Microbiologa

De:

Wagner Junior Delgado Arteaga

Docente:

DR. Dolores Vzquez

Curso:

3er nivel A

ndice
Temas Pg. Tincin de Gram

Colorantes que se utilizan en la Tincin de Gram

Tcnica de la coloracin Gram

Para qu sirven el mtodo de Gram en la Tincin

Fundamentos de diferenciacin de Gram positivo y Gram negativo

Ejemplo de las bacterias con la tincin de Gram

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Glosario

Bibliografa

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Tincin de Gram
La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial
empleado en Bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

Colorantes que se utilizan en la Tincin de Gram

Violeta de genciana.- es el ingrediente activo en el colorante de Gram, usado para clasificar bacterias. El violeta de genciana destruye clulas, y es usado en desinfectante de intensidad moderada externo. El violeta de genciana es muy venenoso para la mayora de los animales, cachorros y gatos incluidos; no debe ser usado para desinfeccin de la piel de estos animales. Yodo.- acta como un mordente, es decir ayuda a la fijacin del colorante previo que has aplicado Alcohol cetona.- acta en forma contraria, ayudando a arrastrar el colorante excedente que no haya fijado a las paredes celulares Safranina.- es un colorante biolgico, de contraste que se utiliza en la Tincin de Gram para proporcionar un color violeta ms intenso a las bacterias Gram+ y tie de rosa a las bacterias G- ; en histologa y en citologa.

Otros colorantes 3

Utiliza varios colorantes (cristal violeta 1m, Yodo 1m, lavado con alcohol, Safranina 30 seg) Colorantes Bsicos: I. II. III. IV. V. VI. Tionina cristal violeta violeta de genciana rojo neutro fucsina bsica hematoxilina. Neutros: I. II. Eosinato de azul de metileno. Eosinato de azur de metileno.

Colorantes cidos: I. II. III. Acido pcrico Fucsina acida, Eosina.

Indiferentes: I. II. Sudan III Rojo escarlata

Tcnica de la coloracin Gram

Fijar un frotis

Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica y esperar que enfre un poco. Tomar el asa (previamente flameada) y con sta tomar un poco de muestra. Una vez obtenida una pequea cantidad de la muestra (con el asa), hacer que sta tenga contacto con una lmina portaobjetos, la cual servir para depositar la muestra contenida en el asa. Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina portaobjetos, proceder a realizar la extensin de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lmina, de tal forma que al terminar la extensin, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lmina.

Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aqul en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.
Tincin

Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 C.
Enjuague

Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, sta debe caer sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un milmetro de espesor. Tambin el enjuague se debe realizar poniendo la lmina portaobjetos en posicin inclinada hacia abajo... La solucin de cristal violeta, se recomienda sea al 1%.
Mordiente

Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 1minuto ms. El mordiente es cualquier sustancia que forma compuestos insolubles con colorantes y determina su fijacin en las bacterias.
Decoloracin (paso crtico)

Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van aadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta

lograr que ste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra ms lquido azul.
Lavado y secado

Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lmina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita.
Tincin de contraste

Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto.
Nuevo enjuague

Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observacin microscpica.

Para qu sirven el mtodo de Tincin de Gram

La tincin de Gram es una prueba esencial y obligatoria a realizar en el laboratorio de microbiologa. Es una etapa preliminar que se utiliza para diferenciar las bacterias Gram positivas de las Gram negativas. El mtodo tradicional de tincin Gram es un proceso largo y complejo que requiere de experiencia tcnica y de numerosas etapas manuales, lo que tiene como consecuencia una menor fiabilidad y reproducibilidad. Es el mtodo de identificacin de bacterias mediante una tincin especfica, desarrollado por el mdico dans Hans Christian Joachim Gram, es un procedimiento utilizado universalmente. En un primer momento las bacterias se tien con violeta de genciana (derivado metilado anilnico) y despus se tratan con la solucin de Gram (1 parte de yodo, 2 partes de yoduro potsico y 300 partes de agua); por ltimo se lavan con alcohol etlico, y unas bacterias

retienen el fuerte color azul de la violeta de genciana y otras se decoloran por completo. A veces se aade una contratincin con fucsina o eosina para teir las bacterias decoloradas de color rojo y hacerlas ms visibles. Se denominan bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tincin azul y bacterias Gram negativas a las que quedan decoloradas. Algunas bacterias presentan capacidad variable de tincin de Gram y se llaman Gram variables. Bacterias Gram positivas tpicas son los estafilococos que producen fornculos; Gram negativas representativas son la Escherichia coli de la flora intestinal o los bacilos de la tos ferina; Gram variables son los bacilos de Koch de la tuberculosis.

Fundamentos de diferenciacin de Gram positivo y Gram negativo

Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado solamente en el peptidoglicano (tambin conocido como murena) Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azulviolcea.

Ejemplo de las bacterias con la tincin

Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teidas con la tincin de Gram.

Bacterias Gram positivas de Bacillus anthracis (bacilos morados) que producen una enfermedad llamada Carbunco, encontrados en una muestra de lquido cerebroespinal. Si hubiera una especia de bacteria Gram negativa apareceria de color rosa. El resto son leucocitos atacando la infeccin.

Una tincin Gram en la que observamos un mezclado de Staphylococcus aureus (Coco Gram positivo) y Escherichia coli (bacilo Gram negative)

Glosario:
Lugol.- este producto se emplea frecuentemente como desinfectante y antisptico, para la desinfeccin de agua en emergencias y como un reactivo para la prueba del yodo en anlisis mdicos y de laboratorio. Fucsina.- la fucsina cida es un colorante magenta utilizado en histologa, en las tinciones de mallory, van gieson y tricrmica de masson. Y dependiendo del tejido a teir, da estos resultados: * colgeno: azul oscuro. * musculatura: anaranjado * cromatina rojo, amarillo opaco. Hematoxilina.- es un compuesto que se obtiene de la planta leguminosa haematoxylum campechianum l., conocida tambin con el nombre de palo de campeche. Es un producto natural que al ser oxidado constituye una substancia de color morado oscuro denominada hematena. Eosina.- es un colorante cido, por lo cual se denomina basfilo (ya que tiene afinidad por las sustancias alcalinas), en forma de polvo rojo cristalino, de uso ampliamente extendido en el mbito industrial, desde la industria textil hasta el estudio biolgico e histolgico. Como curiosidad, tambin se utiliza en la coloracin de la gasolina Mordiente.- el mordiente es una sustancia empleada en tintorera que sirve para fijar los colores en los productos textiles. La funcin del mordiente es favorecer la fijacin del colorante en las fibras. Este trmino es usado principalmente en la industria textil Fosfolpidos.- los fosfolpidos son un tipo de lpidos anfipticos compuestos por una molcula de glicerol, a la que se unen dos cidos grasos (1,2-diacilglicerol) y un grupo fosfato.

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Bibliografa.http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram http://espanol.answers.yahoo.com/question/index?qid=20060909112406 AAhjBR6 http://espanol.answers.yahoo.com/question/index?qid=20060909112406 AAhjBR6 http://espanol.answers.yahoo.com/question/index?qid=2008092606330 2AAzfQ7Z http://espanol.answers.yahoo.com/question/index?qid=20111014141321AAVOqN O http://www.monografias.com/trabajos15/tinciones/tinciones.shtml http://books.google.com.ec/books?id=Nxb3iETuwpIC&pg=PA69&lpg=PA 69&dq=tincion+de+gram+que+colorantes+emplea&source=bl&ots=z82quK 92qD&sig=S_q9mlom09dMN4KtQi9Z2WMes0&hl=es&sa=X&ei=EoWJUeinKIX50gG_woHAB g&ved=0CGAQ6AEwBQ#v=onepage&q=tincion%20de%20gram%20que% 20colorantes%20emplea&f=false http://mediens.blogspot.com/2011/10/como-realizar-una-tincion-degram.html

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