MASTER OFICIAL EN EMBRIOLOGA TISULAR Y MOLECULAR MARCADORES DE DIFERENCIACIN Y CRECIMIENTO

Francisco OValle Ravassa Prof. Titular del Dpto. de Anatoma Patolgica Universidad de Granada

PROCESAMIENTO DE LOS TEJIDOS PARA LAS TCNICAS INMUNOHISTOQUMICAS. MTODOS DE FIJACIN Y DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO. NUEVOS FIJADORES.
Francisco J. OValle Ravassa Dpto. Anatoma Patolgica UGR

PROCESAMIENTO MUESTRAS PARA IHQ FIJACIN INCLUSIN CORTE DESPARAFINACIN HIDRATACIN DESENMASCARAMIENTO PROCEDIMIENTO IHQ

FIJACIN TISULAR
GENERALIDADES: NO EXISTE UN MTODO UNIVERSAL DE FIJACIN FIJACIN NO EQUIVALE A CONSERVACIN TISULAR UN DEFECTO DE FIJACIN DIFCILMENTE SE CORRIGE NO REALIZAR ESTUDIOS IHQ SOBRE MATERIAL CON DEFECTOS DE FIJACIN

FIJACIN TISULAR
OBJETIVOS:

EVITAR ARTEFACTOS. MANTENER LA ESTRUCTURA TISULAR Y CELULAR. ESTABILIZAR LOS TEJIDOS Y LAS CLULAS. EVITAR CONTAMINACIONES.

FIJACIN TISULAR
CARACTERSTICAS:

BLOQUEAR LOS FENMENOS DE AUTLISIS. MICROBICIDA (evita degradacin celular por bacterias). NO PROVOCAR RETRACCIONES TISULARES. pH APROXIMADO AL FISIOLGICO.

FIJACIN TISULAR
PROTOCOLO:

COLOCAR LA MUESTRA RPIDAMENTE EN EL FIJADOR. MEJOR FIJAR LAMINAS DE TEJIDO DE 0.5 cm. VOLUMEN DE FIJADOR 20:1 TIEMPO DE FIJACIN.

QUMICA DE LA FIJACIN

FIJACIN TISULAR
FACTORES QUE AFECTAN AL ESTUDIO IHQ:

TIPO DE FIJADOR EMPLEADO TIEMPO TRANSCURRIDO ENTRE BIOPSIA Y FIJACIN DURACIN DE LA FIJACIN

DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO

TEJIDOS CORRECTAMENTE FIJADOS

Fijacin inmediata. Tiempo: 1212-24 horas. Fijador: formalina tamponada al 10%.

TEJIDOS MAL FIJADOS

Demora en la fijacin. Tiempo: <12 >24 horas - das Fijador: formalina no tamponada a > 10%.

FIJACIN TISULAR

FORMOL TAMPONADO NEUTRO AL 10%

VENTAJAS
RPIDA PENETRACIN NO ENDURECE EL TEJIDO ESCASA RETRACCIN FIJADOR MS UNIVERSAL BARATO

INCONVENIENTES
ENMASCARAMIENTO Ag. Ag. FIJACIN EN EXCESO ES IRREVERSIBLE IHQ IRRITANTE PIEL Y MUCOSAS

FIJACIN TISULAR
QUMICOS RETICULACIN DE PROTENAS
FORMOL (TAMPONADO NEUTRO AL 10%) BOUIN (Formol 40% + cido pcrico 1.2% p/v) B5 (cloruro de mercurio, acetato sdico y formol 40%) GLUTARALDEHIDO (0.2% glutaraldehido y 2% paraformaldehido) paraformaldehido) DESHIDRATACIN TISULAR ETANOL (ALCOHOL ETLICO 7070-95%) ETANOL 90% /ACETONA 10% ACETONA 100%

FIJACIN TISULAR
FSICOS

CONGELACIN CRIODESECACIN O LIOFILIZACIN CRIOSUSTITUCIN

FIJACIN TISULAR
Deteccin de problemas y soluciones Fijacin parcial y no uniforme
Tincin heterogenea (areas + yy-)

Control tiempo fijacin Volver a fijar

Sobrefijacin Irreversible prolongar desenmasc. desenmasc. Elevada temperatura fijacin o procesamiento Disminucin o prdida antigenicidad parafina< 58C prolongar desenmasc. desenmasc. Endurecimiento del tejido
Disminucin o prdida inmunorreactividad Dificultad cortes 4 m

Control tiempo fijacin

TCNICAS DE DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO.

Francisco J. OValle Ravassa Dpto. Anatoma Patolgica UGR

DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO

TEJIDOS FIJADOS POR CONGELACIN TEJIDOS FIJADOS E INCLUDOS EN PARAFINA

DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO

MTODOS Saponinas y detergentes Enzmas proteolticas Calor

DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO

MTODOS Saponinas y detergentes

Mecanismo: Emulsin lpidos de membrana Tipos: Saponina Triton X-100 Twen 20

DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO

MTODOS Enzmas proteolticas

Mecanismo: Rotura de enlaces Tipos: Tripsina Proteinasa K Pronasas Saponina Neuraminidasa Ficina etc.

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J Histochem Cytochem. 1991 Jun;39(6):741-8.

Shi SR, Key ME, Kalra KL. BioGenex Laboratories, San Ramon, California

Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections.
We describe a new approach for retrieval of antigens from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues and their subsequent staining by immunohistochemical techniques. This method of antigen retrieval is based on microwave heating of tissue sections attached to microscope slides to temperatures up to 100 degrees C in the presence of metal solutions. Among 52 monoclonal and polyclonal antibodies tested by this method, 39 antibodies demonstrated a significant increase in immunostaining, nine antibodies showed no change, and four antibodies showed reduced immunostaining. In particular, excellent immunostaining results were obtained with a monoclonal antibody to vimentin as well as several different keratin antibodies on routine formalin-fixed tissue sections after pre-treatment of the slides with this method. These results showed that after antigen retrieval: (a) enzyme predigestion of tissues could be omitted; (b) incubation times of primary antibodies could be significantly reduced, or dilutions of primary antibodies could be increased; (c) adequate staining could be achieved in long-term formalin-fixed tissues that failed to stain by conventional methods; and (d) certain antibodies which were typically unreactive with formalin-fixed tissues gave excellent staining.

DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO

MTODOS Calor
Posibles mecanismos:
Suurmeijer and Boon. Eur J Morphol 31:14431:144-50, 1993.

Rotura de enlaces cruzados crosscross-Links entre eptopos de la molcula o con otras protenas inducidos por la formalina. formalina. Extraccin de protenas bloqueadoras difusibles. difusibles. Precipitacin de protenas. Rehidratacin de la seccin tisular que mejora la penetracin del del Ac. Ac.

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Principio del mtodo de desenmascaramiento del epitopo por altas temperaturas

Principio del mtodo de desenmascaramiento del epitopo por altas temperaturas

R-CH2-R

PUENTES DE METILENO

PUENTES DE METILENO

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DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO

MTODOS Calor
Mecanismo: Rotura de enlaces cruzados crosscross-Links HORNO DE MICROONDAS OLLA PRESURIZADA AUTOCLAVE MTODOS CONVENCIONALES DE CALOR CALOR HMEDO (VAPORIZADORES) MDULO PT

Desenmascaramiento antignico por tratamiento con alta temperatura: Olla presurizada. 1-1:30 min.

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Desenmascaramiento antignico por tratamiento con alta temperatura: Microondas.

Desenmascaramiento antignico por tratamiento con alta temperatura: Bao termorregulado.

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Desenmascaramiento antignico por tratamiento con alta temperatura: Autoclave.

120C

Autoclavado (120C, 10 min.)

Mdulo PT

98C 20min

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DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO

FACTORES DETERMINANTES: TEMPERATURA TIEMPO COMPOSICIN QUMICA DE LA SOLUCIN pH SOLUCIN TAMPN VOLUMEN DE TAMPN

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DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO

TIPOS DE SOLUCIONES Y TAMPONES EMPLEADOS: Agua destilada Soluciones con sales pesadas EDTA 1 Mm pH 8 Tampn fosfato (PBS) Tampn citrato 0.01 M pH >6 Tampn TrisTris-ClH pH 9 Tampn TrisTris-ClH + urea pH 9.5

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DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO

CITOLOGAS BIOPSIAS AUTOPSIAS

MTODO INMUNOCITOQUMICA

CD45

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MTODO INMUNOCITOQUMICA

CITOQUERATINA CAM5.2
Fijacin Desteir: (Ac. Oxlico 0.5%) Permeabilizar: Tween 20 Sin Desenmascarar Tcnica inmunocitoqumica

Mdulo PT

98C 20 min.

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H&E

IHQ

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UMFIX

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FIGURE 1. Infiltrating ductal carcinoma of breast, formalin-fixed, RTP-processed (left panel), UMFIX-exposed, RTP-processed (right panel). Hematoxylin and eosin (top), ER-1D5 (middle), and E-cadherin (bottom). The intensity of reactions is comparable.

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Normal prostate gland, UMFIX-exposed, RTP-processed. Hematoxylin and eosin (top). Basal cells are positive for the high-molecular-weight cytokeratin (middle) and p63 (bottom).

HOPE = Hepes-Glutamic acid buffer mediated Organic solvent Protection Effect

Amino acids and glucose together with an organic buffer, acetone as the only dehydrating agent and pure paraffin. Much weaker denaturation of proteins and nucleic acids.

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Schematic of a head and neck cancer tissue microarray (TMA) containing eight differently fixed tumor samples from one patient stained for EGFR. Tissue samples from each tumor were alternatively fixed as indicated. After paraffin embedding, tumor specimens were cut into 5-m sections and stained with H&E to define representative tumor regions. For preparation of TMAs, tumor cylinders were punched from the donor blocks and placed on 25 x 35-mm paraffin blocks. Consecutive paraffin slides of each TMA were serially cut and stored in the dark at RT for follow-up IHC staining.

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RIONES DE CERDO! AL JEREZ

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AUTOLISIS RENAL: RECUPERACIN DE ANTGENOS PARA INMUNOHISTOQUMICA

AUTOLISIS RENAL: RECUPERACIN DE ANTGENOS PARA INMUNOHISTOQUMICA

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LOS MEJORES FIJADORES JEREZANOS

EL FINO JEREZANO
Vino con crianza biolgica Graduacin media 15 Levadura Saccharomyces en flor Consumen etanol, cido actico y glicerol Producen ACETALDEHDO (ETANAL) Dependiendo de la bodega entre 300-400 mg/litro (30-40 mg%) Glutaraldehdo al 2-4%

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ESTUDIO MORFOLGICO REGLADO

DEMOSTRACIN DE LA HIPTESIS

RECUPERACIN ANTIGNICA

Etanal 10%

Formalina 10%

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DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO
HORNO DE MICROONDAS
Hornos de microondas domsticos vs. de laboratorio. Preparaciones en recipientes de plstico. No introducir material metlico. 600600-700 w de potencia. Repartido en varios tiempos (5(5-5, 1010-10)

Protocolo:
Solucin tampn: 500 ml tampn citrato (cestilla de 10 portaobjetos) portaobjetos) Potencia: 700 w tiempo: dos periodos de 5 minutos (comprobar ebullicin) dejar atemperar entre cada periodo y al final (durante 1515-20 minutos)

DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO

HORNO DE MICROONDAS Caractersticas y precauciones:

Fuerte evaporacin del tampn. No utilizar recipientes de poca capacidad (jarras coplin). coplin). Falta de homogeneidad de temperatura. Difcil de estandarizar. Mantener constante volumen de tampn y n de preparaciones. Portas especiales para inmunohistoqumica.

La intensidad de la inmunotincin baja si no se deja atemperar El enfriamiento brusco desprende las secciones histolgicas. Algunos detalles morfolgicos pueden perderse con el MO.

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VENTAJAS DE OPERAR EMPLEANDO HORNO MICROONDAS RAPIDEZ DE RESULTADOS CALIDAD DE RESULTADOS REPRODUCIBILIDAD Y CONSISTENCIA SEGURIDAD DE LOS TCNICOS DE LABORATORIO

APLICACIONES FUNDAMENTALES DEL PROCESAMIENTO EN HORNO MICROONDAS

1) BIOPSIAS PARA VALORAR LA IDONEIDAD DE LOS RGANOS A TRASPLANTAR 2) BIOPSIAS POSTRASPLANTE 3) CONFIRMACIN RPIDA DE BIOPSIAS INTRAOPERATORIAS 4) BIOPSIAS DE MXIMA URGENCIA (En nefropatologa, nefropatologa, glomerulonefritis rpidamente progresiva)

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DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO
OLLA PRESURIZADA Olla presurizada ultrarrpida. Preparaciones en recipientes de plstico o cristal. Un nico tiempo (1(1-1:30 min.) Ms constante y eficiente el desenmascaramiento Necesita menos tiempo. Ms barato y reproducible. Uniformidad en la temperatura. Mejores resultados que con MO. No existe evaporacin. No influye el n de portaobjetos.

DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO
OLLA PRESURIZADA Protocolo:
Solucin tampn: 2 L tampn citrato (cestilla portaobjetos) Potencia: calentar previamente el tampn con la olla abierta (no (no ebullicin) tiempo: una vez cerrado espera la subida de al vlvula (dos ranura) ranura) mantener a fuego lento 11-1:30 min. Enfriar la olla bajo el grifo Esperar a que pierda presin. Dejar atemperar (durante 1010-15 minutos).

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DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO

AUTOCLAVE Ventajas: Mejor calidad morfolgica de las secciones tisulares. Mayor inmunorreactividad. menor tincin de fondo background. Mayor reproducibilidad.

DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO

AUTOCLAVE Protocolo:
Solucin tampn: tampn citrato (jarras coplin portaobjetos) Potencia: 120C tiempo: 10 min. Esperar a que pierda presin. Dejar atemperar e agua de stilada hasta TA (durante 1010-15 minutos).

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DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO
MTODOS CONVENCIONALES DE CALOR Esterilizador de biberones
Caractersticas: Control: No tiene selector de temperatura. Temperatura: La reaccin de desenmascaramiento a 100C Tiempo: Dos periodos de 10 minutos. Tampn: secciones en jarras coplin con tampn citrato Agua hasta la seal rodeando a la jarra coplin. coplin.

DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO

CALOR HMEDO (VAPORIZADOR ALIMENTARIO)

Caractersticas: Control: No tiene selector de temperatura. Temperatura: La reaccin de desenmascaramiento a 97C Tiempo: Un periodo de 20 minutos. Tampn: secciones en jarras coplin con tampn citrato.

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DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO

Efectos adversos:
Desprendimiento total o parcial de la seccin histolgica. Prolongado desenmascaramiento puede disminuir la antigenicidad. Puede dificultar la contratincin con algunos colorantes Soluciones con pH muy cido pueden ocasionar falsos positivos.

DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO

CONCLUSIONES
Los mejores resultados se obtienen con la olla presurizada, autoclave autoclave y horno de microondas. La solucin de desenmascaramiento ms ptima es el Citrato trisdico trisdico 10 mM pH (6(6-7). El pH de la solucin tampn parece ms crtica que su composicin composicin Las variaciones en la molaridad del tampn influyen en la eficacia eficacia del desenmascaramiento antignico.

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DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO

ELECCIN DE LA SOLUCIN TAMPN INFLUENCIA DE LOS CAMBIOS DE MOLARIDAD INFLUENCIA DEL CAMBIO DE pH DEL TAMPN

DESENMASCARAMIENTO ANTIGNICO
DESPEGAMIENTO SECCIN HISTOLGICA SECADO DE PREPARACIONES SECCIONES: ESTUFA 37C 16 HORAS. ESTUFA 60C 1 HORA PORTAOBJETOS SILANIZADOS TIPO DE TEJIDO: DESPEGAMIENTO PARCIAL O TOTAL TEJIDOS MUY FIBROSOS TEJIDOS ADIPOSO ABUNDANTE TIEMPO DESENMASCARAMIENTO

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