UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE SAN JUAN DEL RO DIVISIN DE QUMICA

Procesos Biotecnolgicos
Practica # 1Preparacin de medios de cultivo para microbiologa

Ingeniera Qumica

12/06/2013

OBJETIVO El alumno aprender la preparacin de los diferentes medios de cultivo

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INTRODUCCION:

Para cada bacteria a ser cultivada es necesario proveer el ambiente bioqumico y biofsico apropiado. El ambiente bioqumico (nutricional) se hace disponible como medio de cultivo, y dependiendo de las necesidades especiales de cada bacteria particular se ha desarrollado una gran variedad y tipos de medios de cultivo con diferentes propsitos y utilizaciones. Los medios de cultivo son empleados para el aislamiento y mantenimiento de cultivos puros de bacterias y tambin son utilizados para la identificacin de bacterias de acuerdo a sus propiedades bioqumicas y fisiolgicas. Los Medios de Cultivo se clasifican de acuerdo a su estado fsico (lquido, slido, semislido) y a la finalidad de su uso. La preparacin de los medios de cultivo es un proceso que tambin se menciona en este trabajo. MARCO TEORICO:

El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. Composicin de un medio de cultivo: componentes indispensables: agua, nutrientes orgnicos (hidratos de carbono, aminocidos, vitaminas, etc.), nutrientes inorgnicos ( P, e, N, Mg, S, etc.) componentes alternativos: isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agar-

agar), tampones, indicadores de pH, etc. Tipos de medios de cultivo: En funcin de su consistencia: medios lquidos medios slidos (en tubo, en placa) medios semislidos

En funcin de su composicin: medios complejos (caldo ordinario, extracto de levadura) medios sintticos

Existen medios de cultivo cuya composicin permite el crecimiento de una gran diversidad de microorganismos (agar nutritivo, caldo ordinario). Otros en cambio, se utilizan para la seleccin

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de determinados

grupos

de

organismos,

se

desarrollan

para

el

estudio

de

determinadas pruebas fisiolgicas o test bioqumicos. medios selectivos enriquecimientos medios para test bioqumicos

Preparacin de un medio de cultivo: Pesar y disolver los componentes en el medio en el volumen indicado de agua destilada Ajustar el pH del medio, si procede Para la preparacin de medios slidos se adiciona agar-agar como agente solidificante. Para asegurar la completa disolucin del agar, el medio se calienta hasta ebullicin al mismo tiempo que se somete a agitacin previamente a su esterilizacin en el autoclave. Esterilizacin de medios de cultivo: Una vez preparado el medio, ste se debe esterilizar lo antes posible para evitar el crecimiento de microorganismos: Medios slidos en placa - tapar el matraz con tapn de algodn graso y cubrir con papel de aluminio para llevar a esterilizar en el autoclave (121 C, 15-20 min). Una vez estril repartir el medio en placas de Petri estriles y dejar en reposo para su solidificacin. Medios slidos en tubo (agar inclinado) - tras la ebullicin del medio con agar, ste se reparte en los tubos de cristal, de forma que queden llenos hasta aproximadamente la mitad. Los tubos se cubren con tapn (de aluminio), etc.). Para llevar a autoclavar. Una vez esterilizado, los tubos se disponen en posicin inclinada para su solidificacin. Medios lquidos una vez disueltos los componentes del medio en el matraz, repartir en su caso en tubos a razn de 2-4 ml por tubo, cubrir con tapn y llevar a esterilizar en el autoclave. Alternativamente, se puede esterilizar el medio en el matraz, y posteriormente repartirlo con la ayuda de pipetas estriles en tubos de plstico estriles. Medios semislidos se preparan con concentraciones inferiores de agente solidificante (agar-agar). El medio se reparte en tubos. En caso de desear proporcionar condiciones anaerbicas, existen diversas metodologas para ello. Los medios semislidos se utilizan para el crecimiento bacteriano a lo largo del tubo. Los niveles de difusin de oxgeno en las distintas capas condicionar el crecimiento de distintos tipos de microorganismos (aerobios, anaerobios).

DESARROLLO:

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2 2 1 1 1 1 1 1

Materiales y equipos Cajas petri estriles Potencimetro Tubos de ensaye con tapn Mecheros Matraz Erlenmeyer de 250 ml Probeta de 100ml Balanza granataria Parrilla Esptula Autoclave Cinta testigo Tubos de ensayo medianos Pipeta graduada de 10 ml Pipeta graduada de 1 ml Probeta de 100 ml Frasco de dilucin Balanza Granatara

Reactivos Buffer pH 4, 7, 10 Solucin salina al 0.9% Agua destilada Sal y manitol Agar MIO, TSI Caldo lactosado Agar Nutritivo Agar Salmonella o TCBS Caldo de infusin cerebro corazn Algodn, papel manila, agua destilada Solucin de hipoclorito de sodio al 2 ppm

PROCEDIMIENTO: 1. Elaborar un tapn de algodn y un gorro de papel estraza para el matraz de 1000 ml, procurando que este embone perfectamente. 2. Medir 500 ml de H3O destilada 3. Verter los 500 ml de H3O destilada en el matraz Erlenmeyer de 1000 ml. 4. Pesar 11.5 g de la frmula de Agar Nutritivo en la balanza y agregar al matraz Erlenmeyer de 1000 ml que contiene los 500 ml H3O destilada. 5. Tomar la franela y doblarla a lo largo para rodear la boquilla del matraz Erlenmeyer. 6. Calentar sobre la llama del mechero tipo Fisher con movimientos circulares, hasta que la solucin no presente partculas y del color mbar vire a un color con tendencia transparente. 7. Colocar el tapn de algodn y el gorro de papel estraza. Marcando el matraz con una tira de cinta testigo. 8. Esterilizar en el autoclave a 121 C / 15 lbs. de presin durante 15 minutos. 9. Verificar cuidadosamente el vire en la tira de cinta testigo 10. Colocar el matraz recin esterilizado sobre la mesa de trabajo.

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RESULTADOS:

Preparacin general de medios de cultivo

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AGAR NUTRITIVO:
Vaciar los gramos pesados y 500 ml de agua destilad en el mismo matraz Erlenmeyer

Leer la etiqueta del Agar Nutritivo

Pesar 11.5 gramos del Agar Nutritivo

Vaciar 500 ml de agua destilada en un matraz Erlenmeyer

Dejar enfriar y medir el pH

Hasta su completa disolucin

Calentar el Agar nutritivo con agitacin suave

Una vez obtenido el pH deseado 6.6

Si
pH de 6.8 0.2

No

Agregar NaOH para neutralizar Agregar HCl para acidificar

Colocar el tapn de algodn y el gorro de papel estraza al ME y marcarlo con cinta testigo

Esterilizar en autoclave a una presin de 15Lb durante 15 min

Colocar en la mesa de trabajo para su uso.

Puntos crticos en la preparacin de los medios de cultivo pH Temperatura Pesaje de los medios Condiciones de esterilizacin

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COMPETENTES DEL MEDIO DE CULTIVO

Agar nutritivo

CUESTIONARIO 1.- Qu norma mexicana nos indica el procedimiento para la realizacin de medios de cultivo? NOM-065-SSA1-1993, que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo. Generalidades. 2.- Qu pasa si el medio de cultivo se excede en el calentamiento? Los medios que contiene azucares como parte de sus componentes principales generalmente se caramelizan al someterlos a altas temperaturas, modificando el aspecto final del medio. 3.- Cuntos tipos de medio de cultivo existen menciona un ejemplo de cada uno de ellos? Medio Medios basales Medios enriquecidos Medios selectivos o inhibitorios Medios Diferenciales Medios de enriquecimiento Medios de transporte Medios de conservacin Ejemplo A.N. M.E G.A.S., G.Ch. A.V.B. y A.BP. bioqumicas Caldo tetrationato Cary-Blair B.A.B.

Nota: estos tambin pueden clasificarse segn el estado de agregacin en solidos (agares) y lquidos (caldos).

4.- Cul es la diferencia entre un medio lquido y un slido? La diferencia principal entre ellos es que un medio solido contiene agar el cual le da la consistencia slida al medio, adems de sus usos ya que estos tienen diferentes objetivos. Medios lquidos. Se emplean fundamentalmente para: Cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos o bien la produccin de metabolitos especficos. Estimular y promover la seleccin de algn o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen.

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 Identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioqumicas.

Medios slidos. Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. Los medios slidos constituyen la mayor parte de los medios de cultivo que se emplean en Microbiologa. 5.- Defina que es un medio de cultivo Medio de cultivo es el material nutritivo en el que se pueden recuperar, multiplicar y aislar los microorganismos, as como efectuar pruebas de susceptibilidad. Generalmente se presenta desecado en forma de polvo fino o granular. Conjunto de nutrientes con determinadas condiciones ambientales que permiten que los microorganismos crezcan y se reproduzcan. Aportan carbn y nitrgeno y elementos minerales, factores decrecimiento, agua y pH adecuado. 6.- Qu sucede si el medio est muy fro y se desea vaciar? Este no caer debido a que se ha gelificado totalmente. 7.- Diferencie entre los trminos: Desarrollo y Crecimiento 8.- Usos y cuidados del potencimetro. Los principales cuidados que hay que tenerse a la hora de utilizarse el potencimetros es que el electrodo no debe de tocar el fondo del recipiente donde se coloque ni ser golpeado y que este se deber de calibran con las soluciones buffer de pH 4, 7, y 10 antes de ser utilizado. Su uso principal es medir el pH de las soluciones como caldos, y soluciones para ajustar el pH de los medios. 9.- Investiga la tcnica Gram La tincin Gram es una tcnica utilizada para la identificacin de bacterias Gram positivo y Gram negativo mediante el uso de ciertos colorantes como la safranina, el azul violeta, violeta de genciana y otros colorantes los cuales tienen la capacidad de teir las paredes de las clulas esto debido a que algunas de ellas tienen una sustancia llamada peptidoglucano o murena la cual provoca la retencin o no del colorante. Las bacterias Gram positiva se visualizan de color moradas y las Gram negativa se visualizan de color rosa o rojo o grosella. PASOS A SEGUIR PARA REALIZAR UNA TINCIN GRAM Tincin Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 C.

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Enjuague Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, sta debe caer sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un milmetro de espesor. Tambin el enjuague se debe realizar poniendo la lmina portaobjetos en posicin inclinada hacia abajo... La solucin de cristal violeta, se recomienda sea al 1% . Mordiente Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante un minuto ms. El mordiente es cualquier sustancia que forma compuestos insolubles con colorantes y determina su fijacin en las bacterias. Decoloracin Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van aadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que ste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Lavado y secado Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lmina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita. Tincin de contraste Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto. Nuevo enjuague Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observacin microscpica.

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CONCLUSIONES *Cervantes Alonso Ana Laura Previo a la preparacin de un medio de cultivo es necesario conocer el tipo de MO con el que se ha de trabajar, esto nos permitir delimitar que medio el ms adecuado para su crecimiento. Hay factores como la temperatura y pH que son crticos en su preparacin pues la mayora de veces de estos depende el obtener un buen medio de cultivo y que cumpla con las especificaciones requeridas. En la prctica ajustamos el pH del agar nutritivo usando NaOH para neutraliza hasta alcanzar un pH de 6.6. *Morales Ortiz Erick Los medios de cultivo son agentes nutritivos que permiten la recuperacin y proliferacin de los MO por lo que su preparacin debe ser cuidadosa siempre cuidando que cumpla con las especificaciones establecidas en la norma y su etiquetado, pues en ellos se especifican factores como la temperatura, pH y las fuentes de nutrientes que contiene, que son crticos en el crecimiento de los MO. Es por eso que para su preparacin se necesita conocer el tipo de MO con el que hemos de trabajar. En la preparacin del agar nutritivo se ajust su pH a 6.6 para que fuera apto para el crecimiento de MO segn marca la etiqueta del frasco del agar. *Rodrguez Fajardo Jos Jonny Las condiciones de temperatura y pH son condiciones crticas en la preparacin de los medios de cultivo, ya que las altas temperaturas afectan las azucares q contienen algunos medios, pues estas se caramelizan, de igual manera el pH ya que si este tiende a acido no proliferan ningn tipo de bacterias; pero no as los hongos y levaduras. Por eso la importancia de trabajar bajo las especificaciones que marca la norma y el etiquetado de cada medio. Pues en este caso necesitbamos un pH de 6.8; as que se ajust el pH del agar nutritivo a 6.6 con NaOH. Sanabria Celestino Kennedi La preparacin de un medio de cultivo es fundamental en la proliferacin de MO por lo que tiene que hacerse cuidadosamente. Teniendo en cuenta aspectos representativos del tipo demedio ya sea slido, semislido o un caldo; as como el pH, temperatura de preparacin, etc. Otro factor a tomar en cuenta para la preparacin del medio es el tipo de MO con el que se pretende trabajar, pues este defina las caractersticas del medio. En el caso de nuestra practica se prepar un agar nutritivo al cual se le ajusto el pH de cido a prcticamente neutro de 6.5 para poder cumplir con los requerimientos especificados para su uso que son de un pH de 6.8 0.2 BIBLIOGRAFA NOM-065-SSA1-1993, que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo. Generalidades. Microbiologa industrial presentacin de power point. http://www.buenastareas.com/ensayos/Medios-De-Cultivo/839009.html

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http://egg.umh.es/frvalera/manualDePracticas.pdf

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