Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria

Embrapa Instrumentao Agropecuria

Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

Protocolos de anlises para polpa de aa: um guia prtico de consulta

Tatiane Regina Albarici Danieli Melo de Freitas Jos Dalton Cruz Pessoa

Embrapa Instrumentao Agropecuria So Carlos, SP 2009

Exemplares desta publicao podem ser adquiridos na: Embrapa Instrumentao Agropecuria Rua XV de Novembro, 1452 Caixa Postal 741 CEP 13560-970 - So Carlos-SP Fone: (16) 2107 2800 Fax: (16) 2107 2902 http://www.cnpdia.embrapa.br E-mail: sac@cnpdia.embrapa.br Comit de Publicaes da Unidade Presidente: Dr. Luiz Henrique Capparelli Mattoso Membros: Dra. Dbora Marcondes Bastos Pereira Milori, Dr. Joo de Mendona Naime, Dr. Washington Luiz de Barros Melo Valria de Ftima Cardoso Membro Suplente: Dr. Paulo Srgio de Paula Herrmann Junior Supervisor editorial: Dr. Victor Bertucci Neto Normalizao bibliogrfica: Valria de Ftima Cardoso Tratamento de ilustraes: Valentim Monzane Capa: Manoela Campos Editorao eletrnica: Manoela Campos 1a edio 1a impresso (2009): tiragem 300

Todos os direitos reservados. A reproduo no-autorizada desta publicao, no todo ou em parte, constitui violao dos direitos autorais (Lei no 9.610). CIP-Brasil. Catalogao-na-publicao. Embrapa Instrumentao Agropecuria A327p Albarici, Tatiane Regina Protocolos de anlise para polpa de aa: um guia prtico de consulta./ Tatiane Regina Albarici, Danieli Melo de Freitas, Jos Dalton Cruz Pessoa. So Carlos, SP: Embrapa Instrumentao Agropecuria, 2009. 48 p. ISBN 978-85-86463-19-8. 1. Aa. 2. Protocolos. I. Freitas, Danieli Melo de. II. Pessoa, Jos Dalton Cruz. III. Ttulo. CDD 21 ED 634.6 004.62 Embrapa 2009

Autores
Tatiane Regina Albarici Doutora em Cincias-rea Qumica Orgnica Ps-doutoranda Embrapa Instrumentao Agropecuria So Carlos SP tatianealbarici@gmail.com Danieli Melo de Freitas Graduada em Qumica Mestranda pelo PPG Biotecnologia/UFSCar Embrapa Instrumentao Agropecuria So Carlos SP danielifreitas@yahoo.com.br Jos Dalton Cruz Pessoa Doutor em Cincias Pesquisador A Embrapa Instrumentao Agropecuria R. XV de Novembro 1452, So Carlos SP, CEP 13.560-970, dalton@cnpdia.embrapa.br

Apresentao

O aa se popularizou como um alimento energtico e saudvel cuja polpa de sabor extico vem ganhando espao no mercado internacional. A exportao da polpa congelada aumentou com o interesse no potencial uso do aa como nutracutico devido a sua atividade antioxidante, atribuda aos compostos fenlicos. Atualmente uma grande diversidade de mixers de aa est disponvel no mercado. O Laboratrio de Instrumentao em Ps-colheita (LIPCo) da Embrapa Instrumentao Agropecuria tem um programa de estudo da cadeia do aa: projetos sobre a anatomia do frutos; seu tempo de vida til; mtodos de anlise da bebida; tcnicas de processamento e o aproveitamento do resduo da agroindstria. A aproximao do laboratrio com indstrias processadoras de aa do Nordeste Paraense, a maior regio produtora, indicou a necessidade de padres de qualidade e a busca por polpas com atividade antioxidante comprovada uma necessidade cada vez mais frequente na agroindstria do aa. A garantia da qualidade um dos fatores que agrega valor ao produto. A idia deste guia prtico nasceu da necessidade de um documento simples e didtico contendo protocolos de anlise da bebida de aa que possam ser utilizados nos laboratrios de controle de qualidade das indstrias, em laboratrios de pesquisa ou no desenvolvimento de novos produtos.

Dr. lvaro Macedo da Silva Chefe Geral Embrapa Instrumentao Agropecuria

Informaes de segurana

Todos os protocolos descritos neste guia fazem uso de reagentes qumicos com diferentes graus de periculosidade. Para a manipulao correta dos reagentes de extrema importncia a consulta dos rtulos e das fichas de segurana que acompanham os reagentes ou mesmo que podem ser acessadas atravs da internet nos sites das empresas que fornecem os mesmos. O uso dos equipamentos de proteo individual (EPIs) como luvas e mscaras adequadas para cada reagente, culos de segurana, sapatos apropriados e avental de fundamental importncia em qualquer laboratrio qumico. Os produtos ou reaes que liberam vapores como devem ser manipulados em capelas.

Sumrio
Introduo ............................................................................................ 13 Protocolo 1 - Teor de antocianinas totais ............................................... 15 Protocolo 2 - Polifenis totais ................................................................ 21 Protocolo 3 - Atividade enzimtica ........................................................ 25 Protocolo 4 - Atividade antioxidante pelo mtodo orac .......................... 33 Protocolo 5 - Anlise de antocianinas por cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE)................................................................................... 39 Protocolo 6 - Anlise de acares ......................................................... 43

Lista de abreviaturas
MM = massa molecular mL = microlitros FD = fator de diluio v/v = relao volume do soluto por volume da soluo l = comprimento de onda lvis-max= comprimento de onda mximo na regio do visvel e = absortividade molar SM = soluo me S = soluo U = unidade de atividade AUC = rea sobre a curva CLAE = cromatografia lquida de alta eficincia nm = nanmetros

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Introduo
O consumo do aa comeou a ser ampliado no final da dcada de 1990 com a industrializao e congelamento da polpa vendida aos mercados nacional (especialmente Rio de Janeiro, So Paulo) e internacional. A procura crescente do aa deve-se ao poder antioxidante dos compostos fenlicos, dentre eles as antocianinas, que tambm so responsveis pela cor caracterstica da polpa. O aumento da demanda tambm traz a necessidade de mtodos de monitoramento da qualidade, tanto do produto a ser consumido in natura quanto do produto a ser reprocessado. Em 2000 foi publicada uma instruo normativa no Dirio Oficial da Unio com o intuito de estabelecer os padres mnimos de identidade e qualidade para a polpa de aa (produto sem adio de gua) e para o aa (fino, mdio ou grosso) destinados ao consumo como bebida, onde foram estabelecidos valores mximos e mnimos para propriedades fsico-qumicas como slidos totais, lipdeos totais, carboidratos totais e protenas e acares totais. Este guia descreve mtodos de anlises qumicas adaptadas ao aa e polpa de aa. Os autores tm a inteno de disponibilizar um de guia de anlise com mtodos que podem ser facilmente reproduzidos, tanto no meio acadmico quanto nos laboratrios de controle de qualidade das indstrias processadoras. Os protocolos foram desenvolvidos a partir de mtodos amplamente difundidos na literatura e tem aplicao em diferentes fases da cadeia, como no processamento, transporte e armazenamento da polpa, e no desenvolvimento de novos produtos. Nos protocolos 1 e 5 esto detalhados procedimentos para a avaliao dos teores de antocianinas totais, compostos responsveis pela cor caracterstica do aa que, juntamente com os demais polifenis, so responsveis pelo potencial antioxidante da polpa. A anlise dos polifenis totais, descrita no protocolo 2, juntamente com os procedimentos descritos nos protocolos 1 e 5, monitoram a presena de compostos com comprovada atividade antioxidante. Esta
BRASIL. Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Instruo normativa n. 01, de 7 de Janeiro de 2000. Regulamento Tcnico Geral para Fixao dos Padres de Identidade e Qualidade para Polpa de Fruta. Dirio Oficial da Unio, 10 janeiro 2000. Seo 1, p. 54-58.

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capacidade pode ser diretamente avaliada pelo mtodo ORAC (Capacidade de Absoro de Radicais de Oxignio) descrita no protocolo 3. O protocolo 4 descreve a avaliao de atividade das enzimas peroxidase e polifenoloxidase, responsveis pela elevada perecibilidade do aa pois atuam na oxidao dos compostos fenlicos. Sua atividade um indcio da velocidade de degradao dos mesmos e servem como parmetro para avaliao da etapa de pasteurizao da polpa. Alm disso, a avaliao dos teores de acares descrita no protocolo 6 til para a averiguao do enquadramento da polpa nas normas estabelecidas pelo Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento.

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Protocolo 1 - Teor de Antocianinas Totais

Reagentes - Cloreto de potssio (KCl) MM=74,551g/mol Observaes: Se inalado levar a vtima para local arejado. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas. Se ingerido fazer com que a vtima beba gua (2 copos no mximo). - Acetato de sdio (CH3CO2Na.3 H2O) MM=136,08 g/mol Observaes: Se inalado levar a vtima para local arejado. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas. Se ingerido fazer com que a vtima beba gua (2 copos no mximo). - Metabissulfito de potssio (K2S2O5) MM=222,32 g/mol Observaes: contato com cidos libera gases txicos. Irritante para o sistema respiratrio. Risco de danos srios no contato com os olhos. Se inalado levar a vtima para local arejado, chamar um mdico. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas, chamar imediatamente um oftalmologista. Se ingerido fazer com que a vtima beba gua (2 copos no mximo) e chamar um mdico. - cido clordrico (HCl) MM=36,4610g/mol Observaes: Causa queimaduras, manipular usando luvas. Irritante ao sistema respiratrio, manipular em capela ou utilizando mscara.

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Se inalado levar a vtima para local arejado, chamar um mdico. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia aplicar levemente polietileno glicol 400. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas, chamar imediatamente um oftalmologista. Se ingerido fazer com que a vtima beba gua (2 copos no mximo), evitar vmito (risco de perfurao) e chamar um mdico (no tentar neutralizar). Materiais -Espectrofotmetro UV-vis -Agitador magntico -Balana analtica -Medidor de pH -Pipetas de 100-1000 mL e de 1000-5000mL Preparo das Solues Tampo cloreto 0,025 mol/L pH=1 Pesar 1,86 g Kcl e diluir em 980mL de gua destilada em um copo de Becker. Medir o pH e ajustar para 1,0 com HCl. Transferir para um balo volumtrico de 1L e completar o volume com gua destilada. Observao: A soluo estvel mesmo quando mantida a temperatura ambiente por alguns meses, porm o pH deve ser verificado antes do uso. Tampo acetato 0,4 mol/L pH=4,5 Pesar 54,43 g de CH3CO2Na.3 H2O e diluir em 960mL de gua destilada em um copo de Becker. Medir o pH e ajustar para 4,5 com HCl. Transferir para um balo volumtrico de 1L e completar o volume com gua destilada. Observao: A soluo estvel mesmo quando mantida a temperatura ambiente por alguns meses, porm o pH deve ser verificado antes de cada uso.

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Soluo de metabissulfito de potssio Pesar 1 g de metabissulfito de potssio (K2S2O5) transferir para um balo volumtrico de 5mL e completar com gua destilada. Observao: Este reagente deve ser preparado no mesmo dia das medidas. A mudana de colorao da soluo (de incolor para amarelo) pode contribuir com a absorbncia medida e interferir na quantificao. Preparo da Amostra: O preparo da amostra est diretamente ligado determinao do fator de diluio (FD) apropriado para as anlises. Este fator determinado pela diluio de uma quantidade conhecida de amostra em tampo cloreto pH=1,0 deixando-se em equilbrio a temperatura ambiente e protegida da luz por 30 minutos. Fazer a medida de absorbncia. Observao: para no exceder a capacidade tamponante da soluo tampo a amostra no deve exceder 20% do volume total.O fator de diluio ideal obtido quando o valor de absorbncia mxima na regio do visvel menor do que 1,0. O fator de diluio calculado dividindo-se o volume final da soluo pelo volume de amostra diludo. Diluies em srie devem ser consideradas no calculo do fator de diluio, por exemplo: para a soluo de aa preparada com proporo de 1 parte de polpa para 2 partes de gua (v/v) temos um fator de diluio de 3. Posteriormente se utilizarmos 0,5 mL desta soluo de aa e completarmos o volume para 10 mL de tampo pH= 1,0 teremos um segundo valor de fator de diluio de 20. Portanto para os clculos finais o Fator de diluio ser: DF = (3x20) = 60. Aps a determinao do fator de diluio preparar a amostra de acordo com os valores obtidos. Para polpa com 12% de matria seca (aa mdio): Medir 1 volume de polpa e adicionar 2 volumes de gua destilada. Deixar em agitao por 40 minutos. Centrifugar a soluo e separar o sobrenadante para anlise.

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1.1 - Antocianinas Monomricas - Mtodo do pH-Diferencial Anlises - Ligar o espectrofotmetro 30 minutos antes de fazer as medidas; - Utilizar gua destilada como branco; - Preparar as diluies da amostra: uma em tampo cloreto pH= 1,0 e outra em tampo acetato pH= 4,5 de acordo com o valor de fator de diluio previamente calculado; - Para polpa com 12% de matria seca (aa mdio): adicionar 500 mL da amostra a um balo volumtrico de 10 mL e completar com o tampo; - Deixar em equilbrio a temperatura ambiente e na ausncia de luz por 30 minutos; Observao: o tempo de equilbrio deve estar entre 15min e 1h aps a adio do tampo, pois tempos maiores tendem a aumentar os valores observados. - Acompanhar a absorbncia no comprimento de onda do visvel no qual a absorbncia mxima (lvis-max) e a 700nm (para corrigir o espalhamento de luz produzido por uma possvel turbidez da amostra); - Fazer as medidas em triplicata. Resultados e Expresso dos Resultados A concentrao das antocianinas totais ser calculada atravs da seguinte frmula:

C (mg / L) = [( Alvis-max - Al700 nm ) pH 1.0 - ( Alvis-max - Al700 nm ) pH 4.5 ] MM DF 1000 e -1

Onde a diferena dos valores de absortividade em pH= 1,0 e pH= 4,5 diretamente proporcional a concentrao de antocianinas, com o clculo baseado na cianidina-3-glicosdeo, com massa molecular (MM) de 449,2 g/mol e absortividade molar (e) de 26.900.

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1.2 - ndice de Degradao de Pigmento, Cor Polimrica e Browning Anlises - Ligar o espectrofotmetro 30 minutos antes de fazer as medidas; - Utilizar gua destilada como branco; - Preparar uma diluio da amostra com gua de acordo com o valor do fator de diluio previamente calculado; - Transferir 2,8 mL da amostra diluda para dois tubos de ensaio protegidos da luz; - Ao primeiro adicionar 0,2mL de soluo de metabissulfito de potssio e ao segundo 0,2mL de gua. Deixar equilibrar por 30 minutos; - Realizar as medidas de absorbncia a 420, lvis-max e a 700nm. Resultados e Expresso dos Resultados O clculo da densidade (DC) de cor feito atravs da frmula:

DC = ( A420 nm - A700 nm ) + Alvis-max - A700 nm DF

A cor polimrica (CP) das amostras descoradas com metabissulfito calculada como a seguir:

CP = ( A420 nm - A700 nm ) + Alvis-max - A700 nm DF

A porcentagem da cor polimrica (%CP) calculada da seguinte forma:

%CP = (CP / DC ) 100

Literatura consultada GIUSTI, M.; WROLSTAD, R. E. Characterization and Measurement of Anthocyanins by UV-Visible Spectroscopy. New York: John Wiley & Sons, 2001. (Current Protocols in Food Analytical Chemistry). LEE, J.; DURST, R. W.; WROLSTAD, R. E. Determination of total monomeric anthocyanin pigment content of fruit juices, Beverages,natural colorants, and wines by the pH differential method: collaborative study. Journal of AOAC International, Arlington, v. 88, p. 12691278, 2005.

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Protocolo 2 - Polifenis Totais

Reagentes -Reagente de Folin-Ciocalteu Mistura dos cidos fosfotungstico (H3PW12O40) e fosfomolbdico (H3PMo12O40). Observao: Se inalado levar a vtima para local arejado. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas, se necessrio consultar um oftalmologista. Se ingerido fazer com que a vtima beba gua em abundncia chamar um mdico. -Carbonato de sdio anidro (Na2CO3) MM=105,99g/mol Observao: Irritante aos olhos. Se inalado levar a vtima para local arejado. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas. Se ingerido fazer com que a vtima beba gua em abundncia. -cido glico (cido 3,4,5-trihidroxibenzico) (C6H2(OH)3COOH) MM=170,12 g/mol

Observao: Irritante para os olhos, nariz e garganta. Se inalado pode causar tosse ou dificuldade respiratria. Irritante para a pele. Se inalado e a respirao for dificultada, aplicar oxignio ou fazer respirao artificial. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas, se necessrio consultar um oftalmologista.

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- Acetona ((CH3)2CO) MM=58,08g/mol Observao: Altamente inflamvel. Irritante aos olhos. Exposio repetida pode causar ressecamento e rachaduras na pele. Inalao de vapores pode causar sonolncia e vertigem. Se inalado levar a vtima para local arejado. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas e consultar um oftalmologista. Se ingerido, em caso de vmito risco de aspirao. Manter as vias areas livres. Chamar um mdico imediatamente. Lista de Materiais -Espectrofotmetro UV-vis -Agitador magntico -Balana analtica -Pipetas de 20-200 mL, de 100-1000 mL e de 1000-5000 mL Preparo das Solues 1- Soluo de Folin 2/10 Em um balo volumtrico de 50mL transferir 10mL de reagente de Folin Ciocalteau e completar o volume com gua destilada. Observao 1: A soluo deve ser preparada no mesmo dia da anlise transferida para um frasco mbar e mantida sob refrigerao at o momento da anlise. Observao 2: 50mL de soluo suficiente para a anlise de 20 amostras. 2- Soluo carbonato de sdio 75g/L Em um copo de Becker pesar 3,75g de carbonato de sdio adicionar gua destilada e manter sob agitao at a dissoluo de todo o slido. Transferir a soluo para um balo volumtrico de 50mL (lavando o copo de Becker pelo menos 3 vezes) completar o volume com gua destilada.

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Observao 1: A soluo deve ser preparada transferida para um frasco mbar e mantida sob refrigerao at o momento da anlise. Esta soluo se conserva por at 3 dias sob refrigerao. Observao 2: 50mL de soluo suficiente para a anlise de 25 amostras. 3- Soluo de cido glico Soluo me (SM): pesar 0,5g de cido glico e diluir em 100mL de gua. Soluo de trabalho: adicionar o volume indicado na Tabela 2.1 em bales volumtricos de 10mL. Tabela 2.1. Diluies do padro (cido glico) para a construo da curva de calibrao.
Diluies 1 2 3 4 5 6 Conc. (mmol/L) 25 20 15 10 5 branco Vol. de sm (mL) 50 40 30 20 10 0

Preparo da Amostra Fazer a extrao com 7mL de acetona em 3g de polpa fresca livre de leo ou 10 mL de soluo acetona gua 3:7 em 0,5g de polpa liofilizada livre de leo. Deixar sob agitao durante 20 minutos e filtrar. Diluir 100mL do extrato em 9,9 mL de gua. Anlises - Adicionar a um tubo de ensaio 500uL de gua (branco), cido glico (padro) ou amostra diluda.; - Adicionar 2,5 mL de reagente de Folin-Ciocalteu, deixar em repouso durante 2 minutos a temperatura ambiente; - Adicionar 2 mL de carbonato de sdio , agitar com vortex e deixar em repouso durante 15 minutos em um banho de gua a 50C;

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- Esfriar rapidamente em um banho de gelo; - Realizar as leituras da absorbncia a 760nm. Neste mtodo o reagente Folin-Ciocalteu que mistura de cidos fosfotungstico (H3PW12O40) e fosfomolbdico (H3PMo12O40) se reduz ao oxidar os compostos fenlicos, produzindo xidos de tugstico (W8O23) e molibdeno (Mo8O23) de cor azul que absorvem no comprimento de onda de 760nm; Todas as anlises realizadas em triplicata. Resultados e Expresso dos Resultados O valor de absorbncia do branco subtrado dos valores de absorbncia obtidos para o padro e para as amostras. Construir o grfico dos valores de absorbncia por concentrao de cido glico. Interpolar os valores de absorbncia obtidos para a amostra. Fazer as correes dos fatores de diluio. Os valores de fenlicos totais so expressos como equivalentes de cido glico (mg de cido glico em 100 mg de slidos totais). Literatura consultada GEORGE, S.; BRAT, P.; ALTER, P.; AMIOT, M. J.; Rapid Determination of Polyphenols and Vitamin C in Plant-Derived Products. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Easton, v. 53, n. 5, p. 1370-1373, 2005.

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Protocolo 3 - Atividade Enzimtica

3.1- Polifenoloxidase Reagentes - Pirocatecol (C6H6O2) MM=110,11g/mol

Observao: Prejudicial sade quando em contato com a pele ou se ingerido. Irrita os olhos e a pele. Se inalado levar a vtima para local arejado. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia e chamar um mdico. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas, chamar um oftalmologista. Se ingerido fazer com que a vtima beba gua em abundncia e chamar um mdico. - Fosfato de potssio monobsico (KH2PO4) 136,09g/mol Observao: Se inalado levar a vtima para local arejado. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas. Se ingerido fazer com que a vtima beba gua (2 copos no mximo). - Fosfato potssio dibsico (K2HPO4) 174,18g/mol Observao: Se inalado levar a vtima para local arejado. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas, consultar um oftalmologista se necessrio. Se ingerido fazer com que a vtima beba gua (2 copos no mximo).

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Lista de Materiais -Espectrofotmetro UV vis -Agitador magntico -Balana analtica -Pipetas de 100-1000 mL e de 1000-5000 mL -Centrfuga -Banho termosttico Preparo das solues 1-Tampo fosfato de sdio 0,1M pH= 7,0 Soluo A - 2,17725g de K2HPO4 em 250 mL de gua. Soluo B - 13,609g de KH2PO4 em 1L de gua. Tampo fosfato mistura-se as solues para a obteno do pH desejado (7,0) 2- Catecol 60 mmol/L Pesar 0,330g de catecol e diluir em 50mL de tampo pH= 7,0 em um balo volumtrico. Proteger da luz e manter a soluo em gelo at o momento das analises. A soluo deve ser preparada pouco antes de fazer as medidas, pois o substrato instvel. Preparo da Amostra Extrato bruto enzimtico Para a polpa O extrato bruto preparado sob agitao e em banho de gelo com adio de tampo fosfato pH= 7,0 a polpa de aa durante 20 minutos. A soluo centrifugada a 10.000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante recolhido e diludo de forma que a absorbncia no ultrapasse 1,000 para que a lei de Lambert-Beer seja respeitada.

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Anlises - Adicionar a uma cubeta 2,8mL de soluo de catecol (60mmol/L); - Adicionar 200 mL de extrato enzimtico; - Acompanhar a reao representada na Figura 3.1 a l=410nm (comprimento de onda de absoro da benzoquinona) a temperatura constante de 25C durante 1 minuto.

Fig. 3.1. Reao de oxidao do catecol a benzoquinona, catalisada pela enzima polifenoloxidase. Resultados e Expresso dos Resultados Fazer o grfico de absorbncia por tempo em segundos e obter o coeficiente angular da melhor reta (considerando s o perodo em que a atividade linear). A unidade de atividade por mL de polpa calculada pela frmula:

U / mL = (Dabs FD 1000) / (Dt e V )

Onde: FD o fator de diluio utilizado Dt o tempo em minutos e o coeficiente de extino molar do produto da reao (obenzoquinona) V o volume do extrato bruto utilizado na preparao da amostra.

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3.2 - Peroxidase Reagentes -Guaiacol (C7H8O2) MM=124,14 g/mol

Observao: Perigoso se ingerido. Irritante aos olhos e a pele. Se inalado levar a vtima para local arejado. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas e chamar um oftalmologista. Se ingerido imediatamente fazer com que a vtima beba em abundncia. Chamar um mdico. Administrar carvo ativado em suspenso. - Perxido de Hidrognio (H2O2) MM=34,02 g/mol Observao: Irritante ao sistema respiratrio e pele. Risco de danos srios aos olhos. Observao: Se inalado levar a vtima para local arejado. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia, chamar um oftalmologista imediatamente. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas. Se ingerido fazer com que a vtima beba gua em abundncia, chamar um mdico. - Fosfato de potssio monobsico (KH2PO4) MM=136,09g/mol Observao: Se inalado levar a vtima para local arejado. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas. Se ingerido fazer com que a vtima beba gua (2 copos no mximo).

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- Fosfato potssio dibsico (K2HPO4) MM=174,18g/mol Observao: Se inalado levar a vtima para local arejado. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas, consultar um oftalmologista se necessrio. Se ingerido fazer com que a vtima beba gua (2 copos no mximo). Lista de Materiais -Espectrofotmetro UV-vis -Agitador magntico -Balana analtica -Pipetas de 100-1000 mL e de 1000-5000 mL -Centrfuga -Banho termosttico Preparo das Solues 1-Tampo fosfato de sdio 0,1mol/L pH= 7,0 Soluo A - 2,17725g de K2HPO4 em 250 mL de gua. Soluo B - 13,609g de KH2PO4 em 1L de gua. Tampo fosfato mistura-se as solues para a obteno do pH desejado (7,0). 2- Guaiacol 40mmol/L Pesar 0,2484g de guaiacol e diluir em 50mL de tampo pH=7,0 em um balo volumtrico. Proteger da luz e manter a soluo em gelo at o momento das anlises. A soluo deve ser preparada pouco antes de fazer as medidas, e mantido em banho de gelo, pois o substrato instvel. 3- Perxido de Hidrognio 4mmol/L

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Preparo da Amostra Extrato bruto enzimtico O extrato bruto preparado sob agitao e em banho de gelo com adio de tampo fosfato pH=7,0 a polpa de aa durante 20 minutos. A soluo centrifugada a 10.000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante recolhido e diludo de forma que a absorbncia no ultrapasse 1,000 para que a lei de Lambert-Beer seja respeitada. Anlises -Adicionar a uma cubeta 2,5mL de soluo de guaiacol (40mmol/L); -300 mL de perxido de hidrognio (4mmol/L); - 200 mL de extrato enzimtico; - Acompanhar a reao representada na Figura 3.2 a l=470nm (comprimento de onda de absoro do tetraguaiacol) a temperatura constante de 25C durante 1 minuto.

Fig. 3.2. Reao do guaiacol na presena de perxido de hidrognio catalisada pela enzima peroxidase, formando tetraguaiacol.

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Resultados e Expresso dos Resultados Fazer o grfico de absorbncia por tempo e obter o coeficiente angular da melhor reta (considerando s o perodo em que a atividade linear). A unidade de atividade por mL de polpa calculada pela frmula:

U / mL = (Dabs FD 1000) / (Dt e V )

FD o fator de diluio utilizado. Dt o tempo em minutos. E o coeficiente de extino molar do produto da reao (tetraguaiacol). V o volume do extrato bruto utilizado na preparao da amostra. Literatura consultada ROGEZ, H. Aa: Preparo, Composio e Melhoramento da Conservao. Belm, PA: EDUFPA, 2000. 313 p. FATIBELO-FILHO, O.; VIEIRA, I. C. Uso Analtico de Tecidos e de Extratos Brutos Vegetais como Fonte Enzimtica. Qumica Nova, So Paulo, v. 25, n. 3, p. 455-464, 2002.

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Protocolo 4 - Atividade Antioxidante pelo Mtodo ORAC (Capacidade de Absoro de Radicais de Oxignio)
Reagentes -Trolox (6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic Acid) (C14H18O4) MM=250,29g/mol

Solubilidade: Etanol (160 mg/mL), metanol, ou H2O (0.5 mg/mL) Observao: Irritante ao sistema respiratrio, olhos e a pele. Perigoso se ingerido. Se inalado levar a vtima para local arejado, em caso de parada respiratria aplicar imediatamente ventilao mecnica, chamar um mdico imediatamente. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia, cobrir a rea afetada com um emoliente e consultar um mdico. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas durante pelo menos 15 minutos, chamar imediatamente um oftalmologista. Se ingerido no causar vmito e chamar um mdico imediatamente. - Fluorescena sdica (C20H12O5) MM= 376,28g/mol

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Observao: Se inalado levar a vtima para local arejado. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas, consultar um oftalmologista se necessrio. Se ingerido fazer com que a vtima beba gua em abundncia. - AAPH - 2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (C8H18N6. 2HCl) MM= 71,20g/mol

Observao: Pode ser nocivo se ingerido. Pode causar reao alrgica em contato com a pele. Pode causar danos aos seguintes rgos: pulmes, sistema digestivo trato gastrointestinal, pele, cabea e estmago. Se inalado levar a vtima para local arejado, em caso de parada respiratria aplicar imediatamente ventilao mecnica, chamar um mdico imediatamente. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia durante 15 minutos, chamar um mdico imediatamente. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas durante pelo menos 15 minutos, chamar imediatamente um oftalmologista. Se ingerido no causar vmito e chamar um mdico imediatamente. - Fosfato de sdio monobsico NaH2PO4 119,01g/mol Observaes: Se inalado levar a vtima para local arejado, em caso de parada respiratria aplicar imediatamente ventilao mecnica, chamar um mdico imediatamente. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia e chamar um mdico imediatamente. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas durante pelo menos 15 minutos, chamar imediatamente um oftalmologista. Se ingerido no causar vmito e chamar um mdico imediatamente.

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- Fosfato de sdio de sdio dibsico Na2HPO4.7H2O 268,07g/mol Observaes: Se inalado levar a vtima para local arejado, em caso de parada respiratria aplicar imediatamente ventilao mecnica, chamar um mdico imediatamente. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia e chamar um mdico imediatamente. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas durante pelo menos 15 minutos, chamar imediatamente um oftalmologista. Se ingerido no causar vmito e chamar um mdico imediatamente. Lista de Materiais -Fluormetro -Cubetas medidas de fluorescncia -Agitador magnticos -Balana analtica -Pipetas de 20-200 mL e de 100-1000 mL -medidor de pH -banho termosttico Preparo das Solues 1- Tampo fosfato pH= 7,4 Soluo A- 2,40 g de NaH2PO4 em 100 mL de gua destilada em balo volumtrico. Soluo B- 26,81g de Na2HPO4.7H2O em 500 mL de H2O em balo volumtrico. Misturar 71mL da soluo A e 304mL da soluo B em balo volumtrico de 1L, completar o volume com gua. Se necessrio ajustar o pH para 7,4.

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2- Fluorescena 16,371.10-8mol/L em tampo fosfato Soluo Me (SM): 10,00mg de fluorescena em 50mL de tampo fosfato (53,15mmol/L). Soluo de trabalho: 15,4 mL de SM em 50 mL de tampo fosfato. Observaes: a soluo me pode ser preparada e mantida sob refrigerao por aproximadamente 1 ms em frasco mbar, j a soluo de trabalho deve ser preparada no mesmo dia da anlise. 3- Soluo de AAPH 178 mmol/L em tampo fosfato Soluo de trabalho: 241,3 mg em 5 mL de tampo Observao: A soluo de AAPH deve ser preparada no mesmo dia da anlise mantida sob refrigerao at o momento da anlise e protegida da luz (envolver o balo volumtrico com papel alumnio). 4- Soluo de trolox Soluo Me (SM): 20,51mg em 10mL de tampo fosfato. O trolox deve ser pesado em balana analtica precisa. Devido a sua baixa solubilidade em gua deve ser adicionado etanol (aprox. 1mL) at a dissoluo total do slido e s ento o tampo fosfato adicionado. Soluo 1: Diluir uma alquota de 500 mL da SM em 50 mL de tampo fosfato. Solues de trabalho: so preparadas 6 solues em bales volumtricos de 10mL segundo a Tabela 4.1. Tabela 4.1. Diluies do padro (Trolox) para a construo da curva de calibrao.
Diluies 1 2 3 4 6 Conc. (mmol/L) 40 30 20 10 branco Vol. de s1 (mL) 5,00 3,75 2,50 1,25 0

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Preparo da Amostra As diluies da amostra so feitas de maneira que a intensidade de fluorescncia na mesma decaia num intervalo de tempo menor que o padro de trolox a 40mmol/L e maior que o trolox a 5 mmol/L. Anlises Adicionar: -1,50 mLde soluo de trabalho de fluorescena (Conc. final 63mmol/L); - 0,75 mL de tampo (branco), trolox (padro) ou amostra; - Deixar a 37C durante 5 minutos; - Adicionar 0,75mL de soluo de trabalho de AAPH; - Seguir a fluorescncia (lex=485nm e lem=520nm) a cada minuto. O pico de absoro da fluorescena est entre 450 e 500 nm e o de emisso entre 510 e 550 nm. Resultados e Expresso dos Resultados Determinar a rea sob a curva (AUCbruta) de cada padro e subtrair a rea sob a curva do branco encontrando a rea lquida (AUClquida=AUCbrutaAUCbranco) como demonstrado na Figura 4.1.
30000 Amostra Branco 25000

20000 15000

AUC lquida
10000 5000 0 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

Fig. 4.1. Curva do decaimento da fluorescncia em funo do tempo para uma amostra antioxidante (azul) e para o Branco (em vermelho), a rea cinza corresponde a rea lquida (AUClquida=AUCbrutaAUCbranco).

Fluorescncia

Tempo (s)

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Construir um grfico de AUClquida por concentrao de trolox (mM). Calcular a rea lquida (AUClquida= AUCamostra-AUCbranco) para cada concentrao da amostra. Interpolar o resultado ao grfico do padro (trolox). Fazer as correes dos fatores de diluio a fim de encontrar um resultado expresso em mmol/L Trolox equivalente por grama matria seca ou por ml de soluo. Controle de Rplicas As anlises devem ser feitas em triplicata. O coeficiente de variao ((desvio padro/mdia)x100) no deve ultrapassar 5%. Literatura consultada WANG, H.; CAO, G.; PRIOR, R. L. Oxigen Radical Absorbing Capacity of Anthocyanins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Easton, v. 45, p. 304-309, 1997. PRIOR, R. L.; WU, X.; SCHAICH, K. Standardized Methods for the Determination of Antioxidant Capacity and Phenolics in Foods and Dietary. Journal of Agricultural Food Chemistry. Supplements, Easton, v. 53, p. 4290-4302, 2005.

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Protocolo 5 - Anlise de Antocianinas por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)

Reagentes - gua Milli Q H2O MM= 18,00g/mol -Acetonitrila Grau HPLC (CH3CN) MM= 41,05 g/mol Observaes: Lquido inflamvel. Pode causar danos srios nos olhos. Se inalado levar a vtima para local arejado, em caso de parada respiratria aplicar ventilao mecnica ou mascara de oxignio se necessrio. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia e chamar um mdico. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas e consultar um oftalmologista. Se ingerido fazer com que a vtima beba gua (2 copos no mximo). -cido frmico (CH3COOH) MM= 46,30 g/mol Observao: Causa queimaduras graves. Se inalado levar a vtima para local arejado, chamar um mdico. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia aplicar levemente polietileno glicol 400. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas por pelo menos 10 minutos, chamar imediatamente um oftalmologista. Se ingerido fazer com que a vtima beba gua em abundncia (se necessrio, vrios litros), evitar vmito (risco de perfurao) e chamar um mdico (no tentar neutralizar). Lista de Materiais -Cromatgrafo Lquido -Detector de ultravioleta

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-Agitador magntico -Balana analtica -Pipetas de 20-200 mL e de 100-1000 mL -Seringa de 50 mL -Medidor de pH - Coluna Phenomenex-geminiC18 (150x4,6 mm, 5 mm) -filtro de Nylon 0,45 mL, 25mm Preparo dos Reagentes 1-Fase mvel A: gua acidificada pH= 2,0 Acidificar a gua mili Q com acido frmico at atingir o pH= 2,0. Degaseificar a fase mvel em equipamento de ultrasom durante 30 minutos antes de utiliz-lo. 1-Fase mvel B: acetonitrila Degaseificar a acetonitrila durante 30 minutos em equipamento de ultrasom antes de utilizar. Preparo da Amostra A extrao de antocianinas feita atravs da adio de metanol acidificado na polpa. Centrifugar a amostra. Filtrar em membrana de nylon com poro de 0,45 mm. Anlises -Inicialmente fazer a purga do equipamento com os solventes A e B; iniciar a eluio utilizando uma proporo de 11% do solvente B num fluxo de 1 mL por minuto, durante 30 minutos aproximadamente (o tempo deve ser necessrio para que a linha de base e a presso na coluna estejam constantes); -Injetar 20ul da amostra previamente preparada, o comprimento de onda de deteco deve ser 520nm (comprimento de onda de absoro das antocianinas);

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O mtodo de separao isocrtico, porm, para limpeza da coluna e preparao para uma nova injeo necessrio que seja feita a limpeza da coluna no modo gradiente. O mtodo de anlise est descrito na tabela 5.1. Tabela 5.1. Mtodo para a anlise de antocianinas em CLAE.
Tempo (min) 0-15 15-22 22-28 28-35 %B 11 11-100 100 100-11

Literatura consultada GALLORI, S.; BILIA, A.; BERGONZI, M.; BARBOSA, W.; VINCIERI, F. Polyphenolic Constituents of Fruit Pulp of Euterpe oleracea, Mart. (Aai palm). Chromatographia, New York, v. 59, n. 11/12, p. 739-743, 2004. SCHAUSS, A. G.; WU, X.; PRIOR, R. L.; OU, B.; PATEL, D.; HUANG, D.; KABABICK, J. P. Phytochemical and nutrient composition of freeze-dried amazonian palm bery, Euterpe oleraceae Mart. (Acai). Journal of Agricultural and Food Chemistry, Easton, v. 54, p. 8598-8603, 2006. CASS, Q. B.; DEGANI, A. L. G. D. Desenvolvimento de Mtodos por HPLC: fundamentos, estratgias e validao. So Carlos, SP: EdUFSCar, 2001. 77 p. (Srie Apontamentos).

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Protocolo 6 - Anlise de Acares

6.1- Determinao de Acares Redutores Reagentes -cido dinitrosaliclico (DNS) (C7H4N2O7) MM= 228,12 g/mol

Observao: Perigoso se ingerido. Se inalado levar a vtima para local arejado. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas. Se ingerido fazer com que a vtima beba gua em abundncia e chamar um mdico. -Tartarato duplo de potssio (sal de Rochelle) (C4H4O6KNa.4H2O) MM= 282.1 g/mol

Observao: Se inalado levar a vtima para local arejado. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas. Se ingerido fazer com que a vtima beba gua em abundncia. -Hidrxido de sdio (NaOH) MM= 40 g/mol Observao: Perigoso. Causa queimaduras no trato respiratrio, olhos e na pele. Pode causar danos aos seguintes rgos: pulmes, trato gastrointestinal, trato respiratrio, cabea, lngua e traquia.

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Se inalado levar a vtima para local arejado, em caso de parada respiratria aplicar imediatamente ventilao mecnica, chamar um mdico imediatamente. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia durante 15 minutos chamar um mdico imediatamente. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas durante pelo menos 15 minutos, chamar imediatamente um oftalmologista. Se ingerido no causar vmito e chamar um mdico imediatamente. -Glicose (C6H12O6) MM= 180,16 g/mol

Lista de Materiais -Balana analtica -Cubetas -Tubos de ensaio -Bales volumtricos de 25mL e 1000mL -Pipeta automtica de 100-1000 L -Espectrofotmetro visvel Preparo das Solues 1- Soluo de cido dinitrosaliclido (DNS) Dissolver 16g de NaOH em 200mL de gua destilada e adicionar 10g de DNS. Aps a dissoluo total, adicionar 300g de sal de Rochelle (tartarato duplo de sdio e potssio), dissolvidos em 500mL de gua destilada, aquecer em torno de 40OC para a completa dissoluo. Transferir para um balo volumtrico de 1L e completar com gua destilada.

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Observao: A soluo deve ser mantida em geladeira e em frasco protegido da luz. 2-Soluo padro de glicose Soluo me: preparar uma soluo de glicose 0,18g em 100mL. Soluo de trabalho: preparar as diluies em bales volumtricos de 10mL como indicado na Tabela 6.1. Tabela 6.1. Diluies do padro (Glicose) para a construo da curva de calibrao.
Diluies 1 2 3 4 5 6 Conc. (g/L) 1,8 1,44 0,72 0,36 0,18 branco Vol. De S1 (mL) 10 8 4 2 1 0

Anlises -Adicionar 1,0mL da amostra e 1mL de reagente DNS; - Aquecer a 100C/ 15 minutos, resfriar em banho de gelo; -Completar com 13mL de gua destilada agitando at homogeneizar a soluo; - Acompanhar a reao representada na Figura 6.1 a l=540nm (comprimento de onda de absoro do cido 3-amino-5-nitrossaliclico).

Fig. 6.1. O cido dinitrossaliclico reduzido pelo acar redutor a cido 3amino-5-nitrossaliclico. Observao: Devido a amostra de aa apresentar absorbncia no comprimento de onda do ensaio o branco correspondente a amostra preparado substituindo o DNS por gua.

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6.2- DETERMINAO DE ACARES TOTAIS Reagentes -Fenol 5% (C6H5OH) MM= 94.11 g/mol

Observao: Txico se inalado, em contato com a pele e se ingerido. Causa queimaduras. Perigo de danos srios a sade por exposio prolongada atravs de inalao, contato com os olhos e ingesto. Possvel risco de efeitos irreversveis. Se inalado levar a vtima para local arejado. Em caso de parada respiratria aplicar imediatamente ventilao mecnica, e se necessrio mascara de oxignio. No caso de contato com a pele lavar polietileno glicol/etanol 2:1 e lavar com gua em abundncia. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas durante 10 minutos e imediatamente chamar um oftalmologista. Se ingerido imediatamente fazer com que a vtima beba gua em abundncia, induzir vmito. Chamar um mdico imediatamente. Administrar carvo ativado em suspenso. -cido sulfrico concentrado (H2SO4) MM= 98,08 g/mol Observao: Causa queimaduras severas. Se inalado levar a vtima para local arejado, chamar um mdico. No caso de contato com a pele lavar com gua em abundncia aplicar levemente polietileno glicol 400. Aps contato com os olhos lavar com gua mantendo as plpebras abertas durante pelo menos 10 minutos, chamar imediatamente um oftalmologista. Se ingerido fazer com que a vtima beba gua (2 copos no mximo), evitar vmito (risco de perfurao) e chamar um mdico (no tentar neutralizar).

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-Glicose (C6H12O6) MM= 180,16 g/mol

Lista de Materiais -Balana analtica -Cubetas -Tubos de ensaio -Bales volumtricos de 25mL e 1000mL -Pipeta automtica de 100-1000 L -Espectrofotmetro visvel Preparo das Solues 1. Soluo de fenol 5% 5g de fenol em 100ml de gua. 2- Soluo padro de glicose Soluo me: soluo de glicose 1%. Soluo de trabalho: adicionar a quantidade da soluo me determinada na tabela em bales volumtricos de 10mL de acordo com a Tabela 6.2. Tabela 6.2. Diluies do padro (Glicose) para a construo da curva de calibrao.
Diluies 1 2 3 4 5 6 Conc. (mg/mL) 90 80 60 40 20 branco Vol. De S1 (mL) 90 80 60 40 20 0

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Anlises - Em um tubo de ensaio adicionar 500L de amostra, 500L de fenol 5% e - 2,5mL de cido sulfrico concentrado; - Deixar reagir temperatura ambiente por 10 minutos; -Agitar com auxlio de um vortex e deixar em banho de gua a temperatura ambiente por 10 minutos; -A leitura realizada com um espectrofotmetro na regio do visvel em 490nm. Neste mtodo ocorre desidratao do acar pelo cido sulfrico seguida da complexao com o fenol, o produto formado da absorve em 490nm. Observao: Devido amostra de aa apresentar absorbncia no comprimento de onda do ensaio o branco correspondente a amostra preparado substituindo o fenol por gua. Literatura consultada DUBOIS, M.; GILLES, K.A.; HAMILTON. J. K.; REBERS, P.A.; SMITH, F. Colorimetric method form Determination of sugars and related substances. Nature, London, v. 28, n. 3, p. 350-356, 1956. MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. Analytical Chemistry, Washington, v. 31, p. 426-428, 1959.

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