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Культура Документы
em
Bioqumica
2012/2013
Biologia Molecular
RELATRIOS
Turma 2 | Grupo 1 Professores responsveis: Dr. Cladio Sunkel e Dr. Carlos Conde Realizador por: Filipa Barros, Henrique Fernandes, Joo Rodrigues, Lisete Moutinho e Sara Moniz
P R E F C I O
O
presente
documento
compila
os
relatrios
de
todos
os
trabalhos
prticos
e
terico- prticos
realizados
ao
longo
do
segundo
semestre
do
ano
lectivo
2012/2013
da
licenciatura
em
Bioqumica
(Faculdade
de
Cincias
da
Universidade
do
Porto
e
Instituto
de
Cincias
Biomdicas
Abel
Salazar
da
Universidade
do
Porto).
Os
trabalhos
foram
realizados
no
mbito
da
unidade
curricular
de
Biologia
Molecular.
Toda
a
informao
que
no
est
contemplada
no
manual
dos
trabalhos
prticos
da
unidade
curricular
que
foi
disponibilizado
pelo
professor
e/ou
material
utilizado
nas
aulas
tericas
tem
a
sua
fonte
citada
na
bibliografia.
N D I C E
EXTRAO
DE
DNA
GENMICO
DE
DROSOPHILA
MELANOGASTER
....................................
4
OBJECTIVOS
..............................................................................................................................
4
INTRODUO
TERICA
.........................................................................................................
4
METODOLOGIA
.....................................................................................................................
5
REAGENTES
.......................................................................................................................
5
EQUIPAMENTOS
................................................................................................................
5
procedimento
experimental
..............................................................................................
5
RESULTADOS
EXPERIMENTAIS
......................................................................................................
6
CONCLUSES
.........................................................................................................................
8
EXTRACO
DE
DNA
PLASMDICO
DE
ESCHERICHEA
COLI
...................................................
9
OBJECTIVOS
..............................................................................................................................
9
INTRODUO
TERICA
.........................................................................................................
9
METODOLOGIA
...................................................................................................................
10
REAGENTES
.....................................................................................................................
10
EQUIPAMENTOS
..............................................................................................................
10
procedimento
experimental
............................................................................................
10
RESULTADOS
EXPERIMENTAIS
....................................................................................................
10
CONCLUSES
.......................................................................................................................
10
ANLISE
ELETROFORTICA
DE
DNA
DIGERIDO
COM
ENZIMAS
DE
RESTRIO
..................
12
OBJECTIVOS
............................................................................................................................
12
INTRODUO
TERICA
.......................................................................................................
12
METODOLOGIA
...................................................................................................................
14
REAGENTES
.....................................................................................................................
14
EQUIPAMENTOS
..............................................................................................................
14
procedimento
experimental
............................................................................................
14
RESULTADOS
EXPERIMENTAIS
....................................................................................................
15
CONCLUSES
.......................................................................................................................
16
ELABORAO
DO
MAPA
DE
RESTRIO
DE
UM
PLASMIDEO
RECOMBINANTE
.................
17
OBJECTIVOS
............................................................................................................................
17
INTRODUO
TERICA
.......................................................................................................
17
METODOLOGIA
...................................................................................................................
18
procedimento
experimental
............................................................................................
18
RESULTADOS
EXPERIMENTAIS
....................................................................................................
18
CONCLUSES
.......................................................................................................................
19
DISCUSSO
.............................................................................................................................
22
PCR
POLIMERASE
CHAIN
REACTION
..........................................................................
23
OBJECTIVOS
............................................................................................................................
23
INTRODUO
TERICA
.......................................................................................................
23
2
METODOLOGIA ................................................................................................................... 24 REAGENTES ..................................................................................................................... 24 EQUIPAMENTOS .............................................................................................................. 24 procedimento experimental ............................................................................................ 24 RESULTADOS EXPERIMENTAIS .................................................................................................... 25 CONCLUSES ....................................................................................................................... 27 TRANSFORMAO DE ESCHERICHIA COLI COM DNA PLASMDICO .................................... 28 OBJECTIVOS ............................................................................................................................ 28 INTRODUO TERICA ............................................................................................................. 28 METODOLOGIA ................................................................................................................... 29 Reagentes ........................................................................................................................ 29 Procedimento Experimental ............................................................................................ 29 RESULTADOS EXPERIMENTAIS .................................................................................................... 30 CONCLUSES .......................................................................................................................... 33 SEQUENCIAO DE DNA .................................................................................................. 35 OBJECTIVOS ............................................................................................................................ 35 INTRODUO TERICA ............................................................................................................. 35 RESULTADOS EXPERIMENTAIS .................................................................................................... 36 CONCLUSES .......................................................................................................................... 38 CLONAGEM DE CDNA Y-TUB ............................................................................................. 39 OBJECTIVOS ............................................................................................................................ 39 INTRODUO TERICA ............................................................................................................. 39 METODOLOGIA ................................................................................................................... 39 Reagentes ........................................................................................................................ 39 Equipamento ................................................................................................................... 39 Procedimento Experimental ............................................................................................ 39 RESULTADOS EXPERIMENTAIS .................................................................................................... 40 CONCLUSES .......................................................................................................................... 41 BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................. 42 ANEXOS ........................................................................................................................... 43
Com
a
lise
celular
todos
os
compostos
que
intercelulares
so
libertados
para
a
soluo
e
geralmente
provocada
por
rompimento
mecnico
ou
se
necessrio,
utilizando
enzimas
que
degradem
a
parede
celular.
frequente
utilizarem-se
tambm
detergentes
e
assim,
a
purificao
do
DNA
dar-se-
com
a
libertao
de
todos
os
compostos
intercelulares
por
precipitaes
diferenciais
e
ao
de
enzimas
como
protases
e
RNAases.
O
DNA
genmico
obtido
pelos
processos
referidos
anteriormente,
pode
ser
utilizado
em
variados
processos
moleculares
(Southern
blotting,
bancos
genmicos,
etc).
Deve
ser
guardado
solubilizado
a
70C
(ou
20C).
Porm,
congelao
e
descongelao
sucessivas
provocam
quebras
nas
cadeias
de
DNA.
Ento,
para
armazenamentos
a
longo
prazo
convm
ser
guardado
em
alquotas
enquanto
que
a
curto
prazo,
aconselha-se
a
preservao
a
4C.
Para
o
armazenamento,
solubilizado
em
tampo
TE,
onde
o
EDTA
previne
a
degradao
do
DNA
por
ao
quelante
de
metais
pesados
e
caties
que
promovem
a
quebra
das
ligaes
fosfodister
por
ao
das
DNAases.
A
electroforese
em
gel
acionada
por
um
campo
elctrico
frequentemente
utilizada
para
separar
e
estimar
o
tamanho
de
fragmentos
de
DNA.
Sujeitos
a
um
campo
elctrico,
os
cidos
nucleicos
migram
em
direo
ao
plo
positivo,
uma
vez
que
apresentam
carga
negativa
a
pH
neutro. A agarose funciona como uma rede cujos poros deixam passar mais facilmente as molculas mais pequenas, que vo portanto migrar mais do que as de maiores dimenses. A migrao de um fragmento de DNA depende da sua conformao. De um modo generalista, o cccDNA migra mais rapidamente do que os fragmentos do mesmo tamanho de dsDNA porque a conformao circular tem menor raio hidrodinmico (devido aos super- enrolamentos). No DNA circular, com uma quebra numa ligao fosfodister, os enrolamentos desaparecem pois h uma quebra de uma ligao fosfodister; este facto torna-a a forma mais lenta de migrao. A distncia de migrao dos vrios fragmentos depende tambm da voltagem aplicada e da concentrao de agarose empregue. Pelas mesmas razes da influncia do peso molecular na mobilidade, o aumento da concentrao da agarose leva a um retardamento da migrao electrofortica. A concentrao de agarose a usar deve ser adaptada gama de tamanhos de fragmentos que se pretende resolver. Assim, em suma a distncia que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicao, comparada com a distncia que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esses fragmentos so os ladders (marcadores de peso molecular), misturas de segmentos de DNA de tamanhos variveis, e que so aplicados em um poo no gel no incio do processo. Os gis de agarose so, geralmente, corados com solues de brometo de etdio (EtBr), uma substncia intercalante que revela os cidos nucleicos ao fluorescer sob luz ultravioleta. 5
Concentraes de at 1ng de DNA podem ser visualizadas por exame direto do gel na luz ultravioleta.
METODOLOGIA
REAGENTES
Usou-se
tampo
de
lise
e
Brometo
de
etdeo
(mutagnico
muito
forte).
EQUIPAMENTOS
Recorreu-se
a
um
espectrofotmetro.
Suporte
para
o
gel
de
agarose
e
fonte
de
alimentao
para
a
electroforese.
PROCEDIMENTO
EXPERIMENTAL
A.
Extrao
de
DNA
genmico
de
Drosophila
Melanogaster
Recolha
de
cerca
de
200
moscas
adultas,
procendendo
homogeneizalo
em
5
ml
de
tampo
de
lise
previamente
arrefecido
em
gelo.
Centrifugao
a
1000
rpm
,
durante
um
minuto.
Transferncia
do
sobrenadante
(correspondente
suspenso
de
ncleos)
para
um
tubo
de
Falcon.
Adio
de
50
l
de
soluo
de
proteinase
K
(
a
10
mg/ml)
suspenso
de
ncleos
e
incubao
a
37C
durante
2
horas.
Isolamento
de
uma
fraco
de
ncleos
isolados
e
ressuspendidos
em
500
l.
Adio
de
500
l
de
soluo
de
fenol
equilibrado
em
tampo
TE
(
10mM
Tris-
HCL
pH
8;
1mM
EDTA
pH
8
)
suspenso
de
ncleos.
Agitao
por
inverso
do
tubo
e
centrifugao
a
5000
rpm
durante
2
minutos.
Transferncia
da
fase
aquosa
para
um
novo
tubo.
Adio
de
500
l
da
mistura
fenol/clorofrmio/lcool
isoamilico
e
agitar
cuidadosamente
por
inverso
do
tubo.
Nova
centrifugao
a
5000 rpm durante 2 minutos. Transferir novamente a fase aquosa para novo tubo. Adicionar de 500 l da soluo de clorofrmio , repetindo-se a mistura da preparao por inverso do tubo seguida de nova centrifugao mesma rotao e intervalo de tempo que a anterior e transferncia da fase aquosa para novo tubo. Adio de 100 l da soluo de NaCl e 900 l de etanol absoluto frio fase aquosa e misturar bem, seguindo-se nova centrifugao a 12000 rpm durante dez minutos a 4C. Remoo do sobrenadante com uma micropipeta e adio de 500 l de uma soluo de lavagem de etanol 70% ao DNA precipitado. Centrifugao a 12000rpm durante 2 minutos, igualmente a 4C. Remoo do novo sobrenadante e secagem do sedimento na estufa a 37C durante 5 minutos. Dissoluo do sedimento em 50 l de tampo TE. B. Verificao da ao de tratamentos fsicos sobre a integridade do DNA genmico Retirar 10 l da amostra de DNA genmico para um tubo Eppendorf. Um dos DNAs vortexado vigorosamente durante dois minutos e colocado em gelo; outro aquecido em gua at a ebulio, e finalmente, arrefecido em gelo. C. Determinao da concentrao e grau de pureza do DNA Fazer o zero da absorvncia, com o espectrofotmetro ajustado a 260 nm, com gua pura numa cuvete de quartzo. Adicionar 695 l de gua ultra-pura e 5 l da amostra de DNA (diluio de 140). Tapar a cuvette com parafilme e inverter vrias vezes. Ler a absorvncia a 6
260nm. Repetir o procedimento e fazer a leitura a 280nm. Calcular a concentrao de DNA e o grau de pureza da amostra D. Electroforese de DNA e preparao do gel de agarose Pesar a agarose para um frasco e adicionar 40 ml de tampo TAE 1. Aquecer o tampo e a agarose at esta se dissolver totalmente. Uma vez arrefecida a soluo de agarose, adicionar 1 l de soluo de brometo de etdeo (a 10 mg/ml). Verter a soluo sobre um molde, utilizando-se um pente para a formao dos poos, onde sero colocadas as amostras de DNA. O gel deixado arrefecer para que solidifique. Remover o pente e colocar o gel na tina de electroforese submergido em tampo TAE 1. Aps colocao do tabuleiro na tina de electroforese, cobrir o gel com tampo de electroforese, 1 a 2 mm acima da superfcie do gel.
RESULTADOS
EXPERIMENTAIS
Determinao
da
concentrao
e
do
grau
de
pureza
do
DNA
Foi
determinada
a
absorvncia
no
comprimento
de
onda
de
260nm
uma
vez
que
esta
proporcional
quantidade
de
cidos
nucleicos.
Registou-se
tambm
a
um
comprimento
de
onda
a
280nm,
porque
proporcional
quantidade
de
protenas
com
resduos
aromticos.
Assim
podemos
avaliar
a
contaminao
da
amostra
de
DNA
por
protena.
Grau pureza DNA = A260=0,452
A280=0,222
A(260nm) = 2,04
A(280nm)
Tabela
1
Distncias
migradas
pelas
bandas,
respectivos
pesos
moleculares
e
logaritmos.
dmigrada/mm
PM/pb
log(PM)
46,07
10000
4,000
49,88
8000
3,903
60,15
6000
3,778
65,65
5000
3,699
72,16
4000
3,602
77,91
3000
3,477
87,64
2500
3,398
95,54
2000
3,301
105,57
1500
3,176
119,51
1000
3,000
129,45
800
2,903
137,91
600
2,778
149,71
400
2,602
166,04
200
2,301
4,500
4,000
Log(PM)
3,500
3,000
2,500
log(PM)
=
-0,0133
dmigrada
+
4,5749
R
=
0,9958
A=lc
Assim:
(1)
!"# = 2,26 g mL!! Uma vez que a diluio foi de 5L para 700L: !"# = 316,4 g mL!! Clculo dos pesos moleculares das amostras
Figura 1 Electroforese em gel de agarose. gDNA (DNA genmico) (1), gDNA vortexado intensamente (2); gDNA fervido (3); gDNA pipetada mltiplas vezes (4). DNA plasmdico (5) (referente ao trabalho seguinte Extrao do DNA plasmdico da E.coli); marcadores de pares de bases (6). 7
Tabela 2 Distncias migradas por cada banda nos poos de 1 a 5. Respectivo clculo do nmero de pares de bases com base na equao da reta obtida pela regresso representada na figura 2. Os valores relativos ao poo 5 sero usados na anlise dos dados do prximo trabalho. Poo 1 dmigrada/mm 32,12 120,56 171,18 33,45 120,10 169,88 154,32 33,90 121,82 166,87 141,00-174,13 PM/pb 14 051 936 199 13 490 950 207 333 13 305 901 227 501-182
sendo por isso possvel a estimativa quantitativa do DNA da amostra relativamente a do padro (clivado com Hind III). Os poos 1, 2 e 4 apresentam uma banda correspondente a aproximadamente 13500 pb que corresponde, ento, ao gDNA. Contudo o aparecimento de outras bandas nesses poos indicam a contaminao da amostra. A banda mais intensa, provavelmente no ser uma contaminao, dado que a determinao do grau de pureza do gDNA resultou num valor aprecivel para a pureza da amostra obtida. Assim poder tratar-se de gDNA que sofre supercoiling e que, portanto, apresenta uma maior distncia percorrida no gele de agarose. A banda que mais migrou corresponder, provavelmente a contaminaes por RNA. Uma forma de eliminar estas contaminaes, era recorrer a RNAses que degradasses o RNA e purificassem assim a amostra de gDNA. Em relao aos tratamentos a que o gDNA foi sujeito, verifica-se que apenas a fervura foi capaz de destruir o DNA. Uma vez que tanto os poos 2, como 4 apresentam um perfil idntico ao 1 (controlo). O facto do poo 3 apresentar uma banda muito intensa que migrou muito no gel, isto indica que o DNA foi desnaturado e cortado em vrias pores fazendo com que se formassem vrias pores de DNA com poucos pares de bases (cerca de 300 pb). Conclui-se ento que o vortexar ou pipetar repetidamente o DNA no afeta, de forma alguma, a sua integridade. Salvaguarda-se que a resoluo do gel no permite obter valores, relativos ao nmero de pares de bases de cada fragmento, que possam ser tomados em considerao de forma absoluta. Temos apenas dados comparativos e valores aproximado 8
2 3 4 5
CONCLUSES
A
absoro
de
radiao
ultravioleta
por
parte
dos
cidos
nucleicos
a
base
da
metodologia
utilizada
para
determinar
o
grau
de
pureza
do
DNA
e
que
se
designa
por
mtodo
espectrofotomtrico.
Assim,
a
quantidade
que
radiao
ultravioleta
que
absorvida
relaciona-se
proporcionalmente
com
a
quantidade
de
DNA
da
amostra.
A
amostra
de
DNA
genmico
extrada
de
Drosophila
melanogaster
,
obtida
com
um
elevado
grau
de
pureza
com
uma
concentrao
de
316,4
g/mL
e
possu
cerca
de
Um
mtodo
alternativo
seria
um
teste
utilizando
fluorescncia
induzida
pelo
brometo
de
etdeo
com
posterior
comparao
com
a
fluorescncia
de
uma
srie
de
padres
que
apresentam
uma
gama
de
fragmentos
com
vrias
dimenses.
Cada
barra
corresponde
a
uma
concentrao
de
DNA
bem
definida,
INTRODUO
TERICA
Muitas
bactrias,
para
alm
do
DNA
genmico
cm
cerca
de
4
milhes
de
pares
de
bases,
possuem
DNA
plasmdico
em
grandes
quantidades,
chegando
a
alguns
milhares
de
pares
de
bases.
Estas
molculas,
pequenas,
so
constitudas
por
uma
cadeia
dupla
de
cidos
nucleicos,
devidamente
associados
entre
si,
de
forma
circular
fechada
(cccDNA)
e
possuem
replicao
autnoma.
Estas
caractersticas
morfolgicas
facilitam
a
sua
separao
do
DNA
cromossmico.
Para
alm
disso,
verificou-se
que
os
plasmdeos
contm
genes
especficos
que,
na
bactria
que
os
possui,
codificam
todo
um
conjunto
de
informaes
de
elevada
importncia
a
nvel
evolutivo.
Assim,
estas
molculas
de
DNA,
hoje
em
dia
extremamente
manipuladas
pelo
homem,
revelaram-se
bastante
teis
em
Engenharia
Gentica
pela
sua
capacidade
de
conferir
fentipos
vantajosos
e
variados,
tais
como
resistncia
a
metais
pesados,
enzimas
e
antibiticos,
produo
e
catabolismo
de
molculas
orgnicas
complexas
e
9
METODOLOGIA
REAGENTES
Utilizou-se
meio
de
cultura
LB;
Tampo
STET;
Lisozima;
Isopropanol
e
agarose
1%.
RESULTADOS EXPERIMENTAIS
EQUIPAMENTOS
Incubadora;
Vortex;
microcentrfuga.
PROCEDIMENTO
EXPERIMENTAL
Inoculou-se,
durante
a
noite,
a
estirpe
E.
coli
com
o
plasmdeo
a
purificar.
Introduziu-se
1,5
ml
da
cultura
num
tubo
Eppendorf
e
centrifugaram-se
as
clulas
durante
3
minutos
velocidade
mxima.
Aspirou-se,
ento,
o
contedo
sobrenadante
com
ajuda
de
uma
micropipeta.
Adicionou-se
1,5
ml
da
cultura
bacteriana
ao
sedimento
obtido
no
processo
e
200
l
do
tampo
STET,
ressuspendendo-se
o
sedimento
em
vortex
ou
com
a
micropipeta.
Adicioinou- se
4
l
de
lisozima
(50
mg/ml)
e
incubou- se
durante
5
minutos
temperatura
ambiente.
Posteriormente
procede-se
incubao
a
95C
durante
1
minuto,
centrifugao
do
lisado
celular
durante
10
minutos
velocidade
mxima.
Descarta-se
o
sedimento
e
adicionam-se
200
l
de
isopropanol
ao
sobrenadante
e
vortexa- se.
Segue-se
uma
centrifugao
velocidade
mxima,
durante
10
minutos.
Recolhe-se
o
sobrenadante
com
uma
micropipeta
e
seca-se
o
sedimento
a
37C
na
estufa
durante
10
minutos.
Ressuspende-se
o
DNA
em
10
l
de
gua
pura.
Procede-se
realizao
de
uma
electroforese
em
gel
de
agarose
(1%).
Aplicao
de
5
l
da
amostra
misturados
com
5l
de
tampo
de
aplicao.
10
Figura 3 Electroforese em gel de agarose. gDNA (DNA genmico) (1), gDNA vortexado intensamente (2); gDNA fervido (3); gDNA pipetada mltiplas vezes (4). Isto referente ao trabalho prtico Extraco do DNA genmico de Drosophila melanogaster. DNA plasmdico (5); marcadores de pares de bases (6).
CONCLUSES
De
acordo
com
a
imagem
apresentada,
(Figura
3)
podemos
concluir
que
o
plasmdeo
uma
poro
de
DNA
de
menor
peso
molecular
que
o
DNA
cromossmico,
tendo
em
conta
que
foi
o
material
que
apresentou
maior
migrao
no
gel,
o
que
est
de
acordo
com
o
esperado
tendo
em
conta
que
estas
pores
de
material
gentico
so
pequenos
fragmentos
de
DNA
bacteriano
de
forma
circular.
Por
anlise
do
resultado
da
electroforese
(Figura
3
Poo
5),
verifica-se
que
o
DNA
plasmdico
foi
separado
do
demais
material
gentico
da
bactria,
DNA
cromossmico,
com
sucesso.
Isto
porque
no
se
verifica
o
aparecimento
de
outras
bandas no gel que pudessem indiciar a presena de outro DNA ou RNA que esteja a contaminar a amostra. Contudo no podemos inferir, com total certeza, acerca da contaminao por RNA, uma vez que o RNA migraria para valores prximos dos migrados pelo DNA plasmdico e a banda detectada muito grande. A banda em causa engloba fragmentos de cerca de
500 a 200 pb, podendo portanto englobar RNA. Uma forma de certificar a ausncia de RNA na amostra era proceder ao tratamento da amostra com RNAses que degradassem o DNA e repetir a electroforese. Daqui, podemos ainda concluir, que o DNA plasmdico apresenta aproximadamente entre 500 a 200 pb.
11
INTRODUO
TERICA
Os
rpidos
avanos
da
investigao
cientfica,
em
particular
da
Biologia
Molecular,
que
tiveram
lugar
nas
duas
ultimas
dcadas
foram
possveis
em
grande
parte,
devido
capacidade
de
isolar
determinados
segmentos
de
interesse
de
DNA
procaritico
e
eucaritico.
A
clonagem
de
genes
requer
que
as
molculas
de
DNA
sejam
cortadas
de
um
modo
muito
preciso
e
reprodutvel.
Atravs
da
utilizao
das
enzimas
de
restrio
esse
objectivo
facilmente
conseguido,
pois
possuem
a
capacidade
de
ligao
especfica
a
determinados
locais
de
DNA
de
cadeia
dupla
(sequncia
de
reconhecimento)
e
sua
posterior
clivagem,
no
interior
dessa
sequncia
ou
adjacente
a
ela.
De
acordo
com
as
caractersticas
de
corte,
as
endonucleases
de
restrio
so
classificadas
em
trs
tipos.
As
enzimas
do
tipo
I
e
III,
para
alm
da
aco
nuclesica,
tm
aco
modificadora
(metilao)
no
mesmo
domnio
de
reconhecimento
da
protena.
Apesar
destas
enzimas
reconhecerem
sequencias
especificas
de
DNA,
a
actividade
nuclesica
ocorre
de
modo
aleatrio
na
proximidade
da
sequencia
de
reconhecimento
e
dependente
de
ATP.
sondas marcadas para anlises por southern e northern. Existem trs tipos de extremidade resultantes do corte consoante o modo de corte da cadeia dupla. Enzimas de restrio que cortam exatamente no meio da sequncia do palindroma (SmaI) originam extremidades sem nenhuma das duas cadeias protuberante (blunt ends). Outras enzimas cortam na extremidade 5do palindroma reconhecido originando extremidades protuberantes 5de 2-4 bases na forma de cadeia simples (EcoRI) denominadas por extremidades 5coesivas (5 sticky-ends). Outras enzimas cortam na extremidade 3do palindroma originando extremidades protuberantes 3de 2-4 bases na forma de cadeia simples (KpnI) denominadas por extremidades 3coesivas (3 sticky- ends). Como estas enzimas de restrio so, na sua maioria, especficas em relao sequncia de reconhecimento e corte, duas molculas de DNA diferentes que foram digeridas com a mesma enzima, por exemplo BamHI, possuiro extremidades 5 iguais que podem assim emparelhar utilizando as bases que ficaram em cadeia simples, numa reao catalisada por uma DNA Ligase. O resultado da ligao destas duas cadeias ser uma molcula recombinante. Dois factores so essenciais para a eficincia de corte das endonucleases de restrio: pureza do DNA e o tampo de digesto. As impurezas habituais presentes em amostras de DNA (protenas, fenol, clorofrmio, EDTA, SDS e a elevada concentrao de sais) podem inibir por completo determinadas enzimas 13
de restrio. A influncia de todos estes factores varia de enzima para enzima, pelo que se devem ter em conta quando se verifica ausncia de atividade, assegurando-se que as condies de reao foram as ideais. Os componentes essenciais dos tampes de digesto so: tampo Tris (pH 7.58.0), ies de magnsio, cloro, sdio, e potssio; um agente redutor como ditioeritriol, ditiotreitol ou 2-mercaptoetanol. Embora haja especificidade da atividade em relao a todos estes factores, o mais importante a concentrao de ies (fora inica). Assim, dividem-se as enzimas em trs grupos: as que requerem elevada fora inica, mdia fora inica e baixa fora inica. Esta propriedade particularmente importante para digestes com vrias enzimas de restrio em que impossvel a digesto simultnea com enzimas que requerem foras inicas diferentes. Nestes casos, as digestes devem ser feitas em separado, comeando pela enzima de menor fora inica, desnaturar a enzima por calor, ajustar a concentrao de sais e proceder segunda digesto. As consequncias do uso de condies no ideais em digestes com enzimas de restrio so a ausncia de atividade ou o fenmeno de star activity em que a enzima perde a especificidade para a sequncia de reconhecimento, passando a fazer cortes no s nos locais especficos mas tambm noutros locais. Um factor que pode ser importante em alguns casos o grau de metilao do DNA. A produo de enzimas de restrio um mecanismo de defesa das bactrias contra a infeco por DNA exgeno. Para
precaver a ao contra o prprio DNA, estas enzimas de restrio promovem a metilao de nucletidos, ficando ento a sequncia de reconhecimento imune sua ao. Assim, quando se trabalha com DNA plasmdico proveniente de estirpes bacterianas com uma elevada capacidade de metilao, deve-se ter em ateno, tambm, a sensibilidade da enzima a usar para a metilao dos nucletidos da sequncia de reconhecimento. A estratgia mais usada o uso de estirpes bacterianas manipuladas geneticamente para a perda dessa capacidade.
PROCEDIMENTO
EXPERIMENTAL
Pipetar
para
dois
tubos
Eppendorf,
usando
pontas
de
pipeta
diferentes
e
limpas,
15l
de
gua
destilada
e
esterilizada,
2l
de
tampo
de
enzima
de
restrio
5,
2l
de
DNA
plasmdico
e
1l
de
enzima
de
restrio,
por
esta
ordem,
em
que
no
tubo
1
adiciona-se
apenas
EcoRI,
e
no
tubo
2
adiciona-se
apenas
HindIII.
Preparar
uma
terceira
soluo,
pipetando
14l
de
gua
destilada
e
esterilizada,
2l
de
tampo
de
enzima
de
restrio
5,
2l
de
DNA
plasmdico
e
1l
de
cada
enzima
de
restrio
Misturar
cuidadosamente
batendo
levemente
com
o
dedo
no
fundo
do
tubo.
Incubar
a
37
C
durante
1
hora.
Preparao
do
gel
1%
de
agarose:
Pesar
0,4
g
de
agarose
e
adicionar
40
mL
de
tampo
TAE
1x.
Aquecer
at
ebulio
de
forma
a
dissolver
completamente
a
agarose.
Adicionar
1
L
de
brometo
de
etdeo,
agitar
levemente
e
verter
a
soluo
sobre
um
molde,
utilizando-se
um
pente
para
a
formao
dos
poos,
onde
sero
colocadas
as
amostras
de
DNA.
O
gel
deixado
arrefecer
para
que
solidifique.
Remover
o
pente
e
colocar
o
gel
na
tina
de
electroforese
submergido
em
tampo
TAE
1.
Preparao
das
amostras
em
tubos
Eppendorf
para
carregar
o
gel:
No
primeiro
adicionar
5
l
de
DNA
no
digerido
e
5
l
de
tampo
de
aplicao;
no
segundo
adicionar
20
l
de
DNA
digerido
com
HindIII
e
5
l
de
tampo
de
aplicao;
no
terceiro
adicionar
20
l
de
DNA
digerido
com
EcoRI
e
5
l
de
tampo
de
aplicao;
No
quarto
adicionar
20
l
de
14
METODOLOGIA
REAGENTES
Utilizou-se
3
L
de
soluo
enzimas
de
restrio
EcoRI
e
HinIII
estas
devem
ser
mantidas
em
gelo
durante
a
actividade
prtica,
sendo
depois
armazenadas
a
- 20C;
11
L
de
plasmdico
pSK-polo;
6
L
de
tampo
de
enzima
de
restrio
5x;
0,4
g
de
agarose;
tampo
TAE
1x;
1
L
de
brometo
de
etdio;
5
L
marcador
de
peso
molecular
Bioline;
20
L
de
tampo
de
aplicao;
44
L
de
gua
destilada
e
esterilizada.
EQUIPAMENTOS
Utilizou-se
uma
estufa,
um
suporte
para
gel
de
agarose,
uma
fonte
de
alimentao
para
a
electroforese
e
um
transiluminador
de
UV.
DNA digerido com HindIII e EcoRI e 5 l de tampo de aplicao. Carregar o gel com as quatro amostras, carregando um quinto poo com 5 l de marcador de peso molecular. Correr o gel a 100V at a frente do gel chegar a cerca de dois teros do gel. Visualizar o DNA num transiluminador de UV.
cada banda, em cm, e ao logaritmo dos pesos moleculares. PM /pb 10000 8000 6000 5000 4000 3000 2500 2000 1500 1000 800 600 400 200 A partir da aplicao da regresso linear da distncia migrada (d) em funo do logaritmo dos pesos moleculares (log PM) obtm-se a seguinte equao: dmigrada = - 3,811 log(PM) + 17,27 (1) Aplicando a equao (1) s bandas correspondentes s amostras obtm-se os pesos moleculares apresentados na tabela 3. dmigrada / cm 2,40 2,65 2,85 3,09 3,30 3,79 4,10 4,48 5,05 5,95 6,40 6,92 7,12 8,68 Log(PM) 4,00 3,90 3,78 3,70 3,60 3,48 3,40 3,30 3,18 3,00 2,90 2,78 2,60 2,30
RESULTADOS
EXPERIMENTAIS
Aps
a
electroforese
obteve-se
os
resultados
apresentados
na
figura
3.
Figura 4 Gel de agarose 1% corrido a 100V. Da direita para a esquerda: marcador de pesos moleculares; DNA plasmdico por digerir; DNA plasmdico digerido com HindIII; DNA plasmdico digerido com HindIII e EcoRI; DNA plasmdico digerido com EcoRI. Tabela 2 Valores referentes aos pesos moleculares do marcador Bioline em pares de bases, distncia migrada de 15
Tabela 3 Valores referentes s distncias de migrao das bandas das amostras e aos respectivos pesos moleculares. dmigrada / cm 2,50 3,85 2,92 3,13 3,50 5,50 3,51 5,40 PM / pb 7510 3322 5827 5132 4104 1226 4079 1302
No
que
diz
respeito
ao
estudo
do
DNA
digerido
com
diferentes
enzimas
de
restrio,
pode-se
concluir
que
a
EcoRI
possui
duas
zonas
de
corte
no
plasmdeo
recombinante,
o
que
origina
duas
bandas
no
gel,
com
pesos
moleculares
de
4079
pb
e
de
1302
pb.
Em
relao
enzima
HindIII
conclui-se
que
esta
corta
o
plasmdeo
apenas
uma
vez,
fazendo
com
que
este
perca
a
sua
conformao
circular
e
adquira
uma
conformao
linear,
levando
ao
aparecimento
de
apenas
uma
banda.
No
caso
da
digesto
do
DNA
plasmdico
com
as
duas
enzimas,
observa-se
trs
bandas,
o
que
concordante
com
o
esperado,
dado
que
a
insero
do
gene
polo
foi
feita
entre
um
corte
da
EcoRI
e
o
corte
da
HindIII.
Assim,
pode-se
concluir
que
o
fragmento
inserido
correspondente
ao
gene
polo
possui
um
peso
molecular
de
aproximadamente
1302
pb.
CONCLUSES
Analisando
o
gel,
pode-se
verificar
a
presena
de
duas
bandas
no
poo
do
DNA
plasmdico
controlo
e
ainda
uma
terceira,
pouco
visvel.
O
que
seria
de
esperar
era
obter-se
3
bandas
distintas,
referentes
s
3
formas
de
DNA
plasmdico:
DNA
circular,
DNA
linear
de
cadeia
dupla
e
DNA
superenrolado.
16
INTRODUO
TERICA
Para
a
manipulao
de
fragmentos
de
DNA
genmico
de
maior
interesse
a
obteno
de
pores
gnicas
de
menores
dimenses,
pois
estas
molculas
so
quase
sempre
demasiado
grandes
para
poderem
ser
manipulados
diretamente.
Os
plasmdeos
so
molculas
circulares
duplas
de
DNA
extra
cromossomais
capazes
de
se
reproduzir
independentemente
do
DNA
cromossmico.
Podem
estar
presentes
em
duas
ou
mais
cpias
na
clula
e
podem
variar
entre
5
e
400
kb
(kilobases).
Este
plasmdeos,
sendo
capazes
de
amplificar
o
segmento
de
DNA
neles
inserido,
so
utilizados
como
vetores
de
clonagem.
Para
isso,
tm
que
possuir
certas
propriedades
como
ter
uma
origem
de
replicao
e
possuir
Mltiplos
Stios
de
Clonagem
(MSC),
ou
seja,
vrios
locais
nicos
de
clivagem
para
endonucleases
de
17
Figura 5 Esquema de preparao de um plasmdeo recombinante. Como consequncia, so obtidas inmeras pores de dimenses mais reduzidas, cujo peso molecular determinado em gel de agarose, mapas de restrio. importante referir que as extremidades referidas dessas mesmas pores so sequncias nucleotdicas conhecidas, que correspondem sequncia de reconhecimento da(s) enzima(s) de restrio utilizada(s) durante a reao. A relao entre o nmero de pares de bases correspondente a cada uma das bandas do DNA padro (marcador) e a distncia percorrida por essas mesmas bandas num gel de agarose permite determinar qual a equao da reta que
relaciona estas duas variveis, tendo em conta que as bandas correspondentes ao marcadores tm pesos moleculares conhecidos. Assim, a elaborao de mapas de restrio rigorosos permite a seleo de sequncias genmicas de dimenses mais reduzidas que podem ser clonados posteriormente facilitando o seu estudo. Estes mapas podem, portanto, ter aplicaes de grande importncia em gentica molecular, tais como localizao fsica dos locais de corte de enzimas de restrio ao longo da molcula de DNA, bem como identificar segmentos de DNA homlogos.
Tabela
4
Lista
dos
pesos
moleculares
(pb)
de
cada
banda
do
marcador
e
respectivos
valores
da
distncia
migrada
no
gel
(cm).
Marcadores
de
PM/pb
23130
9416
6557
4361
2322
2027
564
Com
estes
valores,
traou-se
o
grfico
da
distncia
migrada
pelas
bandas
do
marcador
em
funo
do
logaritmo
dos
respectivos
pesos
moleculares.
Assim,
obtm-se
uma
reta
que
permitir
calcular
os
pesos
moleculares
das
bandas
do
DNA
digerido.
5,60
4,60
d/cm
3,60
2,60
1,60
0,60
2,700
3,000
3,300
3,600
3,900
4,200
log(PM)
dmigrada
=
-2,7475log(PM)
+
12,705
R
=
0,9575
RESULTADOS
EXPERIMENTAIS
Relativamente
ao
marcador
(DNA
padro)
conhecem-se
os
pesos
moleculares
e
mediram-se
as
distncias
migradas
de
cada
banda
obtendo-se
os
seguintes
resultados:
18
Figura 6 Representao grfica de dmigrada em funo do log(PM). Seguidamente, procedeu-se medio das distncias migradas pelas bandas do DNA digerido da amostra de plasmdeo utilizada.
Tabela
5
Enzimas
de
restrio
utilizadas,
distncias
migradas
e
respectivos
pesos
moleculares
das
bandas
dos
fragmentos
R
e
L.
Fragmento
L
d/cm
Peso/pb
3,8
3,6
3,7
3,4
4,2
3,3
4,3
3,1
5,0
3,0
5,9
2,9
3,5
4,3
5,0
1742
2060
1895
2436
1246
2649
1146
3133
637
3406
300
3704
2240
1146
637
Fragmento
R
d/cm
Peso/pb
3,2
3,5
3,6
3,1
5,1
3,1
4,7
3,0
4,8
3,4
3,7
2,8
3,0
4,8
7,0
2881
2240
2060
3133
586
3133
820
3406
754
2436
1895
4028
3406
754
119
Enzima pGEM 3x BamHI SalI1 SalI2 HindIII1 HindIII2 PstI1 PstI2 XhoI1 XhoI2 PvuII1 PvuII2 SacI Xho/SacI1 Xho/SacI2 Xho/SacI3
CONCLUSES
Construo
do
mapa
de
restrio
do
fragmento
L
O
plasmdeo
pGEM-3
sem
o
fragmento
inserido
tem
1742
pb.
O
seu
peso
molecular
foi
determinado
atravs
do
peso
molecular
do
fragmento
obtido
pelo
corte
com
a
enzima
de
restrio
BamHI.
O
plasmdio
com
o
fragmento
L
possu
3704
pb.
Os
valores
das
determinaes
so
aproximados
porque
as
medidas
esto
carregadas
com
erros
significativos
e
isso
propaga-se
em
todas
as
operaes,
ocorrendo
desvios
at
dezena
de
pb.
Sabendo
que
tanto
o
fragmento
L
como
o
R
foram
inseridos
com
a
enzima
de
restrio
Sal
I
possvel
construir
o
mapa
de
restrio
do
plasmdeo.
19
Figura 8 Eletroforese onde se inseriu o fragmento L. Com os valores das distncias migradas pelas bandas de cada amostra no gel (cm) e substituindo esses resultados na equao da reta do grfico da figura 6 traado com os dados do marcador, obtm-se os pesos moleculares das bandas no gel.
Relativamente enzima HindIII pode-se concluir que esta corta duas vezes obtendo-se dois fragmento, um com 2436 pb e o outro com 1246 pb. Esta enzima corta o pGEM-3 na posio 7 e uma outra, originado duas bandas, ento ter de possuir um outro local de corte no fragmento inserido. Assim, o segundo local de corte da HindIII ser a 1228 pb (1246 pb + 7 pb) do primeiro local de corte. Quanto Pst I , verifica-se que tambm corta duas vezes o fragmento, tendo um dos fragmentos 2649 pb e o outro 1146 pb. Sabe-se que este enzima corta o pGEM-3 na posio 23 pb, ento, o outro local de corte da Pst I ser a 1146 pb do primeiro corte e ter de ser no fragmento, pelo que ocorrer na posio 1169 pb. Com a enzima PvuII tambm se obtm duas bandas, o que significa que corta duas vezes o fragmento, sendo que um dos fragmentos tem 3406 pb e outro 300 pb. Sabe-se que tem um local de corte na posio 104 pb do vetor, pelo que com o fragmento inserido, este local ocorre na posio 2164 pb do vetor com o fragmento L. O outro local de corte ter de ocorrer, obrigatoriamente, no fragmento L, assim ir ocorrer na posio 1864 pb (2164 pb 300 pb). Relativamente enzima Sal I (utilizada para inserir o fragmento no plasmdeo), verifica-se o aparecimento de duas bandas muito prximas uma da outra no gel de electroforese, o que nos indica que o fragmento e o vetor devero ter um tamanho muito aproximado e pesos moleculares de 2060 pb e 1895 pb. A enzima Sac I origina apenas uma banda no gel de agarose e sabe-se que corta o vetor na posio 56 pb pelo que cortar o plasmdeo na posio 2085 pb. Assim, no 20
ter nenhum corte no fragmento inserido. O peso molecular relativo a esta banda (3704 pb) o tamanho do plasmdeo recombinante (vetor + fragmento). Sabe-se que a enzima XhoI no corta o vetor, o que significa que as duas bandas que aparecem no gel correspondem a dois locais de corte no fragmento. Dos dados obtidos conclui-se que corta em dois locais originando fragmentos com 3133 pb e 637 pb. Para se localizar os dois locais anteriormente referidos recorresse anlise dos resultados obtidos para as bandas respetivas digesto dupla com as enzimas de restrio XhoI e SacI, partindo j da informao de que esta ltima apenas corta o pGEM-3. Sabe-se que estas duas enzimas juntas cortam o plasmdeo em trs locais, a 2240 pb, 1146 pb e 637 pb. Tendo em conta que a Sac I corta o plasmdeo na posio 2116 pb, um dos locais de corte da Xho I ser a 970 pb (2116 pb - 1146 pb). O outro local de corte pela XohI acontece na posio 337 pb (970 pb 637 pb). O mapa de restrio obtido encontra-se apresentado na figura 9. Construo do mapa de restrio do fragmento R Relativamente ao fragmento R procedeu- se do mesmo modo para a construo do mapa de restrio. Dado que as enzimas de restrio usadas foram as mesmas e o vetor o mesmo. Assim o mapa de restrio obtido encontra-se apresentado na figura 10.
DISCUSSO
Com
a
realizao
desta
atividade
conseguiu-se
analisar
segmentos
de
DNA
distintos
cortados
com
vrias
enzimas
de
restrio,
bem
como
compreender
qual
a
dimenso
dos
mesmos
por
comparao,
relativamente
a
um
padro
conhecido.
Para
isso,
teve-se
em
ateno
o
grfico,
que
relaciona
o
comprimento
(cm)
com
o
nmero
de
pares
de
bases
correspondentes.
Assim,
por
existir
uma
dependncia/necessidade
de
determinar
com
a
maior
exatido
possvel
o
nmero
de
pares
de
bases
num
segmento
de
DNA,
a
correta
elaborao
do
grfico
tambm
fundamental.
Assim,
o
rigor
do
modelo
ser proporcional ao nmero de fragmentos considerados, cuja migrao no gel de agarose foi analisada anteriormente. Portanto, para determinar o nmero de pares de bases que compem os fragmentos contidos nos diversos poos, utiliza-se uma ladder que permite estabelecer a comparao com base numa proporcionalidade direta. Atravs da elaborao do mapa de restrio de ambos os fragmentos foi possvel visualizar de forma esquemtica o processo de corte de cada uma das enzimas.
22
INTRODUO
TERICA
A
tcnica
de
PCR
(reao
de
polimerase
em
cadeia)
o
mtodo
mais
usado
e
rpido
para
a
amplificao
de
certos
fragmentos
de
DNA
ou
RNA
em
sistemas
in
vitro.
Esta
tcnica,
como
a
de
clonagem
molecular,
permitiu
o
desenvolvimento
da
Biologia
Molecular.
A
PCR
uma
tcnica
com
uma
vasta
gama
de
aplicaes,
que
vo
desde
a
clonagem
de
DNA
ou
de
cDNA
(DNA
complementar),
ensaios
de
mutaes
in
vitro,
engenharia
gentica,
anlise
de
amostras
forenses,
determinao
de
agentes
infecciosos,
diagnstico
de
doenas
genticas
at
sequenciao
direta
do
DNA
genmico
e
do
cDNA.
A
tcnica
de
PCR
baseia-se
na
atividade
cataltica
de
uma
DNA
polimerase
e
requer
a
existncia
de
dois
iniciados
oligonucleotdicos
(primers)
que
se
encontram
nas
extremidades
do
fragmento
de
DNA
a
ser
amplificado,
a
designada
sequncia
alvo.
Para
alm
disso,
a
soluo
onde
se
encontram
as
DNA
polimerases,
DNA
e
primers
submetida
a
vrios
ciclos
de
aumento
e
abaixamento
da
temperatura.
Assim,
em
cada
ciclo
promove-se
a
desnaturao
do
DNA
de
cadeia
dupla
pelo
aquecimento,
hibridam-se
os
primers
s
sequncias
complementares
e
por
fim
ocorre
a
extenso
dos
primers
por
incorporao
de
nucletidos
por
ao
das
DNA
Polimerases.
Os
nucletidos
so
23
Contudo
sequncias
que
possuam
trs
ou
mais
guanina
(G)
ou
citosinas
(C)
deve
ser
evitado,
pois
em
caso
de
emparelhamento
errneo,
torna-se
mais
difcil
a
sua
remoo
para
uma
nova
tentativa,
dada
a
fora
da
interao
formada.
No
desenho
dos
primers
deve
ter-se
em
ateno
possibilidade
de
emparelhamento
entre
os
prprios
primers,
assim
dever-se-
ter
em
linha
de
conta
possveis
sequncias
complementares
entre
diferentes
primers.
Se
houver
uma
grande
probabilidade
de
emparelhamento
entre
o
par
de
primers
utilizado,
a
ocorrncia
deste
fenmeno
ser
superior
das
reao
de
PCR,
dada
a
preferncias
com
que
ocorrem.
Ainda
dentro
dos
estudos
de
complementaride
dos
primers,
estes
so
devem
ter
sequncias
com
mais
de
4
bases
que
possam
ser
complementares
dentro
do
mesmo
primer,
pois
impulsionaria
a
formao
de
estruturas
por
auto- complementaridade,
estruturas
secundrias
(hairpins).
Como
j
foi
referido
a
composio
de
bases
dos
primers
muito
importante,
da
que
um
primer
no
dever
ter
menos
de
17,
nem
mais
do
que
25
nucletidos
e
o
contedo
em
guanina
e
citosinas
deve
estar
entre
45
a
55%.
Outro
aspecto
importante
a
temperatura
que
os
diferentes
primers
dentro
de
um
mesmo
par
hibridam,
dado
que
essa
temperatura
deve
ser
muito
semelhante
(Tm).
Esta
temperatura
pode
ser
calculado
com
base
na
equao
1
e
no
deve
diferir
em
mais
do
que
5C
entre
cada
primer
dentro
de
um
par
a
utilizar.
! = ! + ! 4 + ! + ! 2
negativamente). Neste tipo de tcnica necessrio recorrer a DNA polimerases que sejam resistentes s variao de temperatura que ocorrero durante os ciclos, da usar-se frequentemente a Taq DNA Polimerase (DNA polimerase termoestvel) que extrada da bastria Thermus aquaticus pois trata-se de uma bactria extremfila encontrada em ambientes aquticos a elevadas temperaturas.
METODOLOGIA
REAGENTES
Utilizou-se
1ng
de
cDNA;
5ng
de
gDNA;
solues
de
0,1
mol
dm-3
dos
primers
9R1
(sense
primer)
e
9R2IC
(antisense
primer);
soluo
de
dNTPs
com
a
concentrao
de
200
mol
dm-3;
tampo
de
reao
1x;
soluo
aquosa
de
MgCl2;
Taq
DNA
polimerase:
0,25U;
gua
estril
ultrapura.
Para
a
electroforese
utilizou-se
agarose;
Brometo
de
etdeo
(potencialmente
cancergeno;
manusear
com
luvas
e
evitar
o
contacto
com
as
vias
respiratrias).
EQUIPAMENTOS
Recorreu-se
a
um
amplificador
termocclico
para
efetuar
o
programa
de
ciclos
para
as
reaes
de
PCR
e
centrfuga.
Suporte
para
o
gel
de
agarose
e
fonte
de
alimentao
para
a
electroforese.
(1)
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
No que diz respeito execuo Preparao do meio reacional para PCR de experimental propriamente dita, existem gDNA alguns cuidados a ter em conta como a utilizao duma concentrao adequada de Para um tubo de PCR pipetar 1L da soluo Cloreto de Magnsio (MgCl2), dado que o de gDNA; 5L de tampo de reao; 1L de Mg2+ um co-fator importante na ativao cada uma das solues de primers; 4L da da polimerase e ainda importante na soluo de dNTPs; e 6L da soluo de estabilidade das cadeias de DNA (carregadas MgCl2. Adicionar gua para perfazer um 24
volume total de 50L (tendo em conta que se ir adicionar, posteriormente, 0,25L de Taq DNA Polimerase), assim deve ser adicionado um volume de gua estril de 31,75 L. Misturar suavemente a mistura e centrifugar. Adicionar 0,25L da soluo de Taq DNA polimerase e misturar muito suavemente com a ponta da pipeta. Preparao do meio reacional para PCR de cDNA Repetir o procedimento anterior, com a exceo da adio de 1L de gDNA, que em vez disso, dever ser adicionado 1L da soluo de cDNA. Colocar os tubos de PCR em banho a 95C durante 5 minutos. Segue-se o acondicionamento dos tubos de PCR no suporte do aplificador termocclico e programar 15 ciclos. Cada ciclo dever compreender um perodo de 15 segundos a 94C (promove a desnaturao), seguido de 30 segundos a 50C (hibridao) e 1 minuto
a 72C (extenso). Aps o ltimo ciclo, as amostras devero ficar 10 minutos a 72C. Retirar os tubos do amplificador termocclico e acondicion-los a 4C. Aplicar as amostras em gel de agarose a 1%.
RESULTADOS
EXPERIMENTAIS
DESENHO
DOS
PRIMERS
O
primer
9RI
(sense
primer)
foi
obtido
com
base
nas
regras
definidas
na
introduo
e
obtido
diretamente
a
partir
da
sequncia
53.
J
o
primer
9R2IC
(antisense
primer)
obtido
a
partir
da
sequncia
da
extremidade
oposta
e
como
ter
de
polimerizar
na
cadeia
oposta,
o
primer,
ter
de
ser
complementar
s
bases
que
compe
a
sequncia
escolhida.
Extremidade 5 da sequncia sense da poro a amplificar 5 AGCTATGCTATGCTATGCTAGCCAGTCAGCTGAACGTG 3 5 TATGCTAGCCAGTCAGC 3 Primer sense Sequncia sense
Extremidade 3 da sequncia sense da poro a amplificar 5 TCTAATTCCAAGCCAATTGCCAAAAAGGAACCG 3 3 AGATTAAGGTTCGGTTAACGGTTTTTCCTTGGC 5 3 CGGTTAACGGTTTTTCC 5 O primer sense constitudo por 17 apresenta uma Tm=50C. Assim o par de nucletidos, dos quais 9 so guanina ou primers escolhido por ser usado para PCR, citosinas (53% de G/C) e apresenta uma dado que possuem um nmero de Tm=52C (calculado com base na equao 1. nucletidos aceitvel, a percentagem de G/C Para o primer antisense, o nmero de est dentro dos parmetros estipulados, e a nucletidos o mesmo (17), possu 8 Tm difere apenas em 2C entre cada um dos guaninas ou citosinas (47% de G/C) e primers. 25 Sequncia sense Sequncia antisense
Primer antisense
ELECTROFORESE Como forma de avaliar a qualidade do produto da PCR, procedeu-se a uma electroforese em gel de agarose a 1%, cujo resultado (Figura 1) evidncia uma maior migrao do cDNA do que do gDNA. Para alm disso verificam-se mais trs bandas de migrao para o poo 2, correspondente ao gDNA. No que diz respeito ao cDNA, verifica- se a migrao de mais uma banda no gel. Procedeu-se a medio das distncias de migrao dos marcadores de pesos moleculares (valores sumariados na Tabela 1) e procedeu-se ao traado grfico do logaritmo dos pesos moleculares em funo da distncia migrada no gel (Figura 2). Os pontos ajustam-se a uma reta cuja regresso linear (R2=0,99434) utilizada para determinar o nmero de pares de bases de cada um dos fragmentos de cDNA e gDNA.
Tabela 6 Valores referentes migrao dos marcadores de pesos moleculares, nmero de pares de bases referentes a cada banda e respectivo logaritmo.
dmigrada
/mm
5,4
6,1
6,8
7,3
7,9
8,8
9,5
10,4
11,7
13,4
14,2
15,1
17,0
18,8
log(PM)
3,900
3,700
3,500
3,300
3,100
2,900
Marcadores PM/pb 10000 8000 6000 5000 4000 3000 2500 2000 1500 1000 800 600 400 200
log (PM) 4,000 3,903 3,778 3,699 3,602 3,477 3,398 3,301 3,176 3,000 2,903 2,778 2,602 2,301
Figura 11 Resultado da electroforese em gel de agarose 1% para o produto da amplificao por PCR de cDNA (1) e gDNA (2). O poo (3) corresponde aos marcadores de pesos moleculares.
2,700 2,500 2,300 5,0 7,0 9,0 11,0 13,0 15,0 17,0 19,0
dmigrada /mm
Figura 12 Representao grfica dos pontos referentes ao logaritmo do nmero de pares de bases em funo da distncia migrada pelas bandas. Respectiva regresso linear e equao da reta.
26
Com base na equao da reta determinada e nas distncias migradas pelas bandas do cDNA (dmigrada=16,0 mm) e do gDNA (dmigrada=15,4 mm) possvel determinar o nmero de pares de bases de cada um dos fragmentos, Tabela 2. Tabela 7 Valores referentes migrao do cDNA e do gDNA em gel de agarose a 1% e respectivo nmero de pares de bases. cDNA gDNA Como seria de esperar, o cDNA apresenta um menor nmero de pares de bases (menos 83pb) do que o corresponde gDNA. Isto porque o cDNA obtido atravs de uma transcriptase reversa a partir do mRNA correspondente. Ora, o mRNA sofre um processo de splicing ps transcrio de modo que os intres so removidos e portanto, leva ao encurtamento da sequncias de mRNA e consequente encurtamento da sequncia de cDNA. Assim podemos inferir que cerca de 80pb do gene polo correspondem a intres e que no codificam para a protena. dmirada /mm 16,0 15,4 pb 463 546
O DNA genmico (gDNA) composto por intres, exes e fragmentos que regulam a expresso gnica. Porm, apenas os exes contm informao para a sntese proteca, dado que os intres so transcritos para mRNA mas so eliminados durante o processo de splicing do mRNA. Assim de esperar que o mRNA tenha menos bases que o o gDNA que lhe deu origem. Como o DNA complementar (cDNA) obtido a partir do mRNA por ao enzimtica de uma transcriptase reversa, esta poro de DNA ter um nmero de bases inferior ao gDNA inicial, da o cDNA migrar mais do que o gDNA em gel de agarose. Detectou-se ainda a migrao de mais trs fragmentos diferentes no poo carregado com gDNA, isto deve-se a estruturas de DNA com elevado efeito de supercoilling que apresentam uma menor distncias migrada no gel. Contudo, estas e a outra banda detectvel no poo carregado com cDNA podem dever-se a contaminaes do material gentico utilizado. No que diz respeito intensidade das bandas, esta uma boa forma de avaliar a eficincia da PCR qualitativamente. Verifica-se que a banda correspondente ao gDNA deveras mais intensa do que a de cDNA, isto pode estar relacionado com temperaturas que no se ajustavam to bem amplificao do cDNA como o que aconteceu com o gDNA. Pode ainda pensar-se que a quantidade de Mg2+ adicionada foi demasiado elevada e que levou a uma sobreatividade da Taq DNA polimerase e que aumenta a inespecificidade da tcnica, diminuindo a eficincia e aumentanto o nmero de bandas correspondentes a bandas no desejveis.
CONCLUSES
No
que
diz
respeito
ao
desenhos
dos
primers,
estes
seguem
todas
as
condies
para
optimizarem
a
reao
de
PCR,
para
alm
dos
requisitos
que
satisfazem
e
que
j
fora
supracitados,
apresentam
ainda
pouca
probabilidade
de
emparelharem
um
com
o
outro,
para
alm
de
que
no
existem
mais
do
que
3
guaninas
ou
citosinas
consecutivas
em
cada
um
dos
primers.
27
INTRODUO
TERICA
Define-se
como
transformao
o
processo
de
introduo
de
DNA
em
clulas.
Esta
tcnica
atualmente
amplamente
utilizada
para
a
amplificao
de
certos
fragmentos
de
DNA.
A
primeira
descrio
de
transformao
de
E.coli
aconteceu
cerca
de
40
anos
atrs
quando
Mendel
e
Higa
demonstraram
que
clulas
de
E.coli
tratadas
com
solues
geladas
de
cloreto
de
clcio,
seguidas
de
aquecimento,
eram
capazes
de
importar
para
o
seu
interior
DNA
do
bacterifago
.
Apesar
de
no
se
perceber
muito
bem
o
mecanismo,
a
verdade
que
bactrias
sujeitas
a
baixas
temperaturas
em
solues
com
caties
ficam
capazes
de
importar
DNA
exgeno.
Ao
longos
dos
tempos
tm
sido
feitos
vrios
ensaios
no
sentido
de
melhorar
a
eficincia
do
processo,
contudo
nem
sempre
se
percebe
o
fundamento
por
detrs
de
tais
execues.
Neste trabalho recorrer-se- ao cloreto de clcio de modo a tornar as bactrias competentes na importao do DNA. O cloreto de clcio liberta caties clcio em soluo que neutralizam as cargas negativas do DNA e ajudam-no a migrar para o interior das bactrias. O choque trmico que se sucede desorganiza momentaneamente as membranas e faz com que o DNA consiga migrar para o seu interior. As bactrias crescem ento em meio no seletivo e depois so transpostas para meios seletivos. 28
lactose. As clulas transformadas com este plasmdeo quando introduzidas em meio Mac/Lac/Amp, a lactose induz a expresso da galactosidase o que metaboliza a lactose produzindo substncias cidas que baixam o pH e tornam violeta o neutral red. Este fragmento incorpora o DNA exgeno dentro do gene para a galactosidase pelo que a sua atividade fica inibida e as colnias adquirem cor amarela. O plasmdeo pEMBL- CAT foi construdo por insero do gene CAT. A clonagem deste gene permite estudar a induo da expresso em resposta presena de lactose no meio. A correta induo do CAT permite que portadoras do gene sejam resistentes ao cloranfenicol quando crescidas em meio de lactose.
ressuspender o sedimento em 20 mL de uma soluo de 100mM de CaCl2 previamente arrefecida. Incubar em gelo durante 20 minutos. Voltar a centrifugar nas mesmas condies. Descartar o sobrenadante e ressuspender as clulas em 500L da mesma soluo de CaCl2. Incubar em gelo durante 4 a 24 horas. A competncia para a transformao aumenta consideravelmente com o aumento do tempo de incubao em gelo at s 24 horas, a partir desse tempo ocorre uma diminuio rpida da competncia adquirida. B. Transformao Medir 50L da soluo que contm as clulas competentes para quatro microtubos devidamente identificados com os quatros plasmdeos. Adicionar 50L da soluo de DNA plasmdico aos quatro microtubos, o DNA plasmdico diferente em cada tubo. Incubar os tubos em gelo durante 20 minutos. Provocar o choque trmico colocando os tubos a 42C durante 2 minutos e voltando a colocar no gelo durante mais 2 minutos. Adicionar 700L de meio LB e incubar a 37C durante 30 minutos com agitao contnua. Plaquear as clulas de acordo com a tabela seguinte.
METODOLOGIA
REAGENTES
Usaram-se
solues
com
os
plasmdeos
pEMBL9,
pEMBL9-CAT,
pBR322
e
pBR322- CAT;
meio
de
cultura
LB,
LA
e
Mac/Lac;
assim
como
placas
de
cultura
LA/Amp,
LA/Amp/Tet
e
Mac/Lac/Clor;
soluo
aquosa
de
cloreto
de
clcio;
soluo
e
bactrias
E.coli
JM101.
PROCEDIMENTO
EXPERIMENTAL
A.
Preparao
de
clulas
competentes
Inocular 50 mL de LB (meio de cultura) com a estirpe apropriada de E.coli e incubar a 37C com agitao durante a noite. Inocular 200 mL de LB, previamente aquecido a 37C, com 2 mL de da cultura preparada anteriormente e incubar a 37C com agitao at a DO600 estar entre 0,2 e 0,375. Colocar a cultura em tubos pr-arrefecidos e deixar em gelo durante 15 minutos. Centrifugar os tubos a 3000 RPM durante 15 minutos, temperatura de 4C. Descartar, cuidadosamente, o sobrenadante e 29
Tabela
8
Volumes
das
solues
preparadas
acima
que
foram
plaqueadas
e
respectivos
meios
de
cultura
utilizados.
Os
tubos
1,
2,
3
e
4
correspondem
aos
tubos
preparados
acima
com
os
plasmdeos
pEMBL9,
pEMBL9-CAT,
pBR322
e
pBR322- CAT,
respectivamente.
O
tubo
5
corresponde
apenas
soluo
de
clulas
competentes
resultante
do
procedimento
A..
Tubo
Volume
/L
Meio
de
cultura
com palitos esterilizados, de 10 colnias individuais, dos meios anteriores, para novos meios. Assim dever-se- tranferir colnias referentes ao pEMBL9, pEMBL9- CAT e pBR322-CAT a partir dos meios LA/Amp para placas (diferentes) com os meios Mac/Lac/Clo. As placas so ento incubadas a 37C durante a noite. Verifica-se ento o crescimento das colnias.
RESULTADOS
EXPERIMENTAIS
As
figuras
abaixo
correspondem
s
placas
incubadas
a
37C
durante
uma
noite.
1 2 3 4 5
125
As placas so ento incubadas a 37C durante a noite. Procede-se ento contagem das colnias e toma-se nota das suas cores nas placas Mac/Lac. Para induzir a expresso do gene CAT e testar a resistncia das clulas ao cloranfenicol, procede-se transferncia, Figura 13 Placa com meio de cultura LA/Amp. Controlo Tubo 5.
Figura 14 Placas com meio de cultura Mac/Lac/Amp (esquerda) e LA/Amp (direita). Corresponde incubao das bactrias com o plasmdeo pEMBL9 Tubo 1. 30
Figura 15 Placas com meio de cultura Mac/Lac/Amp (direita) e LA/Amp (esquerda). Corresponde incubao das bactrias com o plasmdeo pEMBL9-CAT Tubo 2.
Figura 16 Placas com meio de cultura LA/Amp/Tet (esquerda) e LA/Amp (direita). Corresponde incubao das bactrias com o plasmdeo pBR322 Tubo 3.
Figura 17 Placas com meio de cultura LA/Amp/Tet (direita) e LA/Amp (esquerda). Corresponde incubao das bactrias com o plasmdeo pBR322-CAT Tubo 4.
31
Figura 18 Placas com meio de cultura Mac/Lac/Clo. Corresponde incubao das bactrias com o plasmdeo pEMBL9 previamente incubadas em LA/Amp.
Figura 20 Placas com meio de cultura Mac/Lac/Clo. Corresponde incubao das bactrias com o plasmdeo pBR322-CAT previamente incubadas em LA/Amp.
Figura 19 Placas com meio de cultura Mac/Lac/Clo. Corresponde incubao das bactrias com o plasmdeo pEMBL9-CAT previamente incubadas em LA/Amp.
32
Tabela 9 Contagem das colnias, avaliao da cor e respectivo clculo da eficincia da transformao. Plasmdeo pLEMB9 pLEMB9- CAT pBR322 Meio de cultura Mac/Lac/Amp LA/Amp Mac/Lac/Amp LA/Amp LA/Amp/Tet LA/Amp pBR322- CAT Controlo LA/Amp/Tet LA/Amp LA/Amp N de colnias 150 600 50 100 3 100 0 50 0 Cor Violeta Brancas/amarelas Brancas/amarelas Brancas/amarelas Brancas/amarelas Brancas/amarelas Brancas/amarelas Eficincia de transformao 7,14 104 2,86 105 2,38104 4,76104 1,4 103 4,76104 2,38104
Nota: Os tubos foram preparados com 5 ng de DNA em 300 L (concentrao de 1,67x10-5 g L-1). Foram plaqueados 125 L, assim a massa de DNA plaqueada foi de 2,1x10-3 g.
CONCLUSES
Os
resultados
obtidos
indicam
que
ocorre
a
transformao
em
todos
os
plasmdeos,
pois
em
meio
LA/Amp
ocorreu
o
crescimento
de
colnias
em
meio
com
o
antibitico
ampicilina.
Isto
significa
que
o
gene
de
resistncia
ampicilina
foi
incorporado
e
expresso
da
forma
adequada.
Isto
no
se
verificou,
apenas,
para
o
controlo
pois
este
no
continha
o
gene
para
a
resistncia
e
portanto
as
bactrias
no
conseguiram
resistir
ao
antibitico.
As
colnias
de
bactrias
cujo
plasmdeo
analisado
foi
o
pEMBL9
apresentaram
cor
violeta,
isto
porque
foi
expresso
o
gene
para
a
-galactosidade.
Isto
originou
produtos
cidos
no
meio
que
tornaram
violeta
o
neutral
red.
O
mesmo
no
aconteceu
aps
a
insero
do
gene
CAT,
que
por
ser
inserido
no
meio
do
gene
que
codifica
para
a
- galactosidade,
inibe
a
sua
produo
e
portanto
incapaz
de
degradar
a
lactose
e
acidificar
o
meio
envolvente.
No caso do plasmdeo pBR322 verifica-se que cresce nos meios utilizados com ampicilina e portanto fica provada a sua resistncia nativa ampicilina e tetraciclina. Contudo, a insero do gene CAT feita na poro referente resistncia tetraciclina, e portanto as bactrias com o plasmdeo pBR322-CAT no resistem ao meio rico em tetraciclina. No que diz respeito eficincia das transformaes, os valores obitdos so bastante mais reduzidos do que aqueles que seriam de esperar, sendo obtidos valores na ordem dos 104-5. Isto pode ser explicado pela recolhas das clulas fora da fase exponencial do crescimento, uso de reagentes pouco puros, contaminaes e m importao do plasmdeo por parte das bactrias. Em relao resistncia ao clornfenicol verifica-se que nenhuma das placas apresentava colnias desenvolvidas, pelo que as bactrias introduzidas no resistiram ao clorofenicol. No entanto, este era o
33
resultado esperado para as bactrias com pEMBL9 e pBR322-CAT porque o pEMBL9 no possu o gene que codifica para a clornfenicol acetil transferase e que portanto no consegue degradar o antibitico. As bactrias com pBR322-CAT, apesar de terem o gene CAT no conseguem express-lo porque falta-lhes os elementos do promotor para a transcrio. Seria de esperar que as bactrias com pEMBL9-CAT expressassem o gene CAT porque possuem os elementos do promotor necessrios e
encontravam-se em condies com o seu indutor natural, a lactose. O facto de no se ter verificado o crescimento de bactrias neste meio pode ter sido causado pelo mal acondicionamento das colnias, m transferncia das colnias do meio LA/Amp para o meio com clornfenicol, as colnias transferidas no eram resistentes ao clornfenicol, podendo at pensar-se que a lactose no seja o indutor da expresso do gene CAT no plasmdio pEMBL9.
34
SEQUENCIAO
DE
DNA
OBJECTIVOS
Sequenciar
um
gene
pelo
mtodo
de
Sanger.
Isolar
uma
protena
por
mtodos
bioqumicos
e
determinao
dos
primeiros
10
aminocidos
(N-terminal).
Isto
permite
o
desenho
de
primers
degenerados
que
podem
ser
usados
na
aplificao
do
cDNA
na
biblioteca
genmica
(cDNA).
codificantes
(ORF
Open
Reading
Frame)
para
alinhamento
com
as
sequncias
aminoacdicas
e
nucleotdicas
residentes
nas
bases
de
dados.
Isto
permite
obter
informao
de
bastante
relevncia
acerca
da
funo
e
estrutura
do
gene,
sendo
ainda
possvel
obter
informao
acerca
da
evoluo
do
gene
em
relao
a
outros
semelhantes
j
registados.
Conhecer
a
sequncia
do
gene
d-nos
tambm
informao
importante
acerca
de
pores
no
codificantes
do
gene
5
e
3,
isto
utilizado
para
perceber
melhor
o
funcionamento
da
regulao
gnica
e
possibilita
a
aplicao
de
tcnicas
de
mutao
dirigida
a
um
determinado
gene.
Por
fim,
e
um
dos
papis
mais
importantes
da
sequenciao
aplicada
diretamente
medicina,
a
deteco
de
zonas
que
apresentem
alteraes
em
determinados
nucletidos
e
que
podem
originar
doenas
genticas.
Este
conhecimento
permite
a
produo
aprimorada
de
tcnicas
e
frmacos
para
o
tratamento
da
mutao
em
causa.
INTRODUO
TERICA
A
clonagem
apenas
o
incio
do
estudo
de
um
gene,
posteriormente
procede-se
anlise
estrutural
e
funcional
desse
mesmo
gene.
A
sequenciao
de
um
gene
uma
das
etapas
mais
importantes
na
caracterizao
genmica,
dado
que
oferece
informao
acerca
da
estrutura
gentica.
O
passo
decretrio
para
a
sequenciao
do
DNA
a
capacidade
de
obter
fragmentos
bem
definidos
de
DNA.
Isto
justifica
a
relao
estreita
entre
a
clonagem
e
a
sequenciao
e
um
gene,
uma
vez
que
a
clonagem
possibilita
a
obteno
dum
elevado
nmero
de
amostras
do
fragmento
de
DNA
que
se
pretende
estudar.
Nos meados da dcada de 70 comeam a surgir as primeiras tcnicas de clonagem No mbito das tcnicas de DNA molecular e consigo tambm as tcnicas de recombinante, muito importante conhecer sequenciao. O investigador Robert Holley a sequncia do gene para que se possa fazer criara uma tcnica de sequenciao de tRNA o devido manuseamento posteriori. que fora usada, inicialmente, para Normalmente, depois de sequenciado o sequenciar DNA embora com resultados no gene, a sequncia introduzida e corrida muito relevantes. Mais tarde Gilbert e por um software que procura os locais de Sanger trabalham arduamente na tentativa restrio, oferecendo assim um estudo de encontrar uma tcnica que possibilitasse detalhado de tudo do gene em estudo. Estas a sequenciao do DNA. Daqui surgiram informaes so muito importantes, por duas tcnicas, a degradao qumica de exemplo, se quisermos utilizar o gene em Maxam e Gilbert e o mtodo enzimtico de causa como vetor para expresso proteica Sanger. Apesar dos princpios subjacentes ou subclonagem. A sequncia analisada serem diferentes, ambos se baseavam na por software de modo a obter as regies produo de populaes de oligonucletidos que comeavam sempre num local 35
especfico e conhecido e terminavam num determinado resduo. Os locais de terminao so, portanto, nucletidos especficos mas que ocorrem em locais aleatrios ao longo do DNA. Assim podemos obter populaes de oligonucletidos que acabam em A, T, G ou C. Assim sero obtidos oligonucletidos de comprimentos diferentes, consoante a altura em que foi incorporado um ddNTPs e portanto no possvel o crescimento da sequncia a partir desse ponto. Os fragmentos so ento corridos em gel de poliacrilamida onde possvel distinguir fragmentos que diferem apenas num nucletido. O mtodo e Gilbert encontra-se em desuso pelo uso de marcadores radiativos nos extremos dos fragmentos de DNA que eram posteriormente degradados por reaes especficas. Assim a posio de cada nucletido na cadeia de DNA era determinada pela distncia entre o ponto de degradao e a extremidade radioativa visualizada por autoradiografia.
faz com que ocorra a competio entre a incluso dos dNTPs que levam continuao do alongamento da cadeia e a incluso de um ddNTP que finaliza a cadeia. Fazendo a reao com os quatro ddNTP, obtm-se os respectivos oligonucletidos com os primers na extremidade 5. Estes fragmentos so corridos em gel em 4 poos diferentes. A revelao feita por fluorescncia ou por exposio a uma placa fotogrfica (Raios X). Assim podemos ler a sequncia do fundo para o topo, sendo essa a ordem dos nucletidos da extremidade 5>3. A tcnica mais recente para a sequenciao do DNA marca os ddNTPs ao invs de marcar os primers. Assim basta fazer uma reao, pois os oligonucletidos obtidos so depois corridos em gel no interior de capilares (electroforese capilar) e os diferentes ddNTPs so identificados por anlise laser em equipamentos automticos. Isto possvel por marcao dos ddNTPs com marcadores fluorescentes de cores diferentes.
O outro mtodo mais comummente RESULTADOS EXPERIMENTAIS utilizado e baseia-se na adio de um ddNTP especfico a uma mistura de todos os dNTPs, o que, aleatoriamente, ir incorporar um Sequncia de Aminicidos: ddNTP e finalizar a polimerizao de uma N-Ser-Tyr-Cys-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Ala-C das cadeias. Isto acontece porque no existe o grupo OH no C3. Isto impede a formao da ligao fosfodister entre dois nucletidos vizinhos, impedindo a Sequncia reconhecida pela enzima de continuao do alongamento da cadeia. restrio EcoRI: Neste mtodo, recorre-se a um primer que 5 GAATTC 3 hibridriza na cadeia simples de DNA e leva polimerizao de uma nova cadeia Sequncia reconhecida pela enzima de complementar. Repete-se o procedimento restrio HindIII: com quatro meios reacionais diferentes em 5 AAGCTT 3 que cada um deles contm um dos quatro tipos de ddNTPs. O primer est marcado Por anlise dos resultados de electroforese radioactivamente ou por um marcador (Anexo 1) possvel obter a sequncia da fluorescente, fazendo com que os cadeia que se formou por emparelhamento fragmentos possam ser identificados em gel. com a cadeia a sequenciar, sendo que as A adio de uma pequena poro de ddNTP 36
bandas que mais migraram correspondem aos oligonuclotidos que terminaram nos nucletidos mais prximos da extremidade 5. Assim a sequncia complementar ser a correspondente sequncia alvo cuja Sequncia da amostra A
sequncia ocorre de 5 para 3 quando a anlise feita pela complementar de cima para baixo no gel. As sequncias obtidas para o gene em causa encontram-se abaixo representadas.
5TAGCGAATTCACCAGGTTCCGAACATCGCCATTCCAGGGAACTCATTGAGTCTAGCCTA ACTAACGACCCATGTCGCCCCGTGAAAAGCTTCGCCTA 3 Sequncia da amostra B 5TAGCGAATTCATTATCCCCGATCTAGTAACGCATCCTCTAACTAGCGTGAATTATGTCA TATTGCCTGCCCATGTCCCCGCGTGCGAAGCTTCGCCTA 3 Sequncia da amostra C 5TAGCGAATTCAATCGACCCA...GGTCACAACCTTCCGGCTCAAGCCTAACCTAGTTAA GACCCTATGTCTCCCCGAGCTAAGCTTCGCCTA3 As sequncias acima correspondem s sequencias originais de cDNA amplificado para cada clone e foram obtidas por complementaridade com as sequncias determinadas pela anlise do gel obtido por electroforese. A amarelo encontra-se assinalados os locais de restrio EcoRI e a azul os locais de restrio HindIII. O primer utilizado na amplificao por PCR de cada gene emparelhou com as sequncia assinaladas a negrito nas sequncias. As sequncias dos primers para cada um dos clones encontra-se apresentada abaixo. Assim para o clone A foi usado um primer com a sequncia, 3-GGGTACAGGGGCGCA-5 Para o clone B, a sequncia do primer foi, 37 3-GGGTACAGCGGGGCA-5 Por fim, o clone C foi amplificado por PCR com um primer de sequncia, 3-GGATAAAGAGGGGCT-5 De forma a descobrir qual dos clones codifica para a sequncia de aminocidos pretendida, verifica-se qual das seguintes sequncias apresentam os tripletos de nucletidos que codificam para cada um dos aminocidos da sequncia. Assim verifica-se que o clone em causa o B. 5-ATG TCA TAT TGC CTG CCC ATG C -Met Ser Tyr Cys Leu Pro Met TCC CCG CGT GCG-3 Ser Pro Arg Ala- N
Acima encontra-se a sequncia codificante do clone B e respectiva sequncia de aminocidos que codificam (negrito).
CONCLUSES
Atravs
do
mtodo
de
Sanger
foi
possvel
descobrir
que
primer
foi
usado
nos
ensaios
de
PCR
de
cada
um
dos
clones.
Para
alm
disso
foi
possvel
identificar
a
sequncia
codificante
que
codifica
para
a
sequncia
de
aminocidos em causa, sendo essa correspondente ao clone B. A identificao dos primers utilizados para a amplificao das sequncias por PCR foi feito por anlise, na sequncias codificante, dos nucletidos que agrupados 3 a 3 diferiam no mximo no ltimo nucletido desses tripletos. Isto por definio de mistura de primers degenerados.
38
EQUIPAMENTO
Usou-se
o
transiluminador
de
UV;
mini- coluna
SV;
centrfuga
PROCEDIMENTO
EXPERIMENTAL
A.
Digesto
e
purificao
do
DNA
O
plasmdeo
recombinante
pSK-yTUB
previamente
digerido
com
EcoRI
de
acordo
com
o
procedimento
descrito
em
Anlise
electroforritca
de
DNA
digerido
com
enzimas
de
restrio.
Aplicar
em
gel
de
poliacrilamida
o
marcador
de
pesos
moleculares,
o
plasmdeo
recombinante
no
digerido
e
os
produtos
da
digesto.
Correr
o
gel
de
poliacrilamida
a
100V
at
a
frente
do
gel
percorrer
2/3
do
gel.
Visualizar
o
gel
num
transiluminador
UV.
Excisar
as
bandas
do
gel
correspondentes
aos
produtos
da
digesto.
Colocar
as
bandas
num
Eppendorf.
Determinar
a
massa
da
banda
excisada
por
pesagem
do
tubo
Eppendorf
antes
e
depois
da
adio
da
exciso.
Adicionar
1L
de
Membrane
Binding
Solution
por
cada
1mg
de
gel.
Vortexar
vigorosamente
e
incubar
a
65C
at
a
agarose
se
dissolver
completamente.
Transferir
a
soluo
resultante
para
uma
mini-coluna
SV
previamente
inserida
num
tubo
coletor.
Centrifugar
velocidade
mxima
durante
1
minuto,
descartar
o
filtrado
e
voltar
a
colocar
a
coluna
dentro
do
tubo.
Adicionar
700L
de
Membrane
Wash
Solution.
Centrifugar
velocidade
mxima
durante
1
minuto.
Descartar
o
filtrado
e
colocar
a
coluna
dentro
do
tubo.
Repetir
o
passo
8.
Com
500L
de
Membrane
Wash
Solution.
Transferir
a
mini-coluna
SV
para
um
Eppendorf
limpo
e
adicionar
50L
de
gua
ultra-pura
e
centrifugar
velocidade
mxima
durante
1
minuto.
Por
fim
descartar
INTRODUO
TERICA
O
DNA
complementar
(cDNA)
amplamente
utilizado
quando
se
pretende
amplificar
um
gene
que
codifica
para
uma
determinada
protena.
A
vantagem
do
cDNA
que
no
contm
os
intres
que
o
gene
original
conteria,
assim
apenas
amplificada
a
sequncia
codificante,
poupando-se
recursos
e
ignorando
o
processamento
do
mRNA.
O
gene
em
causa,
neste
caso
cDNA,
inserido
num
vetor,
que
pode
ser
um
plasmdeo,
e
introduzido
em
bactrias
de
modo
a
que
o
crescimento
das
colnias
aumente
a
quantidade
de
cDNA
e
leve
formao
de
colnias
com
o
gene
em
causa.
METODOLOGIA
REAGENTES
Usou-se
soluo
contendo
o
plasmdeo
recombinante
pSK-yTUB
digerido
com
a
enzima
de
restrio
EcoRI;
Agarose
(1%);
marcadores
de
pesos
moleculares;
membrane
binding
solution;
membrane
wash
solution;
tampo
de
ligao
(5x);
soluo
de
T4-ligase;
soluo
de
E.coli
JM101
competentes;
placas
com
meio
Mac/Lac/Amp.
39
a mini-coluna SV e guardar o filtrado em gelo. B. Ligao Preparam-se quatro solues com a composio apresentada na tabela abaixo. Tabela 10 Volumes medidos para 4 tubos eppedorf diferentes de modo a provocar a ligao do cDNA ao vetor pKS. Reaes Soluo A B C D Vetor pKS digerido 5L 5L 5L 10L 10L 10L cDNA Tampo de ligao 4L 4L 4L 4L Taq ligase 1L 1L 1L Agitar suavemente a mistura por colises suaves com o dedo no fundo do tubo. Incubar a 37C durante uma hora, em alternativa poder-se- incubar a 4C durante a noite. Congelar a mistura a -20C. C. Transformao Descongelar uma alquota de clulas E. Coli JM101 competentes em gelo. Colocar num Eppendorf 5L de pKS e num outro 5L da mistura de ligao obtida no procedimento B. Para um outro tubo medir 5L de gua ultra-pura, este ser o controlo negativo. A cada um dos tubos adicionar 50L das clulas competentes e misturar com movimento circulares efectuados com a ponta da pipeta. Incubar os tubos em gelo durante 20 minutos. Provocar o choque trmico das clulas colocando-as a 42C durante 2 minutos e colocar novamente em gelo durante 2 minutos. Adicionar 200L de meio LB e incubar a 37C durante 30 minutos com agitao. Plaquear as clulas em meio Mac/Lac/Amp. Incubar as placas durante a noite a 37C.
RESULTADOS
EXPERIMENTAIS
Aps
a
incubao,
as
placas
obtidas
tinham
o
aspecto
das
figuras
abaixo
apresentadas.
Figura 21 Placa resultante do crescimento de colnias de bactrias transformadas com a mistura reacional A.
Figura 22 Placa resultante do crescimento de colnias de bactrias transformadas com a mistura reacional B.
Figura 23 Placa resultante do crescimento de colnias de bactrias transformadas com a mistura reacional C.
40
no
baixe
as
colnias
apresentam-se
brancas.
Assim,
verifica-se
que
a
placa
A
apresenta
colnias
de
bactrias
que
incorporarm
o
cDNA.
A
no
expresso
do
gene
LAC
quando
o
cDNA
incorporado
explicado
pelo
facto
da
incorporao
acontecer
no
meio
do
gene
LAC,
impedindo
a
sua
expresso.
Figura
24
Placa
resultante
do
crescimento
de
colnias
de
bactrias
transformadas
com
a
mistura
reacional
D.
Tabela
11
Contagem
das
colnias
e
avaliao
da
eficincia
da
transformao.
A
B
C
D
Colnias
Colnias
Transformadas
Eficincia
(%)
No que diz respeito reao na ausncia de cDNA, o vetor fecha expresso sem o cDNA inserido. Isto faz com que as bactrias resistam ampicilina mas que todas elas expressem para a -galactosidade, fazendo com que todas as colnias sejam violetas (diminuio do pH provocada pela libertao de cido frmico). As placas B e C no apresentam colnias, porque as bactrias so incapazes de sobreviver. No C no apresentam o vetor que contm o gene que codifica para a resistncia ampicilina, dando origem a bactrias susceptveis e que no resistem. No caso do B, como no se adiciona a Taq Ligase, o plasmdeo no capaz de ciclizar e portanto no possvel proceder transcrio para a que o gene de resistncia ampicilina seja expresso e portanto as bactrias no se conseguem desenvolver. Por contagem das colnias, verifica-se que a transformao ocorreu em 22,6% das bactrias que deram origem s respectivas colnias.
128 0 0 63
29 0 0 0
CONCLUSES
A
reao
A
corresponde
poro
onde
realmente
teria
de
haver
a
transformao
e
realmente
isso
aconteceu,
isto
porque
existem
algumas
colnias
amarelas
que
correspondem
s
colnias
de
bactrias
transformadas,
uma
vez
que
no
expressam
o
gene
LAC
e
que
portanto
no
produzem
- galactosidade
que
degrada
a
lactose
originado
cido
frmico
que
leva
a
um
abaixamento
do
pH.
Esse
abaixamento
evidenciado
pelo
aparecimento
da
cor
violeta
em
corante
neutral
red.
Caso
o
pH
41
BIBLIOGRAFIA
Sunckel,
C;
Protocolos
das
aulas
experimentais
de
Biologia
Molecular;
Instituto
de
Cincias
Biomdicas
Abel
Salazar;
Porto;
2009/2010
Andrysik,
Zdenek
;
Bernstein,
William
Z.
;
Deng,
Li;
The
novel
mouse
Polo-like
kinase
5
responds
to
DNA
damage
and
localizes
in
the
nucleolus,
Nucleic
Acids
Researchs,
38,
9,
2010,
2931-2943.
42
ANEXOS
43