CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICIENCIA La fase mvil es lquida

Las muestras no necesitan ser vaporizadas para su anlisis. Se separan compuestos orgnicos e inorgnicos voltiles o no, trmicamente inestables

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Caractersticas

-Una muestra en estado lquido es arrastrada por una corriente lquida llamada eluyente (fm) es el parmetro fundamental de la separacin. -Como fase estacionaria acta un slido finamente dividido (dimetro de partcula 3, 5, 10 m), o una pelcula lquida a l adherida. -Dependiendo de la retencin de los componentes de la muestra por la fase estacionaria y de su solubilidad en el eluyente se provocar su migracin diferencial.

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Caractersticas

- NO Destructivo recupera muestra - Picos angostos (alta eficiencia) - Rpida - Presiones de 1000 - 6000 psi (pounds square inch = libras por pulgada cuadrada, 1 atm = psi/14.7)

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Esquema del equipo de HPLC

INYECTOR PRE-COLUMNA

BOMBA CMARA DE MEZCLA COLUMNA

DETECTOR RESERVORIOS DE SOLVENTE

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Solventes utilizados como FM

Solventes orgnicos, agua/solventes miscibles, agua/soluciones reguladoras Alta pureza

Desgasificados

Tratamiento con He Sistema de desgasificacin al vaco Filtracin

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Elucin isocrtica vs elucin con gradiente Elucin isocrtica: solvente de composicin constante. Elucin con gradiente: solventes de distinta polaridad. Se vara la composicin de la FM en forma continua o escalonada. Elucin con gradiente Elucin isocrtica

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Sistemas de bombeo
Requerimientos Generacin de altas presiones (1000 - 6000 psi) Caudales 0.1 10 mL/min Componentes resistentes a la corrosin (acero inoxidable, tefln)

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Sistemas de inyeccin de muestra

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Precolumna
Composicin similar a la columna cromatogrfica Se trata de una pequea columna (0,5 3 cm) colocada entre el inyector y la columna

PRE-COLUMNA

Elimina materia en suspensin y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la FE Se usa para mejorar la vida de la columna. Se reemplaza cuando se contamina.

COLUMNA

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Columna
Tubos de acero inoxidable. Ocasionalmente de vidrio resistente Columnas termostatizadas: en general se trabaja a T ambiente. La T constante mejora el cromatograma Rectas (10 - 30 cm de longitud) y 4-10 mm d.i. Tamao partculas de relleno: 3 10 m

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Columna
Relleno
Relleno de partculas. Micropartculas porosas de slica, almina o polmero de 3 10 m de dimetro. Se recubren con pelculas orgnicas que se unen qumicamente o fsicamente a la superficie.

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Mecanismos de interaccin en HPLC Particin o reparto

La separacin se basa en el reparto o distribucin de los solutos entre una fase mvil lquida y otra estacionaria inmiscible, soportada sobre un slido inerte. La separacin se produce por diferencias de solubilidad. Las especies ms retenidas sern las que presenten mayor afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase mvil eluyente).

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Mecanismos de interaccin en HPLC Particin o reparto Existen dos modos bsicos de operacin: Fase normal. fase estacionaria polar fase mvil no polar. Fase reversa. fase estacionaria no polar fase mvil polar.
Segn empleemos fase normal o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucin de bandas y el tiempo de anlisis.

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Mecanismos de interaccin en HPLC Particin o reparto

Materiales comerciales empleados como soportes en columnas para HPLC (particin)

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Mecanismos de interaccin en HPLC Particin o reparto

Principales fases estacionarias en HPLC

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Detectores
Requisitos Sensibilidad adecuada Respuesta rpida y reproducible Manejo sencillo Clasificacin Basados en la medida de una propiedad del eluyente -Indice de refraccin -Constante ielctrica -Densidad - Absorbancia - Fluorescencia, - Corriente lmite

Basados en la medida de una propiedad del soluto

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Detectores
Principales detectores empleados en HPLC: - UV/Vis - Fotodiodos - ndice de refraccin - Fluorescencia - Conductividad - Dispersin de luz - Espectrometra de masas

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Detectores
Detector uv/vis - El ms usado - Para sustancias que absorben radiacin UV/VIS - Con lmparas de deuterio, xenon o wolframio - Desde 190 a 900 nm
Al desecho Ventanas de cuarzo Fuente UV Detector De la columna

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Detectores
Detector de ndice de refaccin - Van a medir variaciones en el ndice de refraccin del eluato con respecto al del disolvente puro. - Slo se pueden usar si la elucin es isocrtica. - Responden casi todos los solutos pero con escasa baja sensibilidad. - Son muy sensibles a las variaciones de temperatura. - Deben estar termostatizados.

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