Tincin Diferencial de Gram

Introduccin:
Los microorganismos se diferencian entre s de forma fsica y qumica por ese motivo reaccionan de diferente manera frente a un proceso de tincin, de este modo la tincin diferencial nos permite distinguir entre grupos con caractersticas similares y diferenciarlos de otros con caractersticas distintas. En particular la tincin de Gram nos ayuda a diferenciar entre bacterias Gram positivas y Gram Negativas, el motivo de esta diferenciacin se encuentra en la composicin de las membranas celulares. En el caso de las Gram positivas la capa es bastante gruesa con un gran porcentaje en su composicin de pptidoglucano, por otro lado las Gram negativas la pared es una multicapa de protena, lipopolisacarido y un 5% de pptidoglucano. Estas caractersticas le dan una diferen permeabilidad a la membrana frente a los reactivos utilizados dando una diferenciacin en la coloracin. Gram-positiva (azul) Gram-negativas (rojo)

En la tincin de Gram se requieren: Un colorante bsico Un mordiente Un agente decolorante Un constrastante (otro colorante bsico)

El mordiente es una sustancia que incrementa la afinidad entre la clula y el colorante, ayudando a la fijacin del colorante en la estructura de inters. El agente decolorante es una sustancia que retira el colorante de una estructura teida. El contrastante es un colorante bsico de un color diferente al usado inicialmente.

Objetivo:
Demostrar a travs de la tcnica de tincin diferencial de Gram la existencia de dos grupos principales de bacterias.

Materiales:
Cultivos jvenes de microorganismos (18-24 hrs) o Bacillus sp. o Echerichia coli o Streptococcus aureus Decolorante: Alcohol-cetona Lminas porta objeto Mechero de alcohol Piseta con agua Aceite de inmersin

 Colorantes bsicos: Cristal Violeta y Safranina Mordiente: Lugol

Asa de klle Soporte para tincin Papel secante

Metodologa:
El primer paso es teir la preparacin intensamente con un colorante bsico, preferentemente el cristal violeta. Esto es seguido por un tratamiento de las clulas teidas con un mordiente, por ejemplo, un compuesto iodado como el lugol. La preparacin luego tratada por un agente decolorante como el alcohol-cetona o simplemente alcohol. Las clulas que retienen el colorante bsico despus de la decoloracin son llamadas Gram-positivas y aquellas que son decoloradas son Gram-negativas, y pueden ser reteidas con un contrastante como la safranina.

Resultados:
Coloracin despus de la tincin de Gram Azul Rojo Azul Que tipo Gram-positiva Gram-negativa Gram-positiva

Muestras Bacillus sp Escherichia coli Staphylococcus aureus

Tincin de Gram en Bacillus sp. Utilizando la tincin de Gram se pudo teir la muestra de Bacillus sp. Se observaron los bacilos presentando un color violeta intenso as mismo se observ la asociacin de estreptobacilo:

Tincin de Gram en Echerichia coli. Tras el procedimiento de tincin de Gram sobre la muestra de Escherichia coli, se llev la muestra al microscopio a 100X y se observ que las bacterias mostraban un color entre rojo plido o rosado, lo que determina un resultado Gram-negativo como se esperaba.

Tincin de Gram en Staphylococcus aureus El Sthaphylococcus areus se ti con el azul de metileno y no con la safranina .

Tincin de Gram en Staphylococcus aureus, Bacillus sp y Echerichia coli. El Bacillus sp y el Sthaphylococcus aureus retuvieron al Cristal violeta por otro Echeriachia coli se decolor y se tio con la Safranina obteniendo un color rojo.

Discucin:
La relacin que existe entre los diferentes componentes que se usaron para la tincin de Gram permite la diferenciacin entre las Gram positivas de las Gram negativas. En el caso del Bacillus sp, este presenta como componente principal una capa gruesa de peptidoglicano y adems presenta cidos teicoicos en su pared celular (Olivas, 2001), el colorante principal para esta tincin es el

cristal violeta, el cual se une por afinidad a la pared del Bacillus sp debido a su carga negativa cuando el pH es casi neutro, pero cuando se le aade Lugol (yodo + yoduro de potasio) el yodo forma con el colorante primario un complejo que es insoluble al agua y soluble en alcohol y cetona (Macarulla y Goi, 1994). Y la bacterias gram-positivas no pierden el colorante cuando se le agrega el alcohol-cetona debido a su gruesa capa de peptidoglicana y que presenta pocos lpidos en esta, lo cual dificulta la penetracin del alcohol para la extraccin del colorante. Durante el proceso de tincin diferencial Gram, para el caso de Escherichia coli da un resultado gram-negativo, debido a la naturaleza de su pared celular formada por muy pocas capas de peptidoglucano, sin cidos teicoicos y una pared externa de lipopolisacricos (LPS), lipoprotenas y fosfolpidos con una intensa carga negativa (Funke et al, 2007) que no retiene tan fuertemente al complejo formado por el lugol y el cristal violeta, y adems el alcohol-cetona disuelve la membrana externa y genera orificios en la delgada capa de peptidoglucano que termina por decolorar las clulas. Tras la aplicacin de Safranina, que es un colorante catinico (Madigan et al, 2003), estas se tieron de rosado, verificndose la tincin gram-negativa (Fuller, 2007). El Sthaphylococcus areus es el patgeno ms importante del genero Sthapylococcus (SEIJA, 2008), es una bacteria que posee una pared celular de gran tamao formado mayormente de peptidoglucano con enlaces (1-4) sin ramificaciones, es decir estas molculas forman una capa que envuelve la membrana plasmtica, estas molculas se encentra conectadas por puentes peptdicos lo que le da la rigidez (BROCK, ), esta pared est compuesta de murena (peptidoclucano) en un 90% y por cidos teicoicos en un 10%. Esta bacteria al interactuar con el cristal violeta, este colorante por ser un tinte catinico, penetra en la pared de las gram-positivas y tie a las sustancias que estn cargadas negativamente como los cidos nucleicos (BAUTISTA, 2011), al echar el mordiente que es el yoduro potsico, el yodo forma con las clulas una sustancia insoluble en agua (ACUANATURA, 2007), es decir se forma un complejo violeta iodo hidrofbico, por lo tanto al echar el alcohol-acetona (decolorante), este complejo se vuelve soluble en ella, sin embargo, el alcohol deshidrata las paredes celulares cerrando sus poros ya que el pptidoglucano se contrae, por lo tanto el cristal violeta solubilizado no puede salir de la clula ya que rgida y gruesa capa est cerrada, hacindolo un sistema cerrado, en otras palabras la clula no se decolora, por lo tanto al echarle la safranina, est ya no colora al Sthapylococcus areus, por lo tanto esta bacteria se queda con la coloracin azul, hacindola una gram-positiva. Cuando en una misma muestra mezclamos Bacillus sp, Echerichia coli y Sthaphylococcus aureus se nota la diferencia de tincin ms claramente y las nicas que se tien con la Safranina son las Gram Negativas que en este caso solo es la Echerichia coli, hacer una muestra con microorganismos combinados, es para demostrar que se tuvo una adecuada precisin al momento de aplicar el alcohol-cetona. De modo que todas las bacterias respondieron segn sus caractersticas a la aplicacin del decolorante, tambin cabe resaltar que esta aplicacin es la ms crucial de toda la experiencia en

la tincin de Gram ya que una incorrecta aplicacin del decolorante altera completamente el resultados ya sea por exceso o falta de este.

Conclusiones:
En conclusin el complejo colorante primario-Lugol permite que el colorante quede atrapado en las bacterias gram-positivas. Tras un procedimiento de tincin diferencial Gram, se observan dos tipos de resultados: gram-negativo y gram-positivo, lo cual determina dos grupos de clasificacin. Escherichia coli, al no conservar el colorante primario y teirse con el colorante de contraste y presentar un color rosado tras observarla al microscopio, se clasifica como bacteria gram-negativa. El Sthaphylococcus areus es una Gram positiva. Toda las bacterias Gram positivas poseen pared gruesa. La Aplicacin del decolorante es el momento crucial en la tincin diferencial de Gram.

Bibliografa:
FUNKE; TORTORA; CASE. Introduccin a la Microbiologa. Novena Edicin. Editorial Mdico Panamericana. Argentina, 2007. MADIGAN; MARTINKO; PARKER. Brock Biologa de los microorganismos. Dcima Edicin. Editorial Pearson - Prentice Hall. EEUU, 2003. FULLER. Instrumentacin quirrgica: teora, tcnicas y procedimientos. Cuarta Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Mxico, 2007. MACARULLA, JOS MARA. GOI , FLIX. Bioqumica humana: curso bsico. Segunda edicin. Editorial Reverte. Espaa, 1994. OLIVAS, EVANGELICA. Manual de laboratorio de microbiologa bsica. Primera edicin. Universidad autnoma de Ciudad Jurez. Mxico, 2001. STAINER, ROGER. INGRAHAM, JOHN. WHEELIS, MARK. PAINTER, PAGE. Microbiologa. Quinta edicin. Editorial Revert. Espaa, 1992. BAUTISTA, Luciano. Degradacin de Colorantes (Azul de Metileno) por mtodos electromagntico. Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad Veracruzana. 2011 ACUANATURA. Tcnicas de Tincin. 2007 SEIJA. V. Etiopatognia Microbiolgica. Seccin III. 2008 BORRAS. Carmen. Epidemiologa de la Resistencia a la Meticilina en Cepas de Sthapylococcus areus Aislada en Hospitales Espaoles. 2006. Departamento de Patologa I Terapetica Experimental. Facultad de Medicina. Universidad de Barcelona. MORENO, RAMOS, VILLENA, GUTIERREZ. Microbiologa Gua de Laboratorio. Departamento Acadmico de Biologa. Universidad Nacional Agraria La Molina. 2013

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA
CURSO PROFESOR : :
Laboratorio de Microbiologa Gretty Villena

INFORME DE PRCTICAS
PRCTICA N TTULO ALUMNOS : : :
02 Tincin Diferencial de Gram Arias Edson Cerna Cynthia Marquez Diego Salazar Claudia

FACULTAD HORARIO DE PRCTICAS (DA Y HORA) FECHA DEL EXPERIMENTO FECHA DEL REPORTE

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Ciencias Lunes/14:00 a 16:00 hrs

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08/04/2013 15/04/2013

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