Prctica de Laboratorio

Determinacin de Protenas y Enzimas

I.

Introduccin

Las protenas son biomleculas formadas bsicamente por carbono, hidrgeno, oxgeno y nitrgeno. Pueden adems contener azufre y en algunos tipos de protenas, fsforo, hierro, magnesio y cobre entre otros elementos. Las protenas proporcionan estructuras, catalizan reacciones celulares y llevan a cabo multitud de tareas. Su papel central en la clula queda reflejado en el hecho que la informacin gentica se expresa en forma de protenas. Existe para cada protena un segmento de ADN que codifica la informacin que especifica su secuencia de aminocidos. Las enzimas son molculas de protenas que tienen la capacidad de facilitar y acelerar las reacciones qumicas que tienen lugar en los tejidos vivos, disminuyendo el nivel de la "energa de activacin" propia de la reaccin. Se entiende por "energa de activacin" al valor de la energa que es necesario aplicar (en forma de calor, electricidad o radiacin) para que dos molculas determinadas colisionen y se produzca una reaccin qumica entre ellas. Generalmente, las enzimas se nombran aadiendo la terminacin "asa" a la raz del nombre de la sustancia sobre la que actan. Las enzimas no reaccionan qumicamente con las sustancias sobre las que actan (que se denominan sustrato), ni alteran el equilibrio de la reaccin. Solamente aumentan la velocidad con que estas se producen, actuando como catalizadores. La velocidad de las reacciones enzimticas dependen de la concentracin de la enzima, de la concentracin del sustrato (hasta un lmite) y de la temperatura y el PH del medio.

Las unidades que componen las protenas se denominan aminocidos. II. Fundamento terico
Las Protenas ESTRUCTURA BSICA DE LAS PROTENAS AMINOACIDOS Existen 20 aminocidos diferentes y todos ellos tienen una parte comn en su molcula que consisten en un grupo amino (NH3) y un grupo cido (COOH), unidos al mismo tomo de Carbono (C) . Se pueden representar como NH2-CHR-COOH, siendo R un radical o cadena lateral caracterstica de cada aminocido. Existen 2 enantimeros (imagen especulares no superponibles, pero que tienen las mismas propiedades fsicas y qumicas, excepto por la interaccin

con el plano de la luz polarizada) posibles, pero solo la forma L, se encuentra presente en las protenas.

Aminocidos proteicos Aminocidos Aminocidos no Estndar Se utilizan como mensajeros o precursores o mensajeros metablicos

Neurotransmisores: GABA (derivado de glutamina)- Serotonina (triptfano) Hormonas : Tiroxina (tirosina) - Acido indol actico (triptfano) Intermediarios metablicos: Citrulina- Ornitina Se clasifican segn sus radicales R. Hay varios tipos:

APOLARES - Glicina - Alanina - Valina - Leucina CIDOS-

POLARES - Cerina - Trebolina - Cistena Ac. Asprtico

AROMTICOS - Tirosina - Triptfano - Fenilalanina - Ac. Glutmico

BSICOS - Arginina - Histidina - Lisina

FUNCIONES * Enzimas Protenas variadas y altamente especializadas, con actividad cataltica para las reacciones qumicas de las biomolculas orgnicas en forma especfica.

* Transporte Protenas de transporte del plasma sanguneo que fijan y transportan molculas o iones especficos de un rgano a otro. - Hemoglobina: en los eritrocitos fija el O2 a medida que pasa la sangre pasa a travs de los pulmones, lo transporta a los tejidos perifricos y all lo libera para que participe en la oxidacin de los nutrientes para la produccin de energa. - Lipoprotenas: en el plasma transportan lpidos desde el hgado a otros rganos. - Protenas de Membrana: adaptadas para fijar glucosa, aminocidos u otras sustancias y transportarlas a travs de la membrana.

* Nutricin y Reserva - Ovoalbmina: protena de la clara de huevo. - Casena: protena de la leche - Ferritina: en bacterias y en tejidos animales y vegetales almacenan hierro. * Estructurales confieren la capacidad de moverse, contraerse, cambiar de forma. - Actina y Miosina: sist. Contrctil del msculo esqueltico y otras clulas no musculares. - Tubulina: forma los microtbulos y estos actan con la Dineina de los flagelos y cilios. Filamentos de soporte, que confieren fuerza o proteccin a las estructuras biolgicas. - Colgeno: componente de tendones y cartlagos, posee una resistencia elevada a la tensin - Elastina: ligamentos, que se extienden en 2 dimensiones - Queratina: pelo, uas, plumas * Defensa contra la invasin por otras especies o protegen contra las heridas. - Inmunoglobulinas- Anticuerpos: fabricada por los linfocitos, pueden reconocer y precipitar o neutralizar bacterias, virus o protenas invasoras. - Fibringeno- Trombina (enzimas): coagulacin, impiden prdida de sangre al dao vascular. * Regulacin Hormonas: regulan la actividad celular o fisiolgica. - Insulina: regula metabolismo glucocdico - Protenas G: fijan GDP y facilitan la respuesta a muchas seales hormonales. NOMENCLATURA Se suelen clasificar de acuerdo a los siguientes criterios: * Segn tamao: Pptidos - Oligopptidos: (2-10 aminocidos) Ej.: Aspartamo (2aa), Oxitocina (9 a a) - Poli pptidos: (10-100 a a) Ej.: Glucagn Protenas: (1000-3000 a a)

* Segn cantidad de cadenas polipeptdicas: Monomricas: constan de una sola cadena, como la mioglobina, citocromo C Oligomricas: constan de varias cadenas. Las distintas cadenas polipeptdicas se llaman subunidades y se unen a travs de enlaces no covalentes, y pueden ser iguales o distintas entre s. Un ejemplo es la hemoglobina, formada por 4 subunidades. * Segn su forma: Fibrosas: Presentan cadenas polipeptdicas largas y una tpica estructura segundaria. Son insolubles en agua y en soluciones acuosas. Algunos ejemplos de estas son la queratina y colgeno. Por lo general, tienen funciones estructurales. Globulares: Se caracterizan por doblar apretadamente sus cadenas en una forma esfrica apretada o compacta. Ejemplo de stas son la mayora de las enzimas, anticuerpos, algunas hormonas, protenas de transporte.

FORMACIN DEL ENLACE PEPTDICO Los L--aminocidos se unen mediante enlaces peptdicos, para formar los pptidos. La unin entre dos aminocidos, se establece entre el grupo carboxilo (-COOH) de un aminocido y el grupo amino (-NH2) del aminocido inmediato, con la prdida de una molcula de agua. El enlace peptdico tiene un comportamiento similar al de un enlace doble, es decir, presenta una cierta rigidez que inmoviliza en un plano los tomos que lo forman Corresponde a una reaccin de condensacin. PROPIEDADES Es rgido y planas. Tiene carcter parcial de doble enlace. Equilibrio de estructuras resonantes. No tiene libertad de giro.
Formacin de un grupo amida.

 Es ms corto que otros enlaces C-N. Se presenta normalmente en transformacin Trans. Los grupos C=O y N- H son polares y participan en la formacin de puentes de hidrgeno.

Las Enzimas Las enzimas son protenas que tienen uno o ms lugares o denominados sitios activos, a los cuales se une el sustrato, es decir la sustancia sobre la que acta la enzima. El conjunto de enzimas constituye el grupo de molculas ms extenso y ms especializado del organismo. Para poder actuar, algunas enzimas requieren la presencia de sustancias llamadas cofactores. El cofactor puede ser un metal o un grupo prottico, como el caso de las protenas conjugadas. Otras enzimas necesitan pequeas molculas denominadas Coenzimas. Por ejemplo las deshidrogenasas necesitan una molcula de nicotinamida adenina dinucleotido (NAD o NADP) para poder funcionar. E + NAD + S E + NADH + H S oxidado

E Enzima

S Sustrato + H (Hidrogenado)

NAD nicotinamida adenina dinucleotido

El Reactivo de Biuret Entre las reacciones coloreadas especficas de las protenas, que sirven por tanto para su identificacin, destaca la reaccin del Biuret. Esta reaccin la producen los pptidos y las protenas, pero no los aminocidos ya que se debe a la presencia del enlace peptdico CO-NH que se destruye al liberarse los aminocidos. El reactivo del Biuret lleva sulfato de Cobre (II), en un medio fuertemente alcalino, se coordina con los enlaces peptdicos formando un complejo de color violeta (Biuret) cuya intensidad de color depende de la concentracin de protenas. La prueba de biuret es una prueba qumica de protenas y polipptidos . Se basa en el reactivo de biuret , una solucin de azul que se vuelve violeta al entrar en contacto con las protenas, o cualquier sustancia con enlaces peptdicos . La prueba y el reactivo en realidad no contienen grupos biuret, que se llama as porque tanto biuret y protenas tienen la misma respuesta a la prueba.

III.

Marco terico

Las protenas ocupan un lugar de mxima importancia entre las molculas constituyentes de los seres vivos (biomolculas). Prcticamente todos los procesos biolgicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de molculas .

Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una preparacin enzimtica, para el diagnstico de enfermedades, as como para muchos otros propsitos. Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV, b) para la formacin de derivados qumicos, o c) la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes. Ensayo de Biuret: Est hecho de hidrxido potsico (KOH) y sulfato cprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O64H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de protenas, y vira a rosa cuando se combina con polipptidos de cadena corta. El Hidrxido de Potasio no participa en la reaccin, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar. ++ Consiste en tratar una protena o pptido con Cu en medio alcalino, producindose una ++ coloracin violcea por formacin de un complejo de coordinacin entre el Cu y los pares electrnicos libres de los nitrgenos de los grupos amino de la unin peptdica. Son necesarias por lo menos dos uniones peptdicas para que tenga lugar la reaccin. La reaccin del biuret no es una reaccin especfica para protenas. Eso hace que un resultado positivo con este reactivo deba ser cuidadosamente evaluado para descartar los resultados falsos positivos Un resultado negativo de la reaccin del biuret sobre una muestra problema no necesariamente indica la ausencia de protenas, ya que puede ocurrir a) que no existan protenas o pptidos en la muestra (ni tampoco otras sustancias no proteicas biuret positivas), b) que existan una o ms sustancias interferentes en la muestra que impidan que se produzca la reaccin (lo que dara lugar a un resultado falso negativo). Esto puede descartarse (o evitarse) si conozco de antemano la composicin aproximada de la muestra. Por ejemplo, si deseo determinar el + contenido de pptidos generados por una reaccin de hidrlisis cida, los H del medio interferirn con la reaccin del biuret, ya que sta necesita de un medio alcalino para la ++ formacin del complejo con Cu . En este caso la interferencia puede eliminarse alcalinizando el medio antes de realizar el ensayo (en caso contrario obtendra un falso negativo como resultado) y c) Que existan pptidos, pero a una concentracin inferior al lmite de sensibilidad del mtodo. Todo mtodo permite determinar la presencia de un compuesto slo si la concentracin del mismo es superior a cierto valor. Existen mtodos mucho mas sensibles que el biuret (ver mas abajo).

Figura 1: Reaccin de Biuret.

IV.

Objetivos

a. Determinar la presencia de protenas con el reactivo de Biuret. b. Determinar la mayor presencia de enzimas.

V.

Materiales y Procedimiento Materiales

Material Gentico Mandarina Durazno Albumina de huevo Agua Reactivos Biuret Agua destilada

5.1.

Materiales de laboratorio Vigueta Vaso precipitado Tubos de ensayo (x4) Pipeta Gotero Bistur, gradilla

5.2.
Tubo

Procedimiento
2 ml. De solucin de la muestra Reactivo de Biuret * Resultados

a. Determinacin de Protenas mediante el reactivo de Biuret.

1 2 3 4

Agua Albumina MP#1 ( Mandarina) PM#2 (Durazno)

17 gotas 17 gotas 17 gotas 17 gotas

Ninguno **Color Violeta Ninguno Ninguno

**_ En este punto del resultado, la coloracin de la solucin al 1% de albumina de Huevo se torn de color violeta, que significa que en esta reaccin al aplicar el reactivo de biuret encontramos ms de un enlaces peptdico de protenas. *_EL RECTIVO DE BIURET (es una solucin alcalina de Cobre Cu-), reacciona cuando hay ms de dos enlaces peptdicos y acta como indicador de protenas. b. Determinacin de Catalasas (Enzimas). Muestra o sustancia Papa Hgado Agua oxigenada(HO) 5 ml. Tubos de ensayo 1 4 gr. 4 gr. 5 ml. 2 Resultados R-Lenta R-Rpida --------

VI. Resultados y Anlisis

La enzima catalasa est presente en los peroxisomas que son orgnulos de las clulas animales y vegetales. Durante el metabolismo celular se forma una molcula txica llamada perxido de Hidrgeno, que por accin de la catalasa, esta se descompone en agua y oxgeno.

Reconocimiento de protenas

Despus de esta ensayo, la solucin se torna color violeta por lo tanto se puede deducir que la ovoalbmina presenta por lo menos dos o ms enlaces peptdicos.

a) Reconocimiento de Catalasas
Reconocimiento de catalasas en clulas animales

Inmediatamente se observa liberacin de Oxgeno en forma de abundante espuma, indicndonos una mayor actividad en la enzima, por tanto el hgado presenta mayor cantidad de enzimas. Reconocimiento de catalasas en la clula Vegetal

Se observa menor liberacin de espuma, indicndonos una menor actividad en la enzima.

VII. Conclusiones

A. Al realizar las diferentes pruebas con la albmina de huevo se concret que se trata de una concentrada protena. B. Se logr identificar a la catalasa con mayor actividad y velocidad en la clula animal.

VIII. Bibliografa

Melo Virginia, Camuat Oscar. Bioqumica de los Procesos metablicos. Segunda Edicin. 2
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reimpresin 2008.
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