RESUMEN DE LA CLASE TERICA (Slo se explican los conceptos recientes.

El resto de la informacin est en los libros de texto, an desactualizados)

VIRUS HERPES SIMPLEX Prof. Dr. Norberto Sanjuan

CARACTERSTICAS DEL VIRUS Y SU REPLICACIN El virus Herpes simplex (HSV) est clasificado, en base a su morfologa, como un miembro de la familia Herpesviridae, de la cual forman parte ms de 130 virus distintos que infectan a una amplia variedad de animales. El HSV-1 (un virus humano) fue descubierto en 1919 por Lowenstein y recin en 1962 Schneweiss describi al serotipo HSV-2. Estructuralmente est compuesto, de afuera hacia adentro, por una envoltura lipoproteica que se observa como una membrana trilaminar por microscopa electrnica de transmisin (MET), luego una zona amorfa denominada tegumento y por ltimo una nucleocpside de simetra icosadrica, de 100 nm de dimetro, organizada en 162 capsmeros y con forma toroidal, que contiene al DNA viral. El virin (que es la partcula viral infectante) mide entre 120 y 280 nm, dependiendo del espesor del tegumento. La envoltura, al ser la parte ms externa de la partcula viral, no slo recubre a la nucleocpside sino que tambin interacta con los receptores celulares. Est compuesta por 11 protenas de las cuales 10 son glicoprotenas, denominadas gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gK, gL y gM. El tegumento contiene protenas no glicosiladas, algunas de ellas crticas en los procesos de replicacin viral y de latencia, como VP-16 (VP indica viral protein). La cpside es tambin proteica y, en conjunto con las protenas del tegumento, contiene los 20 pptidos restantes que forman el virin. El DNA viral es bicatenario y lineal, compuesto por 150 Kilopares de bases (Kpb) y estructurado en dos segmentos: el largo (UL) y el corto (US) que estn separados por secuencias de DNA palindrmicas (es decir, repetitivas pero inversas). Estas secuencias tienen funciones regulatorias en la expresin del genoma. El HSV puede infectar una amplia variedad de clulas in vitro, aunque in vivo se acepta que tiene un tropismo preferencial por los tejidos derivados del ectodermo embrionario, especialmente la piel y el sistema nervioso. A nivel de una sola clula, el HSV-1 inicia su ciclo de replicacin contactando las gB y gC con el receptor celular que es el componente glicosaminoglicano del heparan sulfato ubicado en la membrana plasmtica. El siguiente paso es la interaccin de gD con un co-receptor celular que puede ser de 3 tipos. El primer tipo corresponde a un miembro de la familia de receptores para el TNF (factor de necrosis tumoral). A este co-receptor originalmente se lo denomin HVEM (Herpes virus entry mediator) pero posteriormente se le cambi el nombre por el de HveA. El segundo tipo de co-receptores pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas y est relacionado con el receptor para el virus Polio. Este co-receptor puede, a su vez, tener 2 variantes: el HveB y el HveC. Se ha observado recientemente que estos co-receptores son

protenas que intervienen como molculas de adhesin intercelulares, por lo cual se las denomin nectinas. De tal forma que la nomenclatura ms actual es nectina 1-alfa para designar a HveC y nectina 2-alfa para denominar a HveB. Estas nectinas (sobre todo la 1alfa) son importantes no slo para determinar el tropismo del HSV-1 (dado que estn presentes en la piel, el cerebro, los ganglios raqudeos, etc) sino, adems, para permitir el pasaje intercelular del virus. El tercer tipo de co-receptor con el que HSV-1 puede interactuar es el heparn sulfato 3-O-sulfatado. El ltimo paso para el ingreso de la partcula viral a la clula es la fusin de la envoltura viral con la membrana plasmtica celular. Si en vez de ingresar por la mencionada fusin el virus entrara por endocitosis la infeccin productiva no tendra lugar. Posteriormente, las nucleocpside y algunas protenas del tegumento son transportadas hacia los poros nucleares, probablemente a travs de su interaccin con dinena, que es una protena motora asociada a microtbulos. No obstante, este punto es an oscuro, porque fue demostrado en pocos sistemas de cultivos celulares. En el borde del poro nuclear, las nucleocpsides liberan al DNA viral que, en consecuencia, ingresa al ncleo por mecanismos an hoy poco conocidos, quedando la cpside vaca en el citoplasma. Dentro del ncleo el genoma viral se circulariza unindose por sus extremos palindrmicos. El genoma del HSV-1 ubicado en el ncleo celular se expresa en forma de cascada, con 3 grupos de genes diferentes que se denominan alfa (o inmediatamente tempranos), beta (o tempranos) y gamma (o tardos). Los genes alfa y gran parte de los beta son reguladores de la sntesis del DNA viral, mientras que los gamma son genes que codifican para la sntesis de protenas estructurales. Los 3 grupos de genes regulan su expresin entre s, induciendo o reprimiendo la expresin de los otros. El comienzo de la transcripcin de los genes alfa est dado por la presencia en el ncleo de la protena del tegumento VP-16, mientras que la protena UL41 bloquea la sntesis de las protenas celulares. Una vez sintetizadas las protenas en el citoplasma, regresan al ncleo donde se unen al DNA viral que se obtuvo por replicacin previa y ensamblan nuevas nucleocpsides. Inmediatamente las protenas que formarn el tegumento recubren a las nucleocpsides y las partculas se acercan a la membrana interna de la envoltura nuclear, donde VP-16 es esencial para que las partculas broten desde esa membrana. Es incierta la ruta de egreso de los viriones una vez ubicados en el espacio formado entre las membranas interna y externa de la envoltura nuclear. La ms aceptada afirma que las partculas envueltas migran por el citoplasma dentro de la luz del retculo endoplsmico o en vesculas pertenecientes al aparato de Golgi o del sistema trans-Golgi, donde maduran las glicoprotenas. De esta forma el virus saldra de la clula siguiendo el aparato secretor celular, a travs de vesculas que se fundiran con la membrana plasmtica y liberaran a las partculas virales o, alternativamente, cambiando su envoltura por una nueva obtenida de la membrana plasmtica celular. Como consecuencia de todo este proceso, el virus induce en la clula infectada cambios morfolgicos sustanciales, tales como el redondeamiento, la eventual formacin de sincicios y alteraciones nucleares que, en conjunto, constituyen el efecto citoptico viral (ECP).

LA INFECCIN LTICA Y LA LATENCIA VIRAL Desde el clsico trabajo de Lascano y Berra donde se aplic por primera vez el mtodo de inmunoperoxidasa (PAP) para el seguimiento de una infeccin experimental por HSV-1, se confirm desde el punto de vista histopatolgico e inmunocitoqumico lo que haba sido propuesto anteriormente por mtodos no tan precisos: el HSV replica inicialmente en un epitelio y posteriormente avanza por el sistema nervioso perifrico hasta alcanzar la mdula espinal y el encfalo cuando el virus haba sido inoculado, por ejemplo, en la almohadilla plantar de la pata del ratn. El mtodo PAP permite realizar estudios in situ de la presencia de antgenos virales que son casi siempre incontrovertibles, ya que los antgenos aparecen coloreados en los cortes histolgicos, y los tejidos y clulas infectadas pueden caracterizarse simultneamente contracoloreando tnuemente los preparados con hematoxilina. Este mtodo permiti reemplazar al clsico procedimiento de aislamiento de virus de cada uno de los rganos mediante la homogeneizacin de los distintos tejidos supuestamente infectados y la posterior inoculacin en cultivos celulares. La aplicacin sistemtica del mtodo PAP, permiti determinar con precisin la progresin de la infeccin intravaginal por el HSV-2 en ratones, el estudio experimental de la infeccin de HSV-2 durante la preez o el compromiso de los linfocitos T en la infeccin genital a travs del seguimiento de la infeccin intravaginal en ratones genticamente atmicos. Una vez alcanzado el sistema nervioso central (SNC), en los modelos murinos habitualmente el HSV-1 provoca la muerte del animal debida a una encefalitis. En otros modelos, en cambio, se establece un tipo de infeccin similar al que ocurre en el humano, denominada latente. La infeccin latente se caracteriza porque el virus se encuentra en el ncleo de las neuronas en forma episomal (es decir, circularizado y extracromosmico), con la sola transcripcin de 3 intrones denominados LATs (latency-associated transcripts), que tienen 8,3, 2 y 1,5 Kpb. Es decir que el DNA viral se encuentra en el ncleo de las neuronas latentemente infectadas en forma circularizada, slo transcribe los LATs (que no se traducen en la sntesis de protena alguna ya que no tienen la polaridad del RNA mensajero) y no expresa protenas en la membrana plasmtica celular. Este es un verdadero mecanismo de evasin del virus para no ser detectado dentro de las neuronas por la intensa respuesta inmune celular y humoral concomitante que se observa durante el estadio de latencia. Otros mecanismos de evasin han sido descriptos, incluyendo uno recientemente detectado que implica el aumento de la liberacin de Galectina-1 luego de la infeccin por HSV-1, lo que lleva a la apoptosis de los linfocitos T. Simultneamente los LATs contribuyen a evitar la apoptosis de la neurona que alberga al HSV-1 durante la fase de latencia, hecho que sera esperable luego de una infeccin viral aguda de esas clulas, y estaran tambin involucrados en el tropismo viral. Otros genes de importancia son el GRE (elemento de respuesta a los glucocorticoides) que responde al contacto con el receptor de glucocorticoides aumentando la replicacin viral, y el gen que codifica para la enzima Timidina Kinasa (TK). Esta enzima es la responsable de la accin del frmaco aciclovir e interviene en la neurovirulencia del HSV. Los mecanismos moleculares que hacen mantener el estado de latencia son todava desconocidos en su mayor parte. Existen bsicamente 2 teoras para explicarlos (seleccionadas de las mltiples especulaciones e hiptesis publicadas). Una de ellas se basa en que, dado que el DNA del HSV-1 es bicatenario y que sus genes alfa son esenciales para iniciar la replicacin viral y en consecuencia un ciclo ltico, es curioso el hecho de que en la cadena complementaria a los genes alfa 0 y alfa 4 se encuentra la secuencia nucleotdica 3

que codifica a los LATs. De acuerdo a esta teora, la sntesis de los LATs sera de naturaleza anti-RNA mensajero de los genes alfa mencionados, inhibiendo de esta manera el comienzo de la transcripcin del genoma viral por la inhibicin de la expresin de los genes alfa 0 y alfa 4. Una segunda teora, ms reciente, propone una mayor participacin de algunos factores celulares en el mantenimiento del estado de latencia. En este sentido, es sabido que un factor crtico para que el genoma del HSV-1 ubicado en el ncleo celular comience su transcripcin es su activacin por una protena del tegumento del virus, la VP16, que viaja hacia el ncleo en forma independiente del trayecto realizado por la nucleocpside viral. Existen evidencias experimentales que indican la presencia de VP-16 conjugada con un factor celular denominado Oct-1 y otra protena celular denominada HCF (de host cell factor) en el citoplasma de las clulas latentemente infectadas con HSV-1. Si estas clulas reciben en forma experimental algunos de los estmulos conocidos para la reactivacin de la infeccin herptica (todos ellos tendientes a un estado de stress celular) el complejo formado por VP-16, Oct-1 y C se translada del citoplasma al ncleo y acta como un factor de transcripcin del genoma viral, especialmente sobre los genes alfa 0 y alfa 4, permitiendo iniciar de esta manera la sntesis de nuevas molculas de DNA viral, su posterior encapsidacin intraneuronal y su migracin intra-axonal hacia el epitelio del dermatoma correspondiente a la neurona infectada. Si, en cambio, el estmulo no existiera, el complejo mencionado permanecera en el citoplasma y, en consecuencia, los genes alfa no seran transcriptos, manteniendo de ese modo el estado de latencia. Durante el ao 2006 se descubri el primer factor exclusivamente neuronal humano que estara involucrado en la latencia viral: la protena Zanghfei. Esta protena acta sobre VP-16, impidiendo la formacin del trmero VP-16-Oct-1-HCF y, de esta forma, impidiendo la replicacin viral. Esto contribuira al mantenimiento de la latencia. Otro hecho reciente fue la observacin de que, durante la latencia, los genes LATs promueven el ensamblado de heterocromatina celular sobre los promotores de los genes virales involucrados en la lisis celular. Este mecanismo epigentico est asociado a la metilacin de algunas histonas celulares y tambin contribuira al mantenimiento de la latencia, as como la codificacin por parte del virus de micro RNAs, que anulan la expresin de algunos genes virales. Ms recientemente se detectaron poblaciones oligoclonales de linfocitos T CD8+ infiltrando a las neuronas latentemente infectadas en el ganglio de Gasser y obtenidos de cadveres humanos. No obstante, no est claro cmo estas clulas, que pueden liberar sustancias lticas, no lo hacen en este caso y de esa forma no destruyen a las neuronas. Lo reciente de esta publicacin (2007) hace que todava sea prematuro analizar el papel de estos linfocitos en la latencia. Cualesquiera sean los mecanismos involucrados en el mantenimiento del estado de latencia el hecho es que, luego de su reactivacin, el HSV-1 migra hacia el epitelio que forma parte del dermatoma y replica activamente en l, provocando la lisis de las clulas de la capa de Malpighi y la posterior espongiosis (edema intercelular), que llevar ms tarde a la formacin de vesculas mltiples repletas de virus. Estas vesculas por ltimo se resolvern con la formacin de costras, dando fin al episodio de reactivacin.

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