COLABORACIONES [Revisiones clnicas y estudias teraputicos)

Valoracin del medio de cultivo diferencial para dermatofitos (Micodek) despus de una incubacin prolongada
0. LPEZ-JODRA, J.M. TORRES-RODRGUEZ, M.E. PUEYO-CASTELL
GRMEC (Grup de Recerca en Micologia experimental i clnica). IMIM. Universitat Autnoma de Barcelona.
(2 tablas, 2 figuras, 2 fotografas, 1 microfotografa y 13 citas bibliogrficas)

RESUMEN Aunque la orientacin clnica y los datos epidemiolgicos puedan sugerir que una lesin de piel, o anejos es de origen mictico, solamente despus de haber efectuado un estudio micolgico puede afirmarse con certeza el diagnstico de tia. En los ltimos tiempos se ha introducido en Espaa el uso por dermatlogos de un medio selectivodiferencial Micodek (Teknopara, Italia) con el fin de facilitar el diagnstico de una tia cuando no se tiene fcil acceso a un laboratorio de Micologa. El presente trabajo forma parte de un estudio de control de calidad sobre el uso y la eficacia de este medio como apoyo al diagnstico de dermatofitosis, cuyo objetivo es valorar su eficacia en periodos de incubacin prolongada y determinar la eficacia que puede tener su uso por parte de dermatlogos, no expertos en micologia. De un total de 670 cultivos examinados, un 44% no presentaron crecimiento ni cambio de color, y el 7% presentaron crecimiento sin alterar el color inicial del medio. Un 47% presentaron viraje del medio, de los cuales un 30% correspondan a dermatofitos, el 16,7% restante a levaduras y a otros hongos filamentosos contaminantes y tan slo el 1.2% a bacterias. Se ha comprobado que Micodek es un medio

qumicamente estable, ya que no se produjeron virajes espontneos ni falsos negativos, an despus de 6 meses de incubacin.

INTRODUCCION El acceso del mdico dermatlogo a un laboratorio de Micologa no siempre es fcil. Las infecciones de piel y anexos cutneos producidas por hongos dermatofitos presentan formas clnicas muy variadas dependiendo de la relacin husped-parsito (1). A veces son fcilmente diagnosticadas, mientras que en otras ocasiones la similitud es parcial o casi total con otro tipo de dermatopatas, lo cual determina que puedan producirse errores de diagnstico y como consecuencia de tratamiento. La prevalencia de las tias es elevada, sin que se pueda concretar el nmero exacto ya que es una enfermedad de declaracin no obligatoria. La frecuencia con que se presentan en la consulta dermatolgica se estima que oscila entre el 5 y 10% del total de visitas; esta cifra se supone que no comprende los casos diagnosticados por el pediatra o por el mdico generalista (1). La introduccin del nuevo medio de cultivo (Micodek) entre los clnicos, basado en un cambio de color cuando hay crecimiento de un dermatofito, facilita el

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diagnstico de las tias directamente por el mdico y permite indicar un tratamiento adecuado al paciente. Se trata de un medio selectivo para los dermatofitos, disponible comercialmente (Tecknofarma, Torino, Italia) en cuya composicin existen antibiticos que inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas, Gram negativas y hongos contaminantes, adems de un indicador de pH que hace virar el medio en presencia de dermatofitos; estas caractersticas son comunes al medio llamado DTM, medio selectivo para dermatofitos que desde hace anos se viene utilizando (2). Para que este medio cumpla su cometido de especificidad ha de ser empleado siguiendo estrictamente las instrucciones de uso, siendo importantsimo la valoracin dentro de los diez das siguientes a la siembra. Sin embargo, no es infrecuente que se supere este tiempo y en ese caso los resultados son cuestionables. El objetivo de este trabajo ha sido valorar la utilidad del medio cuando la incubacin ha sido excesivamente prolongada.

llo original a pesar de que el medio estuviera desecado (Fotografa 2). En 50 frascos no hubo cambios de color, pero si crecimiento de algn microorganismo identificable en 9 casos como bacterias, 6 casos de levaduras, y 32 casos de hongos miceliares contaminantes y en 1 caso se aisl Scopulariopsis brevicaulis. En dos frascos muy desecados no pudo identificarse el microorganismo desarrollado que result inviable. De los 373 frascos restantes en 316 hubo viraje al rojo, correspondiendo en 204 casos a dermatofitos de los gneros Trichophyton, Microscoporum y Epidermophyton (Fig. 1) (Tabla 1). En la gran mayora de los casos la observacin microscpica directa permiti identificar el dermatofito a nivel de especie (Microfotografa).
TABLA 1 Distribucin de los hongos aislados en medio Micodek virado (n=316) despus de una incubacin excesiva. El total de cultivos evaluados fue de 670. Hongos aislados: 316 N Porcentaje 64,55 21,20 20,8 15,8 1,89 2,84 0,632 0,316 0,316

MATERIALES Y METODOS Un total de 670 frascos de Micodek que haban sido sembrados directamente en la consulta del dermatlogo fueron remitidos al laboratorio de Mitologa del I.M.I.M. para proceder a su estudio, las muestras fueron remitidas de 11 comunidades autnomas del estado Espaol. Todas las muestras sembradas procedan de pacientes en quienes exista la sospecha clnica de una dermatofitosis que afectaba piel, cabello o uas. Todos los medios haban sido sembrados como mnimo con un mes de anterioridad al envo y la mayora entre 2 y 6 meses. Se valor el crecimiento de algn microorganismo y si el medio haba virado o no al rojo (Fotografa 1). En el caso de crecimiento, las colonias desarrolladas, independientemente del viraje, se observaron al microscopio para su identificacin. Se hizo cultivo en medio de Sabouraud de los hongos crecidos en medio Micodeke y que no pudieron ser identificados directamente al microscopio. Posteriormente se estudiaron macro y microscpicamente siguindose para la identificacin los criterios expuestos por varios autores (3,4,5).
l

Dermatofitos 204 l Trichophyton rubrum . 69 l Tricophyton mentagrophytes 66 l Mycrosporum canis . . . . . . . . . . . . . . . 50 . . . . Mycrosporum gypseum 6 l Epidermophytonfiocossum 9 l E. flocossum ms dematiaceos 2 l Tricophyton rubrun + S brevicaulis 1 l Tricophyton sp 1 No dermatofitos l Levaduras l Scopulariopsis brevicaulis l Filamentosos contaminantes: l Aspergillus sp l Penicillium sp l Trichosporon sp .......... l Crysosporium sp l Fusarium sp ............. l Acremonium sp* .......... l Zigomiceto. . . . . . . . . . . . . . l Dematiaceos l Scopulariopsis+ Aspergillus l Aspergillus + Penicillium l Aspergillus + dematiaceo l Penicillium + dematiaceo l Penicillium + M E lDematiaceo+ME . . . . . . . . l Micelio estril . . . . . . . . . . . . l No viables** 112 19 13 76 10 10 1 1 1 4 1 10 1 1 2 2 1 1 25 4

RESULTADOS En 197 frascos de Micodek no hubo crecimiento de microorganismos ni cambios de color en el amari-

35,44 6,01 . . 4,11 24,05 3,16 3,16 0,316 0,316 0,316 1,26 0,316 3,16 0,316 0,316 0,63 0,63 0,316 0,316 7,91 1,26

* En 4 casos (1.26%) se cultivaron bacterias. ** Hongos no identificablesy no cultivables.

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De estos 316 frascos virados en 112 casos los miemorganismos no eran dermatofitos; entre ellos se identificaron bacterias, levaduras, hongos miceliares contaminantes de diferentes especies (Fig. 2) (Tabla II) y en 10 casos correspondi a Scopulariopsis brevicaulis. En siete cultivos el grado de desecacin era tan grande que no fue posible definir si haba algn microorganismo.
TABLA II Resultados obtenidos de 347 medios de Micodek sembrados en que no se observ viraje (51,79%). Microorganismos Sin crecimiento Con crecimiento Scopulariopsis brevicaulis Levaduras...................... Penicillium sp Aspergillus sp Bacterias Dematiaceos.. Acremonium sp Micelio estril Levadura + bacterias No viables**
** Hongos no identificables y no cultivables.

N 297 50 1 6 6 2 9 3 1 19 1 2

Porcentaje 85,59 14,40 0,288 1,729 1,729 2,59 0,86 0,288 0,288 5,47 0,288 0,576

Fotografa 1. Medio de cultivo diferencial para dermatofitos (Micodek) virado al color rojo por presencia de dermatofitos y sin virar de color amarillo, tras una siembra de una semana.

DISCUSION En general, se desconoce la prevalencia de las dermatofitosis en la poblacin sana, ya que estas no son enfermedades de declaracin obligatoria. La forma clnica y la incidencia no es la misma en todas las partes del mundo, actualmente se acepta que a nivel mundial el agente ms comn de las dermatofitasis es T. rubrum seguido por T. violaceum y en tacer lugar T. mentagrophytes (6). En Europa, el agente ms habitual de la tinea capitis es M. canis; M. audouinii lo fue a comienzos del siglo XX; sin embargo su incidencia ha disminuido notablemente en estos ltimos aos. T. rubrum fue excepcional en Europa hasta la segunda guerra mundial, pero en la actualidad ocupa el primer lugar en la mayora de los pases como responsable de tinea corporis, tinea cruris, tinea pedis y principalmente de tinea unguium. En Espaa T. violaceum y m. audonii son especies excepcionalmente aisladas.

Fotografa 2. Medio de cultivo diferencial para dermatofitos (Micudek) despus de una incubacin excesiva. Obsrvese el importante grado de deshidratacin y las colonias de diferentes dermatofitos.

Microfotografia. Observacin microscpica de

Trichophyton mentagrophytes procedente de una colonia

desarrollada en medio Micodek: observese la presencia de abundantes macroconidios.

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Hay grandes variaciones regionales en la distribucin de los dermatoftos y pueden ocurrir cambios significativos con el paso de los aos, corno es el caso de la variacin observada. en el rea metropolitana de Barcelona, donde se aprecia un importante descenso de especies prevalentes en el pasado como T. violaceum y T. tonsurans, aislndose en aos posteriores (1977-1983) una mayor frecuencia de T. menragrophytes var granulosum (7). En cambio en este estudio, con muestras procedentes de pacientes atendidos por numerosos dermatlogos de diferentes comunidades autnomas espaolas (Andaluca, Catalunya, CastillaLen, Castilla La Mancha, Canarias, Galicia, Madrid, Murcia, Pas Vasco y Valencia) ha predominado T. rubrum con un 10% frente a un 9,8% de T. mentagrophytes y a un 7.4% de M. canis . Esto se puede explicar con la heterogeneidad de las muestras sembradas ya que la distribucin de los hongos dermatofitos, es muy variable, dependiendo de la edad, sexo, poblacin, tia. Esta amplia diversidad etiolgica justifica la bsqueda de nuevos medios de diagnstico que sean tiles tanto para el especialista en micologia como para el dermatlogo. Desde la primera mitad del siglo XIX (8) el diagnstico de las micosis superficiales se basa en la visualizacin microscpica de elementos fngicos en preparaciones con hidrxido de potasio y posteriormente en cultivos en medios como el descrito por Sabouraud. La interpretacin de las preparaciones o el examen directo requiere una degradacin previa de la queratina de la piel y una experiencia de laboratorio que pocos dermatlogos poseen. El medio de Sabouraud es un medio satisfactorio para aislar la mayora de los hongos en cultivo primario, pero a menudo se contamina por hongos saprfitos y bacterias cuando se cultivan pelos o escamas de la piel. En 1956, George (9) ampli las tcnicas de cultivo cuando formul un medio ms selectivo conteniendo penicilina, estreptomicina y cicloheximida. Este medio con ms modificaciones posteriores como la adicin de cloranfenicol sigue siendo ampliamente usado. Blank y Kebel (10) en 1965 introdujeron una tcnica para separar dermatofitos de hongos saprfitos; esta tcnica inclua griseofulvina en uno de los tubos. Taplin (11) introdujo la gentamicina como inhibidor bacteriano y Bacter (12) propuso el uso de tinta azul como indicador de cambios de pH en cultivos de dermatofitos. Postetiormente Taplin (12) y colaboradores perfeccionaron una prueba de identificacin de dermatofitos, describiendo el medio diferencial,

Fig. 1. Distribucin porcentual de 670 muestras sembradas. en el medio de cultivo Micodek.

Fig. 2. Distribucin dermatofitos por especies aisladas en medio Micodekvirados.despus de una incubacin excesiva de un total de 670.

cido como DTM (Dermatophyte test medium), basado en un cambio de color, del amarillo al rojo, debido al crecimiento de los dermatofitos que ocasiona la alcalinizacin del medio, producida por dichos hongos. Con este medio conocido se aislan los dermatofitos en un 97% de los cultivos, basndose nicamente en el cambio de color. Existen otros mtodos de diagnstico como el propuesto por Kligman (13) del PAS (cido de Shiff) para mejorar la visualizacin de los hongos en tejidos. El Micodek es un medio conceptualmente similar al DTM. de aislamiento de hongos dermatofitos que permite detectar el crecimiento de dermatofitos slo con la observacin del viraje del mismo. Contiene varias substancias inhibidoras cuya composicin no ha sido revelada por los fabricantes que inhiben el crecimiento bacteriano otros organismos fngicos no dermatofitos.

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COLABORACIONES (Revisiones clnicas y

El medio analizado ha demostrado ser qumicamente estable al no producirse virajes espontneos en los medios sembrados en los que no hubo crecimiento de microorganismos, a pesar de que en muchos casos haban transcurrido 6 meses de incubacin. Tampoco hubo falsos negativos ya que todos los dermatofitos produjeron viraje del medio. Para una correcta valoracin del medio diferencial evaluado es imprescindible no sobrepasar el tiempo ptimo de incubacin que es de 10 das posteriores a la siembra. En cualquier caso, a pesar del tiempo transcurrido, la verificacin microscpica del cultivo permite una correcta identificacin de la gran mayora de las colonias, como en nuestro estudio donde se observ que los virajes producidos por hongos n dero matofitos o bacterias slo era e 16,7 l 1% de los crecimientos y que seguramente fueron debidos a una incubacin excesivamente prolongada que favoreci la contaminacin de los mismos. A pesar del excesivo tiempo de incubacin transcurrido la observacin de los cultivos, sobre todo microscpicamente ha permitido distinguir entre un dermatofito y otros microorganismos.

4. Badillet G. Dermatophyties et Dermatophytes. Pars. Varia. 1991. 5. De Hoog GS, Guarro J. Atlas of Clinical Fungi. Baam y Reus. Centraalbureau voor. Schimmelcultures & Universitat Rovira i Virgili. 1995. 6. Pereiro-Minguen M y Pereiro M Jr. Dermatofitosis y sus agentes etiolgicos En: Torres-Rodrfguez JM. Micologa mdica. Barcelona. Masson 1993. 7. Torres-Rodrguez JM, Balaguer Meler J, Ventin-Hernndez M, Martn-Casabona N. Multicenter study of dermatophyte distribution in the metropolitan area of Barcelona (Catalonia, Spain). Mycopatologia 1986; 93: 95-97. 8. Taplin. Superficial mycoses. J Invest Dermatol 1976; 67: 177-181. 9. Georg LK. Use of cycloheximide medium for isolation of dermatophytes from clinical materials. Arch Dermatol Syphilol 1953; 67: 355-361. 10. Blank H, Rebell G. Griseofulvin containing medium for simplified diagnosis of dermatophytosis. Arch Dermatol 1965; 92: 319-322. 11. Taplin D. The use of gentamicin in mycology media. J Invest Dermatol 1965; 45: 549-550. 12. Baxter M. The use of ink in the identification of dermatophytes. J Invest Dermatol 1965; 44: 23-25. 13. Kligman AM, Mescon H, deLamatre DE. The Hotchkiss-Mcmanus stain for the histopathologic diagnosis of fungus disease. Am J Clin Pathol 1951; 21: 86-91.

Correspondencia: BIBLIOGRAFIA
1. Martnez Roig A, Torres Rodrguez JM. Dermatofitos y tias. En: Torres-Rodrguez J M. Micosis que afectan piel y mucosas. Barcelona, Doyma. 1987. 2. Taplin D, Zaias N, Rebell G, Blank H. Isolation and

recognition of dermatophyte on s a new medium (DTM).

Arch Dermatol 1969; 99: 203-209. 3. Rippon JW. Dermatophytosis and dermatomycosis en Medical Mycology. Philadelphia. Saunders. 1988. Third edition.

Dr. Josep M. Torres-Rodrguez GRMEC -IMIMC/. Dr. Aiguader, n. 8 08003 Barcelona Tel. (93) 221 10 09 Fax (93) 221 32 37 E mail: JMTorres@imim.es

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