Qumica Analtica III

CROMATOGRAFA LQUIDA

FUNDAMENTOS

Las muestra se disuelven en una fase mvil (FM) lquida que se hace pasar a travs de una fase estacionaria (FE) inmiscible, la cual se mantiene fija en una columna o lecho cromatogrfico

Los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la FM y FE dependiendo de la afinidad por ambas fases, desplazndose a velocidad distinta

Debido a la distinta movilidad, los componentes se separan en bandas discriminadas que pueden analizarse cualitativamente y/o cuantitativamente

Eluyente: lo que entra en la columna Eluato: lo que sale de la columna Elucin: proceso de paso de la FM a travs de la columna

FUNDAMENTOS

CLASIFICACIN DE LOS MTODOS CROMATOGRFICOS

TIPO Adsorcin Intercambio inico Exclusin Particin Afinidad FASE ESTACIONARIA Slido Resina Gel Lquido Slido INTERACCIN Fuerzas de van der Waals Electrostticas Tamao de partculas Solubilidad Retenciones bioespecficas

CLASIFICACIN DE LOS MTODOS CROMATOGRFICOS

Segn el mecanismo de separacin

CLASIFICACIN DE LOS MTODOS CROMATOGRFICOS

CROMATOGRAFA DE PARTICIN
La FE lquida est retenida por un soporte slido. Los soportes slidos ms utilizados en CLL son: gel de slice, tierra de diatomeas (Kieselguhr, Celita, etc.) y celulosa. Dificultad en relacin con el soporte slido: presencia de fenmenos de adsorcin(siempre muestra algo de actividad superficial).

CROMATOGRAFA DE ADSORCIN
La FE es un slido adsorbente de gran rea superficial. Los centros activos situados sobre la superficie del slido interaccionan con los grupos funcionales polares de los compuestos a separar. La separacin se produce como consecuencia de la distinta intensidad de esas interacciones para los diferentes compuestos.

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO (CII)

Se basa en el equilibrio de los iones de soluto entre el solvente y los sitios cargados en la FE.

La FE consta de una matriz (R) con grupos funcionales cargados (A) y contraiones de carga opuesta (M), susceptibles de intercambiarse con especies de la misma carga contenidas en la FM (X)

RA M+ + X+ RAX+ + M+ (intercambio catinico) RA+M + Y RA+Y + M (intercambio aninico)

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR (CPG)

Se aplica fundamentalmente para la separacin y caracterizacin de sustancias de peso molecular elevado. Se utiliza extensamente en Bioqumica para separar molculas grandes como protenas e hidratos de carbono, si bien, tambin encuentra aplicaciones en la qumica de los polmeros.

CROMAROGRAFA LQUIDA Por qu se produce la distribucin del soluto entre las dos fases?
Debido a la interaccin, en diferente proporcin, de las molculas de soluto con las molculas de cada fase Fuerzas intermoleculares: inicas polares
INTENSIDAD DECRECIENTE

dispersivas

FUERZAS INTERMOLECULARES

Fuerzas inicas: Atracciones polares: Interacciones dispersivas:

atraccin electrosttica de iones con carga opuesta para separar aniones se requiere una FE catinica y viceversa

puede tratarse de interacciones de molculas polares (alcoholes, cetonas, aldehdos) o polarizables (benceno, tolueno, naftaleno) Para su separacin se requerir que la FM sea no polar o poco polar y la FE sea polar

se originan entre cadenas hidrocarbonadas y sustancias polares como consecuencia de asimetras electrnicas instantneas

PRINCIPIOS BSICOS

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (CLAR O HPLC)

EVOLUCIN DE LA CL
a) CL convencional. b) HPLC con partculas peliculares. c) HPLC con partculas microporosas.

OPTIMIZAR LA CL
El primer aspecto considerado fue incrementar la velocidad de la fase mvil Utilizacin de bombas adecuadas y conexiones de tubos que impidan fugas, al estar sometido el lquido a presiones elevadas. Con fases estacionarias convencionales, el empleo de altas velocidades de fase mvil implica una prdida de resolucin. Para mejorar sta, se hace necesario modificar el empaquetamiento (conexin con la ecuacin de van Deemter)

B H = A + + Cu u

OPTIMIZAR LA CL
La resolucin en CL se mejora al disminuir el tamao de las partculas de FE

Se reduce A ya que las trayectorias seguidas por la FM son ms uniformes

B/u slo es significativa cuando la velocidad de flujo es excesivamente lenta.

La resistencia a la transferencia de masa, Cu, es fundamental

A altos valores de u, slo si la transferencia de solutos entre FM y FE es rpida la Rs ser alta.

Decisiva la reduccin del tamao de las partculas de la relleno

Los materiales que se usan en CL convencional tienen partculas de 150 m ms y poros profundos.

FM estanca, lenta transferencia de masa entre fases.

Se origina un ensanchamiento de bandas excesivamente grande.

PROPIEDADES DE LOS SOLVENTES EMPLEADOS EN HPLC

La cada de presin a lo largo de una columna se puede calcular como:

P = 250 LF
2 d2 d p c

Viscosidad de mezclas acuosas empleadas como FM en RPLC

P = cada de presin (psi) L= longitud de columna (cm) = viscosidad (cP) F = caudal (mL/min) dp = dimetro de partcula (m) dc = dimetro de columna (cm)

(cP)

%v/v de agua
Al usar una mezcla de 50% de MeOH en agua, se obtiene un P que es el doble del que se obtendra para la misma columna con una mezcla MeCN/agua.

PROPIEDADES DE LOS SOLVENTES EMPLEADOS EN HPLC

Alto poder solubilizante para no precipitar el analito en la columna Baja reactividad Alto grado de pureza Compatibilidad con el detector (en el caso del detector UV, punto de corte adecuado) Baja viscosidad (evitar cadas de presin elevadas y mejorar la transferencia de materia entre fases)

La fase estacionaria se une qumicamente a la superficie del soporte slido.

Cromatografa de fase enlazada (CFE o BPC) Los grupos OH pueden ser silanizados por reaccin con organocloro u organoalcoxisilanos para formar enlaces siloxano estables

Constituido por micropartculas de gel de slice (dimetros entre 3 y 10 m).

SOPORTE SLIDO
El soporte ms comn en HPLC son las partculas microporosas de slice. Pueden tener un rea superficial de hasta 300 m2/g. Su superficie contiene unos 8 mol/m2 de grupos SILANOL (Si-OH).

PARTCULAS DE SLICE (TAMAO DE PORO, 10 nm)

a)Agregado de partculas esfricas, rea superficial 150 m2/g b)Estructura esponjada, rea superficial 300m2/g.

PARTCULAS DE SLICE

Partculas irregulares o esfricas Tamao :

LC 40-200

HPLC 3 -10

CROMATOGRAFA DE FASE ENLAZADA (BPC)

con octadecilclorosilano, el proceso es,

Los grupos silanol residuales que no hayan reaccionado es necesario desactivarlos, lo cual suele hacerse con clorotrimetilsilano.

EMPAQUES DE SILOXANOS
Las fases ligadas ms frecuentes (cepillo, oligomrica y voluminosa) son producidas por monocloro, dicloro y triclorosilanos, respectivamente.

unin siloxano grupo silanol reactivo Si OH O + Si OH unin siloxano CH3 ClSi R CH3 alquil clorosilano Si - HCl O Si OH O CH3 Si R CH3

R = C6H13; C8H17; C18H37; C4H6N;C8H9SO3; etc

FASE UNIDA TIPO CEPILLO (BRUSH)

Los grupos estn en posicin perpendicular a la superficie generando una estructura de cepillo o brocha

Estructura A

Estructura B

impedimento estrico (grupos metilo unidos al silicio)

ms aceptada

FASE UNIDA TIPO OLIGOMRICA

Etapa 1

Alquil diclorosilano

FASE UNIDA TIPO OLIGOMRICA

Etapa 2

Etapa 3

Se trata la silica en forma alternada con agua y diclorosilano. Se va formando el oligmero que constituye la FE

FASE UNIDA TIPO OLIGOMRICA

Etapa final

Cuando se une la ltima cadena, se hace reaccionar al grupo silanol remanente con trimetil clorosilano.

Es la fase ligada ms difcil de obtener

Etapa 1

Alquil triclorosilano

FASE UNIDA TIPO VOLUMINOSA (BULK)

Consiste en una pelcula polimrica algo abierta de FE cubriendo la superficie de la slica

Etapa 2

La cadena octildicloro reacciona con agua para dar una cadena octildihidroxo

FASE UNIDA TIPO VOLUMINOSA

Etapa 3 La cadena octildihidroxo reacciona con molculas de triclosilanos y forma la superficie polimrica.

Los grupos clorosilanos tienen libertad de movimiento para reaccionar con silanoles de la superficie (capa de polmero entrecruzado)

FASE UNIDA TIPO VOLUMINOSA

FASES LIGADAS

Fases tipo cepillo (brush)

Se sintetizan de una manera reproducible, y por lo tanto son generalmente recomendadas para la mayora de las aplicaciones.

Fases voluminosas (bulk)

Tienen alta capacidad retentiva y son adecuadas para sistemas que operarn con mezclas de solventes acuosos con altos contenidos de agua.

CROMAROGRAFA DE PARTICIN LQUIDO-LQUIDO Teora de equilibrio

El potencial qumico del soluto en fase estacionaria (ms) y en fase mvil (mM) se pueden expresar:

= o + RTlna S S S = o + RTlna M M M
= M S

Al alcanzar equilibrio:

RTln

S = o - o = RTlnK o M S a M

Donde Ko es la constante termodinmica de distribucin o particin

CROMAROGRAFA DE PARTICIN LQUIDO-LQUIDO Teora de equilibrio a x Ko= S = S S = Kx S a x M M M M

x representan fracciones molares Kx = xS/xM es la constante de distribucin expresada en fracciones molares Tomando como estado normal del soluto al soluto puro (a=1 para x=1) en ambas fases:

o = o M S
Por lo tanto:

K = 1

Kx = M S

CROMAROGRAFA DE PARTICIN LQUIDO-LQUIDO Teora de equilibrio

Para las soluciones diludas con las se trabaja en cromatografa se puede escribir:

x Kx = x

o o v C n v V N S M = S S M = S S o o v n v C V N n M M M M S S M n

nS y nM: nmero de moles en fase estacionaria (S) y mvil (M) NS y NM nmero de moles de S y M vS y vM volmenes molares de S y M VS y VM volmenes de fase estacionaria y mvil CS y CM concentracin molar del soluto en fase estacionaria y mvil

CROMAROGRAFA DE PARTICIN LQUIDO-LQUIDO Teora de equilibrio o C v Reordenando la ecuacin anterior: K = S =Kx M o D C v M S

Combinando con la expresin de Kx encontrada:

o v K = M M o D v S S

KD y VR estn, como siempre, relacionados por la ecuacin fundamental de la cromatografa

=V

+K V M D S

Cmo calcular los coeficientes de actividad? Teora de las soluciones regulares de Hildebrand
Para una solucin regular, el coeficiente de actividad a

dilucin infinita de un soluto 1 en un solvente 2 viene dado por:

es el parmetro de solubilidad, que es una medida de lo que comnmente se denomina polaridad. cuanto ms polar es una sustancia, mayor es su parmetro de solubilidad. la expresin para el coeficiente de actividad de un soluto i en fase mvil y en fase estacionaria ser:

o v ln = 1 ( - )2 1 2 1 RT

o v ln = i ( - )2 i M i, M RT

o v ln = i ( - )2 i S i, S RT

Coeficientes de distribucin en cromatografa lquida

Introducimos las expresiones anteriores la de KD

o o v v 2 2 ln K = i [ ( - ) - ( - ) ] + ln M o D M M i i RT v S
Si los volmenes molares de los lquidos usados como fases mvil y estacionaria no son muy diferentes vM vS

o 2 2 ln K = i [( - ) - ( - ) ] D i M i M RT v

MODALIDADES DE CROMATOGRAFA LQUIDA

Si vamos a separar analitos polares (i grande)
s deber ser de similar magnitud para minimizar (i s) m deber ser pequeo para maximizar (i m) y lograr tener retencin

La fase estacionaria deber ser polar y la Estamos en presencia de particin en FASE NORMAL (NPLC) fase mvil poco polar

> > M S i

MODALIDADES DE CROMATOGRAFA LQUIDA

Si vamos a separar analitos no polares (i chico)
s deber ser de similar magnitud (chico) para minimizar (i s) y lograr tener retencin m deber ser grande para maximizar (i m)

La fase estacionaria en presencia de particin en FASE deber ser no polar Estamos REVERSA (RPLC) y la fase mvil polar

< < M S i