90 232,04
Tulio Tm 69 168,93
Uranio U 92 238,03
Vanadio V 23 50,94
Volframio W 74 183,85
Xnon Xe 54 131,3
Yodo I 53 126,9

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2.2. cidos y bases
Peso molecular % de peso Molaridad (aprox.) 1 M de solucin (ml/l) Densidad especfica
cidos
cido actico (glacial) 60,05 99,6 17,4 57,5 1,05
cido frmico 46,03 90 23,6 42,4 1,205
98 25,9 38,5 1,22
cido hidroclrico 36,46 36 11,6 85,9 1,18
cido ntrico 63,01 70 15,7 63,7 1,42
cido perclrico 100,46 60 9,2 108,8 1,54
72 12,2 82,1 1,70
cido fosfrico 98,00 85 14,7 67,8 1,70
cido sulfurico 98,07 98 18,3 54,5 1,835
Bases
Hidrxido de amonio 35,0 28 14,8 67,6 0,90
Hidrxido de potasio 56,11 45 11,6 82,2 1,447
Hidrxido de sodio 40,0 50 19,1 52,4 1,53
2.3. Istopos propiedades fsicoas de los istopos usados comunmente
Nuclidos Vida media Emisin Energa,
mx. (MeV)
Rango de
emisin, mx.
Material
recomendado
3
H 12,43 aos b 0,0186 0,42 cm (aire)
14
C 5.370 aos b 0,156 21,8 cm (aire)
32
P 14,3 das b 1,71 610 cm (aire) Vidrio acrlico (1 cm)
0,8 cm (agua)
0,76 cm (acrlico)
33
P 25,4 das b 0,249 49 cm Vidrio acrlico (1 cm)
35
S 87,4 das b 0,167 24,4 cm (aire)
125
I 60 das g 0,270,035 0,2 mm (plomo) Plomo (0,02 mm)
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Los sistemas de dispensacin funcionan de acuerdo con dos
principios fsicos diferentes: la dispensacin de lquido tiene
lugar o bien a travs de una cmara de aire o mediante un
desplazamiento positivo. Estos dos principios diferentes de
dispensacin sern analizados a continuacin, tomando como
ejemplo las pipetas de mbolo y teniendo en cuenta los aspec-
tos ergonmicos tan importantes hoy en da para los usuarios.
Las pipetas con cmara de aire constan de un mbolo y un
cilindro que lleva a cabo la medicin real (Fig. 1). Una cmara
de aire separa la muestra aspirada en una punta de plstico
del mbolo que se encuentra en el interior de la pipeta. Un
movimiento ascendente del mbolo produce un vaco parcial en
la punta, lo que arrastra el lquido dentro de la punta. La cmara
de aire desplazada por el mbolo acta como un resorte
elstico del que est suspendido el volumen de lquido en
la punta. Gracias a la expansin de este volumen de aire, el
volumen desplazado por el mbolo es aprox. de un 2% a un
4% superior al volumen aspirado del lquido requerido. Dicha
expansin se compensa mediante un factor que tiene en cuenta
el volumen correcto y la altura de la elevacin en la punta de
la pipeta. Las variaciones de temperatura, presin de aire y
humedad deben minimizarse con las pipetas de cmara de
aire a travs de medidas diseadas para que la precisin de la
dispensacin no se deteriore.
Fig.1: Modelo de pipeta de cmara de aire por dentro (eppendorf Reference
)
Pulsador
Indicador digital (pipeta variable)
mbolo (cermica)
Cierre del mbolo
Cmara de aire
Resorte de eyeccin de puntas
Manguito de eyeccin
Cono de la pipeta
3.1. Principio de cmara de aire (desplazamiento de aire)

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Fig. 2: Funcionamiento de una pipeta de cmara de aire (Eppendorf Research
)
La figura 2 muestra el principio de diseo funcionamiento de
una pipeta de cmara de aire en la posicin de reposo (1). Para
preparar la aspiracin del lquido (2) se presiona el pulsador
hasta el primer tope (recorrido de medicin). El mbolo desci-
ende, desplazando un volumen de aire que se corresponde con
el volumen de aspiracin seleccionado del lquido. Para aspirar
lquido (3) se sumerge en l la punta de la pipeta verticalmente.
A medida que el pulsador vuelve lentamente a su posicin,
se crea un vaco parcial en la punta de la pipeta, aspirando el
volumen requerido a travs de la apertura de la punta.
Para dispensar lquido (4), se presiona lentamente el pulsador
hasta el primer tope (recorrido de medicin). El mbolo des-
ciende, vaciando la punta. Para vaciar la punta completamente
(expulsin, 5), se presiona el pulsador hasta el segundo tope
(expulsin), y la pipeta se eleva con el pulsador sin presionar
y se limpia contra la pared del recipiente. Cuando el pulsador
vuelve atrs, el mbolo vuelve a la posicin de reposo (6).
La profundidad de inmersin de la punta de la pipeta tiene
un efecto significativo en el resultado. Si la punta est dema-
siado sumergida en el lquido, se forman gotas en el exterior,
falseando posiblemente el volumen de dispensacin. Si la punta
no est suficientemente sumergida en el lquido, se produce una
turbulencia y se aspira un volumen incorrecto.
Rest
position
Preparation for
liquid aspiration
Liquid
aspiration
Rest position
1. Stop
(Measureing stroke)
Liquid
dispensing
Blow-out Tip
ejection
Rest position
1. Stop (Measureing stroke)
Piston
moves
down
2. Stop
(Blow-out)
Blow-out
Tip
ejector
moves
down
Tip ejector
is pressed
Piston
moves
down
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Estos sistemas que funcionan de acuerdo con el principio de
desplazamiento positivo estn sujetos a influencias fsicas dife-
rentes a aquellas que se producen con los sistemas por cmara
de aire descritos anteriormente. Los efectos de las cmaras de
aire no son aplicables en este caso, por ello estos dispositivos
son adecuados tambin para la dispensacin de lquidos y para
aplicaciones muy importantes junto con los sistemas de cmara
de aire. Dichas aplicaciones incluyen: lquidos con una elevada
presin de vapor, una elevada viscosidad o una elevada densi-
dad y aplicaciones en biologa molecular tales como la reaccin
en cadena de polimerasa, que requiere la ausencia de aerosoles.
La precisin de los sistemas de dispensacin de desplazamiento
positivo depende de la punta de plstico desechable en mayor
medida que con los sistemas por cmara de aire. Al contrario
que las puntas de plstico de los sistemas de cmara de aire, las
puntas de los sistemas de desplazamiento positivo tienen un
mbolo integrado que est acoplado a la varilla del mbolo del
dispositivo de dispensacin durante el pipeteo (Fig. 3) y que
lleva a cabo el proceso de dispensacin real. Las puntas estn
diseadas especialmente para utilizar sistemas de desplaza-
miento positivo, y no pueden sustituirse por puntas extraas
para el sistema.
La figura 4 muestra el funcionamiento de un sistemas de
desplazamiento positivo. Para prepararse para la aspiracin
del lquido (1), se presiona el pulsador hasta el primer tope y
el mbolo desciende hasta la posicin correspondiente. Para
aspirar el lquido (2), se sumerge la punta de la pipeta unos
milmetros en el lquido de forma vertical; el pulsador puede
entonces deslizarse hacia atrs lentamente, el mbolo asciende
y se aspira el volumen requerido de lquido dentro de la punta a
travs del vaco parcial que se produce. Para dispensar el lquido
en un recipiente (3), el pulsador se presiona lentamente hasta el
primer tope (recorrido de medicin). El mbolo en la punta
desciende gracias a la varilla del mbolo de la pipeta, desplazan-
do as el lquido de la punta. El pulsador se mantiene presionado
y la punta contra la pared del recipiente. Para expulsar la punta
(4), se presiona el pulsador hasta el final.
La punta tiene un mbolo integrado (2) que est conectado de
forma segura durante el pipeteo con la varilla del mbolo de la
pipeta (1). El lquido en la punta slo llega al borde del sellado
hermtico (3), con lo que se excluye la formacin de aerosoles.
Preparation
for liquid
aspiration
Liquid
aspiration
Liquid
dispensing
Tip
ejection
Rest position
1. Stop (Measureing stroke)
Tip ejection
Fig. 3: Acoplamiento de una pipeta de desplazamiento
positivo a una punta de pipeta compatible:
Fig. 4: Funcionamiento de una pipeta de desplazamiento
positivo (Eppendorf Biomaster
)
3.2. Principio de desplazamiento positivo

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Las tcnicas de dispensacin utilizadas con ms frecuencia
son el pipeteo positivo, el pipeteo inverso, la dispensacin, la
dispensacin secuencial y la dilucin. Mientras que las pipetas
manuales slo son adecuadas para el pipeteo positivo y el pipe-
teo inverso, los sistemas electrnicos de dispensacin cubren
generalmente todas las funciones mencionadas. La seleccin de
la tcnica de dispensacin adecuada en cada caso puede tener
un impacto significativo en losl resultados del anlisis. La tcnica
de pipeteo positivo es adecuada para soluciones acuosas que
pueden contener bajas concentraciones de protena o deter-
gentes. Humectar previamente la punta mejora el resultado del
anlisis. Con lquidos viscosos o espumosos o si se dispensan
vlumenes de muestras muy pequeos, pueden mejorarse
mucho los resultados con el pipeteo inverso. En este caso, el
lquido es aspirado con expulsin y dispensado sin expulsin.
Un residuo de lquido permanece en la punta de plstico, y
despus es descartado o devuelto a un recipiente de aspiracin.
Durante el proceso de dispensacin, el lquido aspirado se
dispensa en etapas definidas. Esta tcnica se utiliza con
frecuencia para el procesamiento de series largas de ensayo
o relleno de placas microtest.
Con dispensacin secuencial, se dispensan una tras otra
diferentes volmenes de una solucin en una secuencia
especfica. Esta tcnica se utiliza con frecuencia en procesos
serolgicos o aplicaciones similares.
Al diluir lquidos, primero se aspira un volumen inicial,
seguido de una burbuja de aire y el segundo volumen. Entonces
se dispensan ambos volmenes en un paso. Esta tcnica de
dispensacin aumenta el rendimiento y, en comparacin con la
realizacin de la aspiracin y la dispensacin, reduce la fatiga
a la mitad con pipetas manuales en particular en el caso de
volmenes considerables y pipetas multicanal.
4.1. Pipetas de cmara de aire
Fig. 5: Pipeteo positivo
Aplicacin recomendada para
soluciones estndar como el agua,
los tampones, las soluciones
salinas diluidas, los cidos diluidos
y las lejas.
1: Presionar el pulsador hasta el
primer tope. Sumergir la punta
unos mlimetros en el lquido.
2: Soltar despacio el pulsador.
Se inicia el llenado de la punta.
3: Dispensar presionando el
pulsador hasta el primer tope,
y expulsar el lquido restante
presionando el pulsador hasta
el segundo tope.
Fig. 6: Pipeteo inverso
Aplicacin recomendada para
soluciones viscosas, soluciones
con una elevada presin de vapor,
disolventes muy humectantes.
1: Presionar el pulsador hasta el
segundo tope. Sumergir la punta
unos milmetros en el lquido.
2: Soltar despacio el pulsador.
Se inicia el llenado de la punta.
3: Dispensar el lquido
presionando el pulsador hasta
el primer tope, en la punta
permanece resto de lquido.
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Systemat|c
meas0|ement dev|at|on
0.2 - 0.4 %
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0.5 - 0.8 %
Systemat|c
1 - 1.2 %
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y
Independientemente de la tcnica de dispensacin empleada,
deben tenerse en cuenta los siguientes elementos durante el
pipeteo:
En el caso de pipetas con cmara de aire, debe seleccio-
narse la punta de la pipeta de forma que la cmara de aire
entre el mbolo de la pipeta y la superficie del lquido sea lo
ms pequea posible. Cuanto ms pequea sea la punta,
menos volumen de aire y mayor precisin de los resultados.
Al aspirar el lquido, la punta debe sumergirse slo unos
milmetros en el medio (tab. 1, fig. 7).
La punta llenada debe elevarse contra la pared del recipiente
para evitar que queden residuos de lquido en el exterior de
la punta.
Humectar previamente la punta dos o tres veces mejorar la
precisin de los resultados.
El lquido debe aspirarse lentamente y de forma constante.
Debe permitirse un periodo de espera de 1a 3 seg para que
el lquido se eleve en la punta.
4.2. Manejo ptimo de pipetas manuales
La pipeta debe sostenerse en vertical durante la aspiracin.
Al aspirar el lquido, la presin hidrosttica de la columna de
lquido en la punta cae, pues el ngulo de inclinacin de la pipeta
aumenta. Como consecuencia, se produce un aumento del
volumen de aspiracin (Fig. 7). La desviacin en volumen puede
ser estimada para cualquier volumen de pipeta y cualquier
ngulo de inclinacin. Con un ngulo de 45 divergente de la
vertical, el volumen extra con una pipeta de 1.000 l es 2,9 l
0,29%. Para una pipeta de 100 l a un ngulo de 60, resultar
un volumen extra de 0,53 l 0,53% (fig. 7).
El hecho de que personas diferentes no pipeteen exactamente
el mismo volumen con la misma pipeta exactamente tambin
se puede explicar por factores como los diferentes ngulos de
inclinacin al aspiracin de lquido. Aunque el efecto es pequeo
en cada caso, el error puede ser mucho mayor cuando se
renen todos los factores diferenciales.
Fig. 7: Influencia de la profundidad de inmersin y ngulo de
sujecin de la pipeta durante la aspiracin de lquidos
Tabla. 1: Profundidad ptima de inmersin para
diferentes volmenes de pipeteo
Volumen (l) Profundidad ptima de inmersin (mm)
0,11 1
1500 23
1011.000 24
1.00110.000 36
Desviacin de la
medicin
sistemtica
0,20,4%
Desviacin de la
medicin
sistemtica
0,60,8%
Desviacin de la
medicin
sistemtica
1,01,2%
Pipeta vertical,
profundidad de
la inmersin de la
punta en el lquido
aprox. 1 cm
Pipeta vertical,
profundidad de
la inmersin de la
punta en el lquido
aprox. 3 cm
Pipeta en el ngulo de
sujecin de 30 a 40,
profundida de la inmer-
sin de la punta en el
lquido aprox. 34 cm

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4.3. Posibilidad y prevencin de contaminacin
Se hace una distincin entre tres posibles fuentes de contaminacin:
De la pipeta a la muestra
De la muestra a la pipeta
De muestra a muestra, tambin conocido como carry over.
La primera fuente de contaminacin es a travs de una punta de
pipeta o una pipeta contaminada. La contaminacin de muestras
se puede evitar utilizando puntas estriles de pipetas y limpiando
o autoclavando la pipeta.
El segundo tipo de contaminacin implica el acceso de la
muestra o sus aerosoles en la pipeta. Para evitarlo, la pipeta
debe sostenerse en vertical durante la aspiracin del lquido.
Tambin se recomienda expulsar inmediatamente la punta de
la pipeta despus de usarla para evitar entren aerosoles en la
pipeta y tambin colocar la pipeta suspendida en el soporte de
pipetas. Adems, el pulsador debe elevarse lentamente en la
aspiracin.
La proteccin ms eficaz contra la contaminacin de pipetas es
utilizar puntas con filtro. Evitan la posibilidad de que penetren
aerosoles y contaminen la pipeta (fig. 8 izquierda). El uso de
pipetas de desplazamiento positivo con puntas que ofrecen
un mbolo con un sello para fugas integrado tambin evita la
contaminacin de la pipeta (fig. 8 izquierda).
El tercer tipo de contaminacin se produce durante la dispen-
sacin de muestras. El carry over tiene lugar cuando se adhiere
parte de la muestra A a la superficie interior de la punta de la
pipeta en forma de gotita. Entonces se mezcla con la muestra B,
produciendo as un resultado falso del ensayo (fig. 8 derecha).
Para evitar la contaminacin muestra a muestra, la punta de
la pipeta debe renovarse despus de dispensar cada muestra .
Fig. 8:
Evitar la contaminacin de una pipeta de mbolo Contaminacin de muestra a muestra
Piston-stroke
pipette
with
Standard tip
Piston-stroke
pipette
with
Filter tip
Positive-
displacement
with
integrated
piston
in the tip
Protected
area
Aerosol
barrier
Filter
Unprotected
area
Risk of
contamination
via aerosols
No risk of
contamination
via aerosols
Sealing lip
of
piston
Rest of sample A
in the
pipette tip
Contamination
of
sample B
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5. Calibracin
5.1. Procedimiento de ensayo gravimtrico
El requisito previo para un procedimiento de ensayo gravimtrico
es una balanza analtica o un dispositivo de pesado equivalente.
El valor de graduacin de la escala debe corresponder al volumen
seleccionado del sistema de dispensacin que va a examinarse
(tab. 2). Para minimizar la prdida de la evaporacin durante el
pesaje, particularmente con volmenes pequeos (< 50 l),
debe utilizarse un recipiente de pesaje adecuado para el volumen
y posiblemente tambin una salida para la evaporacin (fig. 9).
Adems, deben tenerse en cuenta los siguientes puntos
durante la calibracin gravimtrica:
El ensayo debe realizarse en una sala sin corrientes de aire.
En la sala de ensayos debe haber un exceso de un 50% de
humedad relativa y una temperatura constante (0,5 C) de
entre 15 y 30 C.
Antes del ensayo, el sistema de dispensacin y el lquido de
ensayo deben haber estado en vertical el tiempo suficiente
en la sala de ensayos (mn. dos horas) para establecer un
equilibrio con las condiciones de la sala.
Los ciclos del ensayo deben ser lo ms uniformes posibles.
Es importante que el tiempo de medicin sea lo ms idntico
posible dentro de cada ciclo, as como de ciclo a ciclo, para
compensar de forma fiable los efectos de la evaporacin
durante una serie de mediciones mediante clculo.
Debe utilizarse agua desgasificada, destilada o desionizada
como lquido de ensayo.
Con pipetas variables se prueban tres volmenes diferentes:
Volumen nominal (el mayor volumen que puede ajustar
el usuario y establecer el fabricante)
50% del volumen nominal
El lmite inferior del volumen til o el 10% del volumen
nominal.
Generalmente se llevan a cabo diez mediciones por volumen
de ensayo. No obstante, el usuario puede alterar el nmero de
volmenes de ensayo, el nmero de mediciones por volumen
de ensayo y, con pipetas multicanal, el nmero de canales
probados de forma adecuada para que el ensayo satisfaga sus
necesidades en cuanto a precisin.
De acuerdo con el ajuste inicial del fabricante, las pipetas y
los dispensadores deben ser probados para la dispensacin
de lquido de ensayo en un recipiente de pesaje.
El procedimiento de prueba es el siguiente:
El recipiente de pesaje se llena con el lquido de ensayo hasta
un nivel de mn. 3 mm.
Debe medirse la temperatura del lquido, la temperatura de la
sala y la presin del aire. (Las temperaturas y la presin del aire
son necesarios para la seleccin del factor Z de correccin).
La pipeta dispone de la punta de pipeta adecuada, y la
punta de la pipeta humectada previamente cinco veces con el
lquido de ensayo para producir un equilibrio de la humedad
en el volumen justo de aire.
Entonces se cambia la punta y se vuelve a humectar.
La balanza est calibrada.
La pipeta se sostiene verticalmente y la punta de la pipeta
est inmersa unos milmetros (vase la pgina 270, tab. 1) en
el lquido de ensayo.
Debe aspirarse lentamente y de forma constante el volumen
que se desea probar. Aqu debe tenerse en cuenta un periodo
de espera de 1 a 3 seg.
A continuacin, se saca lentamente la punta de la pipeta del
lquido, secndola contra la pared del recipiente.
La punta llenada se inclina contra la pared del recipiente de
pesaje, y el lquido de ensayo se dispensa lentamente hasta el
primer recorrido (recorrido de medicin).
El lquido residual se dispensa presionando el pulsador hasta
el segundo tope (expulsin).
El pulsador se mantiene presionado y la punta contra la pared
del recipiente.
El valor de pesaje, es decir, la masa del lquido pipeteado, se
calcula entonces.
Todas las mediciones en una serie de mediciones se llevan a
cabo tal como se ha descrito.
Fig. 9: calibracin de la pipeta en la balanza analtica con
salida para la evaporacin.
Tabla. 2: Valores estndar para
ensayos gravimtricos de pipetas
Desviacin
de medicin
aleatoria
(imprecisin)
(l)
Escala
graduacin
valor
(mg)
Tipo de balanza

hasta 0,01 0,001 Microbalanza
hasta 0,01 0,01 Semi-microbalanza
hasta 0,01 0,1 Balanza analtica

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6.1. Descontaminacin y limpieza de pipetas de cmara de aire
Clasificacin de sustancias Recomendaciones de manipulacin Descontaminacin y limpieza
Soluciones acuosas y tampones La pipeta se calibra con agua destilada.
Los resultados son muy precisos.
Abrir la pipeta, limpiar bien las partes contaminadas con
agua destilada. Dejar secar a un mximo de 60 C en
el compartimento de secado. Lubricar el mbolo si es
necesario.
cidos inorgnicos Es recomendable limpiar de vez en
cuando la parte inferior de la pipeta
con agua destilada si se pipetean con
frecuencia cidos muy concentrados.
Los plsticos utilizados en las pipetas Eppendorf son
resistentes a los cidos, pues son mbolos de cermica
(excepto al cido fluordrico). Sin embargo, los aerosoles
cidos pueden filtrarse en la parte inferior de la pipeta
y afectar al rendimiento de la misma. Limpiar tal como
se ha descrito en Soluciones acuosas.
Alcalinos Es recomendable limpiar de vez en
cuando la parte inferior de la pipeta
con agua destilada si se pipetean con
frecuencia alcalinos muy concentra-
dos. Tambin se recomienda el uso de
puntas con filtro.
Los plsticos utilizados en las pipetas Eppendorf son
resistentes a los alcalinos, pues son mbolos de cermica
(excepto al cido fluordrico). Sin embargo, los aerosoles
de los alcalinos pueden filtrarse en la parte inferior de la
pipeta y afectar al rendimiento de la misma. Limpiar tal
como se ha descrito en Soluciones acuosas.
Lquidos potencialmente
infecciosos
Para evitar la contaminacin, deben
utilizarse puntas con filtro.
Tambin pueden utilizarse sistemas de
desplazamiento positivo.
Autoclavar las partes contaminadas a 121 C durante
20 min (la Eppendorf Reference puede autoclavarse por
completo. Debe desmontarse de antemano desenroscando
dos veces), o sumergir las partes inferiores en desinfec-
tantes normales de laboratorio. Limpiar con agua destilada
y dejar secar tal como se ha descrito.
Cultivos de clulas Para garantizar la esterilidad, deben
utilizarse puntas estriles.
Proceder tal como se ha descrito en
Lquidos potencialmente infecciosos.
Disolventes orgnicos 1. La densidad es diferente a la del
agua. Por eso, es necesario ajustar la
pipeta.
2. El pipeteo debe realizarse con
rapidez debido a la elevada presin de
vapor y a los cambios en el comporta-
miento de humectacin.
3. Una vez finalizado el pipeteo, abrir la
pipeta y dejar que se evapore el lquido.
Por lo general, este proceso de evaporacin es suficiente
para lquidos con elevada presin de vapor. Tambin se
pueden sumergir las partes contaminadas en detergente,
limpiar bien con agua destilada y secar tal como se ha
descrito antes. Lubricar ligeramente el mbolo.
Soluciones radioactivas Para evitar contaminaciones, deben
utilizarse puntas con filtro. Tambin se
pueden utilizar sistemas de desplaza-
miento positivo.
Abrir la pipeta y colocar las partes contaminadas en
soluciones complejantes o soluciones especiales de
limpieza. Limpiar bien con agua destilada y secar tal
como se ha descrito antes.
Protenas/cidos nucleicos Para evitar contaminaciones, deben
utilizarse puntas con filtro. Tambin se
pueden utilizar sistemas de desplaza-
miento positivo.
1. Protenas: Abrir la pipeta, lavarla bien con detergente.
Lavar y secar tal como se ha descrito.
2. cidos nucleicos: Descontaminar hirviendo en tampn
de glicina/HCL (pH = 2) durante 10 minutos (esto asegura
que no se detecte ADN en gel de agarosa). Lavar bien con
agua destilada y secar tal como se ha descrito antes.
Lubricar ligeramente el mbolo.
3. Limpiar con hipoclorito sdico (5%), lavar bien con agua
destilada y secar tal como se ha descrito antes. Lubricar
ligeramente el mbolo.

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6.2. Posibles fuentes de error para el pipeteo con pipetas de cmara de aire
6.3. Conversin de diferentes unidades de presin
Parmetros que influyen Efecto*
1
Puede estar influenciado por Puede ser reconocido por
Diferencia en la densidad de aire del lquido
que se va a pipetear en comparacin con
la del agua utilizada para el ajuste
hasta 1.0% Reajustar la pipeta (observar
informacin de usuario)
Comparar la densidad del lquido
que se va a pipetear con la del
agua
Diferencia en la presin de vapor del lquido
que se va a pipetear en comparacin con
la del agua utilizada para el ajuste
hasta 2.0% Suficiente humectacin previa de la
punta de la pipeta; observar
EN ISO 8655-6
Empapar punta
Movimiento desigual del mbolo

hasta 0.5% Funcionamiento sin problemas del
mbolo; limpieza y lubricacin del
mbolo
Monitorizar la propia tcnica de
pipeteo
Ritmo desigual y tiempo durante el pipeteo

hasta 1.5% Tcnica constante de pipeteo Se ha sobrepasado el nmero
mximo de errores
Profundidad de inmersin de la punta de
la pipeta y ngulo de manipulacin durante
el pipeteo
hasta 1.0% Sujetar la pipeta en posicin
vertical. Observar la informacin de
usuario o las normas EN ISO 8655-6
Control visual de la profundidad
de inmersin y el ngulo de
manipulacin
Error al humectar previamente la punta de
la pipeta

hasta 2% Humectacin previa de la punta
de la pipeta
Se ha sobrepasado el nmero
mximo de errores
Error al limpiar la punta de la pipeta contra
la pared del recipiente

hasta 3.0% Limpiar la punta de la pipeta en
la pared del recipiente.
Observar las normas EN ISO 8655-6
mximo de errores
Puntas de pipeta que pierden

De 0.5% hasta
50%
Utilizacin de puntas de pipeta
originales o recomendadas
mximo de errores o el empapado
de la punta
*1 Las posibles desviaciones de medicin son valores de referencia y aparecen en porcentajes a partir del valor nominal.
Conversin Multiplicar
por
de a
bar Pascal (Pa) 10
5
bar Hectopascal (hPa) 10
3
bar Kilopascal (kPa) 10
2
millibar (mbar) Pascal (Pa) 10
2
millibar (mbar) Hectopascal (hPa) 1
millibar (mbar) Kilopascal (kPa) 0,1

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6.4. Datos fsicos de los lquidos (ejemplos relevantes)
Sustancia Frmula Punto de
ebullicin (C)
Densidad
mg/l
(20 C)
Presin de vapor
hPa
(20 C)
Viscosidad
mPas
(20 C)
Acetona C
3
H
6
O 56,5 0,79 233 0,32
cido actico CH
3
COOH 118 1,06 15,4 1,53 (25 C)
cido clorhdrico HCl 1,15 213 2
cido cloroactico CH
2
ClCOOH 189 1,60
cido fluordrico HF 112 1,13
cido frmico HCOOH 100,7 1,23 42 1,8
cido fosfrico H
3
PO
4
1,71 2
cido ntrico HNO
3
121,8 1,41 9 1,49 (40 C)
cido sulfrico H
2
SO
4
1,84 0,0016 26,9
cido tricloroactico CCl
3
COOH 196 1,62
Amonaco NH
3
37,7 0,91 500
Butanol C
4
H
9
OH 117,2 0,81 6,7
Cloroformo CHCl
3
61,7 1,47 213
Etanol C
2
H
5
OH 78,5 0,79 59 1,2
Fenol C
6
H
5
OH 181,4 1,06 1,099 (100 C)
Glicerol C
3
H
8
O
3
290 1,26
Metanol CH
3
OH 65 0,79 128 0,597
2-Propanol (alcohol isopropilo) C
3
H
7
OH 82,4 0,78 42,5 2,2
Solucin hidrxido potsico KOH 1,29
Solucin hidrxido sdico NaOH 1,33 19
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6.5. Resistencia qumica de los consumibles
Sustancia Frmula Concentracin
(%)
PE
(Polietileno)
PP
(Polipropi-
leno)
PC
(Policarbo-
nato)
PS
(Poli -
estireno)
Acetaldehdo CH
3
CHO 40 0 4 2 2 4 4 4 4
cido actico CH
3
COOH 96 1 2 1 2 3 3 3 4
cido fluordrico HF hasta 40 2 2 2 2 4 0 1 1
cido tricloroactico CCl
3
COOH 100 3 4 1 1 2 2 0 0
Aqua regia 4 4 3 4 4 4 3 4
Benceno 100 3 4 3 4 4 4 4 4
Bencina 100 3 4 3 4 2 2 3 4
Butanol C
4
H
9
OH 100 1 3 1 3 1 1 1 1
Diclorometano CH
2
Cl
2
100 4 4 3 4 0 0 0 0
Dioxano C
4
H
8
O
2
100 2 3 3 3 4 4 4 4
ter dietlico (C
2
H
5
)
2
O 100 2 3 3 0 4 4 4 0
ter de petrleo 100 3 3 2 3 2 3 3 3
Fenol C
6
H
5
OH Saturada de agua 1 1 1 1 3 3 3 4
Glicerol C
3
H
5
(OH)
3
1 1 1 1 1 1 1 1
Hipoclrito sdico diluido 2 3 1 2 2 0 2 3
Metanol CH
3
OH 100 2 3 2 2 2 2 1 1
Piridina 100 2 3 3 3 3 3 4 4
Polietilenglicol (PEG) 40 1 1 0 0 0 0 0 0
Solucin hidrxido sdico hasta 40 1 1 1 1 3 3 1 1
*1 Atencin! Ataca al mbolo de cermica de la pipeta.
Primer nmero: resistencia qumica a 20 C, segundo nmero: a 50 C
1 = Resistente; el material no cambia ni siquiera despus de estar mucho tiempo en contacto con la sustancia correspondiente.
2 = Prcticamente resistente; el material no cambia despus de estar varias semanas en contacto con la sustancia.
3 = Conditionalmente resistente; si el material ha estado en contacto con la sustancia slo durante un corto periodo de tiempo, no cambia.
4 = No resistente; el material cambia incluso tras un breve contacto con la sustancia.
0 = Ningn valor disponible.

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6. Puntas de aplicacin en la manipulacin de lquidos
6.6. Lmites de error segn EN ISO 8655
Segn la norma EN ISO 8655, los lmites de error se refieren
siempre al sistema formado por la pipeta y la punta de pipeta.
Los lmites de error referidos al volumen nominal son vlidos
para el volumen til total de la pipeta de mbolo, es decir para
una pipeta con mbolo y volumen variable de 10 l a 100 l, el
lmite para los errores sistemticos es de 0,8 l y el lmite para
los errores aleatorios es de 0,3 l para cada volumen medido.
Si el volumen nominal de una pipeta se encuentra entre dos
volmenes nominales de los indicados en la Tabla 1, los lmites
de error absolutos son vlidos para el volumen nominal siguie-
nte. La frmula para calcular los lmites de error en relacin al
volumen nominal es:
El volumen nominal de una pipeta de mbolo y volumen
variable es el mayor volumen regulable por el usuario y el mayor
volumen establecido por el fabricante.
A continuacin se indican los lmites de error de la norma
EN ISO 8655 en relacin al volumen.
Errores sistemticos: desviaciones del volumen dosificado
en relacin al volumen nominal o del volumen seleccionado
del aparato con mbolo. El error se calcula haciendo la media
de los valores obtenidos en 10 mediciones.
Errores aleatorios: desviacin de los volmenes dosificados
en relacin a la media resultante de los volmenes dosificados,
se obtiene calculando la discrepancia media obtenida en
10 mediciones.
Lmite de error [l] x 100%
Volumen nominal [l]
a) Pipetas de mbolo monocanal con cmara de aire
b) Los lmites de los errores sistemticos y aleatorios de las pipetas multicanal con mbolo son el doble de los valores indicados en
la tabla para las pipetas monocanal de mbolo. Esta condicin es vlida para cada canal de la pipeta multicanal de mbolo.
c) Dosificador mltiple (Multipette)
d) Dosificador sencillo (Varispenser)
Volumen nominal ml 0,01 0,02 0,05 0,1 0,2 0,5 1 2 5 10 25 50 100 200
Lmites de
los errores
sistemticos
l 0,2 0,4 0,75 1,5 2,0 5,0 6,0 12 30 60 150 300 600 1.200
Lmites de
los errores
aleatorios
l 0,1 0,1 0,2 0,3 0,6 1,0 2,0 4,0 10 20 50 100 200 400
Volumen nominal ml 0,001 0,002 0,003 0,01 0,02 0,05 0,1 0,2 0,5 1 2 5 10 25 50 100 200
Lmites de
los errores
sistemticos
l 0,05 0,1 0,075 0,2 0,3 0,5 1,0 2,0 5,0 10 16 30 50 125 250 500 1.000
Lmites de
los errores
aleatorios
l 0,05 0,1 0,11 0,25 0,4 0,75 1,0 2,0 3,0 4,0 8,0 15 30 75 125 250 500
Volumen nominal l 1 2 5 10 20 50 100 200 500 1.000 2.000 5.000 10.000
Lmites de
los errores
sistemticos
l 0,05 0,08 0,125 0,12 0,2 0,5 0,8 1,6 4,0 8,0 16 40 60
Lmites de
los errores
aleatorios
l 0,05 0,04 0,075 0,08 0,1 0,2 0,3 0,6 1,5 3,0 6,0 15,0 30,0
306 Info

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g
y
6. Puntas de aplicacin en la manipulacin de lquidos
Todas las pipetas de la marca Eppendorf se caracterizan por su gran exactitud y
precisin. Para los siguientes productos certificamos el cumplimiento de las normas
de calibracin.
6.7. Declaracin de conformidad
Monocanal de volumen fijo
Research
fix Todos los volmenes

Reference
fix Todos los volmenes

Monocanal de volumen variable
Reference
Todos los volmenes

Research
Todos los volmenes

Research
pro Todos los volmenes

Biomaster
Todos los volmenes

Varipette
4810 Todos los volmenes

Varipette
4720 En todas las combinaciones

Multicanal
Research
Todos los volmenes

Research
pro Todos los volmenes

Multipette
plus
En combinacin con todos los Combitips
plus
Multipette
stream/Xstream
En combinacin con todos los Combitips
plus (modo dispensador)

Dispensadores de frasco
Todos los volmenes
Resultados analticos seguros en los laboratorios mdicos
requieren precisin en cada uno de los pasos de trabajo:
comenzando con el pipeteo pasando por el anlisis hasta llegar
a la evaluacin. Cuanto ms pequeas sean las tolerancias
de errores de cada uno de los instrumentos, mayor sern la
exactitud y precisin de los resultados. Para que el laboratorio
est desde el inicio en el lado seguro, existe el certificado de
conformidad para pipetas y puntas de pipeta. Este certificado ga-
rantiza que los lmites de error fijados por la norma EN ISO 8655
no se sobrepasan y que se cumplen las normativas legales.
Esto es vlido para el equipo formado por pipetas y puntas de
pipeta.
En Eppendorf se puede conseguir todo de una sola mano.
Si bien es verdad que se pueden utilizar puntas de pipeta de
otros fabricantes, no es menos cierto que la seguridad slo
es posible si se cumplen los requisitos de las normas EN ISO,
utilizando puntas de pipeta especficas para cada pipeta con
certificado de conformidad. Los usuarios responsables utilizan
el equipo Pipeta-Punta de pipeta, marcado con la comn
seal de conformidad.

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17.000
2,1
3
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20.000
20
30
50
100
150
200
300
500
1.000
1.500
2.000
3.000
5.000
4.000
7.000
10.000
15.000
250
300
400
500
600
700
800
900
1.000
1.200
1.500
2.000
2.500
3.000
4.000
3.500
5.000
6.000
7.000
8.000
9.000
10.000
11.000
12.000
13.000
14.000
15.000
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
r [cm] n [rpm] rcf
30.000
15
16
17
18
h
r
r
max
18.000
16.000
7.1. Tabla de conversin rpm/rcf (nomogramo)
Radio de centrifugacin r de un punto a una distancia h
del fondo del tubo con un rotor de ngulo fijo de 45:
r = r
max
h x 0,71
Ejemplo de aplicacin (bosquejo):
r
max
= 9,5 cm
n = 14.000 1/min
rcf
max
= 20.817 x g
Tenga en cuenta que las centrfugas Eppendorf MiniSpin plus,
5415 R, 5417 R,* 5418, 5424, 5430, 5702, 5702 R, 5702 RH,
5804, 5804 R, 5810 y 5810 R* tienen una conversin automti-
ca rpm/fcr, no siendo necesario realizar clculos complicados,
al menos para el rotor estndar. El radio mximo de la MiniSpin
es de 6 cm.
308 Info
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7.2. Factores K y tiempos de centrifugacin
El factor K es un valor determinado fundamentalmente por el
rotor y que influye en el tiempo de sedimentacin. Coloquial-
mente hablando, este valor es una medida para el tramo de
sedimentacin en el tubo de centrifugacin, es decir, para la
diferencia entre la distancia mnima y mxima de una muestra
respecto al eje del rotor. Cuanto ms grande es este tramo,
mayor es el tiempo necesario para la separacin en el tubo. Es
evidente que el factor K depende del ngulo de los tubos en el
rotor y de los tubos analizados. Un factor K pequeo es til para
una separacin ms rpida. El factor K est influenciado adems
por el nmero de revoluciones. Cuanto mayor sea este nmero,
ms rpida ser la separacin.
La comparacin directa de rendimiento entre dos rotores es
posible, si se calcula la velocidad relativa de una separacin
en ambos rotores.
Ejemplo:
El rotor de ngulo fijo de 30 posiciones de la centrfuga 5430
tiene un factor K de 508 a un nmero de revoluciones mximo
de 14.000 min
-1
y a una fuerza de centrifugacin relativa de
20.818 x g. Con el mismo ngulo de rotor (45), el rotor de
ngulo fijo de 18 posiciones de la centrfuga 5418 alcanza con el
mismo nmero de revoluciones mximo (14.000 min
-1
) una fuerza
de centrifugacin relativa de 16.873 x g y un factor K de 719.
En el ejemplo de la 5430 y 5418 resulta un tiempo de
centrifugacin de 10 minutos para la 5418 y un tiempo
de centrifugacin de slo 7 minutos para la 5430 para lograr
el mismo rendimiento de separacin.
Para establecer el tiempo de centrifugacin, es conveniente tener
tambin en cuenta las caractersticas fsicas de la centrfuga a
utilizar, especialmente cuando se vayan a centrifugar muestras
crticas y cantidades pequeas de muestras.
Separation example:
La frmula es:
n = Velocidad; r
min
y r
max
: ver la figura
La frmula para el clculo
del tiempo de centrifugacin relativo es:
t = tiempo de centrifugacin calculado experimentalmente
en la centrfuga de comparacin
t
x
= tiempo de centrifugacin necesario en la centrfuga X
k = factor K de la centrfuga de comparacin
k
x
= factor K de la centrfuga X
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Indice: Practical information for Molecular Biology
Description Page
II. Practical information for Molecular Biology: data, facts, tips and tricks
1. Abbreviations, symbols, conversion factors and data
1.1. Metric prefixes 310
1.2. Abbreviations and symbols 310
1.3. Tris-HCl Buffer, pH-Values 310
1.4. Nucleic acid conversions 310
1.4.1. Conversion of weight to absolute quantity (mol) 310
1.4.2. Conversion of absolute quantity (mol) to weight 310
1.4.3. Molecular weight of DNA fragments 311
1.4.4. Molecular weights for nucleotides 311
1.5. Protein conversions 311
1.5.1. Conversion of proteins to DNA length 311
1.5.2. Conversion of absolute quantity (mol) to weight 311
1.6. DNA content of various organisms 311
2. Genetic code, properties and molecular structure of amino acids
2.1. Genetic code 312
2.2. Nomenclature and properties of amino acids 312
2.3. Molecular structure of amino acids 313
3. Detection of nucleic acids and proteins
3.1. Electrophoretic resolution 314
3.1.1. Recommended agarose gel percentages for resolution of DNA 314
3.1.2. Recommended polyacrylamide gel percentages for resolution of DNA 314
3.1.3. Recommended polyacrylamide gel percentages for resolution of proteins 314
3.2. Dye migration in electrophoresis 314
3.2.1. Dye migration in polyacrylamide nondenaturing gels 314
3.2.2. Dye migration in polyacrylamide denaturing gels 314
3.3. Spectrophotometric conversion of nucleic acids and proteins 315
3.3.1. Physical properties of nucleotides 315
3.3.2. Biophysical data for deoxynucleoside triphosphates 315
3.3.3. Conversion to concentration (g/ml) 315
3.3.4. Quantification made easy 316
4. Application tips for PCR
4.1. Procedure and parameters for PCR 317
4.2. Calculating primer quantity 319
4.2.1. Conversion to absolute quantity (in pmol) 319
4.2.2. Conversion to weight (in g) 319
4.2.3. Calculating the molar concentration of the primer 319
4.3. Using gradient PCR to optimize different reaction parameters 320
4.4. Eppendorf
thermal cycler and SteadySlope
technology 321
4.5. Optimization of the Primer concentration (Primer-Matrix) 322
PCR disclaimers
310 Info

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1.3. Tris-HCl buffer, pH values
1.4. Nucleic acid conversions
1.4.1. Conversion of weight to absolute quantity (mol)
1.4.2. Conversion of absolute quantity (mol) to weight
1.1. Metric prefixes 1.2. Abbreviations and symbols
5 C 7.76 7.89 7.97 8.07 8.18 8.26 8.37 8.48 8.58 8.68 8.78 8.88 8.98 9.09 9.18 9.28
25 C 7.20 7.30 7.40 7.50 7.60 7.70 7.80 7.90 8.00 8.10 8.20 8.30 8.40 8.50 8.60 8.70
37 C 6.91 7.02 7.12 7.22 7.30 7.40 7.52 7.62 7.71 7.80 7.91 8.01 8.10 8.22 8.31 8.42
1 g of 1,000 bp DNA = 1.52 pmol = 9.1 x 10
11
molecules
1 g of pUC18/19 DNA (2,686 bp) = 0.57 pmol = 3.4 x 10
11
molecules
1 g of pBR322 DNA (4,361 bp) = 0.35 pmol = 2.1 x 10
11
molecules
1 g of M13mp18/19 DNA (7,250 bp) = 0.21 pmol = 1.3 x 10
11
molecules
1 g of l-DNA (48,502 bp) = 0.03 pmol = 1.8 x 10
10
molecules
1 pmol of 1,000 bp DNA = 0.66 g
1 pmol of pUC18/19 DNA (2,686 bp) = 1.77 g
1 pmol of pBR 322 DNA (4,361 bp) = 2.88 g
1 pmol of M13mp18/19 DNA (7,250 bp) = 4.78 g
1 pmol of l-DNA (48,502 bp) = 32.01 g
E = exa = 10
18
P = peta = 10
15
T = terra = 10
12
G = giga = 10
9
M = mega = 10
6

k = kilo = 10
3
h = hecto = 10
2
da = deca = 10
1
d = deci = 10
-1
c = centi = 10
-2
m = milli = 10
-3
= micro = 10
-6
n = nano = 10
-9
p = pico = 10
-12
f = femto = 10
-15
a = atto = 10
-18
z = zepto = 10
-21
bp base pair
Da Dalton, the unit of molecular mass;
kDa = 1,000 Da, MDa = 1,000,000 Da.
ds double-stranded (as in dsDNA)
kb kilobase: 1,000 bases or base pairs, as appropriate
M Molar or molarity, moles of solute
per liter of solution (mol/L)
Mb megabase: 1,000,000 bp
MW molecular weight (g/mol)
mol Mole, absolute amount of a substance
(1 mol = 6.023 x 10E23, Avogadro number)
ss single-stranded (as in ssDNA)
l wavelength
l
max
wavelength at the absorption maximum

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1.4.3. Molecular weight of DNA fragments 1.4.4. Molecular weights for nucleotides
1.5. Protein conversions
1.5.1. Conversion of proteins to DNA length
1.5.2. Conversion of absolute quantity (mol) to weight
1.6. DNA content of various organisms
500 bp dsDNA = 325,000 Da
500 nt (nukleotide) ssDNA = 162,500 Da
1 kb dsDNA = 660,000 Da
1 kb ssDNA = 330,000 Da
1 kb ssRNA = 340,000 Da
1 MDa dsDNA = 1.52 kb
Average molecular weight
of dNMP
= 325 Da
Average molecular weight
of DNA base pair
= 650 Da
Compound Molecular weight (in Dalton)
ATP 507.2
CTP 483.2
GTP 523.2
UTP 484.2
dATP 491.2
dCTP 467.2
dGTP 507.2
dTTP 482.2
AMP 347.2
CMP 323.2
GMP 363.2
UMP 324.2
dAMP 312.2
dCMP 288.2
dGMP 328.2
dTMP 303.2
Protein with a molecular weight of 10,000 = 270 bp DNA
Protein with a molecular weight of 30,000 = 810 bp DNA
Protein with a molecular weight of 37,000 (corresponds to 333 amino acids) = 1,000 bp DNA
Protein with a molecular weight of 50,000 = 1.35 kb DNA
Protein with a molecular weight of 100,000 = 2.7 kb DNA
100 pmoles of 100,000 Da protein = 10 g
Organism DNA content (in bp) (haploid Genome)
Escherichia coli 4.2 x 10
6
Arabidopsis thaliana 4.7 x 10
6
Saccharomyces cerevisiae 1.4 x 10
7
Drosophila melanogaster 1.4 x 10
8
Homo sapiens 3.3 x 10
9
Triticum aestivum (hexaploid wheat) 1.7 x 10
10
312 Info

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In yeast mitochondria, the
AUA and UGA codons are
used for Met and Trp, not for
Ile and Stop as normally.
Start codon:
AUG: Methionine
2.1. Genetic code
2.2. Nomenclature and properties of amino acids
Amino acid 3-letter symbol 1-letter symbol Major properties of side chains
Alanine Ala A Aliphatic
Arginine Arg R Basic group
Asparagine Asn N Amide group
Aspartic acid Asp D Acidic group
Cysteine Cys C Sulfur-containing
Glutamic Acid Glu E Acidic group
Glutamine Gln Q Amide group
Glycine Gly G No side chain
Histidine His H Imidazole group
Isoleucine Ile I Aliphatic
Leucine Leu L Aliphatic
Lysine Lys K Basic group
Methionine Met M Sulfur-containing
Phenylalanine Phe F Aromatic group
Proline Pro P Aliphatic
Serine Ser S Hydroxyl group
Threonine Thr T Hydroxyl group
Tryptophan Trp W Aromatic group
Tyrosine Tyr Y Aromatic group
Valine Val V Aliphatic
2
nd
Codon position
1
s
t

C
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U C A G
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U UUU Phe UCU Ser UAU Try UGU Cys U
UUC UCC UAC UGC C
UUA Leu UCA UAA Stop UGA Stop A
UUG UCG UAG Stop UGG Trp G
C CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg U
CUC CCC CAC CGC C
CUA CCA CAA Gln CGA A
CUG CCG CAG CGG G
A AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser U
AUC ACC AAC AGC C
AUA ACA AAA Lys AGA Arg A
AUG
Met/Start
ACG AAG AGG G
G GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly U
GUC GCC GAC GGC C
GUA GCA GAA Glu GGA A
GUG GCG GAG GGG G
Termination codons:
UAA: ochre
UAG: amber
UGA: opal

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""
CH COO
-
H3N
+
(CH2j3
NH
C
NH2
NH2
+
""
"
""
""
CH
SH
COO
-
H3N
+
CH2
CH
C
COO
-
H3N
+
(CH2j2
NH2
O
""
""
""
""
""
""
CH
NH3
+
COO
-
H3N
+
(CH2j4
S
COO
-
H3N
+
(CH2j2
CH3
""
""
"
""
""
"
""
""
"
""

2.3. Molecular structure of amino acids
Alanine
(Ala)
Arginine
(Arg)
Asparagine
(Asn)
Aspartic acid
(Asp)
Cysteine
(Cys)
Glutamine
(Gln)
Glutamic acid
(Glu)
Glycine
(Gly)
Histidine
(His)
Isoleucine
(Ile)
Leucine
(Leu)
Lysine
(Lys)
Methionine
(Met)
Phenylalanine
(Phe)
Proline
(Pro)
Serine
(Ser)
Threonine
(Thr)
Tryptophan
(Trp)
Tyrosine
(Tyr)
Valine
(Val)
314 Info

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3. Detection of nucleic acids and proteins
3.1. Electrophoretic resolution
3.1.1. Recommended agarose gel percentages
for resolution of DNA
3.1.2. Recommended polyacrylamide gel percentages
for resolution of DNA
3.1.3. Recommended polyacrylamide gel percentages
for resolution of proteins
3.2. Dye migration in electrophoresis
3.2.1. Dye migration in polyacryamide nondenaturing gels
3.2.2. Dye migration in polyacryamide denaturing gels
Gel percentage DNA size range in kb
0.5% 130
0.7% 0.812
1.0% 0.510
1.2% 0.47
1.5% 0.23
34% sieved agarose 0.011
Gel percentage Protein size range in kDa
5% 57212
7.5% 3694
10% 1668
15% 1243
Gel percentage Bromophenol blue Xylene cyanol
5.0% 35 nucleotides 130 nucleotides
Gel percentage Bromophenol blue Xylene cyanol
3.5% 100 bp 460 bp
5.0% 65 bp 260 bp
8.0% 45 bp 160 bp
12.0% 20 bp 70 bp
15.0% 15 bp 60 bp
20.0% 12 bp 45 bp
Gel percentage DNA size range in bp
3.5% 1,0002,000
5.0% 75500
8.0% 50400
12.0% 35250
15.0% 20150
20.0% 5100

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50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
dsDNA
RNA
ssDNA
3. Photometric detection of nucleic acids and proteins
3.3. Spectrophotometric conversion of nucleic acids and proteins
3.3.1. Physical properties of nucleotides
3.3.2. Biophysical data for deoxynucleoside triphosphates
3.3.3. Conversion to concentration (g/ml)
Compound Molecular weight l max (pH 7,0) Absorbance at l max
of a 1 M solution (pH 7.0)
ATP 507.2 259 nm 15,400
CTP 483.2 271 nm 9,000
GTP 523.2 253 nm 13,700
UTP 484.2 260 nm 10,000
dATP 491.2 259 nm 15,400
dCTP 467.2 272 nm 9,100
dGTP 507.2 253 nm 13,700
dTTP 482.2 267 nm 9,600
Component Molecular weight (Daltons) Molar extinction coefficient
and l max
dATP 491 15,200 at 259 nm
dCTP 467 9,300 at 271 nm
dGTP 507 13,700 at 253 nm
dTTP 482 9,600 at 267 nm
Double-stranded DNA (dsDNA):
A
260
= OD
260
= 1 for a 50 g/ml dsDNA-solution*
Single-stranded RNA:
A
260
= OD
260
= 1 for a 40 g/ml RNA-solution*
Single-stranded DNA (ssDNA):
A
260
= OD
260
= 1 for a 33 g/ml ssDNA-solution*

Absorbance is calculated as:
Molar extinction coefficient x concentration x path length
(usually cuvette width)
* These values apply when using a neutral-to-light alkaline measuring medium and
a cuvette optical path length of 1 cm.
316 Info

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3. Photometric detection of nucleic acids and proteins
3.3.4. Quantification made easy
With the aid of spectroscopy, the quantitative analysis of nucleic
acids and proteins has established itself as a routine method in
many laboratories. It includes absorption measurements in the
ultraviolet and visible ranges. Proteins are measured (directly)
at 280 nm and nucleic acids at 260 nm; colorimetric protein
determination is performed in the 550 nm to 600 nm range.
The Eppendorf
BioPhotometer plus offers the following

preinstalled test procedures:
1. Nucleic acid determination
DNA, RNA, oligonucleotides and even mononucleotides can be
measured directly in aqueous solutions. Aqueous buffers with
low ion concentrations (e.g., TE buffer) are ideal for this method.
The concentration is determined by measuring at 260 nm against
a blank and then calculating via a factor. Normally, the user has
to calculate the concentration of the measured sample using the
appropriate factor. The BioPhotometer plus can change these
factors easily and will do all necessary calculations.
The absorption of 1 OD at 260 nm is equivalent to approxi-
mately 50 g/ml dsDNA, 37 g/ml ssDNA, 40 g/ml RNA or
30 g/ml for oligonucleotides. Purity determination of DNA inter-
ference by contaminants can be recognized by ratio calculations.
The ratio A
260
/A
280
is used to estimate the purity of nucleic acid
since proteins absorb at 280 nm. Pure DNA should have a ratio
of approximately 1.8, whereas pure RNA should give a ratio of
approximately 2.0. Absorption at 230 nm reflects contamination
of the sample by substances such as carbohydrates, peptides,
phenols or aromatic compounds. In the case of pure samples,
the ratio A
260
/A
230
should be > 2.0.
2. Protein determination
The protein content of a sample can be determined by various
analytical procedures using the BioPhotometer plus. Calculations
can be performed via factor or via a calibration curve with up
to 10 standards.
2.1 Absorption measurement at 280 nm (A
280
)
A
280
method may be used in concentrations of up to approxi-
mately 4 mg/ml (3.0 A). This method is simple and rapid, but
it may be disturbed by the parallel absorption of non-proteins
(e.g., DNA). Unlike the colorimetric process, this method is less
sensitive, requires higher protein concentrations and should thus
be used with pure protein solutions. In addition to the direct ab-
sorbance display, evaluation is possible with the BioPhotometer
via the Warburg formula or against a standard.
2.2 Colorimetric determination (dye tests)
Protein samples often consist of a complex mixture of many
different proteins. The quantitative detection of the protein
content is usually based on the reaction shown by functional
groups of the proteins to dye-forming reagents. The intensity
of the dye correlates directly with the concentration of the
reacting groups and can be measured exactly. Different methods
for dye-quantification are available depending on the type of dye
being used:
2.2.1 Lowry assay
Specialist literature contains a multitude of modifications for the
Lowry assay. The principal goal is to reduce the high suscepti-
bility to interference. In comparison to the pure Biuret assay, the
sensitivity of this assay is greatly increased. However, the Lowry
method is adversely affected by a wide range of nonproteins.
Additives such as EDTA, ammonia sulfate or Triton
X-100, in
particular, are incompatible with the test.
2.2.2 Bicinchoninine acid assay (BCA)
This test represents a highly regarded alternative to the Lowry
assay. It is easier to perform, sensitivity can be varied using
different temperatures and the dye complex is very stable.
In addition, its sensitivity to detergents is similar to that of the
Lowry method. This test is also highly susceptible to inter-
ference.
2.2.3 Bradford assay
This most rapid and easiest method to use is twice as sensi-
tive as the Lowry or BCA tests and is thus the most sensitive
quantitative dye assay. Its additional advantage is that a number
of reducing substances (e.g., DTT and mercaptoethanol), which
interfere with the Lowry or BCA test, have no adverse effect on
results; however, it is sensitive to several detergents. The main
disadvantage is that identical amounts of different standard
proteins can cause considerable differences in the resulting
absorption coefficients.
3. Bacterial cell density
The density of bacterial suspensions may be measured
photometrically at OD600 without adding dyes. This applies,
for example, to the preparation of competent cells, which must
be in a specific phase of growth.
More informations: www.biophotometerplus.info
References:
(1) Wilfinger W.W., Mackey K. and Chomczynski P. 1997. Effect of pH and ionic strenght on the spectro-
photometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques 22: 474-481.
(2) Sambrook J. and Russell D.W. 2001. Spectrophotometry of DNA or RNA. Molecular Cloning. Third
Edition 3: A8.20-A8.21.
(3) Janke S.A., Fortnagel P. und Bergmann R. 1999. Turbidimetrie in der Mikrobiologie mit Standardpho-
tometern. Biospektrum 6: 501-502.
* Triton
is a registered trademark of Union Carbide Chemicals + Plastics Co., Inc.

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4.1. Procedure and parameters for PCR
This PCR table is intended to provide all PCR newcomers with
an overview of the common rules and concentrations that should
be observed when developing their experiments.
There are, of course, a number of exceptions and special points
that we are unable to accommodate in the table.
We invite you to send us any comments or tips of general interest on this topic. References: Sambrook, J., Fritsch EF., Maniatis T. Molecular cloning, 2nd ed. New York;
Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989
Steps Basic rules Comments
1
No. of source molecules No. of cycles Do only perform as many cycles as necessary
to obtain sufficient PCR product. With too many
cycles the formation of unspecific products may
occur.
For calculation of molecule number please refer
to table 1.4.1 and 1.4.2 on page 312
10
5
2530
10
4
3035
No. of cycles 10
3
3540
50 and less 2030 followed by a second
PCR with nested primers,
i. e. with a primer pair that
binds between the first
two primers of the target
sequence
2
95 C for 30 s or 97 C for 15 s
For complex templates (e.g. genomic DNA) begin with
an initial denaturation for 23 min before the actual
cycles
G/C content greater than 50% increases the
denaturation temperature
Inefficient denaturation is a frequent cause
of errors. However:
T Taq at 92.5C = 2 h
T Taq at 95.0C = 40 min
T Taq at 97.5C = 5 min
(T = half life of Taq at a specific temperature)
Denaturation step
3
For standard primers
(approx. 20 nucleotides [nt]; 1 M; 100% match)
Approx. 20 s, T
m
should be approx. 5572C
Low concentrations and long primers extend
necessary annealing times. The optimal
annealing temperature is normally 510C
lower than the primer melting temperature
(T
m
). The T
m
value can be calculated using the
following formulas:
T
m
= (A+T) x 2 + (C+G) x 4 [Wallace],
up to approx. 20 nt
T
m
= 81.5 C + 16.6 (log[Na
+
]) + 0.41 (%G+C)
(500/n) 0.61 (%FA) [Meinkoth and Wahl];
FA = Formamide
Annealing step
4
1 kb require approx. 1 min The shorter the fragment, the easier it is to
control the reaction
200500 bp fragments are sufficient for
most detection reactions
Elongation step
5
Initial denaturation: 2 min 94 C
Denaturation: 0.5 min 94 C
Annealing: 0.5 min 5068 C 2535 cycles
Elongation: 1 min/kb 72 C
Final elongation: 10 min 72 C
Basic thermo cycling
protocol
318 Info
Die mit der jeweiligen Polymerase
gelieferten Puffer sind speziell auf
diese Variante abgestimmt und
knnen oft nicht mit Enzymen anderer Her-
steller verwendet werden.
NaCl Konzentrationen grsser 50 mM
inhibieren die Taq-Polymerase.
Mguss zugegeben werden,
falls im Puffer nicht enthalten,
da Mg Cofaktor fr die
DNA-Polymerase essentiell ist.
Wird dUTP statt dTTP eingesetzt,
muss meist die zentration
erhht werden (max. 5 mM).
Zu hohe Konzentration:
frdert Amplifikation unspezifischer
Fragmente (Schmierbildung);
erhht die Schmelztemperatur.
Zu niedrige Konzentration:
verringert effizientes Annealing
und reduziert die Syntheseleistung.
sinkende Spezifitt
Zu niedrige Konzentration:
sinkende Effizienz
Bitte auch den Punkt
2. Denaturierungsschritt beachten!
fhrt zu Mispriming und
Falscheinbau von Nukleotiden.
Rechnerisch bleibt nach erfolgreicher
PCR ein Groteil der dNTPs brig.
Alle Nukleotide mssen gleich
konzentriert sein.
Modifizierte Nukleotide mssen
hher konzentriert werden.
Drfen keine Sekundrstrukturen
bilden (Stemloop, Hairpin).
Primer drfen an 3-Enden nicht
komplementr sein, da sonst
Primer-Dimere entstehen.
Beide Primer sollten gleichben.
Keine Stretche einzelner Nukleotide.
Ein G oder C am 3-Ende verbessert
Anbindung.
Triton
ist eine eingetragene Marke von Union Carbide Chemicals and Plastics Co., Inc.
Tween
ist eine eingetragene Marke von ICI Americas, Inc.

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4.1. Procedure and parameters for PCR
Triton
is a registered trademark of Union Carbide Chemicals and Plastics Co., Inc.

Tween
is a registered trademark of ICI Americas, Inc.

Reagents Basic rules Comments

Buffers
The most common components (as 10x buffers):
500 mM KCl
100 mM Tris-HCl, pH 8.3 (at 25 C) or 150200 mM
(NH
4
)
2
SO
4
with 500750 mM Tris-HCl, pH 9 (at 25 C)
12% Triton
X-100 or 0.1% Tween
1015 mM Mg
2+
(usually available separately)
The buffers delivered with the
polymerase are specially tailored
to this variety, and it is often not
possible to use them with enzymes
from other manufacturers
NaCl concentrations greater than
50 mM inhibit the Taq polymerase
Mg
2+
must be added (if not
present in buffer) as Mg
2+
is
essential as a cofactor for
the DNA polymerase

Mg2+
0.53.5 mM in the assay
Essential as a cofactor of the DNA polymerase
If dUTP is used instead of dTTP,
the Mg
2+
concentration usually
must be increased (max. 5 mM).
Concentration too high: promotes the
amplification of nonspecific fragments
(smears appear); increases the melting
temperature
Concentration too low: reduces
annealing efficiency and the synthesis
rate of the polymerase

Taq Polymerase
0.52.5 units per PCR reaction Concentration too high:
reduced specificity
Concentration too low:
reduced efficiency
Please see step 2,
Denaturation step

dNTP
Storage in 10 mM, pH 7.0 aliquots
20200 M in the assay
Concentration too high:
leads to mispriming and the
misincorporation of nucleotides
Following a successful PCR, theoretically
the major part of the dNTPs are left over
All nucleotides must have
the same concentration
Modified nucleotides must have
a higher concentration

Primer
0.11 M in the assay
Length: approx. 1530 nt
Secondary structures should not
be able to form (Stemloop, Hairpin)
Primer must not be complementary
at the 3 ends, as this will lead
to the formation of primer-dimers
Both primers should have the same T
m
No stretches of individual nucleotides
G or C at the 3 end improves binding

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4.2. Calculating primer quantity
4.2.1. Conversion to absolute quantity (in pmole) 4.2.2. Conversion to weight (in g)
4.2.3. Calculation of the molar concentration of the primer
For more information on DNA quantification, see page 316.
Primer in pmole =
Weight in g x 1,000,000
Length x 327
Example: 0.1 g of 20 oligomer:
0.1 x 1,000,000
= 15.3 pmole primer
20 x 327
Weight in g =
pmol x Length x 327
1,000,000
Example: 10 pmol of 25 oligomer:
10 x 25 x 327
= 0.081 g primer
1,000,000
Micromolar concentration of primer = pmol/l
Example 1 Example 2
20 pmol of primer
in 100 l PCR mixture = 0.20 micromolar (M)
Primer is 24 nucleotides in length and
is dissolved in 0.1 ml of water
A 10 l aliquot is diluted to 1.0 ml for A
260
measurement: A
260
= 0.76.
The stock solution has an absorbance at 260 nm (A
260
) of 76.
The stock solution (0.1 ml) contains 2.6 A
260
units.
The base composition of the primer is:
A = 6
C = 6
G = 6
T = 6
The Molar Extinction Coefficient at 260 nm for the primer = k (15,200) + l (12,010) + m (7,050) + n (8,400) where:
k = number of As
m = number of Gs
l = number of Cs
n = number of Ts
The Molar Extinction of the PCR primer = 6 (15,200) + 6 (12,010) + 6 (7,050) + 6 (8,400) = 255,960a
The Molar concentration of the PCR primer stock solution is
76
= 297 micromolar
255,960
320 Info
300 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
53 C 67 C

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La PCR en gradientes es una tcnica que permite determinar
empricamente las condiciones ptimas para la PCR dando los
menos pasos posibles. Esta optimizacin puede obtenerse a
menudo mediante un solo ensayo. Tanto el termociclador del
nuevo sistema Mastercycler pro como el clsico de la serie
Mastercycler ofrecen una funcin de gradiente que permite
llevar a cabo, durante una nica sesin, el anlisis de hasta
12 24 temperaturas diferentes de anillamiento, elongacin y/o
desnaturalizacin. Durante la misma sesin es posible adems
chequear una serie de otros parmetros de reaccin, fila por fila.
Durante la amplificacin de un fragmento especfico de ADN es
posible que se produzcan problemas en el trabajo cotidiano de
laboratorio. A menudo se generan despus de la reaccin PCR
bandas secundarias no especficas que dificultan o imposibilitan
otras aplicaciones posteriores o bien la evaluacin correcta del
resultado de la PCR. En estos casos debe llevarse a cabo una
optimizacin de las condiciones PCR.
Fig. 1: Determinacin de la temperatura ideal de anillamiento.
Temperatura de anillamiento
La seleccin de la temperatura de anillamiento es, en este
proceso, el componente ms crtico para la optimizacin de la
especificidad de una reaccin PCR. En la mayora de los casos
debe comprobarse este parmetro empricamente.
La formacin de bandas secundarias no especficas demuestra
que la temperatura ptima es a menudo muy superior a la
calculada (hasta 12 C ms).
Los termocicladores con gradiente de Eppendorf permiten
comprobar rpidamente las condiciones ptimas de temperatura
en un solo bloque y ensayo. Durante la fase de anillamiento se
genera un gradiente de 12 24 temperaturas que aumentan
gradualmente a lo largo del termobloque. Al mismo tiempo
todas las filas, cada una con 8 16 pocillos, presentan una
perfecta homogeneidad de temperaturas, de forma que tambin
es posible comprobar al mismo tiempo los componentes de la
reaccin como las cantidades de enzimas, cebadores y moldes
de ADN.
Temperatura de desnaturalizacin y elongacin
La temperatura de desnaturalizacin para la mayora de las
muestras de ADN se encuentra entre los 94 C y 96 C.
Dependiendo del contenido en GC, de la complejidad y de la
estructura, el punto de fusin especfico de un fragmento de
ADN puede estar por encima o debajo de este rango. Por otro
lado, la temperatura, o bien el tiempo de permanencia deben
mantenerse suficientemente bajos con el fin de reducir lo menos
posible la actividad de la polimerasa. En estos casos se simplifi-
ca considerablemente la determinacin de la temperatura ptima
de desnaturalizacin mediante los Mastercycler gradient. Para
ello se ajusta un gradiente entre 90 C y 99 C, de modo que
sea posible determinar empricamente la temperatura de des-
naturalizacin menor posible que permita el mayor rendimiento
de ADN amplificado.
En la mayora de las aplicaciones estndar con Taq polimerasa
no se requiere una optimizacin. No es as en protocolos ms
complejos, por ejemplo, en la amplificacin de largos frag-
mentos con una mezcla de diferentes polimerasas. En este
caso la optimi zacin de la temperatura de elongacin puede
desempear un papel muy importante, ya que la temperatura
ideal de los enzimas Taq polimerasa y proof reading puede variar
considerablemente.
Fig. 2: Registro termogrfico del termobloque del
Mastercycler gradient.
4.3. La PCR de gradientes para optimizar diferentes parmetros de reaccin

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Homogeneidad de las filas en el modo gradiente
Mediante la tecnologa de triple circuito se dispone de una zona
de calentamiento y refrigeracin adicional, garantizando as
un control preciso de la temperatura para todos los perfiles de
gradientes.
Control adicional de la temperatura mediante TCT
Caractersticas del control de la temperatura
Las caractersticas del control de la temperatura influyen
notable mente en la calidad del resultado, es decir el perfil de
las temperaturas y la velocidad con la que se lleva a cabo el
cambio de temperatura de los ensayos (el calentamiento y el
enfriamiento entre los distintos pasos de la PCR).
La aplicacin PCR ms conocida, que indica la importancia
de una velocidad de control de la temperatura constante, es el
anlisis del ADN polimrfico amplificado al azar (random
amplified polymorphic DNA analysis, RAPD) para detectar
polimorfismos en el marco de investigaciones de la huella
gentica del ADN.
Los cambios en la velocidad de control de la temperatura
alteran la muestra de bandas resultante, al igual que las impre-
cisiones trmicas dificultan la interpretacin de los resultados
obtenidos. Para que el ciclador de gradiente transmita con
xito los protocolos PCR del modo gradiente al modo normal,
la temperatura se tiene que desarrollar en ambos modos de
la forma ms similar posible. Con la tcnica de pendiente
constante SteadySlope de Eppendorf se cumple este requisito:
tambin en el modo gradiente se alcanza la temperatura con la
misma caracterstica, es decir cada temperatura a la velocidad
ptima. Para las aplicaciones PCR estndar, la velocidad mayor
posible es siempre la mejor para una ptima especificidad. sta
est claramente definida y tambin se reproduce 1:1 en el modo
normal. As se garantiza la transmisin segura entre los dos
modos de servicio y se excluye una reduccin de la ganancia o
de la especificidad debido a las diferentes caractersticas de la
temperatura, y se asegura una transferencia sin problemas de
las condiciones de reaccin obtenidas del modo gradiente al
normal.
Control del bloque y control del tubo
El control del bloque es el modo de servicio para largas incu-
baciones estticas. Para tiempos de incubacin cortos, como
es el caso durante la PCR, el tiempo programado y el tiempo de
sometimiento real a la temperatura seleccionada en la mezcla
de reaccin pueden diferir, por el contrario, considerablemente.
El control del tubo compensa automticamente este tiempo
cuidando que la mezcla de reaccin se mantenga durante todo
el tiempo a la temperatura por usted indicada, tal y como usted
la ha programado. El algoritmo altamente desarrollado de la
familia Mastercycler garantiza que este principio sea vlido para
todos los tipos de tubos usados permitindole emplear todo el
bloque para sus ensayos.
Tecnologa SteadySlope
de Eppendorf: curva de la
temperatura constante en el
modo gradiente
Equipo de otra marca con
caracterstica dinmica:
caracterstica variable del
control de temperatura
(diferentes velocidades de
refrigeracin) en el modo
gradiente
4.4. Eppendorf Thermocycler: control de temperatura es sinnimo de calidad
322 Info

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Eppendorf Mastercycler
family
Practice of the patented polymerase chain reaction (PCR)
process requires a license. The Mastercycler is an Authorized
Thermal Cycler and may be used with PCR licenses available
from Applied Biosystems. Its use with Authorized Reagents
also provides a limited PCR license in accordance with the
label rights accompanying such reagent
Real-Time PCR
Practice of the patented polymerase chain reaction (PCR)
process requires a license. The Eppendorf [or appropriate trade-
mark] Thermal Cycler is an Authorized Thermal Cycler and may
be used with PCR licenses available from Applied Biosystems.
Its use with Authorized Reagents also provides a limited PCR
license in accordance with the label rights accompanying such
reagents. This is a Licensed Real-Time Thermal Cycler under
Appleras United States Patent No. 6,814,934 and corresponding
claims in non-U.S. counter parts thereof, for use in research and
for all other applied fields except human in vitro diagnostics. No
right is conveyed expressly, by implication or by estoppel under
any other patent claim.
Para encontrar la combinacin ptima de concentraciones
para los primers es recomendable construir una matriz de
primers que abarque un rango de concentraciones empleadas
habitualmente para los primers directo y reverso. Normalmente
se usa un rango de 50-900 nM. En la tabla 1 se muestra una
matriz de primers tpica. Para conseguir unos resultados fiables,
cada combinacin debera usarse por triplicado y con controles
negativos adicionales.
4.5. Optimizacin de la concentracin de Primers (Matriz de Primers)
Combinacin tpica de primeres directo y reverso para una Matriz de primers.
PCR disclaimers
Forward
50 nM 100 nM 300 nM 600 nM 900 nM
R
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e
50 nM 50/50 100/50 300/50 600/50 900/50
100 nM 50/100 100/100 300/100 600/100 900/100
300 nM 50/300 100/300 300/300 600/300 900/300
600 nM 50/600 100/600 300/600 600/600 900/600
900 nM 50/900 100/900 300/900 600/900 900/900

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fix Todos los volmenes

Todos los volmenes

Todos los volmenes

pro Todos los volmenes

Todos los volmenes

4810 Todos los volmenes

4720 En todas las combinaciones

Todos los volmenes

pro Todos los volmenes

plus (modo dispensador)

thermal cycler and SteadySlope

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