ACERCA DE LA POSIBLE CONTAMINACIN POR OCRATOXINA A EN ALIMENTOS II: PRESENCIA EN VINOS Y REVISIN DE LOS MTODOS DE ANLISIS

Murillo M., Amzqueta S., Gonzlez-Peas E., Lpez de Cerain A., Bello J. Laboratorio de Toxicologa y Tcnicas Instrumentales. CIFA. Universidad de Navarra. Pamplona. Espaa.

RESUMEN

Se han revisado los datos publicados en la bibliografa sobre la presencia de ocratoxina A en vinos tintos, blancos y rosados de distinto origen. Los vinos tintos presentan una concentracin media ms elevada de ocratoxina A que los rosados y los blancos, siendo estos ltimos donde se encuentran los menores niveles. Aunque aparecen datos contradictorios, la mayor parte de los trabajos encuentran en los vinos tintos un aumento gradual de la contaminacin por ocratoxina A desde el norte hacia el sur. La diferencia en latitud y las consecuentes diferencias climticas influyen muy posiblemente en la contaminacin fngica y en la produccin de ocratoxina A. Las diferencias encontradas entre vinos de distintas cosechas se atribuyen as mismo a diferencias climatolgicas que condicionaran el crecimiento fngico. Tambin se piensa que las prcticas de viticultura y enologa juegan un papel sobre el crecimiento fngico y la produccin de esta micotoxina. Una vez presente en el vino, esta micotoxina se mantiene estable durante al menos un ao. Los hongos productores de ocratoxina A en la uva pertenecen principalmente a las especies Aspergillus niger y Aspergillus carbonarius , siendo sta ltima la que tiene mayor poder ocratoxignico. Debido a los bajos niveles establecidos en la legislacin, se requieren tcnicas analticas que alcancen lmites de deteccin del orden de g/L e incluso inferiores. En la actualidad la tcnica ms empleada es la cromatografa lquida de alta resolucin acoplada a un detector de fluorescencia. La purificacin de la muestra se realiza con cartuchos de octadecilsilano o con anticuerpos especficos (columnas de inmunoafinidad) con los que se consiguen los lmites de deteccin ms bajos. Tambin la cromatografa lquida acoplada a la espectrometra de masas (LC-MS-MS) da buenos resultados, pero requiere un equipamiento ms complejo. Las tcnicas de inmunoensayo (ELISA) pueden ser tiles, sobre todo por su rapidez, en procedimientos de screening, pero se consideran tcnicas cualitativas o semicuantitativas que requieren una confirmacin de los positivos. La obtencin de resultados de calidad exige la perfecta validacin del mtodo analtico empleado, cualquiera que sea ste, y la implantacin de un sistema de calidad que incluya ensayos interlaboratorio y que sea certificado por entidades externas.

INTRODUCCIN La ocratoxina A (OTA), micotoxina descubierta por primera vez en frica en muestras de maz (1965) por Van der Merwe y col., es un metabolito secundario de algunos hongos filamentosos. Es un producto cristalino e incoloro con caractersticas de cido dbil, que emite fluorescencia al ser excitado con luz UV (Monaci y Palmisano, 2004), su estructura qumica [7(L- -fenilalanil-carbonil)-carboxil-5-cloro-8-hidroxi-3,4-dihidro-3R-metilisocumarina] se presenta en la figura 1.

Fig 1. Estructura de la Ocratoxina A La OTA se describi originalmente como metabolito de Aspergillus ochraceus , al que debe su nombre (Van der Merwe y col, 1965). Esta especie junto con Penicillium verrucosum, son consideradas las principales productoras de ocratoxina A en alimentos debido a que contaminan una gran variedad de los mismos (Hesseltine y col., 1972). En el vino la produccin de OTA se debe a la especie Aspergillus carbonarius (Serra y col., 2003). As, aunque durante algn tiempo los cereales y los productos animales (contaminados por la ingestin de piensos con OTA) fueron considerados los principales alimentos contaminados por esta micotoxina, en la actualidad se sabe que puede aparecer en otras muchas matrices alimentarias como vino, cerveza, caf, cacao, uvas pasas, especias, etc. De entre ellas, el vino se considera una de las principales fuentes de OTA para el hombre junto con los cereales (A. Visconti, 1999), debido a que es un producto ampliamente consumido por la poblacin general y a la elevada incidencia de OTA en esta matriz, segn se deriva de los numerosos estudios realizados en los ltimos aos. Se ha encontrado OTA en sangre humana en todos los pases en los que se ha

investigado su presencia, aunque generalmente a concentraciones bajas (Cabaes y col., 2002). En Espaa se ha demostrado la presencia de esta toxina en sangre de personas que habitaban distintas regiones distribuidas por el norte, centro y sur de la geografa espaola (Burdaspal y col., 1998; Prez de Obanos y col., 2001, Jimnez y col., 1998). Aunque se dispone de pocos datos sobre la farmacocintica de la OTA en el hombre, parece ser que se metaboliza lentamente y tiene una vida media de aproximadamente 35,5 das ( Studer-Rohr y col., 2000), lo que supone que una vez ingerida con los alimentos, permanece en el organismo largo tiempo, aumentando la probabilidad de producir toxicidad. Se une principalmente a

protenas plasmticas ( Stojkovic y col., 1984) y se acumula en tejido heptico y renal. La

excrecin de la OTA y sus metabolitos suele ser por orina y heces. Tambin se ha comprobado que es capaz de pasar a la leche materna ( BreitholtzEmanuelsson y col., 1993; Gareis y col., 1988). Esta posibilidad hay que tenerla muy en cuenta ya que supone un riesgo de exposicin para recin nacidos y de transmisin a productos lcteos de consumo humano.

Se han estudiado los efectos txicos de la OTA en diferentes especies animales (William y col., 1980; JECFA, 1991; Boorman, 1989), obtenindose datos que demuestran que tiene una actividad txica muy diversa; ha demostrado ser nefrotxica, inmunotxica, genotxica, carcinognica, teratognica y neurotxica (KuiperGoodman, 1996). Respecto a la actividad carcinognica, est demostrado su potencial carcinognico en rata y ratn y la Agencia Internacional de Investigacin del Cncer (IARC) ha clasificado esta toxina en la categora 2B, es decir, como posible carcingeno humano (IARC, 1993). La OTA es una toxina principalmente nefrotxica que se ha demostrado como agente causal en nefropatas porcinas y aviares (Stoev y col., 1998; Kuiper-Goodman, 1991; Krogh y col., 1979; William y col., 1980). En el ser humano tambin se ha sugerido que es el principal factor determinante de la Nefropata Endmica de los Balcanes (NEB) (Scott, 1994), una enfermedad caracterizada por una grave afeccin renal observada en regiones del sudeste de Europa (Bosnia, Servia, Croacia, Bulgaria y Rumania) (Radic y col., 1997; Kovacs y col., 1995; Maaroufi y col., 1995). Esta hiptesis, todava no confirmada, se basa en la semejanza entre esta nefropata humana y la nefropata porcina ocasionada por la OTA y tambin en las altas concentraciones de OTA encontradas en algunas prospecciones de alimentos realizados en esta zona geogrfica (Vrabcheva y col., 2000). Desde el punto de vista del riesgo para la salud humana los efectos que ms preocupan son su posible carcinogenicidad que, si se confirmara que se produce por un mecanismo genotxico, aconsejara reducir su exposicin tanto como fuera posible. As lo entendi el Comit cientfico sobre alimentacin de la Comisin Europea, que en 1998, basndose en los datos de genotoxicidad y carcinogenicidad, consider que sera prudente reducir la exposicin de OTA lo mximo posible y, en cualquier caso, por debajo de 5 ng por kg de peso corporal y da. Por su parte, el Comit mixto FAO/WHO de expertos sobre aditivos alimentarios (JECFA), en 1995 haba establecido un valor de ingesta semanal tolerable de 100 ng por kg de peso corporal, lo que equivale aproximadamente a una ingesta diaria de 14 ng por kg de peso corporal. Como consecuencia de todas estas recomendaciones y a la vista de los datos disponibles sobre la presencia de OTA en diversos alimentos, la Comisin Europea aprob el Reglamento (CE) n 472/2002 de 12 de marzo de 2002, que entraba en vigor el 5 de abril de 2002, y que establece los lmites de OTA en ciertos alimentos (Tabla I). Adems, el 13 de Abril de 2004, se ha adoptado el Reglamento (CE) N 683/2004 de la Comisin, donde se establecen contenidos mximos de Ocratoxina A en alimentos destinados a lactantes y nios de corta edad (Tabla II). Comparando ambos reglamentos, se puede observar que en un intervalo de dos aos, hay una clara tendencia a bajar los niveles mximos de OTA permitidos en alimentos. Por ltimo decir, que algunos pases de Europa han establecido sus propios lmites mximos de OTA en alimentos y piensos (Monaci y Palmisano, 2004); por ejemplo Italia ha limitado el contenido de OTA en carne de cerdo y productos derivados a 1 ppb, y en caf tostado e instantneo a 4 ppb.
3

Se espera que en un breve plazo de tiempo, la UE fije el mximo nivel de OTA permisible en el vino, el cual se prev que sea alrededor de 0,5 g/L (Soleas y col., 2001) o entre 1 y 2 g/L (Soufleros y col., 2003; OIV, 2002).

PRESENCIA DE OTA EN VINO El primer trabajo publicado sobre la presencia de ocratoxina A en vinos es el de Zimmerli y Dick (1996). En un estudio previo, estos autores haban encontrado ciertas diferencias en la concentracin plasmtica de OTA entre personas de distinto sexo y residentes en diversas regiones de Suiza (Zimmerli y Dick, 1995). Pensando que esas diferencias podan estar causadas por el diferente consumo de vino entre las poblaciones estudiadas, determinaron la concentracin de OTA en vinos de distinto tipo y origen. Sealaron la tendencia hacia una mayor concentracin de OTA en los vinos tintos frente a los blancos, as como en los vinos procedentes del sur de Europa respecto de los del norte. En todos los trabajos publicados posteriormente se encuentra un mayor porcentaje de muestras positivas (debido a una mejora en los lmites de deteccin de los mtodos analticos desarrollados) y se constata el hecho de que los vinos tintos presentan una concentracin media ms elevada de OTA que los rosados y los blancos, siendo estos ltimos donde se encuentran los menores niveles. Son diversos los estudios publicados en los que se ha evaluado el contenido de OTA en vinos de diversas regiones de Europa, en especial de Suiza, Francia, Italia, Espaa y Grecia; y tambin de algunos pases del norte de Africa. En la tabla III se resumen estos trabajos indicndose, adems del diferente origen de los vinos, el tipo de vino estudiado (tintos, rosados o blancos). Como se puede observar, en casi todos los trabajos citados se han analizado muestras de vino de distintos tipos aunque en general, el nmero de muestras de vino tinto analizadas es considerablemente ms elevado que las correspondientes a vino blanco o rosado. La mayor concentracin de toxina encontrada en los vinos tintos respecto de los rosados y blancos se puede explicar por el diferente proceso utilizado en la elaboracin de unos y otros. En el caso del vino blanco la uva es prensada inmediatamente despus de ser recogida y a continuacin, la piel es separada del jugo de la uva ( Soufleros y col., 2003). Por el contrario, durante el proceso de elaboracin de los vinos tintos y rosados, una vez prensada la uva, la mezcla de piel y zumo de uva se deja un tiempo en maceracin en funcin del tipo de vino a obtener, siendo este tiempo mayor en vinos tintos que en rosados. En esta fase se dan unas condiciones aerbicas en las que no se produce fermentacin y se favorece probablemente el crecimiento fngico (Amerine y col., 1980). En cuanto a la mayor contaminacin de los vinos procedentes del sur de Europa, los datos iniciales de Zimmerli y Dick (1996) sobre un escaso nmero total de muestras, incluan vinos procedentes de Tnez y Argelia, que presentaban los valores ms altos de OTA. Esta tendencia fue indicada por Otteneder y Majerus (1996), aunque tambin en un estudio con
4

escasas muestras (tan solo 1-2 muestras por pas en muchos casos), procedentes de zonas geogrficas tan dispares como Argentina, Chile o Estados Unidos, y sin haber realizado ningn anlisis estadstico, probablemente debido al deficiente diseo experimental. Burdaspal y Legarda (1999) en un trabajo en el que analizaban 194 vinos espaoles y 73 de otros 5 pases (Francia, Italia, Portugal, Hungra y California), no confirmaron la opinin de los citados autores sobre la relacin de niveles de OTA en vinos tintos europeos con la latitud. Posteriormente, Otteneder y Majerus (2000) en un estudio amplio en el que analizan 44 vinos blancos y 209 vinos tintos de Alemania, Francia e Italia, confirman esta tendencia en los vinos tintos, pero no en los blancos. En trabajos publicados ms recientemente se ha estudiado la influencia de la latitud sobre la presencia de OTA en vinos dentro de un mismo pas, como en Italia ( Pietri y col., 2001) o Grecia (Stefanaki y col., 2003). En los vinos tintos se encontr un aumento gradual de la contaminacin por OTA desde el norte hacia el sur en ambos casos. Se deduce claramente que la diferencia en latitud (del paralelo 46 al 36) y las consecuentes diferencias climticas influyen en la contaminacin fngica y en la produccin de OTA de una manera definitiva (Pietri y col., 2001). Aparte de la latitud, otros factores pueden tambin influir en la aparicin de OTA en vinos. As, Visconti (1999), estudi vinos comerciales y vinos elaborados en casa, todos ellos procedentes del sur de Italia. Entre los vinos tintos, todas las muestras resultaron positivas con concentraciones de OTA relativamente elevadas y ms altas en los vinos comerciales que en los caseros. Similar tendencia se observ en los rosados, pero no as en los blancos. Por otra parte, se han encontrado diferencias muy significativas entre vinos con idnticos origen y proceso de elaboracin, procedentes de dos cosechas consecutivas con condiciones climticas muy distintas, que se atribuyeron a la diferente calidad de la uva debida a la mala climatologa en uno de los aos (Lpez de Cerain y col., 2002). Tambin Stefanaki y col (2003), encontraron diferencias significativas entre vinos tintos y vinos blancos de tres aos consecutivos, pero no as en vinos rosados. Por lo que respecta a los vinos dulces, diversos estudios demuestran que la concentracin de OTA es ms elevada que en los vinos secos (Zimmerli y Dick 1996; Pietri y col., 2001; Stefanaki y col., 2003). Es lgico que esto sea as, ya que en la elaboracin del vino dulce la uva se deshidrata al sol para incrementar su contenido en azcar, siendo as ms susceptible de ser atacada por hongos contaminantes. En resumen, parece ser que tanto la latitud como las condiciones climticas y posiblemente las prcticas de viticultura y enologa determinan unas diferentes condiciones de temperatura, humedad y pH, ms o menos favorables para el crecimiento fngico y la produccin de esta micotoxina. En un reciente trabajo publicado por Bell y col (2004)b, se estudia la relacin entre la produccin de OTA por Aspergillus niger a diferentes niveles de actividad de agua (aw ) en un medio que simula la composicin de la uva. Concluyen que una alta actividad de agua parece favorecer la produccin de OTA por estas especies y su

crecimiento. Este estudio aporta algunas medidas para disminuir la presencia de OTA en las uvas como son: controlar las condiciones de humedad en la via y durante el traslado a las bodegas, elegir adecuadamente las fechas de vendimia, disminuir el tiempo de cosechado y de transporte y evitar cualquier dao de la uva durante la vendimia y el transporte. Por ltimo, la ocratoxina A es una molcula muy estable, por lo que una vez que se ha producido y est presente en el vino elaborado, no se descompone ni desaparece del mismo. Parece ser que su concentracin se mantiene estable durante al menos un ao, ya que no se han detectado diferencias significativas en la concentracin de OTA en muestras de vino contaminadas por OTA, tanto de manera natural como artificial, y mantenidas durante este tiempo a 4 C en la oscuridad (Lpez de Cerain y col., 2002). Se han probado algunos mtodos fsicos, qumicos y microbiolgicos para retirar o eliminar la toxina del vino, pero, en general, tienen poca utilidad prctica; por ejemplo, el uso de microorganismos o de agentes adsorbentes, como por ejemplo el carbn activo, puede afectar a la calidad del vino (Castellari y col. (2001). ESPECIES DE HONGOS PRODUCTORAS DE OCRATOXINA A EN VINOS Las especies de hongos capaces de producir ocratoxina A pertenecen a los gneros Aspergillus y Penicillium. Se considera que A. ochraceus y P. verrucosum son las principales especies productoras de ocratoxina A, la primera crece en un rango de temperaturas ms alto (12-37C) y se asocia con climas clidos y tropicales, habindose encontrado sobre todo en alimentos almacenados; la segunda crece en un rango de temperaturas ms bajo (4-31C) y produce OTA en climas templados y fros, habindose referido su presencia casi exclusivamente en cereales y derivados (Zimmerli y Dick, 1996). Sin embargo, estos hongos productores no forman parte de la poblacin fngica habitual presente en las uvas. Otras especies de hongos con capacidad para producir OTA pertenecen tambin al gnero Aspergillus . Abarca y col. (1994) describieron por primera vez la produccin de OTA por A. niger var. niger, y desde entonces son numerosos los estudios en los que se describe la produccin de OTA por otras especies negras de Aspergillus (seccin nigri). Al contrario que las anteriores, muchas de estas especies estn presentes en las vias y pueden causar podredumbre en las bayas. Entre las especies de este grupo, A. carbonarius muestra el mayor potencial ocratoxignico, ya que la mayor parte de los inculos tienen capacidad para producir OTA en el medio de cultivo (Heenan y col., 1998). En un estudio de microvinificacin a partir de uvas de la variedad garnacha blanca contaminadas por hongos de manera natural, una vez comprobada la presencia de OTA en el vino, Cabaes y col. (2002) aislaron e identificaron los hongos presentes en las bayas y determinaron su potencial toxignico. Las especies A. carbonarius y P. purpurogenum estaban presentes en todas las muestras estudiadas y A. niger var. niger solamente en algunas de ellas. Por otra parte, todos los inculos de A. carbonarius demostraron ser capaces de producir OTA, mientras que no se detect la micotoxina en los cultivos del resto de inculos. Por su parte, Bell y col. (2004)c, encontraron una infeccin significativa por hongos potencialmente

productores de OTA en uvas en el momento del cosechado. Entre todos los hongos encontrados, resultaron ocratoxignicas las especies Aspergillus nigri y Aspergillus circumdati; la segunda produca ms OTA pero la primera contamina ms frecuentemente la uva, razn por la cual se sugiere que Aspergillus nigri es el principal responsable de los niveles de OTA encontrados en vinos. Se piensa que existe una fuerte correlacin entre la presencia de mohos productores de OTA en las uvas y de OTA en los mostos, como as lo demuestra el estudio realizado por Sage y col. (2002), en donde un 73 % de las muestras de mosto contenan OTA que haba sido probablemente por la variedad A. carbonarius , ya que fue la nica especie aislada a partir de la uvas capaz de producir OTA in vitro. En un amplio estudio realizado en 11 viedos portugueses ubicados en cuatro regiones vincolas del pas vecino, se aislaron 301 cepas de Penicillium pertenecientes a 27 especies, ninguna de las cuales result ser productora de OTA, y 370 cepas de Aspergillus pertenecientes a 12 especies, en particular A. carbonarius (39) y A. niger (294); de stas ltimas el 97% y 4% respectivamente resultaron ser capaces de producir OTA ( Serra y col., 2003). Por lo tanto, segn estos datos, A. carbonarius y A. nigri seran las principales especies fngicas responsables de la aparicin de ocratoxina A en el vino. MTODOS DE DETERMINACION Y CUANTIFICACIN DE OCRATOXINA A Los mtodos de determinacin y cuantificacin de OTA han avanzado mucho durante los ltimos aos, as como los procedimientos de extraccin y purificacin. Se buscan tcnicas con lmites de deteccin cada vez ms bajos, que puedan utilizarse tanto en investigacin como en estudios de prospeccin o de control, ya que los lmites mximos permisibles en alimentos son tambin muy bajos, del orden de g/L, g/kg o inferiores. Entre las tcnicas empleadas para la determinacin de OTA descritas en la bibliografa se incluyen la cromatografa en capa fina, la cromatografia lquida de alta resolucin (HPLC), la cromatografa lquidaespectrometra de masas (LC-MS-MS), la electroforesis capilar, la electroforesis en gel, la cromatografia de intercambio inico y tcnicas de inmunoensayo (ELISA). Estas ltimas pueden ser tiles, sobre todo por su rapidez, en procedimientos de screening, pero se consideran tcnicas cualitativas o semi-cuantitativas. Por otra parte, aunque los lmites de deteccin pueden ser bajos y equiparables a los alcanzados por HPLC, existe el problema de los falsos positivos (por reacciones cruzadas) y sobre todo de los falsos negativos, en especial cuando se trata de matrices complejas (Monaci y Palmisano, 2004). Por todo ello, los resultados positivos requieren siempre de una confirmacin por una tcnica cuantitativa. En la actualidad las tcnicas ms empleadas y que mejores resultados estn dando son dos. En primer lugar, la cromatografa lquida de alta resolucin acoplada a un detector de fluorescencia (HPLC-FL) utilizando una fase mvil cida, ya que debido a la fluorescencia de la molcula y a la selectividad del detector se pueden conseguir lmites de deteccin muy pequeos, del orden de g/L e incluso inferiores. En segundo lugar, la cromatografa lquida
7

acoplada a la espectrometra de masas (LC-MS-MS) (Lau y col. 2000). En la tabla IV se resumen las caractersticas de los procedimientos referidos en la bibliografa que utilizan estas tcnicas. Otros autores no citados en la tabla han utilizado alguno de los mtodos reseados con ligeras modificaciones. En cualquier procedimiento de anlisis de OTA existe una etapa previa de extraccin y purificacin de la micotoxina a partir de la matriz alimentaria correspondiente, necesaria para obtener lmites de deteccin bajos y para proteger las columnas de cromatografa empleadas en el anlisis. Este proceso es ms o menos complicado en funcin del alimento de que se trate. En el vino, por tratarse de una matriz lquida, el procedimiento es ms sencillo que en otros productos como caf o cacao. Algunos autores realizan en primer lugar una extraccin lquido lquido con cloroformo (Lpez de Cerain y col., 2002), obteniendo una primera fraccin enriquecida en OTA; otros autores realizan una purificacin y extraccin simultnea pasando el vino directamente, o tras control del pH, por una columna de inmunoafinidad (Bell y col., 2004). Castellari y col. (2000) compararon dos procedimientos directos de purificacin utilizando columnas de inmunoafinidad con un procedimiento de purificacin con extraccin previa lquido-lquido, no observando diferencias cuantitativas significativas entre las diferentes tcnicas. La purificacin de la muestra se realiza generalmente por procedimientos

cromatogrficos. Para ello se utilizan cartuchos de octadecilsilano (RP-18 SPE) o con anticuerpos especficos frente a la OTA (columnas de inmunoafinidad, CIA). El uso de las CIA se ha considerado como el avance ms importante en el campo de los mtodos de purificacin para micotoxinas (Valenta, 1998). Una vez que la muestra ha sido pasada por la columna de purificacin y la OTA ha quedado retenida en ella, se realiza un lavado de la misma para eliminar el resto de los componentes de la muestra y, a continuacin, se procede a la elucin de la OTA utilizando un disolvente orgnico. Por ltimo se evapora el eludo bajo una corriente de N2 y se resuspende la OTA en la fase mvil utilizada para el anlisis cromatogrfico. En un estudio reciente Leitner y col. (2002) comparaban los dos tipos de columnas ms ampliamente utilizadas (CIA y RP-18 SPE), combinadas con dos mtodos de cuantificacin, HPLC-FL y LC-MS-MS. Observaron una mayor sensibilidad en la combinacin CIA-HPLC-FL frente a la combinacin RP18-LC-MS-MS, pero llegaron a la conclusin de que sta era debida al mtodo de deteccin y no al de purificacin. No obstante, la tcnica LC-MS-MS ofrece ciertas ventajas en la preparacin de la muestra y es susceptible de una fcil automatizacin. Adems, se obtienen resultados con una precisin comparable a los obtenidos por HPLC-FL y la sensibilidad es suficientemente alta para los niveles de tolerancia de la Unin Europea. Por estas razones, estos autores proponen esta tcnica como alternativa al mtodo HPLC-FL. Sin embargo, la sensibilidad y selectividad del detector de fluorescencia, y su menor precio frente al del espectrmetro de masas hacen que, hasta el momento, la mayora de los mtodos publicados utilicen la combinacin HPLC-FL para el anlisis y determinacin de OTA. El Comit Europeo para estandarizacin (CEN), present en marzo de 2001 un

borrador en el que se especifica un mtodo para la determinacin de Ocratoxina A en vino y

8

cerveza realizando una purificacin con columnas de inmunoafinidad y posterior cromatografa lquida de alta resolucin con deteccin por fluorescencia. Este mtodo est basado en el procedimiento desarrollado por Visconti y col. en 1999 para la determinacin de OTA en vinos, que tras un estudio de colaboracin interlaboratorio, fue tambin adoptado por la Asociacin Oficial de Qumica Analtica (AOAC) (Visconti y col. 2001). Durante los ltimos aos se ha hecho un esfuerzo considerable para desarrollar nuevos mtodos para el anlisis de micotoxinas en general y OTA en particular, y se observa una tendencia hacia la bsqueda de tcnicas ms econmicas y menos contaminantes, especialmente intentando reducir el uso de disolventes orgnicos ( Corneli y col., 1998). Nos encontramos as, la microextraccin en fase lquida combinada con HPLC-FL, puesta a punto por Gonzlez-Peas y col. 2004, en la cual la micotoxina es extrada desde el vino acidificado hacia una fase aceptora compuesta por 1-octanol que se encuentra en los poros y el interior de una fibra porosa inmersa en el vino. El proceso requiere nicamente 15 L de disolvente extractor y el equipamiento a utilizar es muy sencillo y econmico. Otro estudio que simplifica la determinacin de OTA en vino es el realizado por DallAsta y col 2004, en el cual se inyecta directamente la muestra de vino en el equipo de cromatografa sin pasos previos de extraccin y purificacin utilizndose una fase mvil alcalina (pH 9,8), ya que a este pH la OTA presenta mayor fluorescencia. En un intento de encontrar nuevas alternativas al uso de columnas de inmunoafinidad que resulten ms econmicas, se ha considerado la utilizacin de los llamados molecularly imprinted polymers o MIPs, que se generan por copolimerizacin de monmeros en presencia de molculas patrn que dejan la huella molecular deseada, dando lugar a redes polimricas rgidas con lugares de unin especficos para estas molculas patrn o molculas estructuralmente relacionadas. Son muy estables y permiten el uso de gran nmero de disolventes, pueden lavarse y regenerarse para usos mltiples y resultan baratos; sin embargo, no presentan la excelente selectividad de los rellenos de inmunofinidad. En el trabajo de Maier y col (2004) se describe la aplicacin de este tipo de polmeros al anlisis de OTA en vinos tintos. El estudio de los niveles de Ocratoxina A en las diferentes matrices alimentarias y la comparacin de los mismos con los niveles existentes en la literatura es a veces complicado porque la metodologa no esta siempre especificada y la calidad de los mtodos utilizados muchas veces es desconocida. Por lo tanto, es deseable, que los estudios sean realizados bajo condiciones que aseguren la calidad de los resultados. En este aspecto, es de especial importancia disponer de mtodos validados en los niveles de concentracin a los que se encuentra la OTA en el vino, la utilizacin de materiales de referencia certificados, en el caso de que se disponga de ellos, un riguroso control de calidad interno del laboratorio y la participacin del mismo en estudios interlaboratorio.

CONCLUSIN La presencia de OTA en el vino est demostrada y es un hecho a tener en cuenta tanto por parte del sector industrial vitivincola como por la administracin, que trata de velar por la salud de los consumidores. Para la industria del vino es importante conocer el nivel de contaminacin de sus materias primas y productos finales, con objeto de tomar las medidas que fueran necesarias para reducir los niveles de esta micotoxina y as cumplir las exigencias de la futura legislacin europea. Conviene estar preparado frente a cualquier amenaza procedente de la fuerte competencia internacional. Es conocida adems la enorme susceptibilidad del consumidor por todos aquellos factores que pueden repercutir en su salud. Por su parte, es obligacin de la administracin establecer procesos de control que garanticen la salud de los consumidores. Aunque las concentraciones de OTA encontradas en el vino pueden considerarse bajas, el aporte que suponen en la dieta no es desdeable. En efecto, con una concentracin de OTA de 0.302 g/L (valor medio para vino tinto obtenido de los datos de la tabla II), un bebedor de 70 kg que tomara 200 ml de vino tinto al da, estara recibiendo 17,4% de la ingesta diaria tolerable de OTA, establecida por el Comit cientfico de la Comisin Europea (1998). Convendra reducir por tanto la presencia de OTA en el vino, ya que una gran parte de la poblacin adulta bebe vino diariamente y este hbito es una tendencia al alza. Hay que tener en cuenta adems que en otros muchos alimentos bsicos est tambin presente la micotoxina. Por todo ello, resulta imprescindible disponer de mtodos analticos validados para el anlisis de OTA en vino, que adems sean utilizados en laboratorios con un sistema de calidad implantado y certificado por entidades externas, que asegure la calidad de los resultados.

10

Bibliografa
Abarca M.L.; Bragulat M.R.; Castell G.; Cabaes F.J. (1994): Ochratoxin A production by strains of Aspergillus niger var., Applied and Environmental Microbiology 60 , 2650-2652. Aboul-Enein H.Y.; Banu Kutluk .; Altioka G; Tunel M. (2002): A modified HPLC method for the determination of Ochratoxin A by fluorescence detection, Biomedical Chromatography 16, 470-474. Amerine M.A.; Kunkee R.E.; Ough C.S.; Singleton V.L.; Webb A.D. (1980): The technology of wine making, (4 edition), Westport Conn: AVI Publishing company 5, 154-161 Bell N.; Marn S.; Duaigs A.; Ramos J.A.; Sanchis V. (2004)a: Ochratoxin A in wines, musts and grape juices from Spain, Journal of the Science of Food and Agriculture 84, 541-546. Bell N.; Ramos J.A.; Sanchis V.; y Marn S. (2004)b: Incubation time and water activity effects on ochratoxin A production by Aspergillus section Nigri isolated from grapes , Letters in Applied Microbiology 38, 72-77. Bell N.; Pardo E.; Marn S.; Farr G.; Ramos J.A.; Sanchis V. (2004)c: Occurrence of ochratoxin A and toxicogenic potencial of fungal isolates from Spanish grapes, Journal of the Science of Food and Agriculture 84, 591-594. Boorman G. (1989): Toxicology and carcinogenesis studies of Ochratoxin A, Washington, US National Institutes of Health Publication, 89-2813. Breitholtz-Emanuelsson A.; Olsen M.; Oskarsson A.; Palminger I.; Hult K. (1993): Ochratoxin A in cows milk and in human milk with corresponding human blood samples, Journal Association of Analitical Chemistry 42, 172-176. Burdaspal, P.A.; Legarda, T.M. (1998): Datos sobre la presencia de ocratoxina A en Espaa, Alimentaria 292, 103-109.
th

Burdaspal P.A. y Legarda T.M. (1999): Ocratoxina A en vinos, mostos y zumos de uva elaborados en Espaa y otros pases europeos, Alimentaria 299, 107-114. Cabaes F.J.; Accensi F.; Bragulat M.R.; Abarca M.L.; Castell G.; Minguez S.; Pons A. (2002): What is the source of Ochratoxin A in wine?, International Journal of Food Microbiology 79, 213-15. Castellari M.; Fabbri S.; Fabiani A.; Amati A.; y Galassi S. (2000): Comparison of different inmunoaffinity clean-up procedures for high-performance liquid chromatographic analysis of ochratoxin A in wines, Journal of Chromatography A, 888, 129-136.

11

Castellari, M.; Versari, A.; Fabiani, A.; Parpinello G.P.;

Galassi S. (2001): Removal of

ochratoxin A in red wines by means of adsorption treatments whit commercial fining agents, J. Agric. Food. Chem. 49, 3917-3921. Corneli S.; Maragos C.M. (1998): Capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence: method for the mycotoxin ochratoxin A, J. Agric. Food Chem. 46, 3162 - 3165. DallAsta C.; Galverna G.; Dossena A.; Marchell R. (2004): Reversed-phase liquid chromatographic method for the determination of ochratoxin A in wine, Journal of Chromatography A, 1024, 275-279. Festas I.; Herbert P.; Santos L.; Cabral M.; Barros P.; Alves A. (2000): Ochratoxin A in some Portuguese Wines: Method validation and screening in Port Wine and Vinho Verde, American Journal Enology Viticulture, 51, 150-154. Filali A.; Ouammi L.; Betbeder A.M.; Baudrimont I.; Soulaymani R.; Benayada A.; y Creppy E.E. (2001): Ochratoxin A in beverages from Morocco: a preliminary survey , Food Additives and Contaminants, Vol. 18, N 6, 565-568. Gareis M.; Martlbauer E.; Bauer J.; Gedek B. (1988): Determination of ochratoxin A in breast milk, Z. Lebensm unters forsch 186, 114-117. Gonzlez-Peas E.; Leache C.; Viscarret M.; Perz de Obanos A.; Araguas C.; Lopz de Cerain A. (2004): Determination of Ochratoxin A in wine using liquid-phase microextraction combined with liquid chromatography with fluorescence detection, Journal of Chomatography A, 1205, 163-168. Heenan C.N.; Shaw K.J.; Pitt J.I. (1998): Ochratoxin A production by Aspergillus carbonarius and Aspergillus niger isolates and detection using coconut cream agar, Journal of Food Mycology 1, 67-72. Hesseltine C.W.; Vandegraf E.E.; Fennell D.I.; Smith M.L.; y Shotwell O.L. (1972): Aspergilli as Ochratoxin producers, Micology, 64, 539-550. IARC (1993): Ochratoxin A. Some naturally occurring substances: food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins, IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risk to humans 56, 489-521. JECFA 1995: Evaluation of certain food additives and contaminants. Forty-fourth report. WHO Technical Report Series N 859, p 35-36. Jimnez A.M.; Lpez de Cerain A.; Gonzlez-Peas E; Bello J., Betbeder A.M.; Creppy, E.E. (1998): Exposure to ochratoxine A in Europe: comparison with a region of northern Spain, J. Toxicol.- Toxin Reviews 17, 479-491.

12

Jornet D.; Busto O.; Guasch J. (2000): Solid-phase extraction applied to the determination of ochratoxin A in wines by reversed-phase high-performance liquid chromatography, Journal of Chromatography A 882, 29-35. Kovacs F.; Sandor G.; Vanyi A.; Domany S.; and Zomborsky-Kovacs M. (1995): Detection of Ochratoxin A in human blood and colostrum, Acta Vet. HUNG. 43, 393-400. Krogh P.; Elling F.; Friis C.; Hald B.; Larsen AE.; Lillehoj E.B. (1979): Porcine nephropathy induced by long-term ingestion of ochratoxin A, Veterinarian Pathology 16, 466-475. Kuiper-Goodman T. (1991): Risk assessment of ochratoxin A residues in food. Mycotoxins, endemic nephropathy and urinary tract tumours, Lyon: IARC Science Publications 115, 307. Kuiper-Goodman, T. (1996): Risk assessment of ochratoxin A: an update, Food Additives and Contaminants 13 (suppl.), 53-57. Lau B.P.Y.; Scott P.M.; Lewis D.A.; Kanhere S.R. (2000): Quantitative determination of ochratoxin A by liquid Chromatography/electrospray tandem mass spectrometry, Journal of Mass Spectrometry 35, 23-32. Leitner A.; Zllner P.; Paolillo A.; Stroka J.; Papadopoulo-Bouraoui A.; Jaborek S.; Anklam E.; Lindener W. (2002): Comparison of methods for the determination of ochratoxin A in wine, Analityca Chimica Acta 453, 33-41. Lopez de Cerain A.; Gonzlez-Peas E.; Jimenz A.M.; Bello J. (2002): Contribution to the study of ochratoxin A in Spanish wines, Food Additives and Contaminants 19, 1058-1064. Maaroufi K.; Achour A.; Hammami M.; El May M.; Betbeder AM.; Ellouz F.; Creppy EE., Bacha H. ( 1995): Ochratoxin A in human blood in relation to nephropathy in Tunisia, Human and Experimental Toxicology 14, 609-615. Maier N.M.; Buttinger G.; Welhartizki S.; Gavioli E.; Lindner W. (2004): Molecularly imprinted polymer-assisted sample clean-up of ochratoxin A from red wine: merits and limitations, Journal of Chromatography B 804, 103-111. Majerus P. y Otteneder H. (1996): Detection and ocurrence of ochratoxin A in wine and grape juice, Deutsche Lebensmitter-Rundschau 92, 388-390. Markaki P.; Delpont-Binet C.; Grosso F.; Dragacci S. (2001): Determination of Ochratoxin A in red wine and vinegar by immunoaffinity high-presssure liquid chromatography, Journal of Food Protection 64, 533-537. Monaci L.; Palmisano F. (2004): Determination of ochratoxin A in foods: state-of-the-art and analytical challenges, Anal Bioanal Chem 378, 96-103. OIV (2002): Rsolutions de la 82 Assemble Gnerale de lOIV, Office Internationale de la Vigne et du Vin, Paris.
13
e

Otteneder H.; Majerus P. (2000): Occurrence of ochratoxin A (OTA) in wines: influence of the type of wine and its geographical origin, Food Additives and Contaminants, Vol.17, N 9, 793-798.

Prez de Obanos A.; Lpez de Cerain A.; Jimnez A.M.; Gonzlez-Peas E.; Bello J. (2001): Ocratoxina A en plasma humano: nuevos datos de exposicin en Espaa, Revista de Toxicologa 18, 19-23.

Pietri A.; Bertuzzi T.; Pallaroni L.; y Piva G. (2001): Occurrence of ochratoxin A in Italian wines, Food Additives and Contaminants Vol 18, N 7, 647-654. Radic B.; Fuchs R.; Peraica M.; Lucic A. (1997): Ochratoxin A in human sera in the area with endemic nephopathy in Croatia, Toxicology Letters 91, 150 109. Reglamento (CE) N 472/2002 de la Comisin de 12 marzo de 2002 que modifica el Reglamento (CE) N 466/2001 por el que se fija el contenido mximo de determinados contaminantes en los productos alimenticios. Diario Oficial de las Comunidades Europeas 2002, L 75/18-20. Reglamento (CE) N 683/2004 de la Comisin de 13 de abril de 2004 que modifica el Reglamento (CE) N 466/2001 por lo que respecta a las aflatoxinas y a la ocratoxina A en los alimentos destinados a lactantes y nios de corta edad. Diario Oficial de las Comunidades Europeas 2004, L 106/3-5. Saelzer R.; Vega M.; Retamal A.; Rios G.; Herlitz E. (2002): Implementacin de una metodologa analtica para determinar ocratoxina A en vinos chilenos por HPLC, Noticias tcnicas del laboratorio, 9-10. Sage L.; Krivokob S.; Lelbas E.; Seigle-Murandi F.; y Creppy E.E. (2002): Fungal flora and Ochratoxin A production in grapes and musts from France, J. Agric. Food Chem. 50, 13061311. Scientific Committee on food (1998): Opinion of the Scientific Committee on Food on Ochratoxin A, Expressed on 17 September. Scott P.M. (1994): Mycotoxins in grain. Compounds other than aflatoxins, Fitopathology 2238, 261-507. Serra R.; Abrunhosa L.; Kozahiewicz Z.; y Venncio A. (2003): Black Aspergillus species as ochratoxin A producers in Portuguese wine grapes, International Journal of Food Microbiology 88, 63-68. Shephard G.S.; Fabiani A.; Stockenstrm S.; Mshicileli N.; and Sewram V. (2003): Quantification of Ochratoxin A in South African Wines, J. Agric. Food Chem. 51, 1102-1106.

14

Soleas G.J.; Yan J.; Goldberg D.M. (2001): Assay of ochratoxin A in wine and beer by high pressure liquid chromatograohy photodiode array and gas chromatography mass selective detection, J. Agric. Food Chem. 49, 2733 2740. Soufleros E.H.; Tricard C.; Bouloumpasi E.C. (2003): Occurrence of ochratoxin A in Greek wines, Journal of the Science of Food and Agriculture 83, 173-179. Stefanaki I.; Foufa E.; Tsatsou-Dritsa A.; Dais P. (2003): Ochratoxin A concentrations in Greek domestic wines and dried vine fruits, Food Additives and Contaminants 20, 74-83. Stoev S.D.; Hald, B.; Mantle P.G. (1998): Porcine nephopathy in Bulgaria: a progressive syndrome of complex or uncertain ( mycotoxin) aetiology, The Veterinary Record, February 21. Stojkovic R.; Ganulin S.; Plestina R. (1984): High affinity binding of ochratoxin A to plasma constituents, Biochemistry International 9, 33-38. Studer Rohr I.; Dietrich D.R.; Schlatter C. (2000): Intraindividual variation in plama levels and kinetic parameters of ochratoxin A in humans, Toxicology and Applied Pharmacology, 69-99. Valenta H. (1998): Chromatographic methods for the determination of Ochratoxin A in animal and human tissues and fluids, Journal of Chromatography A. 815, 75 92. Van der Merwe K.J.; Steyn P.S.; Fourie L. (1965): Ochratoxin A, a toxic metabolite produced by Aspergillus ochraceus , Nature 205, 1112-1113. Vrabcheva T.; Usleber E.; Dietrich R.; Mrtlabauer E. (2000): Co-occurrence of Ochratoxin A and Citrinin in cereals from Bulgarian villages with a history of Balkan Endemic Nephropathy, J. Agric. Food Chem. 48, 2483-2488. Visconti A.; Pascale M.; Centonze G. (1999): Determination of Ochratoxin A in wine by means of immunoaffinity column clean-up and highperformance liquid chromatography, Journal of Chromatography A 864, 89-101. Visconti A.; Pascale M.; Centonze G. (2001): Determination of Ochratoxin A in wine and beer by immunoaffinity column cleanup and liquid chromatographic analysis with fluorometric detection: collaborative study, Journal of AOAC International vol. 84, N 6, 2001. William O.; Berndt A.; Wallace H.; y Phillips R.D. (1980): Effects of mycotoxins on renal function: Mycotoxic nephropathy, Kidney International 18, 656-664. Zimmerli B.; Dick R. (1995): Determination of ochratoxin A at the ppt level in human blood, serum, milk and some foodstuffs by high-performance liquid chromatography with enhanced fluorescence detection and inmunoaffinity column clean-up: methodology and Swiss data, Journal of chromatography B, Biomedical Science Application 666, 85-99.

15

Zimmerli B y Dick R (1996): Ochratoxin A in table wine and grape-juice: occurrence and risk assessment, Food Additives and Contaminants 13, 655-668. Zllner P.; Leitner A.; Lubda D.; Cabrera K.; Lindner W. (2000): Application of a chromolith speedROD RP-18e HPLC column: Determination of ochratoxin A in different wines by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Chromatographia 52, 818820.

16

TABLA I. Lmites del contenido mximo de OTA en alimentos (Reg. n 472/2002 (CE)). Producto Cereales en grano sin transformar (incluido el arroz sin transformar y el alforfn) Productos derivados de los cereales ( incluidos los productos transformados a base de cereales y los cereales en grano destinados al consumo humano directo) Uvas pasas (pasas de Corinto, sultanas y otras variedades de pasas) Caf verde y tostado y productos del caf, vino, cerveza, zumo de uva, cacao y productos del cacao y especias Segn el Reglamento, la Comisin Europea tena previsto fijar contenidos mximos para estos productos antes del 31 de diciembre de 2003. ---10 3 Contenido mximo (g / kg) 5

17

TABLA II. Lmites del contenido mximo de OTA en alimentos destinados a lactantes y nios de corta edad (Reg. n 683/2004 (CE))
Producto Contenido mximo (g / kg o ppb)

Alimentos infantiles y alimentos elaborados a base de cereales para lactantes y nios de corta edad. Alimentos dietticos destinados a usos mdicos especiales dirigidos especficamente a los lactantes

0,5

0,5

18

TABLA III. Concentraciones de OTA en vino, recuperaciones y lmites de cuantificacion (LC) y deteccin (LD).
Origen Tipo de vino Blanco Rosado Tinto Mundial Blanco Rosado Tinto Espaa y otros pases europeos Blanco Rosado Tinto Italia Blancoa Blancob Rosadoa Rosadob Tintoa Tintob Mundial Blanco Tinto Muestras 1 +/N -- / 24 -- / 15 -- / 79 14 / 41 6 / 14 40 / 89 45 / 69 29 / 32 87 / 91 2/7 2/2 5/6 2/2 26 / 27 11 / 11 12 / 44 87 / 209 Media ( g /L) 0,011 0,025 0,039 0,07* 0,10* 0,19* 0,020 0,031 0,054 0,045 0,535 0,804 0,525 1,269 1,185 0,012 0,201 Rango ( g /L) < 0,003-0,178 < 0,003-0,123 < 0,003-0,388 < 0,01 1,20 < 0,01 2,40 < 0,01 7,00 < 0,003 0,267 < 0,003 0,161 < 0,003 0,603 < 0,01 0,06 0,10 0,97 < 0,01 1,15 0,41 0,64 < 0,01 7,63 0,46 4,72 < 0,01 0,04 < 0,01 3,31 Recuperacin (%) 82,3 8,5 82,3 8,5 82,3 8,5 --------> 95 --94,5 4,1 94,5 4,1 94,5 5,2 94,5 5,2 92,8 3,5 92,8 3,5 ----LC / LD ( g /L) / 0,003 / 0,003 / 0,003 ------/ 0,003 / 0,003 / 0,003 / 0,01 / 0,01 / 0,01 / 0,01 / 0,01 / 0,01 / 0,01 / 0,01 Otteneder y Majerus, 2000 Visconti y col., 1999 Burdaspal y Legarda, 1999 Majerus y Otteneder, 1996 Referencia

Pases europeos y del norte de Africa

Zimmerli y Dick, 1996

Portugal Marruecos

De Postre Blanco Rosado Tinto

3 / 64 7/7 3/3 20 / 20 82 / 96 31 / 31

0,063 0,073 0,220 0,940 0,419 ---

< 0,02 0,08 0,028-0,18 0,04-0,54 0,04-3,24 < 0,001-3,177 <0,002 - > 1

97,0 10 72 7 --93 2 92,4 6 91,3

/ 0,02 0,01/ -0,01/ -0,01/ -0,001/ / 0,002

Festas y col., 2000

Filali y col. 2001

Italia Pases mediterrneos Espaa (Navarra)

Tinto Tinto

Pietri y col., 2001 Markaki y col., 2001

Blanco Blanco Tinto Tinto

6/6c 1/6d 11 / 14 c 12 / 14 d 55 / 118 7 / 20 33 / 104

0,185 0,192 0,160 0,133 0,250 0,170 0,34

0,154 0,208 0,192 0,056 0,316 0,074 0,193 <0,05 1,72 <0,05 1,16 <0,05 2,69

101 4,1 101 4,1 101 4,1 101 4,1 93,5 4,8 -----

/ 0,05 / 0,05 / 0,05 / 0,05 / 0,05 / 0,05 / 0,05

Lpez de Cerain y col. 2002

Grecia

Blanco Rosado Tinto

Stefanaki y col., 2003

19

Grecia

Blanco Rosado Tinto

7 / 13 0/1 9 / 14 -- / 15 -- / 9 6/ 50 24 / 140

0,27 0,68 0,16 0,24 0,18 0,30

ND 0,87 ND ND 2,51 0,04 0,33 0,07 0,39 ND 1,13 ND 4,24

--------97,3 -----

-- / 0,02 -- / 0,02 -- / 0,02 ---- / 0,01 -- / 0,05 -- / 0,05

Soufleros y col. 2003

Sur de Africa

Blanco Tinto

Shepard y col. 2003

Espaa

Blanco Tinto

Bell y col. 2004 a

N de muestras positivas / n total de muestras analizadas vinos comerciales.

b

vinos elaborados en casa. C cosecha de 1997. d cosecha de 1998.

ND = por debajo del LD. --- No es especificado en el correspondiente articulo * Son valores de mediana y no de media

20

TABLA IV. Mtodos de determinacin y cuantificacin de OTA por distintos autores

Referencia Extraccin Dilucin vino Columna empleada Zimmmerli y Dick 1996 Lquido lquido con cloroformo En PBS con 15 % metanol CIA Disolventes Elucin Metanol Metanol 72% agua 24.8 % actico 3.2% Visconti y col 1999 No extraccin PEG 8000 1% bicarbonato sdico 5% Festas y col. 2000 Lquido lquido con Tolueno/MgCl2/HCl No diluyen Slica Toluenoactico CIA Metanol Acetonitriloagua-actico (99:99:2) Acetato sdico 4mM/actico (10:1) 52% acetonitrilo 48% Zllner y col. 2000 No extraccin No diluyen RP-18 SPE Metanol Metanol- aguaactico (68.5:29:2.5) Jornet y col. 2000 Otteneder y Majerus 2000 Filali y col. 2001 Lquido lquido con tolueno Cloruro magnsico + cido hidroclrico Markaki y col. 2001 Lquido lquido con cloroformo PBS CIA Metanol actico (98:2) Aguaacetonitriloactico (500:500:20 Aboul-Enein 2002 Lquido lquido con cloroformo Etanol No emplean No necesario Acetonitriloagua-actico (99:99:2) Lpez de Cerain y col. 2002 Extraccin con cloroformo PBS-metanol CIA Metanol Metanolacetonitriloacetato sdico 5mM (26:26:48) Saelzer y col. 2002 No extraccin PEG6000 1% bicarbonato sdico 5% CIA Metanol Acetonitriloagua-actico (99:99:2) HPLC-FL HPLC-FL HPLC-FL HPLC-FL Cartuchos de silica Tolueno(90:10) No extraccin PBS CIA Metnol-acido acetico (98:2) Acetonitriloagua-actico (45:54:1) Acetonitrilo(48:52)) HPLC-FL HPLC-FL No extraccin No diluyen RP-18 SPE Acetonitrilo -------HPLC-FL LC-MS-MS HPLC-FL, confirman con LC-MS-MS HPLC-FL HPLC-FL Fase mvil Deteccin

acido actico acetato+actico

21

Bell y col. 2004

No extraccin

No diluyen. Centrifugan y filtran la muestra.

CIA

Metanolactico (98:2)

Acetato sdico 4mM/actico (19:1) 52% acetonitrilo 48%

HPLC-FL

22