NEFROLOGA. Vol. XXIII. Suplemento 3.

2003

Ascitis y disfuncin vascular en la cirrosis heptica humana: nuevos conceptos fisiopatolgicos para una complicacin severa
M. Morales-Ruiz, P. Cejudo-Martn y W. Jimnez
Laboratorio de Hormonas. Hospital Clnic Universitari. Institut dInvestigacions Biomdiques August Pi i Sunyer e Instituto Reina Sofa de Investigaciones Nefrolgicas. Universidad de Barcelona. Barcelona.

INTRODUCCIN El incremento en la resistencia al flujo portal es el factor primario de la fisiopatologa de la hipertensin portal, siendo esta complicacin la mayor causa de morbilidad y mortalidad de los pacientes cirrticos1. Este incremento en la resistencia vascular intraheptica es consecuencia de anomalas anatmicas causadas por la formacin de ndulos de regeneracin heptica y por el aumento del flujo portal venoso que recibe el hgado y que mayoritariamente est causado por un incremento en la vasodilatacin arteriolar esplcnica. La formacin de ascitis en los pacientes cirrticos es la complicacin ms frecuente asociada a la hipertensin portal y consiste en la acumulacin de lquido en la cavidad peritoneal2. La ascitis est formada por una solucin de agua y sales, cantidades variables de albmina, globulinas y clulas en suspensin, principalmente clulas mesoteliales, eritrocitos, macrfagos, linfocitos y neutrfilos. Debido a esta composicin relativamente simple, clsicamente se ha considerado que la ascitis tiene poca influencia sobre las anormalidades hemodinmicas y renales que se observan en los pacientes cirrticos. Sin embargo, este concepto debera ser reconsiderado a la luz de los hallazgos descritos por nuestro laboratorio y por otros investigadores en los que se demuestra la existencia de cantidades significativas de citocinas proinflamatorias, factores vasoactivos y agentes proliferativos en la ascitis de los pacientes cirrticos3-7. Bajo determinadas circunstancias, la produccin de estas sustancias por clulas residentes de la cavidad peritoneal podra modificar la respuesta inmune inespecfica, la tonicidad y la permeabilidad vascular, en este rea o en territorios adyacentes.
Correspondencia: Dr. Wladimiro Jimnez Hospital Clnic Universitari Villarroel, 170 08036 Barcelona E-mail: wjimenez@medicina.ub.es

El estudio de las propiedades fisiopatolgicas de la ascitis y de los tipos celulares contenidos en este fluido, es un requisito necesario para el diseo de nuevas estrategias teraputicas que tengan como finalidad mejorar la calidad de vida de los enfermos cirrticos y retardar la aparicin de descompensaciones severas, incrementando, por tanto, sus posibilidades para beneficiarse de tratamientos alternativos como el trasplante heptico. Por ello, el objetivo de este artculo es el de revisar los ltimos estudios en los que se introducen nuevos conceptos sobre la fisiopatologa del lquido asctico en la cirrosis. PRODUCCIN DE XIDO NTRICO (NO) EN MACRFAGOS PERITONEALES DE PACIENTES CIRRTICOS El NO es un producto de secrecin de clulas eucariotas que est implicado en numerosos procesos fisiolgicos y fisiopatolgicos. Una de sus principales funciones es la de actuar como agente bactericida participando en la respuesta inmune no especfica desarrollada por determinados tipos celulares, como por ejemplo los macrfagos. Aunque la actividad antimicrobiana del NO ha sido confirmada por numerosos estudios, los datos ms concluyentes fueron obtenidos en el trabajo publicado por MacMicking y cols. en 19958, donde se demuestra que ratones mutantes nulos para el gen iNOS presentan una disminucin en la respuesta inmunolgica promovida por infecciones bacterianas. Hasta la fecha el significado biolgico de la activacin de iNOS en macrfagos humanos es ms controvertido y la transcripcin del gen en respuesta a citocinas y lipopolisacrido (LPS) es sorprendentemente dbil, en comparacin con ratones, y requiere la participacin de CD23 y/o CD699, 10. En lo que atae a la cirrosis descompensada, diversos estudios han sugerido que en la cavidad peritoneal de estos pacientes se produce NO11. Estas afirmaciones provienen de estudios en los que se de-

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muestra que la ascitis contiene concentraciones significativamente mayores de nitratos y nitritos (NOx) que las concentraciones halladas en la sangre perifrica de los pacientes cirrticos con ascitis y peritonitis bacteriana espontnea (PBE)12. La PBE es una complicacin comn desarrollada por los pacientes cirrticos y definida como la infeccin del lquido asctico en ausencia de una fuente aparente de infeccin intra-abdominal13, 14. La ascitis de los pacientes cirrticos con PBE contiene concentraciones elevadas de mediadores proinflamatorios que probablemente derivan de clulas residentes en el peritoneo, como por ejemplo macrfagos y clulas mesoteliales. Esta hiptesis proviene de datos experimentales que demuestran que la concentracin en la ascitis de pacientes cirrticos de interleucina-6 (IL6) y de factor de necrosis tumoral- (TNF-) es marcadamente superior a la concentracin plasmtica15. A pesar de la eficacia teraputica del tratamiento antibitico, el ndice de mortalidad en estos pacientes sigue siendo elevado. La patognesis de este fenmeno es incierta pero algunas hiptesis sugieren que mediadores vasculares liberados por clulas residentes en la cavidad peritoneal durante el transcurso de la PBE, podran acentuar la vasodilatacin arterial presente en los enfermos cirrticos y, como contrapartida, activar sistemas vasoactivos compensatorios que conduciran a la vasoconstriccin renal. La concentracin de citocinas y NOx en la ascitis de los pacientes cirrticos vara ampliamente en funcin de si estos individuos presentan o no PBE o si el tratamiento antibitico ha resuelto recientemente la peritonitis5. La concentracin de TNF- e IL-6 es diez veces superior en ascitis de pacientes con PBE que en la de los pacientes cirrticos sin PBE. Sin embargo, la concentracin de citocinas en la ascitis de los sujetos que han recibido tratamiento antibitico, y en los que por tanto se ha resuelto la PBE, es similar a la observada en los pacientes cirrticos con ascitis no infectada. Los cambios de concentracin en lquido asctico de NOx no siguen el mismo patrn. Los pacientes cirrticos con PBE presentan niveles de NOx superiores a los valores obtenidos en los pacientes cirrticos sin peritonitis; sin embargo, la resolucin de la PBE no se asocia a una disminucin en la concentracin de NOx. Por el contrario, los valores ms elevados de NOx en el lquido asctico se alcanzan tras la resolucin de la PBE. Estos hallazgos son similares a los obtenidos por Bories y cols.12 en los que se demuestra que las concentraciones ms elevadas de NOx se alcanzan una semana despus del inicio de la PBE. Estudios inmunocitoqumicos han demostrado que en NOx encontrado en el lquido asctico de los pacientes cirrticos con PBE es producido por

lo macrfagos peritoneales5 y que la liberacin de NOx es superior cuando las clulas provienen de pacientes con una PBE resuelta. Por el contrario, los macrfagos aislados a partir de la ascitis de pacientes cirrticos sin PBE no producen NOx. Paralelamente a los datos obtenidos en los estudios de produccin de NO, el anlisis de la expresin del ARN mensajero y de la protena de iNOS ha demostrado una activacin importante de iNOS en los macrfagos peritoneales de los pacientes cirrticos con PBE, siendo sta ms prominente en los macrfagos aislados de pacientes con PBE resuelta. Estudios realizados en nuestro laboratorio demuestran que la induccin del enzima iNOS juega un papel fundamental para prevenir el desarrollo de peritonitis en ratas cirrticas con ascitis16. Es razonable pensar, por tanto, que la sntesis peritoneal de NO contribuira al control de la PBE en la cirrosis heptica humana. PRODUCCIN DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DEL ENDOTELIO VASCULAR (VEGF) MEDIADA POR MACRFAGOS PERITONEALES DE PACIENTES CIRRTICOS El VEGF-A es una familia de glicoprotenas constituida por diferentes isoformas (VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189 y VEGF206) que se sintetizan mediante un proceso de splicing alternativo post-transcriptional a partir de un gen nico. Se han identificado cinco genes relacionados estructuralmente con VEGF-A que se denominan: VEGF-B, VEGF-C, VEGFD, VEGF-E y VEGF-F, y de los cuales las formas C y D son necesarias durante el proceso de linfoangiognesis17, 18. El VEGF-A induce proliferacin, citoproteccin y migracin celular en el endotelio, a travs de la activacin de sus receptores especficos flt-1, KDR/flk-1 y flt-4. Adems, est descrito que este factor de crecimiento es un potente inductor de la permeabilidad vascular y acta como agente vasodilatador in vivo19, 20. El VEGF-A es producido por una gran variedad de clulas en condiciones fisiolgicas y fisiopatolgicas (macrfagos, clulas musculares lisas vasculares, queratinocitos, fibroblastos, clulas epiteliales, clulas mesangiales, etc.). En concreto, dos estudios realizados en pacientes cirrticos3,6 han demostrado que los macrfagos peritoneales humanos producen VEGF en condiciones basales y que el tratamiento de estas clulas con lipopolisacrido (LPS), TNF- o IL-1 incrementa significativamente la produccin de VEGF-A en comparacin con la produccin basal. Adems, el tratamiento combinado con estos tres agentes provoca una respuesta acumulativa en la produccin de VEGF-A. Este incremento se correlaciona directa59

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mente con un aumento significativo en la expresin y en la estabilidad del ARN mensajero de las isoformas 121, 165 y 189 de VEGF. Paralelamente, los macrfagos extrados de pacientes con PBE tambin producen VEGF en condiciones basales y en respuesta al tratamiento combinado con LPS, TNF-, e IL-1, aunque este efecto es de menor intensidad que la respuesta observada en las clulas de pacientes cirrticos sin PBE. Es importante destacar que este incremento en la produccin de VEGF-A en respuesta al tratamiento con LPS y citocinas no se observa en los monocitos circulantes de sujetos sanos. El anlisis inmunocitoqumicos realizados con anticuerpos anti-VEGF-A tambin demostr que la expresin de VEGF-A es exclusiva de los macrfagos y no se detecta en otros tipos celulares caractersticos de la ascitis, como son los eritrocitos, los linfocitos, o los leucocitos polimorfonucleares. El significado clnico de estos resultados ha sido analizado midiendo la concentracin de VEGF-A en la ascitis y el plasma de pacientes cirrticos con o sin PBE. No se observaron diferencias significativas entre las concentraciones plasmticas de VEGF-A de sujetos sanos y de pacientes cirrticos con o sin PBE. Sin embargo, se detectaron concentraciones elevadas de VEGF-A en el lquido asctico de los pacientes cirrticos con PBE pero no en los pacientes cirrticos sin peritonitis bacteriana. Los experimentos de proliferacin diseados para determinar si el VEGF-A acumulado en el lquido asctico tiene actividad biolgica, mostraron que la ascitis de pacientes cirrticos sin PBE ejerca un discreto efecto proliferativo sobre las clulas endoteliales humanas (HUVEC). Sin embargo, la ascitis o el medio condicionado de macrfagos peritoneales de pacientes cirrticos con PBE incrementaron la proliferacin de clulas HUVEC. Este fenmeno fue inhibido al incluir en las condiciones experimentales anticuerpos anti-VEGF-A. Los datos anteriores, junto con los experimentos que demuestran que los monocitos circulantes de sujetos sanos y de pacientes cirrticos no producen VEGF-A en condiciones basales, apoyaran la hiptesis de que un incremento en la concentracin de VEGF en la ascitis de los pacientes cirrticos, podra tener consecuencias fisiopatolgicas en el contexto de la regulacin local del tono vascular y de la permeabilidad endotelial. LA HIPOXIA ES UN INDUCTOR DE AGENTES VASODILATADORES ESPLCNICOS EN LOS PACIENTES CIRRTICOS Los pacientes cirrticos presentan frecuentemente niveles anormales de O2 en sangre. De acuerdo con diferentes artculos, la concentracin arterial de O2 60

se encuentra reducida entre el 20% y el 60% de estos pacientes21,22, siendo la prevalencia de esta anomala ms alta en pacientes con cirrosis severa23. Lo mismo ocurre en la cavidad peritoneal, donde la concentracin media de O2 en la ascitis de pacientes cirrticos sin PBE es del 7% 0,3%4. La disminucin tisular en la concentracin de O2 induce una respuesta celular adaptativa que consiste en la regulacin de determinados genes que ayudarn a compensar esta deficiencia (por ejemplo: VEGFA, adrenomedulina y endotelina-1). La induccin de estos genes por hipoxia est mediada principalmente por el factor de transcripcin HIF-1. El HIF-1 es una protena heterodimrica que est formado por 2 subunidades: HIF-1 de expresin constitutiva y HIF-1 que se degrada en condiciones de normoxia. Sin embargo, la protena de HIF-1 se estabiliza en condiciones de hipoxia, hecho que permite la dimerizacin con HIF-1 y la activacin de HIF-1. Este factor de transcripcin se une especficamente a secuencias denominadas elementos de respuesta a hipoxia, que estn localizadas en la regin promotora de los genes expresados en estas condiciones24. Los macrfagos son clulas especialmente sensibles a los niveles de O2. Por ejemplo, diversos estudios han descrito que la hipoxia produce grandes cambios en la actividad secretora de estas clulas, induciendo la liberacin de citocinas y agentes angiognicos25. Cejudo y cols.4, analizaron la sntesis de sustancias vasoactivas reguladas por hipoxia en monocitos y macrfagos peritoneales de pacientes cirrticos con ascitis. En este trabajo se prueba que los monocitos circulantes de los pacientes cirrticos producen endotelina-1 (ET-1) y que esta produccin se incrementa en condiciones de hipoxia. En contraste, los macrfagos peritoneales de estos pacientes liberaron cantidades significativas de VEGF-A y adrenomedulina (ADM), pero no se detect la produccin del vasocontrictor ET-1. Es importante destacar que la incubacin de estas clulas en hipoxia regul positivamente la secrecin de VEGF-A y ADM. Los estudios moleculares demostraron que la hipoxia caus en los macrfagos peritoneales cultivados in vitro una induccin del ARN mensajero de la ADM y de VEGF-A que se mantuvo durante 24 horas. Esta regulacin positiva de ADM y VEGF-A se detect tambin en el proceso de transduccin proteica. La ADM y el VEGF, a parte de ser importantes sustancias angiognicas, tienen la propiedad de incrementar la permeabilidad vascular y la vasodilatacin y, por tanto, de disminuir la presin arterial y la resistencia vascular en modelos experimentales. Todos estos fenmenos son realizados a travs de la activacin del NO. Concretamente, en experimentos realizados in vitro, se ha observado que el medio de cultivo de macrfagos peritoneales de pa-

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cientes cirrticos cultivados en normoxia estimula la sntesis de NO en clulas HUVEC. Sin embargo, la concentracin de NO detectada en el medio de cultivo de las clulas HUVEC es mayor cuando las clulas endoteliales son tratadas con el sobrenadante de los macrfagos de pacientes cirrticos cultivados en hipoxia. Este fenmeno es dependiente de la estimulacin de las clulas endoteliales por VEGF, ya que el tratamiento con anticuerpos anti-VEGF-A bloquea la produccin de NO. En este mismo trabajo se demuestra que los macrfagos peritoneales se encuentran en condiciones de hipoxia en la cavidad peritoneal de los pacientes cirrticos, ya que estas clulas expresan en condiciones basales la protena HIF1, y los ARN mensajeros de VEGF y ADM. Por tanto, estos estudios apoyan la hiptesis de que la ADM y el VEGF sintetizados por los macrfagos peritoneales en condiciones de hipoxia podran actuar como vasodilatadores endgenos que agravaran la vasodilatacin arterial esplcnica caracterstica de la cirrosis. CONCLUSIONES En este artculo se ha analizado un aspecto particularmente relevante e inexplorado de la fisiopatologa de la ascitis en los pacientes cirrticos. La produccin de NO y de factores de crecimiento por clulas residentes en la cavidad peritoneal podra modificar la respuesta inmune inespecfica, la tonicidad y la permeabilidad vascular en el rea esplcnica o en los territorios adyacentes. De la misma manera, el lquido asctico podra contener sustancias capaces de regular las propiedades moleculares, morfolgicas o fisiolgicas del endotelio vascular peritoneal. Por lo tanto, sera deseable una mayor caracterizacin de las propiedades biolgicas del lquido asctico y de sus componentes celulares, para posibilitar el diseo de estrategias futuras ms efectivas en el tratamiento de las complicaciones severas que aparecen durante el transcurso de la historia natural de la cirrosis. BIBLIOGRAFA
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