DETECTION DES ANTIGENES VIRAUX DETECTION DES ACIDES NUCLEIQUES VIRAUX

Dr Lucile Larrouy Laboratoire de virologie Hpital Bichat-Claude Bernard

Deux approches

Diagnostic direct:
dtection du VIRUS ou de ses COMPOSANTS, antignes ou gnomes viraux, dans les liquides biologiques.

Diagnostic indirect:
dtection dANTICORPS spcifiques du virus: rponse immunitaire de lindividu.

Deux approches

Diagnostic direct Isolement en culture cellulaire Dtection dantignes viraux Dtection des acides nucliques viraux Microscopie lectronique Diagnostic indirect ELISA Immunofluorescence Immunoempreinte (Western-blot)

Deux approches
Diagnostic indirect Diagnostic direct

Virus entier

IgG
antignes IgM acides nucliques

Prlvement

Echantillon clinique:

orient

prlev un moment adapt la chronologie de linfection achemin et conserv au laboratoire dans des conditions favorables

DETECTION DES ANTIGENES VIRAUX

Dtection dantignes viraux

Isolement en culture cellulaire :

Difficult, lenteur ou impossibilit de cultiver certains virus

Besoin dun laboratoire quip pour la culture

Alternative : techniques immunologiques

technologie des anticorps monoclonaux ne reconnaissant

qu'un seul type dpitope sur un antigne donn. Ils sont par dfinition tous identiques et produits par un seul clone de plasmocyte.

spcificit reproductibilit

Dtection dantignes viraux

Techniques immuno-cytochimiques utilisant des Ac monoclonaux.

BUT : visualiser le complexe Ag-Ac par diverses techniques:

Immunofluorescence Immunoenzymologie

Immunochromatographie ou immunodiffusion
Agglutination de particules sensibilises (hmaties, latex)

Dtection dantignes viraux

Techniques directes : le systme de marquage est li directement lAc primaire

UV fluo

Techniques indirectes : le systme de marquage est fix sur un Ac secondaire dirig contre les Ig de lespce animale chez laquelle a t produit lAc primaire.
UV fluo

Dtection dantignes viraux

Dtection dantignes intracellulaires
Raction dimmunofluorescence Raction immunoenzymatique

Immunodiffusion ou Immunochromatographie (savonnette, bandelette)

Agglutination (Latex) Dtection dantignes libres Raction immunoenzymatique

Immunofluorescence
Prlvement et conditions de transport
Prlvement riche en cellule intactes (scrtions
muqueuses, frottis de lsion, sang ou biopsie)

Prparation des cellules

Lavage des cellules (aspiration nasopharynge) Recueil des leucocytes (antignmie pp65) Cytocentrifugation Fixation sur lame et permabilisation lanticorps par lactone

Lecture au microscope fluorescence

Technicien expriment Respect de critres de positivit bien dfinis

Immunofluorescence
UV

Anticorps secondaire fluorescent

Anticorps primaire

Immunofluorescence

Ex: Antignmie CMV pp65, virus Parainfluenzae

Immunodiffusion ou Immunochromatographie

Agglutination de particules sensibilises

1 : Prlvement contenant des antignes viraux
2 : Ractif contenant des microbilles recouvertes danticorps spcifiques

A : tmoin ngatif B : Agglutination

Ex: gastroentrites virales: Rotalex Adenolex

Immunoenzymologie

Dtection des Ag intracellulaires

(par exemple : immunoperoxydase)

Ex : CMV, HSV

substrat

raction colore

cellules + Ag

2me ac conjugu

raction enzymatique

Immunoperoxydase:
Dtection des Ag intracellulaires

Antignmie CMV pp65

Immunoenzymologie

Dtection des Ag intracellulaires

(par exemple : immunoperoxydase)

Ex : CMV, HSV

Dtection des Ag libres produits en excs et excrts dans raction le srum : technique de type ELISA
substrat colore

Ex: Ag HBs du VHB, Ag p24 du VIH

puits + Ac fixs

prlvement + Ag

2me ac conjugu

raction enzymatique

Immunoenzymologie (ELISA)

Dtection dantignes viraux

Avantages
Technique Technique Ne

simple
rapide : rsultats disponibles (10 min 2 h)

ncessite pas le maintien de linfectiosit virale (culture cellulaire) ou thrapeutiques immdiates

Inconvnients
Spcificit

dpendante de la qualit des Anticorps

Ncessit
Technique Faible

de prlvements de bonne qualit

manuelle et lecture longue (IF)

sensibilit par rapport la culture et la BM

Dtection dantignes viraux

DETECTION DES ACIDES NUCLEIQUES VIRAUX

Dtection dacides nucliques viraux

Applicable tous les virus

ne poussent pas en culture VHC, VHB, HPV dangereux VIH, fivres hmorragiques virales

Diagnostic prcoce car trs sensible depuis la PCR Diagnostic rapide : PCR en temps rel Principe: HYBRIDATION MOLECULAIRE :
Technique base sur la capacit des acides nucliques simple brin sassocier pour former une molcule double brin.

Dtection dacides nucliques viraux

Acide nuclique analyser
5 A T C A G T A C C T T A T A C G C T T C G T T A T 3 3 T A G T C A T G G A A T A T G C G A A G C A A T A 5

Dnaturation

Renaturation

5 A T C A G T A C C T T A T A C G C T T C G T T A T 3

3 T A G T C A T G G A A T A T G C G A A G C A A T A 5

Hybridation
5 A T C A G T A C C T T A T A C 3

5 A T C A G T A C C T T A T A C 3

Sonde
3 T A G T C A T G G A A T A T G C G A A G C A A T A 5

Dtection dacides nucliques viraux

Techniques sans amplification :

Southern-blot Hybridation in situ

Amplification de la cible : PCR (Polymerase Chain Reaction)

Multiplication, de manire exponentielle, dun fragment dacide nuclique (ADN) afin daugmenter la sensibilit de sa dtection

Amplification du signal :

Augmenter le nombre de sondes marques gnrant un signal sans modifier la quantit de molcules cibles prsentes initialement

Techniques sans amplification

Southern blot

PCR : amplification de la cible

ARN cible 5 ADN cible 5 3 95C 5 3 Cycle 1 55C 5 3 5 3 72C 3 Transcription inverse 3 5 1re tape : Dnaturation Cycle 3 3 5 2me tape : Hybridation 3 5 3 5 3me tape : Elongation Amplicon

Cycle 2

PCR : amplification de la cible

multiplication exponentielle
dtection des produits amplifis laide de sondes marques

n cycles

Cycle 3

Quantit thorique de copies gnres par PCR en fonction du nombre de cycles : 1 cycle 2 copies 2 cycles 4 copies 3 cycles 8 copies . 6 cycles 64 copies . 22 cycles 4194304 copies . 30 cycles 1073741824 copies

PCR : amplification de la cible

PCR qualitative : prsence ou absence de gnome

Diagnostic rapide ou prcoce avant la sroconversion

Mningo-encphalites virales, viroses respiratoires VHC

PCR quantitative : suivi dune infection chronique

intrt prdictif (pronostic)

Risque dvolution du portage vers la maladie : CMV, EBV chez les immunodprims Prdiction de lefficacit thrapeutique : VHC

Suivi de lefficacit thrapeutique :

VIH, VHB, VHC

PCR en temps rel

La PCR en temps rel collige les donnes damplification au point de dpart de la phase exponentielle de la PCR par rapport la PCR classique qui collecte les donnes en fin de raction au niveau de la phase de saturation

Collot S, Virologie; 2001 Vol 5

PCR en temps rel

Base sur la dtection et la quantification dun signal fluorescent mis par un fluorophore dont lintensit dmission est proportionnelle la quantit damplicons Quantification prcise Sensibilit et spcificit ++++

Ralisation en tube ferm

Rapidit de lamplification

contamination

PCR en temps rel

2 types de chimie: Des intercalants : le sybr green ou le BET Des sondes : Taqman, test dhybridation

Excitation : le sybr green : 530 nm Taqman : FAM : 492 nm

PCR en temps rel

Principe de la technologie Taqman, sonde dhydrolyse

E Q

E : fluorophore donneur FAM

Q : fluorophore accepteur ou quencheur TAMRA

Amorce

Amorce Fluorophore stimul

E E

Sonde hydrolyse

Activit exonuclasique de la polymrase

PCR en temps rel

principe du test dhybridation

PCR en temps rel

fluorescence

Ct

gamme talon
Thresold

Cycle seuil: Ct

Nombre de cycles

log de copies

Amplification du signal

ADN branch (bDNA)

sondes ramifies Sondes de rvlation/enzyme

cible sondes de capture

Dtection dacides nucliques viraux

PCR multiplex : permettent de dtecter dans le mme

prlvement pathologique des agents pathognes trs loigns (bact, virus, champignons) ayant pour seul point commun de provoquer des infections du mme organe. Ex : RespiFinder

Objectifs de la BM
Quantification de la charge virale : intrt prdictif, pronostic suivi de lefficacit thrapeutique Dtection de gnotypes ou de variants molculaires : gnotypes mutants rsistants aux antiviraux Mise en vidence de nouveaux virus

Gnotypage : test gnotypique de rsistance

PCR puis squenage

Gnotypage

PCR puis Inno-LIPA

PRECIPITE

SUBSTRAT CHROMOGENE
PHOPHATASE ALCALINE

SONDES spcifiques de gnotypes Gnotypes 1 2 3 4

Performances des outils virologiques de diagnostic direct

Sensibilit PCR Culture Spcificit Culture Antigne PCR

Antigne

3
Faisabilit/Cot
Antigne PCR

Culture

Deux approches

Diagnostic direct:
dtection du VIRUS ou de ses COMPOSANTS, antignes ou gnomes viraux, dans les liquides biologiques.

Diagnostic indirect:
dtection dANTICORPS spcifiques du virus: rponse immunitaire de lindividu.

Ces 2 approches ne sexcluent pas et sont parfois complmentaires

Le choix des techniques va dpendre

du virus et du site de linfection du type de linfection du terrain +++ de ce que lon attend du laboratoire +++

Diagnostic dune infection aigu

bnigne

chez immunocomptent virologie inutile

svre ou chez immunodprim privilgier le diagnostic direct urgence et possibilits thrapeutiques diagnostic rapide

si

in

utero ou chez un nouveau-n diagnostic direct ou IgM

Suivi dune infection chronique

Charge virale :
Il

existe une corrlation entre la quantit de virus prsent et lvolutivit dune infection chronique (VIH, VHB, VHC, CMV)

Test gnotypique de rsistance :

Recherche de mutations par squenage des gnes produisant les protines cibles des molcules antivirales (VIH, VHB, CMV)

Exemple du VHB

Exemple du VHB

Exemple du VIH: primo-infection

- 16 000 / j /monde. 4 000/ an / France .
- 50 90% symptomatiques. 90% des primo-infections non diagnostiques ont consult 70% avaient eu un test srologique (ngatif)

- 30-50% des infections dcouvertes au stade SIDA

Exemple du VIH

Ac anti gp 160 Ac anti gp 120 Ac anti gp 41 Ac anti p24

0 exposition

11-1214-15

20-21

28-29

Temps (jours)

ARN VIH plasmatique Antignmie p24 ADN PROVIRAL Anticorps anti-VIH ELISA

Fentre Srologique

Anticorps anti VIH : WB

Exemple du VIH: primo-infection

- ARN-VIH plasmatique : - spcificit des techniques de Biologie molculaire - B300 - Antigne p24 : - moins sensible que PCR ( sensibilit 5 40 pg/ml) - faux positifs rares : neutralisation - B70

Choix raisonns en fonction de lpidmiologie Combinaison des tests srologiques et molculaires

Diagnostic prcoce

Diagnostic prcoce de linfection chez lenfant n de mre sropositive

Recherche dADN proviral lymphocytaire ou de lARN plasmatique
prlvement de la mre en parallle

Naissance 1 semaine Recherche dune infection in utero ou post-partum

M1

M3

M6

M18 Perte des Ac maternels

Traitement prventif de lenfant (6 semaines)

Suivi srologique aprs M6

La PCR ARN peut tre ngative pendant cette priode : refaire lexamen 1 mois aprs arrt du ttt

2 PCR successives positives 2 PCR successives ngatives distance de la prophylaxie

Infection VIH confirme Pas dinfection VIH

CONCLUSION

Notion de renseignements cliniques indispensables

choix des techniques adaptes interprtation raisonne des rsultats virologiques