UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa

LABORATORIO 1 Separacin de Protenas por Cromatografa de Exclusin Molecular.

Introduccin Para estudiar la fun cin o las propiedades de un a protena, co mo p or ejemplo su secu encia, actividad, o estructura, es de gran importancia obtenerla como una especie pura. Los mtodos habitualmente utilizados en la purificacin de protenas, se basan algunas de las caractersticas de stas, incluyendo su tamao, carga o capacidad de unin. El con junto de m todos que tienden a separar protenas pr ovenientes de u n extracto es denominado f raccionamiento, entre los q ue destacan la s cromatografas e n c olumna. Los mtodos cromatogrficos habitualmente u tilizados en e l estudio de pro tenas so n las cromatografas de exclusin molecular o filtracin en gel, de intercambio inico, de afinidad y el HPLC. En el presente prctico se nos presenta como objetivo la separacin de protenas contenidas en una m ezcla, m ediante una crom atografa de exclusin m olecular, utiliza ndo como fase estacionaria Sephadex G75. Una de estas protenas es la fosfatasa cida de germen de trigo. Procedimiento Experimental. 1.- Preparacin de la columna. Se montar una columna de Sephadex G-75. Coloque un pedazo de lana de vidrio en el fondo de la columna de vidrio. Cierre la llave de paso de la columna y llnela con agua destilada. Posteriormente, abra la llave de paso y deje escurrir el agua hasta llegar a la mitad de la columna. De esta forma evitar la formacin de burbujas a la salida de la columna. Agregue la su spensin d e Sephadex G-7 5 y d eje sedimentar. Posteriormente, abra el flujo de la c olumna y c ontine a gregando S ephadex hasta f ormar u na c olumna empaquetada de 10 a 12 cm. Equilibre la columna hacindole pasar 2 volmenes de agua.

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa 2.- Sembrado y elucin de la muestra. Se utilizarn dos muestras. La primera de ellas, una solucin de Azul Dextrano, y la segunda una mezcla que contiene albmina srica de bovino (BSA; 2mg/mL), fosfatasa cida de germen de trigo (2mg/mL), y citocromo C (1mg/mL). Eluya el agua de la columna hasta que la superficie del gel est a punto de secarse. Con una micropipeta agregue 500 L de muestra. Eluya muy lentamente, hasta que la muestra haya ingresado completamente en el gel. Agregue agua a la columna. Comience la elucin de la muestra, colectando fracciones de 1 mL en tubos eppendorf.

3.- Confeccin del cromatograma. En papel milimetrado, se confeccionarn los pe rfiles de elucin de protenas obtenido. Mida la absorbancia de cada una de las fracciones colectadas a 280 y 550 nm, usando eluyente como blanco. Grafique Abs v/s nmero de fraccin. Interprete los resultados o btenidos, y guarde fracciones rep resentativas para los mximos. No olvide guardar un mnimo como control negativo..

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa

LABORATORIO 2 Determinacin de la Concentracin de Protenas por el Mtodo de Bradford

Introduccin Se han descrito n umerosos m todos q ue permiten det erminar la c oncentracin de protenas, todos ellos presentan ventajas y desventajas. La eleccin del mtodo depender de la n aturaleza de la prote na, la nat uraleza de lo s otros componentes en la m uestra o la sensibilidad o sencillez deseadas. Los mtodos ms tradicionalmente usados se basan en diferentes propiedades qumicas y fsicas de las protenas., sie ndo l os principales los e nsayos de B iuret, L owry y Bradford. Este ltimo se b asa en la p ropiedad del co lorante azul d e coomassie G- 250 d e unirse a las protenas, presentando un mximo de absorcin a 595 nm. La coloracin es p roporcional a la concentracin de protenas, obtenindose un comportamiento lineal en el rango de 0 a 30 g de protenas. Anteriormente, fue determinado mediante el mtodo de absorcin UV la presencia de mximos de absorbancia a 280 nm en l as fra cciones c olectadas e n la separacin cromatogrfica. El objetivo del presente prctico ser c alcular la concentracin de p rotenas presentes en las fracciones ms importantes. Procedimiento Experimental. 1.- Elaboracin de una curva de calibracin. Se trabajar a partir de una solucin stock de BSA de c oncentracin 1 mg/mL. El rea ctivo de Bra dford d isponible e s com ercial, y se utilizar en una dilucin 1:5. Disponga de 10 tubos eppendorf, los cuales contendrn 0, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40 y 50 g de BSA. Enrase a un volumen final de 50 L con agua destilada. Agregue 950 L de reactivo de Bradford. Mezcle y deje esperar por 5 minutos. Mida absorbancia a 595 nm. Grafique en un papel milimetrado los datos obtenidos y trace la rec ta correspondiente al rango lineal.

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa 2.- Determinacin de la concentracin de protenas de la muestra. Para la m edicin de protenas, U d deber seleccionar las fracciones correspondientes a lo s m ximos de su cromatograma. Tambin ser deseable utilizar un mnimo. En tubos eppendorf agregue 10 L la muestra y enrsela a 50 L con agua destilada. Repita procedimiento anterior. Recuerde que los valo res de absorbancia obtenidos al medir las muestras deben entrar en el rango lineal de la curva de calibracin. De no ser as, plantese las soluciones al problema.

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa

LABORATORIO 3 Separacin Electrofortica de Protenas en Geles de Poliacrilamida en Condiciones Desnaturantes

Introduccin Una molcula con carga neta posee la capacidad de poder mov erse a t ravs de un campo electrico. Es te fenmeno, denominado e lectroforesis, es am pliamente u tilizado para la separacin de diversas macromolculas, como protenas, DNA y RNA. Sin embargo, esta tcnica no es utilizado para la purificacin de grandes cantidades de protenas; mas bien se utiliza como m todo ana ltico, que nos per mitir separar y visual izar el nm ero de protenas, y p or e nde, el g rado d e pureza de u na m uestra. Este o bjetivo e s de gra n importancia a la hor a de d eterminar eficiencia d e u n pr oceso de fraccionamiento de protenas. Otra v entaja que nos p roporciona esta t cnica es qu e no s p ermite estimar propiedades de la protenas como su punto isoelctrico y su masa molecular relativa. En experiencias anteriores, Ud ha separado protenas mediante una tcnica cromatogrfica y posteriormente ha c uantificado la ca ntidad de stas mediante el m todo de Bradford. En el presente prctico, se buscar verificar el grado de pureza de s us fracciones, a la v ez de determinar las protenas pre sentes e n cada una de ell as, v alindose del m todo d e electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturantes. Procedimiento Experimental 1.- Preparacin del gel de poliacrilamida. El g el a preparar est formado p or u n gel separador (i nferior) y un gel c oncentrador (superior). Para la preparacin de stos rea lice las siguiente mezclas: Gel Separador (5 mL poliacrilamida 10%): 1, 9 mL H2O 30% mezcla Acrilamida 1,7 mL 1,5 M Tris (pH 8,8) 1,3 mL 10% SDS 0 ,05 mL 10 % Persulfato de Amonio 0,05 mL TEMED 0 ,002 mL

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa Gel Concentrador (2 mL poliacrilamida 5%): H 2O 1, 4 mL 30% mezcla Acrilamida 0,33 mL 1,0 M Tris (pH 6,8) 0,25 mL 10% SDS 0 ,02 mL 10 % Persulfato de Amonio 0,02 mL TEMED 0 ,002 mL Antes de armar el siste ma de vidrios (se gn la s instrucciones del p rofesor o de l ayudante), lvelos con agua y etanol. Vierta la solucin del gel separador, hasta aproximadamente de la capacidad de los vid rios. Po steriormente, a gregue m L de etano l o isop ropanol. Un a vez gelificada la solucin, retire el alcohol. Vierta la solucin del gel separador, y coloque la peineta antes su gelificacin.

2.- Preparacin de la muestra. De cada mu estra se carga rn 20 L po r bolsillo, que contengan 1 y 5 g d e protenas. Ad ems d e su s muestras, se d ispondr d e una so lucin patrn de BSA (1mg/mL), de la cual se cargarn 1 g. En tubos eppendorf coloque sus muestras, con buffer de carga y complete con agua hasta 2 5 L (la proporcin de m uestra y b uffer de carga de pender de la concentracin de este ltimo). Coloque sus muestras en agua hirviendo por 5 minutos. Posteriormente ponga los tubos en hielo, hasta cargar las muestras.

3.- Carga y corrida de la muestra. Coloque el gel en la cmara de electroforesis, segn instrucciones, y posteriormente agregue buffer de corrida (25 mM Tris, 250 mM glicina, 0,1% SDS). Con ayuda de una jeringa Hamilton, cargue 20 L de cada muestra. Cargue 5 L del estndar de peso molecular. Conecte la cmara de electroforesis a la fuente de poder y aplique 180 V. Una vez finalizada la corrida electrofortica, retire el gel y corte el gel separador. El gel ser fijado y teido en una solucin de cido actico en metanol, que contiene azul de coomasie (Comercial). El ayudante le facilitar una fotografa de su gel, a partir de la cual Ud. determinar los tamaos relativos de cada muestra resuelta.

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa

LABORATORIOS 4 y 5 Determinacin de las Propiedades Cinticas de la Enzima Fosfatasa Acida de Germen de Trigo
Introduccin Las enzimas son protenas con un gran poder cataltico y un alto grado de especificidad por su sustrato. Estas protenas posee n gran i mportancia en todo s lo s procesos b ioqumicos. Actuando e n form a concer tada, ca talizan cientos d e reacciones que ll evan, entre otros, al metabolismo de nutrientes, la conservacin o transformacin de energa o la biosntesis de macromolculas. La reaccin ms simple que pueden catalizar las enzimas est representada por la ecuacin:

Donde E, S y P, rep resentan a la enzima, al sustrato y al producto, respectivamente, mientras que ES y EP representan los complejos transitorios enzima-sustrato y enzima-producto. Para ca racterizar el funcionamiento de una enzima, es i mportante determinar el como la s condiciones am bientales, el pH y la t emperatura, afectan su ca pacidad c ataltica. En este trabajo prctico se trabajar c on la fo sfatasa cid a de germen d e tr igo, la cual c ataliza la hidrlisis de f osfatos m onosteres, con li beracin de fosfato inorgnico, s egn l a siguiente reaccin:

Dentro de los objetivos a c umplir, se encuentran el determinar las condiciones ptimas de trabajo d e l a f osfatasa cida de germen de tr igo, a s c omo los parmetros ci nticos de sta, comparando la s activid ades especficas tanto de l a en zima c omercial c omo l a purificada en prcticos anteriores. En e ste en sayo, se u sar un sustrato arti ficial, el p- nitrofenil f osfato (NPP). El grado de hidrlisis de ste se d eterminar espe ctrofotomtricamente c uantificando el p -nitrofenol liberado, que en solucin alcalina, absorbe fuertemente a 405 nm.

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa Procedimiento Experimental. 1.- Elaboracin de una curva de calibracin de p-nitrofenol. Prepare 6 tubos que contengan 0, 125, 250, 500, 750 y 1000 L de una solucin de pnitrofenol 60 M (en NaOH 0,05M). Enrase cada uno de los tubos a 1 mL con NaOH 0,05 M. Para cada uno de los tubos lea la absorbancia a 405 nm. Verifique que su blanco sea el apropiado. En papel milimetrado grafique la curva obtenida

2.- Determinacin de las condiciones ptimas para la actividad de la fosfatasa cida de germen de trigo. Se verificar la o btencin de producto a tie mpos fijos e n diferentes condiciones de pH y temperatura. Prepare un tubo qu e con tenga 200 L de a mortiguador y 200 L d el sustrato p nitrofenil f osfato (pNPP 2, 5 m M, dilud o e n el a mortiguador correspondiente), por cada temperatura de ensayo (4, 37 y 60C). Preincube cada tubo a la temperatura de ensayo por 2-5 minutos. Prepare una di lucin de enzima qu e sea 1:20 con respecto al stock (1 0 mg/ml) en el amortiguador respectivo. Agregue 100 L de la dilucin de la enzima (1:20) a cada tubo de reaccin. Mezcle e inmediatamente saque un a alcuota d e 100 L y dej e el tu bo d e reacc in a la temperatura correspondiente. Adicione la alcuota a un tubo que contenga 900 L de una solucin de NaOH 0,05 M. Guarde el tubo en oscuridad. Este es el control denominado tiempo cero de reaccin. Al cabo de 5, 10 y 20 minutos de in cubacin, retire nuevas alcuotas del tubo d e reaccin y adicinelas a respectivos tubos que contengan 900 L de NaOH 0,05 M. Determine la absorbancia a 405 nm de cada uno de los tubos. Verifique que su blanco sea el apropiado. Calcule los moles de Pi formados en cada tubo a diferentes tiempos y la velocidad (moles/min). Grafique en papel milimetrado la actividad enzimtica con respecto a la temperatura y el pH de reaccin.

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa 3.- Determinacin de los parmetros cinticos de la fosfatasa cida de germen de trigo y el efecto del fosfato en la reaccin. Tras determ inar los parmetros ptimos de pH y temperatura para el funcionamiento de la enzima, aplique stos en la determinacin de K m y Vmax para la enzima comercial. Prepare un serie de 5 tubos que contengan 0, 50, 100, 150 y 200 L de p-NPP 2,5 mM y e nrselos a 4 00 L con el a mortiguador ap ropiado. Re pita esta seri e, pero adicionando adems 5, 10 o 20 L de fosfato de sodio (50 mM). Preincube los tubos a la temperatura apropiada por 2-5 minutos. Agregue 100 L de la dilucin de la enzima (1:20) a cada tubo de reaccin. Mezcle e inmediatamente saqu e una al cuota de 100 L y a dicinela a un t ubo que contengan 900 L de NaOH 0,05 M. Seleccione 2 tiempos de reaccin (5, 10, 20 o 30 minutos) y retire nuevas alcuotas del tubo de rea ccin, adi cionndoselas a respectivos t ubos que co ntengan 9 00 L de NaOH 0,05 M. Determine la absorbancia a 405 nm de cada uno de los tubos. Confeccione las curvas pertinentes tanto en p resencia como en ausencia de fo sfato y determine los valores de Km y Vmax.

4.- Determinacin de los parmetros cinticos de la fosfatasa cida de germen de trigo purificada en los prcticos anteriores. Trabaje con las mismas c ondiciones d e pH y temperatura utilizadas anteriormente y d etermine los valores de K m y Vmax para una fraccin de su enzima purificada. Prepare un serie de 5 tubos que contengan 0, 50, 100, 150 y 200 L de p-NPP 2,5 mM y enrselos a 400 L con el amortiguador apropiado. Preincube los tubos a la temperatura apropiada por 2-5 minutos. Agregue a cada tubo de reaccin 100 L de su e nzima dilu ida en el amortiguador apropiado, dejndola a un a c oncentracin 0,5 mg /mL (prot ena tot al). Mezcle e inmediatamente saqu e una al cuota de 100 L y a dicinela a un t ubo que contengan 900 L de NaOH 0,05 M. Incube los t ubos a los mismos tiempos ant eriormente ut ilizados y retir e nu evas alcuotas del tub o de reaccin, a dicionndoselas a respectivo s tubos que contengan 900 L de NaOH 0,05 M. Determine la absorbancia a 405 nm de cada uno de los tubos. Determine los valores de Km y Vmax. Calcule la actividad espcfica y comparela con la obtenida para la enzima comercial.

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE Facultad de Qumica y Biologa Departamento de Biologa

Soluciones. Tampn Citrato (citrato de sodio 100mM; EDTA 150mM pH 5.0). Tampn PBS (NaCl 137mM, KCl 2,6mM, NaHPO4 8mM, KH2PO4 1,8mM, pH 7,4). Tampn Tris (Tris 100mM, pH 9,5) Solucin NaOH 0.05 M Solucin de p-nitrofenol 60 M en NaOH 0,05M. Solucin stock de p-nitrofenil fosfato de sodio 25 mM en agua. Solucin stock de fosfatasa cida 10mg/ml. Solucin de Fosfato de Sodio 50 mM en agua.