Ao de la inversin para el desarrollo rural y la seguridad alimentaria UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL

DE BIOTECNOLOGA

UNIDAD I PRCTICA N02 DOCENTE : Preparacin de medios de cultivo para Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 : ROMERO USQUIANO, Roger

CURSO

: Bioprocesos II

ESTUDIANTES

CHINCHAY CHINCHAY, Joel GARCA PREZ, Carlos LPEZ PREZ, Jimmy Breitner RIVAS SANDOVAL, Walter

CICLO

: VII

Nvo. Chimbote. Mayo de 2013

PRCTICA N02: Preparacin de medios de cultivo para Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126

I.

INTRODUCCION

En esta prctica de laboratorio se llevara a cabo la preparacin de medio de fermentacin, el medio de activacin y el medio de mantencin con el propsito de evaluar ciertos parmetros importantes y bsicos al final de la fermentacin. Las levaduras una vez que han estado en un medio de mantencin es necesario activarlas en otro medio para producir el inoculo correspondiente que nos permitir la fermentacin, para ellos es necesario producir un medio de activacin con nutrientes especficos constituidos de glucosa, extracto de levadura, extracto de malta y solucin de sales que deben ser aptos para una activacin eficaz, para ello debemos hacer los clculos necesarios para un determinado volumen , en esta caso ser de 20 ml en volumen total del medio de activacin, previamente esterilizado en el autoclave, nos brindara la confianza de un buen medio de activacin. El medio de cultivo (fermentacin) es una solucin que proporciona todos los requerimientos para el crecimiento y produccin de metabolitos deseados. Dichos requerimientos varan de acuerdo al microorganismo a utilizar, en nuestro caso prepararemos un medio especial para Saccharomyces cerevisiae. El proceso de fermentacin se llevara a cabo en un biorreactor, entonces determinados sustratos que componen el medio de cultivo sern transformados por los microorganismos en metabolitos y biomasa. El microorganismo va aumentando en su concentracin en el transcurso de la fermentacin debido a su reproduccin al mismo tiempo que el medio se ira modificando debido al consumo y formacin de nuevos productos. El comportamiento de un microorganismo en crecimiento ser el resultado de la interaccin que se produce entre el mismo microorganismo y el medio ambiente en el reactor, llamados efectores intracelulares y efectores extracelulares. Los efectores internos hacen referencia a su gentica y sus mecanismos de regulacin metablica. El comportamiento del microorganismo en el reactor ser el resultado de la influencia de parmetros fsicos y qumicos que constituyen los efectores externos. Los parmetros fsicos son las condiciones de operacin en los reactores como por ejemplo la temperatura, la agitacin, aireacin, etc. Los parmetros qumicos estn representados por los componentes de los medios de fermentacin, adems del oxgeno molecular.

II.

OBJETIVOS

1-Calcular las proporciones adecuadas de los reactivos y las sales para un volumen de 20ml de medio de activacin. 2-Proveer un medio de activacin adecuado para la cepa Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 3.-Hacer una curva de calibrado y determinar la ecuacin de la recta que tenga el mejor coeficiente de correlacin (R2). III. MARCO TERICO

Activacin de la levadura: Como el microorganismo se conserva en tubo inclinado, para transferirlo al medio de cultivo; es necesario activarlo, para esto se utilizan tubos de ensayo tapa rosca con un volumen de 10 mL del medio de cultivo para activacin. NOTA: La fuente de carbono utilizada es xilosa. Se toman colonias definidas y aisladas de una caja petri y se lleva a los diferentes tubos con medio previamente preparados y esterilizados, posteriormente se incuban a 38 C durante 3 das. Pasado este tiempo, se selecciona uno de los tubos dependiendo de la calidad de la colonia y se siembra en el medio de activacion en una forma de escalamiento, previamente el medio de activacion ha sido preparado considerando las proporciones ya calculados de cada uno de los componentes mencionados a continuacion y llevados al autoclave para su esterilizacion. A continuacion los rectivos necesarios para el medio de activacion: GLUCOSA El crecimiento de los microorganismos en los medios de activacin se ve favorecido por la adicin de glucosa, pero el pH baja rpidamente y cesa |el crecimiento. Esta cada de pH se debe a una acumulacin de cido lctico, procedente de la fermentacin de los azucares, especialmente la glucosa (McCarty 1984). EXTRACTO DE LEVADURA El extracto de levadura consiste en una solucion concentrada de hidrolizado proteico de clulas de Saccharomyces cerevisiae, producido por una reaccin autolitica o plasmodica de dichas clulas. Es una buena fuente de aminocidos, carbohidratos y vitaminas especialmente del complejo hidrosoluble B y tiene un bajo contenido en sales. Los carbohidratos principales son glucgeno y trehalosa aunque por hidrlisis enzimtica durante el proceso estos carbohidratos pueden fraccionarse en molculas de glucosa (Bridson 1978).

EXTRACTO DE MALTA El extracto de malta es un extracto soluble en agua de cebada de malta que se obtiene por secado y molido del grano de cebada germinado y posterior extraccin con agua caliente lo que permite conservar el nitrgeno y los carbohidratos constitutivos. Los constituyentes principales del extracto son los carbohidratos (90%), (principalmente glucosa, fructosa, maltosa) y compuestos nitrogenados (4%), en menor proporcin incluye lpidos, compuestos sulfurados e inorgnicos. Es un extracto muy utilizado para el cultivo de hongos filamentosos y levaduras (Bridson 1978). SOLUCION DE SALES: Las sales minerales son la fuente de aniones (p. ej. el Cl-) y de cationes para la clula. Los siguientes cationes, concretamente, se necesitan en cantidades relativamente grandes: K +, Mg++, Ca++, Fe++. participa en muchas molculas implicadas en procesos de respiracin, como citocromos y ferroprotenas no hmicas (protenas con Fe-S);interviene como cofactor en ciertas enzimas. Aparte de estos iones que se requieren en cantidades relativamente grandes, las bacterias necesitan minsculas cantidades de otros elementos (oligoelementos), a los que tambin se denomina como micronutrientes o elementos traza(Bridson 1978). Curva de calibrado La curva de calibrado es un mtodo de qumica analtica empleado para medir la concentracin de una sustancia en una muestra por comparacin con una serie de elementos de concentracin conocida. Se basa en la existencia de una relacin en principio lineal entre un carcter medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques de espectrofotometra) y la variable a determinar (concentracin). Para ello, se efectan diluciones de unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una funcin matemtica que relacione ambas; despus, se lee el mismo carcter en la muestra problema y, mediante la sustitucin de la variable independiente de esa funcin, se obtiene la concentracin de esta. Se dice pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la curva de calibracin, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentracin del analito. Las curvas de calibracin suelen poseer al menos una fase de respuesta lineal sobre la que se realiza un test estadstico de regresin para evaluar su fiabilidad.

IV.

MATERIALES Y MTODOS

MATERIALES: -matraz 125ml -pipetas 10ml -agua destilada -capachos -espatulas -balanza analitica -tampones -autoclave

V.

PROCEDIMIENTO

A. PREPARACIN DE TUBOS DE MANTENCIN

referencia de composicion de medio de mantencion para sacharomyces cerevisae ATCC 4126 nutriente extracto de levadura peptona extracto de malta agar glucosa

concentracion g/l concentracion g/20ml de solucion V=20 ml W= g 3 5 3 20 10 0,06 0,1 0,06 0,4 0,2 0,06 0,1 0,06 0,4 0,2

Pesar los reactivos y adicionar al matraz Aadir agua hasta completar volumen de solucin Calentar mezcla y llevarlo a ebullicin con agitacin constante Hervir 1-2 min a fin de disolver totalmente Distribuir en caliente en 3 tubos de ensayo con tapa (6,3 ml aproximadamente c/u) Esterilizar en olla a presin, (a partir de primera burbuja 10 15 min) Enfriar y dejar vapor de la autoclave Dejar reposar 1 hora o toda la noche los tubos inclinados con la tapa asegurada.

Se usa dos o tres tubos de mantencin para asegurar que las levaduras se reproduzcan.

B. PREPARACIN DEL MEDIO DE ACTIVACIN

MEDIO

NUTRIENTE Glucosa Extracto levadura Extracto de malta Solucion de sales

CONCENTRACION g/L 10g de 3g 5g 5ml/L

CONCENTRACION g/20ml SOLUCION 0.2g 0.06g 0.1g 0.1ml

ACTIVACION

Se hacen los calculos segn las proporciones que se requiere segn el cuadro nro.1 para determinar los pesos en gramos de cada reactivo, luego se procede a pesar en la balanza analitica previamente calibrada y haciendo uso de los respectivos capachos y de las espatulas y pinzas llenando la glucosa en el matraz , el extracto de levadura y el extracto de malta iran juntas en un tubo de ensayo , asi como tambien las sales en otro.

C. PREPARACION DE LAS SALES Composicion de las sales ultilizadas en los medios de cultivo en g / L.

Gramos / medio litro 0,56 0,055 0,03 0,025 0,005 0,00025 0,0135 0,14

Gramos / Litros 1,12 0,11 0,06 0,05 0,01 0,0005 0,027 0,28

Compuesto CaCl2 . 2H2O ZnSO4 . 7H2O FeSO4 . 7H2O CuSO4 . 5H2O CoCl2 . 6H2O MoO3 MnCl NaCl

Condiciones de cultivo: 35 C, velocidad de agitacion: 150 rpm en el shaker

D. PREPARACIN DEL MEDIO DE FERMETACIN

E. ELABORACIN DE LA CURVA DE CALIBRADO Mtodo del DNS (cido dinitrosaliclico) Para la preparacin de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 20 ml de agua, paralelamente se disuelve el DNS en pequeas cantidades con ayuda de un agitador magntico y calentando. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 50 mL y se agita hasta la completa disolucin de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta 50 mL

Se precisa realizar los siguientes pasos para la realizacin de la curva de calibrado:

Tabla n01: Preparacin de las soluciones Estndar de glucosa 2 g/l (100 ml) N tubo ensayo 1 2 3 4 5 6 glucosa (mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Agua (mL) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 glucosa (g/L) 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 Absorbancia ( =540 nm)

1. Se aade 0.5 mL de reactivo DNS a 0.5 mL de muestra a analizar. 2. Se mantiene la mezcla en bao de agua a ebullicin durante 5 minutos para luego enfriar con agua helada por un tiempo de 3 minutos. 3. Se aaden 5 ml de agua destilada, y se deja reposar por 15 minutos, pasados estos, agitar hasta homogenizar la solucin obtenida. 4. Se lee la absorbancia de todas las muestras a una longitud de onda de 540 nm, utilizando agua como blanco. 5. La concentracin se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado. La curva de calibrado para el azcar se obtiene a partir de muestra de concentracin conocida y analizadas segn este procedimiento.

VI.

RESULTADOS

PESADO Y USO DE LOS REACTIVOS

MEZCLADO DE LOS REACTIVOS

MEDIO DE ACTIVACION FINAL

PREPARACION DE SALES:

Tabla n02: Absorbancia de las soluciones Estndar de glucosa preparadas a diferentes concentraciones. N tubo ensayo 1 2 3 4 5 6 glucosa (mL) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Agua (mL) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 glucosa (g/L) 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 Absorbancia (=540 nm) 0.277 0.206 0.297 0.201 0.101 0.0

y = 0.1203x + 0.0415 R = 0.8568 0.3 0.277 0.25 Absorbancia (nm) 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Glucosa (g/L) 0.101 0.201 0.206

Grfica n01. Relacin entre las concentraciones de glucosa y las

absorbancias-Curva de calibracin.

VII.

DISCUSIN

Los medios de cultivo para el aislamiento se vierten en tubos inclinados. Los cuales a pesar de tener una superficie reducida ofrecen seguridad en su manipulacin y buena resistencia a la deshidratacin y a la contaminacin. Se utilizan para conservar cultivos por tiempo ms o menos prolongado. Los medios se seleccionan en base al tipo de muestra que queremos reproducir. (Caedo, V. 2004). Por tales cualidades se eligi aislar en tubos inclinados, los cuales contenan un medio adecuado para Saccharomyces cerevisiae. Los resultados obtenidos en la obtencion del medio de activacion nos muestran un medio apto para la activacion ya que se cumplieron con todas las normas que lo establecen los protocolos establecidos, asi como tambien dicho medio de activacion es el 10% del volumen del medio de cultivo como lo contempla : RAMIREZ L., Gladys. Manual de laboratorio de Bromatologa. Medelln, Enero de 1999. Con respecto a la curva de calibracin se hicieron algunas modificaciones en la prctica, se trabaj con 0.5 ml de solucin de glucosa y con 0.5 ml de DNS, siendo 1 ml el volumen ms adecuado para ambos de acuerdo a los protocolos sobre curvas de calibrado con DNS. Asimismo en los resultados obtenidos se obtuvo que la concentracin de glucosa de 1.2 g/L present una absorbancia de 0.297, mayor que las concentraciones de 1.6 g/L y 2 g/L, lo cual no es correcto debido a que las absorbancias son directamente proporcionales a las concentraciones, esto puede haberse dado debido a un error al momento de hacer reaccionar las soluciones de glucosa con el DNS, las cuales no se dieron en un medio acuoso en ebullicin por 5 minutos, sino en un medio acuoso de 93C por 6 minutos, adems otra posible causa del resultado puede haberse dado debido a la falta del calibracin del espectrofotmetro utilizado. As tambin el coeficiente de correlacin obtenido (R =0.8568) muestra que los puntos obtenidos de la relacin entre la solucin de glucosa y la absorbancia no estn del todo alineados.

VIII.

CONCLUSIONES

1- Se calculo la cantidad necesaria de medio de activacion con las respectivas proporciones de los reactivos y la solucion de sales sales de tal manera que cumple con ser el 10% del medio de cultivo. 2- De esta manera se Provee un medio de activacin adecuado para la cepa Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 3- La curva de calibrado permite determinar de forma aproximada las cantidades de glucosa presentes en las soluciones, en base a sus absorbancias. 4- A partir de la ecuacin de la recta obtenida (y = 0.1203x + 0.0415) se puede determinar las cantidades de glucosa presentes en las soluciones, en base a sus absorbancias.

IX.

RECOMENDACIONES

1-Se recomienda usar pinzas al momento de pesar el la balanza analitica para evitar variaciones en el peso. 2-Se recomienda hacer el pesaje en el menor tiempo posible ya que los reactivos son higroscopicos y absorven agua de la humedad del ambiente , variando significativamente el peso de los reactivos. 3- Sera bueno que en el laboratorio se contara con dos balanzas analticas para poder avanzar en el pesado de las sales y dems compuestos quimicos necesarios para las prcticas.

X.

MATERIAL DE REFERNCIAS

XI.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1-POTTER, Norman N. La ciencia de los alimentos. Ed. Harla, Mxico. (1978). Pg. 359-376. 2-JAGNOW, G. Y David W.Bioctenologa: induccin con experimentos modelos. Ed.Acribia, Zaragoza-Espaa (1991). 3-RAMIREZ L., Gladys. Manual de laboratorio de Bromatologa. Medelln, Enero de 1999. 4- Caedo V. (2004). Manual de Laboratorio para el Manejo de Hongos. Lima, Per.