ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin

Editorial
La aprobacin de la Directiva Marco del Agua ha abierto interesantes debates y nos brinda la oportunidad de afrontar estimulantes retos. Parece que, al menos por un tiempo, los oralismos (su estudio, su identificacin) van a ocupar un lugar central en la determinacin de la calidad biolgica de los sistemas acuticos. Esto supone una revalorizacin de un tipo de trabajo en el que los ficlogos tienen mucho que decir. Esta es la idea que impuls la publicacin de este nmero especial de nuestro boletn. En l encontrareis distintos tipos de aportaciones: desde artculos de opinin, hasta recomendaciones o recopilaciones, que agradecemos enfticamente a todos los autores. Encontrareis tambin en este nmero una recopilacin de protocolos que pensamos pueden ser de gran utilidad. A diferencia de lo que ha ocurrido en otros pases, en Espaa las sociedades cientficas han estado al margen, de forma involuntaria evidentemente, de todo el proceso de implementacin de la DMA. Sirva este nmero al menos como muestra de la opinin que los ficlogos tienen de cmo debera abordarse el proceso, con una perspectiva de futuro y pensando en el largo plazo. Espero que el esfuerzo realizado y el resultado que tenis entre manos sean de vuestro agrado. El editor

Indice, n especial 2005

Editorial e ndice....................................................................3 Aspectos generales Transferring methods and indicators among assessment programs, por R. Jan Stevenson...........................................4 Le phytoplancton et la Directive cadre. Intrt d'une approche fonctionnelle base sur les pigments, por Jean Prygiel....................................................................................10 Uso de las comunidades de algas en la categorizacin y seguimiento de masas de agua continentales. Algunas potencialidades y limitaciones, por Sergi Sabater..........12 Las algas y la implantacin de la Directiva Marco del Agua en Espaa, por Marina Aboal..................................14 Perspectiva de algunos paises europeos Use of diatoms to monitor eutrophication in UK rivers, por Martyn Kelly..................................................................19 Redes de control biolgico en Francia. Algo de historia y situacin actual, por Jean Prygiel......................................29 Use of algae for monitoring of rivers and some matters of special importance in Norway, por Eli-Anne Lindstrm..............................................................................33 Phycological surveys and monitoring in Portugal a summary, por A.J. Calado, S.F.P. Almeida y S.C. Craveiro.................................................................................36 Resultados en Espaa Muestreo del fitobentos en ros, lagos y humedales: requisitos y recomendaciones para la Directiva Marco del Agua, con especial enfoque a los trabajos desarrollados sobre diatomeas en la Cuenca del Duero, por Sal Blanco, Luc Ector y Eloy Bcares.......................41 La Directiva Marco del Agua y las diatomeas como indicadoras de los humedales mediterrneos, por Rosa Trobajo Pujades....................................................................47

Sociedad Espaola de Ficologa (S.E.F.)

www.sefalgas.org Junta Directiva Presidenta: Marina Aboal Sanjurjo Vicepresidenta: ngela Noguerol Seoane Secretaria: Conxi Rodrguez Prieto Tesorera: M Carme Barcel i Mart

Protocolos Protocolo para la evaluacin de la calidad biolgica de los ros mediante las diatomeas. Aplicacin de la Directiva Marco en poltica de aguas de la Unin Europea (2000/60/EU)........................................................50 Metodologa para el estudio taxonmico y ecolgico del fitoplancton de las aguas continentales, por Pedro Snchez Castillo...................................................................56 Metodologa para el estudio taxonmico y ecolgico de picoplancton y plantas de las aguas continentales, la elaboracin de catenas vegetales y la estimacin de la biomasa, por Miguel lvarez Cobelas..............................59

Boletn informativo de la S.E.F.

www.sefalgas.org/boletin.htm Editor: J. Eduardo Linares Cuesta

ALGAS

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin Transferring methods and indicators among assessment programs
R. Jan Stevenson Department of Zoology - Center for Water Sciences Michigan State University - East Lansing, Michigan 48824 USA rjstev@mail.msu.edu

Developing biological assessment programs for new regions, different groups of organisms, or in different ecosystems can present many challenges. However, those challenges can be resolved by recognizing that many ecological assessments have the same basic objective, to determine the deviation in observed condition at a site from an expected condition. Because many assessments have this same basic objective, we can borrow many concepts, study designs, methods, indicators, and analytical tools from established assessment programs for use in new programs. In this paper, I will address issues related to using standard algal assessment methods and indicators among many regions with different climates, geologies, and habitat types.

My comments will be directed primarily to assessments of the biotic and abiotic condition of habitats where relations to natural or reference conditions are emphasized, such as assessments mandated of water quality by the US Congress and the Water Framework Directive (US Clean Water Act, European Commission 2000). These comments will be put in the context of a framework that relates the many activities in ecological assessments such as selecting methods and indices, sampling and sample analysis, and organizing information to interpret results. This framework was developed at a meeting of US and European scientists (Stevenson et al., 2004 a, b). The framework highlights 4 stages in an assessment and management framework: design, characterize condition, diagnose causes and threats, and compare management options (Fig. 1).

Fig 1. The protocols for ecological assessment related in a framework. Three major steps are emphasized, study design, analysis, and integration.

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin The design stage of assessments includes developing objectives, conceptual models, and sampling plans. Objectives usually include protecting and restoring ecological integrity (Frey, 1977; Karr & Dudley, 1981; European Commission, 2000) biodiversity, ecosystem services (Costanza et al., 1991), and water quality. Tradeoffs may exist between different objectives for managing ecosystems for these different valued goals. For example, floods may be controlled with dams and fisheries production may be increased with nutrient enrichment, but dams and nutrient enrichment threaten abundances of native taxa and stimulate algal blooms. One of the reasons that algae are used in assessments is they are important elements of ecological integrity, microbial biodiversity, and ecosystem services, and they cause problems with water quality. So algal condition in habitats affects many valued ecological attributes (VEAs). Conceptual models should be developed to guide indicator selection and analysis. The models should clearly relate three kinds of indicators: 1) VEAs that respond more or less directly to stressors; stressors which are defined as contaminants and habitat alterations caused by human activities; and human activities that cause or mediate stressors, which often are indicated by land use attributes (Fig. 2). These 3 categories of variables are emphasized because of their use in management. Sustaining VEAs is the ultimate goal of management. VEAs respond more or less directly to stressors, for which water quality criteria can be developed to protect and restore VEAs. Human activities (farming, forestry, residential development, industry) are then managed to minimize stressors through use of best management practices (waste lagoons, buffer strips, minimizing fertilizer application, storm water retention basins) and thereby, optimize support of VEAs and human uses of the watershed (Stevenson et al., 2004b).

Fig 2. A conceptual model of human activities that produce contaminants and alter habitats that then affect the physical, chemical and biological integrity of stream ecosystems. The elements of the model are separated into three categories of variables should be considered in ecological assessments: land use, stressor, and response variables. This model was modified from a figure by Bryce et al. (1999) and Stevenson et al. (2004a).

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin These categories of variables are also emphasized because biological indicators, especially algal indicators, are used both to assess VEAs and to infer stressors and human activities causing stressors. Historically, algae have been most often used to infer stressors (e.g. nutrient condition, organic pollution, pH, and low oxygen) using on species composition of all taxa and their autecological characteristics. With slight changes to the way we have historically used indicators, we can use autecological information for algal indicators of stressors to construct indicators of VEAs. For example, protecting sensitive species of algae from stressors such as nutrient enrichment, reduced oxygen, or increased salinity and sedimentation could be an important goal of environmental management. Preventing nonnative taxa that are tolerant to stressors is also an important goal. Thus, high relative abundances of sensitive taxa that are commonly found at sites with very low levels of human disturbance (Hughes, 1995) and low abundances of stressortolerant taxa are VEAs. Thus, we could modify autecological indices such as those commonly used (Sldecek, 1973; Charles, 1985; Van Dam et al., 1994) for just sensitive or tolerant taxa. Autecological indices based on just the most sensitive or tolerant taxa can respond as significantly (precisely) to indicators of human disturbance as indices based on all autecological categories (sensitive, indifferent and tolerant). In addition, similarity of species composition to reference condition and natural diversity are also VEAs. However, inference models of stressors with algae are also valuable, but not as indicators of VEAS. They should be used to infer stressor condition and to help diagnose which stressors are threatening or impairing valued attributes. Stressor inference models complement actual measurement of stressor conditions, especially highly variable conditions like nutrients, and thereby help managers monitor progress in stressor control or reduction during either protection or restoration efforts. Developing a sampling plan, the last step in the design stage, requires selection of indicators, sites, sampling methods, and the regional and temporal scale of assessment. At this stage, decisions will need to be made about using: all algae or just diatoms; plankton or periphyton; targeted habitat sampling or multihabitat sampling; qualitative or quantitative sampling; and which sampling methods. Assessing species composition of all algae in assessments versus just diatoms is important for characterizing algal biomass and therefore, ecosystem services and potential problems with water quality (e.g. taste, odor, toxicity, deoxygenation). Assessing just diatoms is less expensive and they are highly sensitive indicators of ecological condition, but using all algae may extend the range of response to ecological conditions (Leland & Porter, 2000). Methods should be selected based on objectives of the assessment. Richest-targeted habitat sampling involves selecting a specific (target) habitat that is expected to have the most species-rich assemblage of living algae, relatively common in the site sampled, and likely important in ecosystem function. This habitat may be plankton or periphyton on rocks, plants, wood, sand, or fine sediments in either moderate-fast or slow current environments. The richest-targeted habitat would surely vary among lakes, streams, wetlands, and coastal habitats. It also varies among streams in regions. Thus, the habitat sampled will be a factor in refining expected indicator values (condition) at a site, which will be described later in the paper. Richest-targeted sampling is probably good for decreasing variability in assessments of water quality conditions and inferring stressors and land use, but it is probably not the best method for assessing biodiversity because the targeted habitat may contain only half or less of the diversity. Multihabitat sampling (sampling all habitats in relative proportion to occurrence and thus varying from site to site) is probably best for assessing biodiversity and ecosystem services, but produce less precise indicators of water quality. In a recent stream study, we used a hybrid approach, which assumed that algae on rocks, plants, and wood are relatively similar compared to fine sediments. If rocks, wood, and plants were common in streams, we sampled those habitats in a single composite sample; if they were not common, we sampled finer sediments in relatively stable depositional zones. This approach could be extended to lakes, Denicola et al. (2004) recently showed how periphyton could be used in lake assessment. Quantitative sampling is more time consuming in the field than qualitative sampling, but it is important for assessing ecosystem services and potential problems from nuisance blooms. Visual biomass assessments (Secchi depth in lakes and rapid periphyton surveys in streams, e.g. Stevenson & Bahls, 1999; Stevenson et al., accepted) can be used rapidly to characterize biomass in the field and thereby complement qualitative sampling. Characterizing condition, the second stage of the assessment/management framework (Fig. 1), calls for comparing observed and expected conditions to assess effects of humans on ecological condition (VEAs and stressors). Expected conditions can be defined many ways. They may be desired conditions such as large abundant fish, no filamentous algae, high

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin diversity, aerobic conditions, or clear water. These kinds of endpoints (management goals) may be appropriate for drainage ditches and other nonnatural habitats. Alternatively, expected conditions may be related to ecological integrity by using natural, best attainable, or minimally disturbed conditions depending upon historical, current, and planned levels of human activities in the watershed and region. Frequency distributions, predictive models, and thresholds in stressorresponse relationships can be used to define expected conditions when they are related to either desired conditions or ecological integrity (Stevenson et al., 2004b). Without comparison to expected condition, variation due to natural factors and human activities can not be distinguished accurately. For example, we might expect low biomass and species adapted to low nutrients, low organic enrichment, and low conductivity in natural conditions of forested headwater streams, but not in low gradient streams draining wetlands (Fig. 3). In large-scale, ecologically diverse regions, our characterization of expected condition needs to be refined for regional and site-specific characteristics. We need to refine expected condition for the habitats sampled in streams. We should also refine characterizations of expected biomass, species composition, and function of algae depending on factors that ultimately control these attributes, such as climate, geology, hydrology, and landscape attributes and position. Expected algal indicator values can be refined for natural variation in conditions among sites by using basic principles of algal ecology and best professional judgment or by using multivariate analyses with data from sites with low human activities in watersheds or all sites. For example, we could a priori classify sites and expected condition based on habitats sampled within them and other natural features known to affect algae, if those features are not affected extremely by humans at local scales. For example, regional geology, climate, and landscape features should affect water chemistry, temperature, size of the habitat, current, and flood and drought frequency, intensity, and duration. These attributes are known determinants of planktonic and benthic algal biomass, species composition, and function. Based on best professional judgement, we could develop different a priori expectations for algae in lakes, streams, wetlands, and marine coastal regions and this approach could be extended to habitats with different size, hydrogeomorphic characteristics, and climates. Study designs and site selection should be based on these a priori expectations. However, it could be argued that this is not a scientifically defensible approach because of these a priori assumptions. Multivariate analyses of data accounting for effects of natural variability and human disturbance provide more scientifically defensible methods for refining characterizations of expected condition. Two contrasting multivariate approaches involve categorical classification or continuous predictive models of expected conditions in different natural or reference conditions (Wright et al., 1984; Wright et al., 1993; Wiley et al., 2002). RIVPACs methods exemplify the former approach, in which sites with low levels of human disturbance are clustered in groups based on similarity in biological attributes. Then discriminant function models are used to determine which naturally varying abiotic factors affected little by humans (e.g. climate, geology, latitude, longitude, size, slope, hydrology) can predict site membership in groups and thereby predict expected condition at sites. This approach is valuable for situations in which dependent variables, e.g. multiple species, are the VEA being

High % Individuals of Low Nutrient Species

Upland Streams

Wetland Streams

Low

High % Agriculture Land Use in Watershed

Fig. 3. Hypothetical relationships between % low nutrient species and human disturbance in high gradient upland streams (solid line) and low gradient streams draining wetlands (dashed line) illustrate the importance of refining expected condition based on natural variability among habitats. We might find that relative abundances of low nutrient species would be higher in upland streams than low gradient wetland streams where nutrient loading from sediments may be greater. We would also expect relative abundances of low nutrient taxa to decrease in both types of streams with increasing human disturbance that causes nutrient loading. Thus different natural biological conditions would be expected in these two types of streams. Measuring the same level of an indicator in the two stream types would have different interpretations.

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin assessed and therefore characterized in expected condition. Alternatively, we could use regression models of VEAs as a function of human disturbance and naturally varying determinants of VEAs (Wiley et al., 2002). For example, relative abundance of individuals requiring high organic nutrients could be predicted based on channel slope and percent wetlands in the riparian zone. With corrections for expected condition based on site-specific attributes, algal indicators could be used in multiple regions and more accurately and precisely transferred. Issues about autecological variability among populations still remain. However, we know indices based on worldwide generalizations of species autecologies (e.g. Van Dam et al., 1994) are satisfactory in some situations in North America (Fore & Grafe, 2002), even though they were not refined for environmental preferences and tolerance of North American populations. We should expect that autecological indices are transferable among regions, because human disturbance causes similar contamination among regions, such as nutrient enrichment, sediments, salinization, and organic pollution. However we should also expect a decrease in precision due to differences in populations of the same species among regions. Variation in expected conditions is another issue that should be accounted for, because the same index value may characterize very different degrees of impairment in different regions and habitat types (Fig. 3). Thus a reasonable approach is to start assessments using autecological information and indices from other regions with locally refined expectations for reference condition; but that should be followed by refining species autecological information and indices based on regional variability among populations. The latter stages of the assessment/management framework involve diagnosing stressors and human activities causing the contamination and habitat alteration. Diatom indicators are highly valuable in diagnosing stressors. Of course, diatom inference models are particularly valuable in paleoecological reconstructions of environmental characteristics. In addition, gathering evidence indicates that diatom indicators can be used to predict stressors such as nutrient concentrations more precisely than one time sampling and chemical measurement of nutrient concentrations. The precision of inferred stressor conditions based on diatom indicator values may be valuable for assessing whether water quality criteria are being satisfied and for increasing precision in stressorresponse relationships. Thus, diatom indicators of total phosphorus concentrations could complement TP measurements in lakes, streams, and wetlands where nutrient criteria have been established. But also, using diatom inferred TP to indicate P availability may increase precision in the stressor-response relationships that are so valuable for establishing stressor criteria for use in protecting existing condition or restoring impaired conditions (Fig. 4). Caution should be used to prevent circularity when using algal species indicators of VEAs and stressors in the same analysis but both will be valuable.

100.00

Benthic Chl a (g/cm

2)

10.00

1.00

0.10 10 Total P (g/L) 100 2.5 3.5 4.5 MAIA TSI 5.5

Fig. 4. The relationship between chlorophyll a of benthic algae and nutrients availability, indicated by measured total phosphorus (TP) concentration of stream water and by inferred trophic status (MAIA TSI) based on diatom species composition and autecological information (unpublished data). Precision of relations between chl and nutrient availability is much greater when using a diatom indicator of trophic status than measured total phosphorus concentration.

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin In conclusion, diatom indicators from other regions can probably be used more extensively and perhaps even worldwide, if expectations for conditions are corrected for locally and regionally varying natural factors. Regional corrections in autecological characteristics and indices should be made when sufficient data have been accumulated. The capability of using algae and particularly diatoms in assessments will benefit greatly by using and comparing indices across regions and timely communication of those results in the peer-reviewed scientific literature.
Literature Cited Bryce, S. A.; D.P. Larsen; R.M. Hughes & P.R. Kaufmann. 1999. Assessing relative risks to aquatic ecosystems: a mid-Appalachian case study. Journal of the American Water Resoures Association 35: 23-36. Charles, D.F. 1985. Relationships between surface sediment diatom assemblages and lake-water characteristics in Adirondack lakes. Ecology 66: 994-1011. Costanza, R.; R.. dArge; R. deGroot; S. Farber; M. Grasso; B. Hannon; K. Limburg; S. Naeem; R.V. ONeill; J. Paruelo; R.G. Raskin; P. Sutton & M. VandenBelt. 1991. The value of the world's ecosystem services and natural capital. Nature 387: 253-260. Denicola, D.M.; E.D. Eyto; A. Wemaere & K. Irvine. 2004. Using epilithic algal communities to assess trophic status in Irish lakes. Journal of Phycology 40: 481495. European Commission. 2000. Directive 2000/ EC of the European Parliament and of the Council - Establishing a framework for Community action in the field of water policy. Brussels, Belgium. Fore, L.S. & C. Grafe. 2002. Using diatoms to assess the biological condition of large rivers in Idaho (USA). Freshwater Biology 47: 2015-2037. Frey, D.G. 1977. Biological integrity of water - an historic approach. Pages 127-140, in R.K. Ballentine & L.J. Guarraia, editors: The integrity of water. U. S. Environmental Protection Agency, Office of Water and Hazardous Substances, Washington, DC. Hughes, R.M. 1995. Defining acceptable biological status by comparing with reference conditions. Pages 31-47, in W.S. Davis & T.P. Simon, editors: Biological Assessment and Criteria: Tools for Water Resource Planning and Decision Making. Lewis Publishers, Boca Raton, Florida, USA. Karr, J.R. & D.R. Dudley. 1981. Ecological perspective on water quality goals. Environmental Management 5: 55-68. Leland, H.V. & S.D. Porter. 2000. Distribution of benthic algae in the upper Illinois River basin in relation to geology and land use. Freshwater Biology 44: 279-301. Sldecek, V. 1973. System of water quality from the biological point of view. Archiv fr Hydrobiologie und Ergebnisse Limnologie 7: 1-218. Stevenson, R.J.; J. Alba-Tercedor; B. Bailey; M. Barbour; C. Couch; S. Dyer; F. Fulk; J. Harrington; M. Harass; C.J. Hawkins; C. Hunsaker; R. Johnson & K. Thornton. 2004a. Designing data collection for ecological assessments, in Barbour, M.; S. Norton; R. Preston & K. Thornton, editors: Ecological Assessment of Aquatic Resources: Linking Science to Decision-Making. Society of Environmental Toxicology and Contamination Publication. Stevenson, R. J.; J. Alba-Tercedor; B. Bailey; M. Barbour; C. Couch; S. Dyer; F. Fulk; J. Harrington; M. Harass; C.J. Hawkins; C. Hunsaker; R. Johnson & K. Thornton. 2004b. Interpreting results of ecological assessments, in Barbour, M.; S. Norton; R. Preston & K. Thornton, editors: Ecological Assessment of Aquatic Resources: Linking Science to Decision-Making. Society of Environmental Toxicology and Contamination Publication. Stevenson, R.J. & L.L. Bahls. 1999. Periphyton protocols. Pages 6-1 through 6-22, in Barbour, M.T.; J. Gerritsen & B.D. Snyder, editors: Bioassessment Protocols for Use in Wadeable Streams and Rivers: Periphyton, Benthic Macroinvertebrates and Fish, Second Edition. U. S. Environmental Protection Agency, Washington, D.C. Stevenson, R.J.; S.T. Rier; C.M. Riseng; R.E. Schultz & M.J. Wiley. accepted. Comparing effects of nutrients on algal biomass in streams in 2 regions with different disturbance regimes and with applications for developing nutrient criteria. Hydrobiologia. Van Dam, H.; A. Mertenes & J. Sinkeldam. 1994. A coded checklist and ecological indicator values of freshwater diatoms from the Netherlands. Netherlands Journal of Aquatic Ecology 28: 117-133. Wiley, M.J.; P.W. Seelbach; K. Wehrly & J. Martin. 2002. Regional ecological normalization using linear models: a meta-method for scaling stream assessment indicators. Pages 197-218 in Simon, T.P. editor: Biological response signatures: indicator patterns using aquatic communities. CRC Press LLC, Boca Raton, Florida. Wright, J.F.; M.T. Furse & P.D. Armitage. 1993. RIVPACS: a technique for evaluating the biological quality of rivers in the UK. European Water Pollution Control 3: 15-25. Wright, J.F.; D. Moss; P.D. Armitage & M.T. Furse. 1984. A preliminary classification of running water sites in Great Britain based on macroinvertebrate species and the prediction of community type using environmental data. Freshwater Biology 14: 221-256.

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin Le phytoplancton et la Directive cadre. Intrt d'une approche fonctionnelle base sur les pigments
Jean Prygiel Agence de l'Eau Artois-Picardie - Mission Ecologie du Milieu France J.Prygiel@eau-artois-picardie.fr

Il existe relativement peu d'information sur le phytoplancton compar au phytobenthos et aux diatomes en particulier. Le phytoplancton est un lment essentiel des cours d'eau d'ordre suprieur ou gal 3 (Reynolds & Descy, 1996) et cependant les rseaux de suivi qualitatif et quantitatif sont rares et souvent limits aux grands fleuves internationaux comme le Rhin, le Danube (http://www.midcc.at/) ou la Meuse (Friedrich et al., 1998; Ibelings et al., 1998). Ceci peut tre attribu d'une part la trs forte variabilit spatiale et temporelle du phytoplancton (Autraux-Noppe, 2000) et donc la ncessit de disposer d'un grand nombre d'chantillons qui rend les oprations de suivi onreuses. D'autre part, la raret des donnes historiques utilisables rend difficile la proposition de conditions de rfrence (Kohler & Descy, 2003). Enfin, le dterminisme des peuplements phytoplanctoniques est complexe et fait intervenir de nombreux paramtres chimiques, physiques et biologiques (Bauer et al., 2002, Gosselain et al., 1998; Wehr & Descy, 1998). Cette complexit a conduit l'laboration de plusieurs modles pour la gestion des grands cours d'eau (Garnier et al., 1995; Everbecq et al., 2001; Kowe et al., 1998). Les rseaux sont donc pour l'essentiel limits au seul suivi de la chlorophylle a comme en France (Noppe & Prygiel, 1999; Prygiel , 2003) bien qu'elle ne permette pas de distinguer les diffrents groupes d'algues prsents dans la masse d'eau. La Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) permet de caractriser la structure des communauts phytoplanctoniques en sparant et en quantifiant diffrents pigments spcifiques (Wright et al., 1991). Cette technique a t initialement dveloppe pour le milieu marin et a t depuis applique avec succs en milieu ctier et estuarien (Tester et al., 1995; Wong & Wong, 2003; Li et al., 2002) ainsi qu'en cours d'eau (Descy & Metens, 1996). Certains auteurs recommandent toutefois un couplage de l'HPLC avec des observations microscopiques pour valider la technique (Antosegui et al., 2001; Breton et al., 2000). Des procdures statistiques telles que CHEMTAX peuvent galement tre utilises (Mackey et al., 1996). Elles permettent partir des diffrents pigments identifis en HPLC de partitionner la chlorophylle a totale (biomasse algale totale) en chlorophylle a gnre par chaque groupe algal (Pinckey et al., 2001; Schlter &

Mohlenberg, 2003; Schlter et al., 2000). Descy et al. (2000) ont appliqu cette procdure galement dveloppe en milieu marin au phytoplancton des lacs et ont constat qu'une validation des donnes pigments restait encore effectuer. D'autres mthodes bases sur l'analyse de traits biologiques et cologiques (taille, forme, capacit fixer l'azote) peuvent aussi tre utilises pour caractriser les aspects fonctionnels du phytoplancton (Weithoff, 2003). L'utilisation d'indices de diversit, de similarit, de dominance est largement rpandue, mais se rvle la plupart du temps dcevante. En fait, ce sont souvent les indices les plus simples qui sont souvent les plus efficaces (Tsirtis & Karydis, 1998). Dans les conclusions d'un colloque sur le phytoplancton des grands cours d'eau qui s'est tenu Berlin dbut 2003, Kohler et Descy (2003) constatent qu'aucune mthode ne satisfait ce jour aux exigences de la directive cadre mais que le suivi de la biomasse phytoplanctonique est ncessaire ds lors que le temps de rtention des masses d'eau est suprieur 6 jours. Ces auteurs recommandent donc un suivi de la chlorophylle l'aide de normes ISO avec dnombrements et identifications des espces phytoplanctoniques quand la teneur en chlorophylle a est suprieure 20 g/l. En conclusion, le recours aux mesures pigmentaires revt plusieurs avantages: - les analyses de pigments peuvent donner des indications sur la nature et l'abondance des principaux groupes du phytoplancton, ce qui rend cette procdure compatible avec la DCE. - cette technique est utilisable en milieu continental (cours d'eau et plans d'eau), en eaux de transition (estuaires) et dans les eaux ctires. - le recours des comptages et identifications n'est plus systmatique mais reste toutefois ncessaire pour calibrer les relations pigments/algues avant application en routine et pour vrifier qu'il n'y a pas de drive dans le temps de cette relation une fois qu'elle est tablie. - ce type d'analyse est plus rapide et moins onreux que les analyses phytoplanctoniques traditionnelles et autorise donc une frquence d'chantillonnage plus grande, un bon compromis pouvant tre un prlvement tous les 15 jours. - ce type d'analyse se prte plus facilement aux exercices d'intercalibration que les comptages

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin et dterminations qui souffrent d'un manque de standardisation et l'assurance qualit.
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Uso de las comunidades de algas en la categorizacin y seguimiento de masas de agua continentales. Algunas potencialidades y limitaciones
Sergi Sabater Facultat de Cincies - Universitat de Girona, Campus de Montilivi 17071-GIRONA sabater@udg.es

El horizonte marcado por la progresiva implementacin de la Directiva Marco del Agua (DMA) ha estimulado un panorama impensable hace unos pocos aos. Las Confederaciones Hidrogrficas y los organismos con competencias en calidad del agua de algunas Comunidades Autnomas estn elaborando, o estn en curso de finalizar, estudios de definicin de las masas de agua, en las que la informacin biolgica es parte esencial. De hecho, los bilogos estamos de enhorabuena, ya que la DMA establece que los organismos son elementos definitorios de la calidad ecolgica del sistema. Hasta hace muy poco, tan slo la qumica del agua era considerada como un elemento en la definicin de la calidad de las masas de agua. Los organismos vivos han alcanzado, pues, el nivel que les corresponda en la evaluacin y seguimiento de las masas de agua. Los trabajos que se estn efectuando en las distintas cuencas aportan datos hasta ahora inditos en muchos ros, lagos y zonas hmedas. Ms en particular, el uso de los organismos en las tareas de monitoraje se haba centrado en gran medida en aquellos organismos de fcil identificacin, que no requieren de una muy elevada especializacin para su uso de diagnstico ambiental. Estos haban sido principalmente las comunidades de macroinvertebrados, que pueden proporcionar un correcto diagnstico sin la dificultad que encierran otros grupos, como las algas. El trabajo con estos organismos ha abierto el camino, justo es reconocerlo, para que otros grupos de organismos, entre ellos las propias algas, reciban la atencin necesaria. Como fruto de un proceso largo, la DMA establece que es necesaria la informacin proporcionada conjuntamente por las comunidades de peces, macroinvertebrados y algas. La Directiva reconoce, pues, la capacidad diferenciada y complementaria que tiene cada uno de estos grupos de organismos para indicar uno u otro tipo de perturbaciones. El uso extendido de las comunidades de algas, fitoplanctnicas o fitobentnicas, adems de ser una buena noticia, ha sucedido sin que en nuestro pas se hubiesen desarrollado especificamente las herramientas adecuadas. En esencia, las herramientas deben traducir desde lo que sucede en la naturaleza a algo tangible que pueda ser integrado en la gestin concreta del

sistema. A diferencia, por ejemplo, de lo que suceda en Francia, Alemania o Inglaterra, en las que las Agencias del Agua haca mucho tiempo que haban hecho un esfuerzo de desarrollo de herramientas, no solamente para las comunidades de algas, sino para los grupos de organismos que son mayoritarios en las aguas continentales. En nuestro pas, mientras tanto, estbamos enzarzados en disputas estriles sobre cuales eran los mejores indicadores a implementar, discusin que discurra no tanto por razones cientficas sino ms bien por razones econmicas y de una pereza ancestral enraizada en aquel que inventen ellos. Sea como fuere, el adecuado uso de las comunidades de algas como herramienta ambiental requiere como mnimo de dos condiciones: - profesionales adecuadamente formados que puedan aplicar las herramientas con sentido crtico, y - el desarrollo o la adecuacin de herramientas de diagnstico. Por lo que se refiere a la formacin de profesionales, es obvio que en estos momentos existe una escasez de ellos. Sabido es que durante aos formar a alguien en la taxonoma de algn grupo concreto era arriesgar a convertirlo en un parado con un altsimo nivel de especializacin. Esta ha sido una realidad no solamente en Espaa, pero aqu ha sido especialmente dolorosa por la escasez previa de buenos taxnomos. La formacin de profesionales es principalmente funcin de las Universidades, que deben formar, pero tambin de las empresas y de las administraciones que deben contratar. En muchos casos, ni las empresas ni las administraciones tienen muy claro que se deba contratar a alguien para efectuar un anlisis tan especializado como es el de, pongamos, las comunidades de diatomeas. Si no existe, o no ha existido, demanda de profesionales, es absurdo que se plantee la formacin. Y creo que si durante aos no se ha formado a suficientes profesionales ha sido en gran parte, por la ausencia de perspectivas que justificase su formacin. Las Universidades debemos formar profesionales con una adecuada formacin en taxonoma, y tambin con criterio ecolgico suficiente que permita una adecuada interpretacin de los resultados que

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin proporcionan las comunidades. Sostengo que no debemos formar tcnicos sino profesionales, puesto que los primeros no tienen necesidad de entender el funcionamiento de los sistemas en los que trabajan, mientras que los segundos s deben entenderlos con profundidad. Por lo que se refiere a las herramientas, la llegada de la DMA requiere del desarrollo o de la adaptacin de herramientas adecuadas para los sistemas continentales espaoles. Las herramientas para el correcto uso de las comunidades de algas incluyen la adecuada taxonoma de las especies en los distintos sistemas, la informacin autoecolgica asociada a las especies, el desarrollo de metodologas de muestreo especficas, y la aplicacin de ndices biolgicos que se puedan aplicar con xito al diagnstico de las distintas masas de agua. Algunos retos en la correcta aplicacin de las comunidades de algas como indicadoras de la calidad ecolgica en los sistemas acuticos * Mejorar el conocimiento de las especies. Es necesario definir correctamente la adscripcin taxonmica de las especies que participan en los ndices. Es frecuente encontrar taxones que se caracterizan por su variabilidad morfolgica, lo que comporta dudas acerca de su identidad. En organismos plsticos como las algas estas dudas no son extraas, y nacen de la nica consideracin de la morfologa de los organismos como base para decidir sobre la identidad de las especies. En definitiva, puede suceder que exista una situacin de cierta subjetividad en la asignacin de las especies, que conlleva una cierta confusin taxonmica. Esta discusin, que es legtima en un debate acadmico entre taxnomos, se convierte en un complejo problema en cuanto se trata de asignar caractersticas autoecolgicas a las especies que integran la comunidad. Qu representa una especie que no podemos discriminar a ciencia cierta, o que tiene una variabilidad intramuestral tan grande que implica su asignacin a varias entidades taxonmicas? La correcta asignacin especies-autoecologa constituye la base de su aplicacin como herramientas de diagnstico ambiental. No debemos descartar aadir a las herramientas descriptivas usuales otros estudios detallados de la variabilidad de las especies. En algunos casos, pueden existir entidades taxonmicas que probablemente no resisten un anlisis morfomtrico en poblaciones naturales o en cultivos. Se ha visto en experimentos en cultivos que algunas especies varan en funcin de gradientes ambientales. Qu pasara si sometisemos a algunos taxones o grupos de taxones muy cercanos al anlisis mediante herramientas genticas? Este debate es insoslayable si queremos progresar en la aplicacin de las comunidades de algas como herramientas potentes en el diagnstico ambiental. * Relacionar las caractersticas de las especies y de las comunidades con los datos ecolgicos de los sistemas. De la misma manera que las herramientas taxonmicas deben ser perfeccionadas, tambin debe progresar el conocimiento ecolgico de nuestros sistemas naturales. Este progreso en paralelo es esencial a fin de efectuar una adecuada conexin entre la correcta descripcin de las comunidades biolgicas con los caracteres geomorfolgicos, fsicos, y qumicos que caracterizan los ambientes en los cuales se encuentran. El conocimiento ecolgico de nuestros sistemas naturales es incompleto, especialmente por lo que se refiere a las condiciones de referencia (sistemas no perturbados), que permitirn evaluar las posteriores desviaciones. Por tanto, el trabajo ecolgico debiera ser lo ms completo posible, para as poder determinar con certeza los ptimos de distribucin de las especies, y as poder comprender sus respuestas ante las variaciones ambientales. El poder predictivo de las comunidades de indicadores es posible, principalmente a escala ecorregional. Y es precisamente en esta escala en la que la informacin debe ser ms exhaustiva. * Aplicacin adecuada de ndices. Se est haciendo una labor importante de estandarizacin de las metodologas de muestreo y de observacin y cuenteo, que estn siendo plasmadas en normas CEN. Sin embargo, an no existe un acuerdo internacional en los mecanismos de resumen de la informacin suministrada por las comunidades de algas. Por su facilidad de aplicacin, se ha trabajado ms en las comunidades de diatomeas, pero cualquier intento de aplicacin se encuentra con una gran diversidad de ndices. Es obvio que se debe tener cautela al aplicar herramientas desarrolladas en otras ecorregiones, a pesar de que su elaboracin haya sido rigurosa. A modo de ejemplo, el ndice IPS de diatomeas desarrollado por las Agences de lEau francesas ha sido elaborado y posteriormente contrastado con miles de muestras en diversidad de situaciones. Sin embargo, una cierta falta de representatividad puede ser especialmente importante en sistemas meridionales, como los mediterrneos, que tienen poco peso en el pas vecino.

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin Por tanto, la aplicacin de los ndices no puede hacerse de manera automtica, sino que requiere de una tarea previa de validacin, que puede estar basada en aquellos ndices que han funcionado de manera adecuada en sistemas distintos a los propios. Esta validacin de una herramienta disponible parece ms razonable, en principio, que la formulacin de otros nuevos ndices, cuya formulacin quedara justificada en el caso de que ninguno de los ndices existentes reflejase las especificidades de las reas de estudio (grandes ecorregiones) de la Pennsula Ibrica. La validacin pasa por dos grandes principios: - Asignacin de valores de sensibilidad y de valor indicador adecuados para las especies caractersticas de los sistemas, valores que pueden divergir de otros formulados para las mismas especies en otros pases o ecorregiones. Sabemos, por ejemplo, que la abundancia de la diatomea Asterionella formosa no indica lo mismo en sistemas planctnicos templados que en otros ms fros. La asignacin de nuevos valores autoecolgicos debe hacerse de manera rigurosa y, a ser posible, contrastada estadsticamente con datos ecolgicos de los lugares en los que se distribuye la comunidad objeto de estudio. - Reescalamiento de los valores asignados por los ndices seleccionados a las distintas realidades de cada ecorregin. Los valores de los ndices se resumen, comnmente, por rangos y a veces por colores. Toda la informacin proporcionada por las comunidades se cifra, pues, en una clase de valores o de color. Es por ello necesario que evaluemos crticamente los valores proporcionados por los ndices. En este sentido, es substancial el criterio de experto. El potencial reescalamiento de los valores otorgados por los ndices slo ser posible en el caso que se disponga de datos de estaciones de referencia. Ello puede ser especialmente complejo en las partes medias y bajas de sistemas fluviales (habitualmente sometidos a la perturbacin humana) o en sistemas estuarinos. En definitiva, no se debe olvidar que la informacin proporcionada por las comunidades de organismos es opaca para los profesionales no especializados, y por tanto tambin lo es para las necesidades de los gestores de las aguas continentales. Es nuestra responsabilidad resumirla e interpretarla. Adems, los diagnsticos que se emiten califican a las masas de agua para su posterior mejora. Por tanto, los diagnsticos deben ser correctos y, por lo que nos afecta, que sean adecuadamente interpretados. Este objetivo requiere, pues, del concurso de los dos elementos antes descritos: profesionales bien formados, y herramientas adecuadas. Slo as podremos asegurar la credibilidad de las comunidades de algas como indicadores del estado ecolgico de las masas de agua.

Las algas y la implantacin de la Directiva Marco del Agua en Espaa

Marina Aboal Laboratorio de Algologa - Departamento de Biologa Vegetal Universidad de Murcia - Campus de Espinardo 30100-MURCIA maboal@um.es

Los estudios sobre la calidad biolgica de los sistemas acuticos, sobre todo de los ros, han estado en nuestro pas durante muchos aos centrados en los macroinvertebrados. Los mltiples trabajos realizados en las distintas cuencas hidrogrficas no slo han permitido hacer un seguimiento de diferentes tipos de perturbaciones sobre los sistemas, sino que adems han servido para incrementar el conocimiento faunstico y de los requerimientos ecolgicos de los diferentes organismos implicados. La aprobacin de la Directiva Marco abri la puerta a la utilizacin de otros grupos de bioindicadores, por ejemplo las algas. Pero se puede poner en marcha la DMA con facilidad y con rapidez en Espaa?

Mientras en nuestro pas ha habido un notable desinters por este tema, muchos de los pases europeos se afanaban en terminar o poner al da sus floras (John et al., 2000; Kelly, 2000; Rott et al., 1997; Rott et al., 1999), en el diseo de diferentes mtodos de trabajo (Buwal, 2001; Chovanec et al., 2004; Coring et al., 1999; Dares, 2004a, b, c; Gevrey et al., 2004; Jarlman et al., 1995; Star, 2002; Van Dam et al., 1994), en la elaboracin de diversos tipos de ndices (Kelly, 1999; LangeBertalot, 1979; Lecointe et al., 1999; Pipp, 2001) o en comprobar la viabilidad de los mtodos propuestos en cada pas (Almeida et al., 1997; Clausen & Biggs, 1997; Coring, 1997; DellUomo, 1997; De Nicola, 2004; Descy & Ector, 1997; Elorante, 1997; Harding & Kelly, 1997; Hrliman et

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin al., 1997; Kelly, 2003; Lindstroem, 1999; Muoz et al., 1998; Poulickova et al., 2004; Prygiel & Coste, 1993; Prygiel et al., 1999; Root & Pipp, 1997; Rott et al., 2003). Todo ello queda perfectamente reflejado en los diferentes volmenes que recogen las aportaciones a los congresos convocados precisamente para debatir sobre el uso de las algas como indicadores en el monitoreo biolgico, y que vienen celebrndose peridicamente en distintos pases europeos (Prygiel et al., 1999; Whitton et al., 1991; Whitton & Rott, 1996; Journal of Applied Phycology 14, 2002). La falta de este trabajo inicial en nuestro pas y la premura impuesta por las diferentes administraciones parece haber obligado a la adquisicin casi automtica de los mtodos ya existentes, en la mayor parte de los casos sin ningn estudio o intento previo de adaptacin. Sin embargo, la Pennsula Ibrica tiene una serie de peculiaridades que hacen difcil esta transferencia automtica. Existen, por ejemplo, un nmero importante de cursos de agua temporales o muy someros, tanto de forma natural como por imposicin de la regulacin de caudales, mucho ms acuciante en la parte meridional del pas. Pero adems el gradiente de aridez suele ir unido a un gradiente en la concentracin de sales: se produce un aumento de la alcalinidad, de la conductividad y, en muchos casos, tambin un aumento en la concentracin natural de nitrato o sulfato. Muchas veces los valores detectados son bastante superiores a los sealados en otros lugares ms alejados (centroeuropeos). Por otra parte, raras veces se incluyen en los estudios de biomonitores variables biolgicas que muchas veces explican gran parte de la variabilidad observada en la naturaleza, por ejemplo el papel de los herbvoros (Prygiel, este mismo volmen). Es probable que incluso la competencia entre los diferentes grupos de organismos puedan alterar notablemente el desarrollo de las comunidades bentnicas e influir en la diagnosis de la calidad ambiental, como parecen sealar algunos datos (Aboal et al., 2002). Nuestro conocimiento de la flora algal es muy parcial, muchas regiones carecen de estudios recientes o histricos y, es muy frecuente que cuando se emprende un estudio florstico se aporten un nmero importante de novedades no slo para la regin, sino para el pas o la ciencia (Aboal et al., 2003; Cambra et al., 1998; Clavero, 2004; Gom et al., 2004; Linares, 2003; Marn et al., 2004; Trobajo, 2003). Hay, por tanto, mucho trabajo pendiente a realizar sobre la flora de las ecorregiones, y es necesario reforzar los esfuerzos para definir mejor la autoecologa de las especies para optimizar su utilizacin como bioindicadores. Los ndices de calidad biolgica estn basados en datos recolectados en zonas geogrficas concretas, fundamentalmente centroeuropeos, que resultan difcilmente aplicables en los pases del sur de Europa, sobre todo del mbito mediterrneo. Estas dificultades podran explicar, al menos en parte, el retraso en la implantacin de estos mtodos en los pases de la Europa meridional. Diversos estudios han permitido comprobar la existencia de gradientes geogrficos que, al menos, deberan tomarse en consideracin (Leira & Sabater, 2004; Potapova & Charles, 2002; Stevenson, este nmero). La problemtica mencionada parece minimizarse cuando las diagnosis se elaboran a partir de los datos relativos a un nico grupo de algas (diatomeas), pero se muestran en toda su magnitud en el caso de utilizar las comunidades fitoplanctnicas o fitobentnicas, generalmente diversas y constituidas por diferentes grupos taxonmicos (Noppe & Prygiel, 1997; Pipp & Rott, 1993; 1994). Es indudable que la informacin aportada por la comunidad en su conjunto es mucho ms valiosa desde todos los puntos de vista, que la ofrecida por un nico grupo taxonmico (Biggs & Kilroy, 2000; Lindstroem et al., 2004), pero tambin es evidente que su estudio representa una mayor complejidad, aunque puede ser perfectamente abordable simplemente contando con los materiales adecuados (Barbour et al., 1999; Biggs & Kilroy, 2000; Stevenson & Bahls, 2003; Stevenson et al., 2002). La elaboracin y edicin de floras, claves y otros medios adicionales, deberan constituir una de las prioridades de las administraciones y entidades responsables del control de la calidad ambiental, siguiendo el ejemplo de otros pases, europeos y extraeuropeos. Existe suficiente personal tcnico con la formacin suficiente para llevar a cabo estas tareas? En la actualidad es perentoria la necesidad de establecer mecanismos de formacin y actualizacin del personal tcnico encargado de la realizacin de estos trabajos, habida cuenta del nivel de precisin necesario para reconocer y diferenciar los diferentes taxones. Quiz sera adecuado implicar a las sociedades cientficas (Asociacin Espaola de Limnologa, AEL, Sociedad Espaola de Ficologa, SEF) como aglutinantes de los expertos en todo este proceso, aunque hasta la fecha hayan permanecido bastante al margen, porque nunca han sido consideradas como interlocutores, en ninguno de los niveles administrativos de decisin. Quiz no sera excesivamente complicado favorecer la celebracin de cursos peridicos de formacin, que adems permitiran realizar una labor de homogeneizacin de los mtodos y de los criterios taxonmicos, por ejemplo.

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin Por otra parte, sera una buen iniciativa tratar de consolidar una coleccin en cada una de las confederaciones (o mejor centralizarlas todas en algn lugar) con las muestras testigo de los trabajos de las redes de calidad. Esto facilitara el necesario control de calidad de todo el proceso (Kelly et al., 2002), la realizacin de trabajos comparativos (Prygiel et al., 2002) y, por ltimo, aunque no menos importante, establecer una coleccin bsica de la biodiversidad de las aguas continentales de todo el pas, que podran ser de bastante utilidad para otros paises de la cuenca mediterrnea, tanto europeos como del norte de frica. La informacin acumulada, convenientemente introducida en una base de datos, permitira la puesta a disposicin de todos, de los datos florsticos y ecolgicos, que serviran de base para la realizacin de los ajustes o modificaciones de los mtodos utilizados, en cualquier momento. En este contexto, la SEF ha dado un primer paso para facilitar la bsqueda de informacin sobre la distribucin de las algas, sean marinas o continentales, recopilando en su web (www.sefalgas.org) las listas florsticas que se han ido publicando a lo largo de los aos. El paso siguiente, que supondra la elaboracin de un banco de datos sobre biodiversidad de las comunidades de algas en los sistemas acuticos del pas, requiere, adems de inters y entusiasmo, algn tipo de ayuda institucional. Los niveles de calidad ecolgica potenciales varan con diferentes tipologas de ros o en diferentes ecorregiones (Agencia Catalana del Agua, este nmero; Arnwine & Sparks, 2003; Prygiel, este nmero; Solheim et al., 2003; 2004; Solheim & Schartau, 2004). Esta informacin junto con el reconocimiento de las condiciones de referencia constituyen la piedra angular de todo el proceso, pero paradjicamente hay mucho por hacer todava en este tema. El recalentamiento global del clima puede tener como consecuencia un incremento en la frecuencia de las proliferaciones de grupos como las cianoprocariotas (cianobacterias, cianofceas), muchas de las cuales tienen la capacidad de producir distintos tipos de toxinas, de incierta funcin ecolgica, pero seguro carcter txico para la poblacin y para el ganado o especies amenazadas, en peligro o de especial inters en las polticas de conservacin (Gunn et al., 1992; Matsunaga et al., 1999; Metz et al., 1997; Onodera et al., 1997). Aunque con frecuencia se asocian estas proliferaciones con el aumento de la eutrofia (Chorus & Bartram, 1999; Mur et al., 1999) no siempre esta relacin es evidente (Metz et al., 1997). A medida que se intensifican los estudios aumenta el nmero de especies potencialmente txicas, sobre todo en las comunidades bentnicas, aunque la capacidad de producir toxinas no es una caracterstica de especie sino de clon (Chorus & Bartram, 1999). Si en algn momento se pretende desarrollar algn sistema de alerta precoz de toxicidad ser necesario no slo conocer las especies capaces de producir toxinas sino tambin en qu condiciones son capaces de activar la sntesis. La nica forma de conseguirlo es conociendo los ciclos anuales de desarrollo de las especies: la sucesin temporal de las comunidades fitoplanctnicas o fitobentnicas. Las tcnicas genmicas, tan en uso en la actualidad, slo permiten comprobar la existencia de cepas potencialmente txicas (que contienen el gen que codifica la toxina) pero se sabe muy poco de los factores que promueven o inhiben su expresin. Estas consideraciones son aplicables tanto a los medios continentales como los marinos. Las comunidades bentnicas, aunque mucho menos estudiadas tambin producen de forma constante toxinas que son liberadas al agua tanto de los ros como de los embalses de regiones calcreas (Aboal & Puig, 2005; Aboal et al., 2005). Aunque por ahora, son muy escasos los incidentes provocados por la proliferacin de algas txicas en sistemas continentales (Quesada et al., 2000), quiz no estara de ms incrementar los esfuerzos en tareas divulgativas y preventivas. En este aspecto algunos pases vecinos tambin nos han tomado la delantera (Calado et al. este nmero). Es curioso que en un momento en el que es tan grande nuestro desconocimiento de la biologa de muchas especies y de sus requerimientos se est vislumbrando la posibilidad de disear sensores multiespecie que permitan determinar con tcnicas genmicas la calidad del agua. Quiz no est lejos el da en que esto sea posible. El problema es que estos mtodos no sern verdaderamente tiles si no se basan en estudios taxonmicos y ecolgicos profundos.
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Use of diatoms to monitor eutrophication in UK rivers

Martyn Kelly Bowburn Consultancy, 11 Monteigne Drive, Bowburn Durham DH6 5QB UNITED KINGDOM MGKelly@bow-con.fsnet.co.uk

Introduction The use of diatoms for routine monitoring of UK rivers started in 1991, in order to meet the requirements of the Urban Wastewater Treatment Directive (UWWTD: European Union, 1991), a piece of legislation which set standards for sewage treatment across the European Union. For freshwater discharges, most UK sewage treatment works already met the basic requirement for secondary treatment; however, the UWWTD also required the designation of areas where more stringent treatment was required. One of the situations where a sensitive area designation was required was for discharges from large sewage works to waterbodies that were eutrophic or which in the near future may become eutrophic if protective action is not taken (UWWTD Annex 2). Such works were required to install phosphorus stripping facilities unless it can be demonstrated that removal [of P] will have no effect on the level of eutrophication. (UWWTD,

Annex 2). Environmental monitoring in England and Wales at this time was the responsibility of the National Rivers Authority (NRA; replaced by the Environment Agency in 1995). The NRA had a network of chemical monitoring stations which revealed very high concentrations of nutrients in rivers throughout much of the country, (see www.environmentagency.gov.uk/yourenv/eff/water). However, the availability of nutrients is only one part of the definition of eutrophication, and the NRA at this time had no means of measuring the biological response to these nutrients in rivers. They had, in RIVPACS (River Invertebrate Prediction and Classification System), a state-of-the art tool for the assessment of invertebrate assemblages in rivers, based on comparisons between the fauna expected from computer-generated predictions, and that actually observed (Wright et al., 1989). However, invertebrates are consumers rather than primary

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin producers and there were no nationally-accepted methods for the direct assessment of these components of the river biota. Research on appropriate methods for assessment of eutrophication in rivers arose out of this need, and followed two paths the use of macrophytes, which led to the development of the Mean Trophic Rank (MTR: Holmes et al., 1999), and the use of diatoms, leading to the development of the Trophic Diatom Index (TDI: Kelly & Whitton, 1995). Development of the TDI The assumption underlying the TDI is that the response of benthic diatom assemblages to phosphorus can be detected over and above variation due to other factors. In theory at least, assemblages characteristic of low, moderate and high phosphorus concentrations can be defined; however, in practice, there are many other factors that can also influence the composition of diatom assemblages. As the purpose of the TDI was to aid decisions relating to sewage discharges, it is especially important to note that many of the other variables associated with such discharges typically covary with phosphorus (Lenoir & Coste, 1996). Whilst taxa that are described as pollution tolerant (e.g. Nitzschia palea) are typically associated with nutrient-rich water, there is also evidence to show that they are adapted to cope with high concentrations of ammonia (Hrlimann & Schanz, 1993), they can survive at low oxygen concentrations (van Dam et al., 1994) and, in some cases, can take advantage of the abundance of organic matter via heterotrophic nutrition (e.g. Li & Vulcani, 1987). In addition, many such taxa are motile, allowing them to cope with the deposition of fine material on surfaces. For these reasons, a correlation between a diatom index such as the TDI and phosphorus must not be interpreted as indicating a causal relationship without some additional qualification. This is important within the context of monitoring related to the UWWTD as a decision to install nutrient stripping at a large sewage works will necessitate capital investment exceeding 1 million, as well as increasing the running costs for the works. The TDI was based on the weighted average equation of Zelinka and Marvan (1961), which had been used successfully in a number of other indices, notably the Indice de Polluosensibilit of Coste (in CEMAGREF, 1981). Another version of the same equation is used widely by palaeoecologists (Birks et al., 1990). 70 sites were sampled to provide the data on which the TDI was based. All had chemical characteristics and benthic invertebrate faunas that indicated that they were free from significant organic pollution. Although there are computer programs which permit the automatic calculation of weighted average equations (e.g. Line & Birks, 1990), the first version of the TDI was constructed simply by assigning a value from 1 to 5 to each taxon, depending upon its sensitivity to nutrients, and then through an iterative process, adjusting these to maximise the relationship between the prototype index and aqueous P (see Fig. 1).

Fig. 1. Relationship between TDI and Filtrable Reactive Phosphorus (FRP), measured at 70 sites in the UK. From Kelly & Whitton (1995).

For the first version, 100 taxa were included a mixture of genera and species (Kelly & Whitton, 1995), and this figure has been expanded to 113 taxa in the latest version (Kelly et al., 2001). Whilst some phytoplankton taxa (e.g. Stephanodiscus hantzschii) are characteristic of lowland, eutrophic rivers, none of the ten taxa that are predominately planktonic are included in the calculation because they are not a natural part of the benthic assemblage, and because they can confound interpretation in some situations, such as immediately downstream of impoundments. A novel feature of the TDI is the use of a second value, alongside the index itself, to indicate the reliability of the TDI as an estimate of eutrophication at a site. The original rationale was to highlight sites where non-nutrient factors associated with sewage discharges were exerting an effect on the flora. In the latest version, however (Kelly et al., 2001), this was modified to simply percent motile valves, firstly because many of the taxa that were characteristic of organicallyenriched waters were motile, but secondly because spatial or temporal shifts between sessile and motile taxa seemed to provide some general indication of the importance of non-nutrient factors in influencing the composition of the flora. The TDI in practice In order to facilitate national implementation of the TDI, the NRA funded

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin development of a users guide, first published in 1996 and subsequently revised in 2001 (Kelly et al., 2001). This provides procedures for sample collection, preparation and analysis, along with guidance for data interpretation and quality assurance. The first version included, in addition, a simple key to benthic diatoms (one constraint on adoption of diatom-based methods before this was the absence of user-friendly identification guides). However, this was subsequently developed as a separate publication (Kelly, 2000) and was omitted from the revised manual. A new computer-based multi-access key is presently under development. Methods in the users guide are compatible with two European standards (EN 13946 and EN 14407) both of which are close to publication. The wording of the UWWTD requires assessments of eutrophication in relatively limited geographical areas and, for this reason, the Users Manual presents a variety of options for data collection, permitting the methods to be tailored to local circumstances. For example, use of cobbles and small boulders is the most widely used method of sample collection, but there are several stream types within lowland UK where such substrates are rare or absent and, for this reason, options are also provided to allow for sampling from artificial substrates or from macrophytes. Lengths of frayed polypropylene rope have proved to be a cheap and effective substrate. The preparation of permanent slides is an important advantage of benthic diatom analyses, allowing samples to be stored indefinitely and to be posted between laboratories. The former permits archives of material to be reanalysed in the future if required, whilst the latter facilitates quality assurance procedures such as intercalibration exercises and independent audits. The development of robust QA protocols is another novel feature of the TDI. This was particularly important as many laboratories had only one individual trained in diatom identification, which meant that it was necessary to provide a means by which these analysts could be reassured about the quality of the data that they were producing. An audit procedure, based on Bray-Curtis similarity was developed (Kelly, 2001) and is described in full in the Users Manual. The difference in TDI between two trained workers is usually < 5, and the average difference between skilled analysts is typically less. Training is facilitated by a distance learning course, developed by Bowburn Consultancy, in which students perform a number of exercises based on both prepared slides supplied with the course, and on material collected from the students own local environment. Students send photographs or drawings for confirmation, along with the results of analyses performed on both the supplied material and their own samples. This allows students to learn at their own place and in a manner that can be tailored to their own practical needs. Evaluation of point-source eutrophication using the TDI The basic experimental design adopted for the assessment of the impact of sewage discharges on eutrophication was to select sites upstream (control) and downstream (treatment) of the discharge and to sample over a period of about three years in order to ensure that any trends demonstrated were robust. The null hypothesis of such an analysis is that there is no difference in flora (and, therefore, in index values) between the two sites, as the distance will be too short for natural hydromorphological and chemical changes to exert a significant effect. It would appear most logical to sample just far enough downstream of a discharge to ensure full mixing. However, this is often the zone which exhibits the most serious effects of organic pollution, with elevated ammonia, biochemical oxygen demand and suspended solids, and reduced oxygen concentrations (Hynes, 1960). The effects of these on the aquatic flora have already been discussed (see above). For this reason, it is often useful to add a further sampling site in the recovery zone, further downstream. Finally, as sewage works are typically located downstream from the communities that they serve, and as a consequence sites upstream of the sewage works may themselves show the impact of runoff and industrial effluents from the urban area itself. So, finally, there is often value in placing a further sampling site upstream of the urban area (Fig. 2). In practice, however, the situation is rarely as clean cut as this, and the following two case studies (both based on data collected as part of UWWTD designations in the UK) illustrate the TDI in action.
Fig. 2. Schematic representation of sampling strategy for the TDI. Circles indicate sampling stations. See text for more details.

Town STW

Upstream of town

Upstream and downstream of STW

Recovery zone
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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin Case study 1: the River Wear The River Wear rises in the Pennines and flows 107 km to join the North Sea at Sunderland (Fig. 3). The Pennines are an area with a low population density and rough sheep grazing, but at approximately 20 km from the source the river flows onto the Durham coalfield, an area of higher population density. Between km 40 and the tidal limit, effluent from nine large sewage works enters the river either directly or via tributary streams. Annual mean concentrations of dissolved phosphorus, which are < 30 g l-1 at km 24, rise to more than 400 g l-1 by the tidal limit, and exceed the Environment Agencys target concentration of 200 g l-1 by km 60, just upstream of Durham City (Fig. 4).

Fig. 3. Map showing River Wear and major tributaries. Distances on the main river are measured downstream from Wearhead (marked W on the map). Locations of sewage works with a population equivalent > 10,000 (Qualifying discharges) are marked with arrows. From Kelly (2001).
1000

annual mean P (mg l )

800

-1

600

400

200

0 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Distance from Wearhead (km)

Fig. 4. Annual mean concentrations of P (as orthophosphate) in the River Wear as a function of distance from Wearhead. Crosses: values less than detection limit of analytical methods (20-61 g L-1). Dashed line: Environment Agencys proposed target value for lowland rivers. Modified from Kelly (2001).

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin Along with many other rivers in England and Wales, the River Wear was examined by the Environment Agency to see whether there was a case for designation as a eutrophic sensitive area under the terms of the UWWTD. Diatoms formed one part of the evidence that was accumulated, along with chemical data (nutrients and dissolved oxygen concentrations), results of macrophyte surveys and the output from mass balance models predicting likely concentrations if P stripping was installed. Knowledge of the loads contributed by point sources underpinned the application of mass balance models to these data and predicted that significantly lower concentrations of P would be found in the lower part of the river after the onset of nutrient stripping. However, there is no indication from these results whether or not there are likely to be ecological benefits from reducing nutrient concentrations in the river. For this reason, the Environment Agency also used the TDI and the MTR. Diatom samples were collected from approximately 20 km the source down to the tidal limit. The large number of sewage works entering the river meant that the experimental design described in the previous section had to be adapted, as the density of sewage discharges in the river was such that it was not possible to separate the impacts of each individual sewage works. Sampling continued for five years. TDI values at all sites along the river were variable, as the dominant taxa varied between samples. The uppermost samples, for example, were dominated by Achnanthidium minutissimum, Cocconeis placentula var. euglypta and Nitzschia fonticola. However, despite this within-site variability, there was a pattern of gradually increasing TDI values until km 60, after which values remained high until the tidal limit (Fig. 5). Moreover, the pattern of longitudinal variability was consistent within individual surveys, and use of a paired sample ttest permitted significant differences to be detected between sites even when the mean difference was < 5 (Kelly, 2001). Both the TDI and the MTR show the flora of the River Wear to change from one dominated by taxa indicative of low or moderate nutrient enrichment in the upper part of the river to one dominated by taxa indicative of high nutrients in the lower part of the river. This, along with evidence of increasing nutrients in the water derived largely from sewage works formed the basis for the case made for designating the River Wear as a eutrophic sensitive area. The designation started at the point at which the first large sewage works enters the river, which occurred at km 40, and extends to the tidal limit. However, it is important to point out that the ecological evidence on which this designation is based is derived from spatial, not temporal, studies, with the implicit assumption that a reduction in nutrient concentrations will itself drive a change to a flora more typical of low nutrient waters. The case study will illustrate a situation under which these assumptions were not valid. Case study 2: the River Stour There are at least five English rivers with the name Stour (thought to mean the strong one in Old English). The river on which this study is based rises in the south Downs in Kent and flows in an approximately north-easterly direction before joining the English Channel near Ramsgate. The catchment is largely rural but includes two large towns in the freshwater section at Ashford, approximately 22 km from the source, and Canterbury, 30 km downstream from Ashford. The river downstream of Ashford sewage works was one of 33 sensitive areas designated in 1994, before the MTR and TDI were developed. The local Environment Agency ecology team monitored the river above and below the discharge before and after the onset of nutrient stripping in October 1998.

100 80
Fig. 5. TDI values in R. Wear between 1993 and 1997. From Kelly (2001).

TDI

60 40 20 0 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Distance from source (km)

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin Although chemical monitoring showed an almost immediate benefit, with dissolved P concentrations downstream of the discharge falling to a level that was more or less thesame as concentrations measured upstream (Fig. 6), the diatom assemblage showed almost no change (Fig. 7).

2.5 Bybrook 2.0 Longport

ortho-P (mg l )

-1

1.5

1.0

0.5

0.0
19-Jun-97 05-Jan-98 24-Jul-98 09-Feb-99 28-Aug-99 15-Mar-00 01-Oct-00 19-Apr-01

date
Fig. 6. Phosphorus (as FRP) concentrations in River Stour above (Bybrook Bridge) and below (Longport Bridge) Ashford STW. From Kelly & Wilson (in press).

100 80

TDI

60 40 20 0 19-jun-97

Bybrook Longport

5-ene-98

24-jul-98

9-feb-99

28-ago-99

15-mar-00

1-oct-00

date
Fig. 7. TDI values in the River Stour, above and below Ashford STW. From Kelly & Wilson (in pres).

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin This lack of response occurred not just with the TDI, but also with a German variant of the index (Coring et al., 1999) and the Austrian Trophic Index (Rott et al., 1999) and the reasons provide some useful lessons for the future exercises in eutrophication control. First, the lack of a significant difference between upstream and downstream sites before the onset of nutrient stripping, despite an obvious increase in nutrient concentrations, suggest that there was probably not a strong case on ecological grounds for the installation of nutrient stripping in the first place. A close examination of chemical data shows that summer P concentrations even after the onset of nutrient stripping can reach 0.5 mg l-1. Furthermore, these summer P concentrations are sufficiently high that P is unlikely to be the limiting nutrient so there is little scope for the ecological benefits of nutrient stripping to be manifested (Kelly & Wilson, submitted). However, further downstream the situation was appeared more optimistic. Monitoring in this stretch only started after the start of nutrient stripping but Spring samples in the area approximately 15 to 20 km downstream from Ashford had TDI values between 60 and 70 (Fig. 8) and were dominated by Achnanthidium minutissimum, a species characteristic of low or moderate nutrient levels. P concentrations along this stretch of the river are lower than those measured immediately downstream of Ashford largely a consequence of dilution by water from tributary streams. Examination of P concentrations in this stretch before and after the onset of nutrient stripping, and a comparison with the known autecology of A. minutissimum, suggests that this is likely to be a consequence of nutrient stripping, although this conclusion based on post hoc reasoning - should be treated with caution. It does, however, illustrate some of the problems of bringing about demonstrable ecological changes in lowland rivers. Lessons in eutrophication management in lowland rivers One of the lessons of the past few years is that repeated sampling is necessary in order to ensure that any trends observed by ecological monitoring are robust. This is true both of establishing longitudinal trends to provide the evidence for the designation, and for subsequent temporal monitoring to establish whether or not any nutrient stripping was successful. This, along with the inevitable time lags caused by the designation process and by the time required to plan the necessary investment in tertiary treatment at affected works, means that there are few strong demonstrations of the ecological benefits of the UWWTD yet available in the UK. However, there are a few general lessons that have been learnt over the past decade. One of these is to understand that all measures of a biological response to nutrients have a theoretical foundation in the principle of limiting factors first proposed by Lieberg in the nineteenth century.

100 80 60 40 20 0 10 20 30 40 50 60

TDI

Distance from source (km)

Fig. 8. Longitudinal distribution of TDI values in the River Great Stour during study period. Arrows indicate the locations of large (>10,000 p.e.) sewage works. Unpublished data.

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin One assumption implicit in the use of any mathematical function that attempts to infer an environmental variable from biological data is that the variable in question is able to exert a detectable influence on the biota. Where a nutrient is in short supply then this is clearly the case; however, there will be a point at which there are sufficient nutrients to satisfy all the needs of the biota. Fig. 9 expresses this diagrammatically. structure ceases to respond to increases in phosphorus and that it is important for users to be able to identify this point (Kelly, 1998). An insight into this can be obtained by looking at the N:P ratio, assuming a Redfield Ratio of 106:16:1 for C:N:P (Redfield, 1958), which would suggest that N:P > 16 indicates a P-limited system whilst N:P < 16 indicates an N-limited system. Experimental studies (Chiaudani & Vighi, 1974; Fosberg & Ryding, 1980; Chessman et al., 1992) have shown that the situation is not quite this simple (presumably because of differences in the metabolism of particular species), and that N:P < 10 usually indicates N limitation, with N:P between 10 and 16 representing a grey area where either nutrient might be limiting. It is also important to point out that other factors (e.g. light availability) might override nutrients and limit growth, so an analysis based on N:P ratios alone is rather crude. However, applying this logic to data from the River Stour we see that many of the samples collected from the river have N:P ratios that suggest that P is not limiting (Fig. 10) and, furthermore, that these tend to occur in the summer, when the biological effects of eutrophication are most obvious.

Fig. 9. Schematic representation of stages in response of photosysnthetic community to increase in nutrient loading. From Kelly et al. (2001), modified from Sas (1989). The response to P loading depends upon the zone in which the initial P concentration is found: I, Increase in biomass and floristic change in response to increased P loading; II, Increase in biomass but no floristic change; III, No biomass response to increase in P loading.

When phosphorus is in short supply, then an increase in the supply will influence both the composition of the flora and the total biomass, with taxa able to thrive at low nutrient concentrations being replaced by more competitive species as the phosphorus concentration increases. However, there will be a point at which the composition of the flora ceases to change and the only response will be an increase in the biomass of those taxa that were best equipped to compete under high nutrient concentrations. Finally, a point will be reached when the phosphorus supply is such that there is no scope for the biomass to increase, perhaps due to self-shading or other density-dependent factors unless or until a density-independent factor (e.g. grazing or scouring spates) is able to remove some of the accumulated biomass. It follows from this that the TDI, and other indices of eutrophication that are based on community structure, will have an upper limit of effectiveness at the point where community

Fig. 10. N:P ratios in River Stour (calculated as total oxidised nitrogen (nitrate-N + nitrite-N) : orthophosphate-P. Horizontal line indicates N:P = 10.

Low N:P ratios occurred both before and after the onset of nutrient stripping (Kelly & Wilson, submitted), with N:P >10 corresponding to P concentrations of < 0.3 mg l-1. A sensible target for nutrient-stripping in this river would therefore be for summer orthophosphate-P concentrations to meet this criterion, and it would not be difficult for such scenarios to be built into modelling exercises in advance of future designations. It is also

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin important to point out that any such limit is, to some extent, catchment-specific, depending upon the sources of nutrients and, perhaps, upon the importance of non-nutrient factors in limiting growth. Also it is worth reiterating that this limit applies only to changes in community structure and the effect of nutrient stripping on plant biomass in the River Stour has not been evaluated. A second lesson is the need for repeat sampling, and for robust experimental designs. Whilst surveys along the length of a river are useful for indicating broad trends (see Figs. 5 & 8), it is useful to focus attention on particular sewage works. In the case of the River Wear, individual sewage works could be studied in isolation, by selection of an appropriate pair of sites, one upstream and one downstream of the discharge. This was aided by the relatively good water quality in much of the Wear, which meant that variables associated with organic pollution were unlikely to exert a strong influence on the biota. Simultaneous collection of upstream and downstream samples eliminated temporal factors as a major source of variation and permitted the use of a paired sample t-test, which was able to detect differences in TDI as small as two units (Kelly, 2001). In addition, use of statistical power analysis (Peterman & MGonigle, 1992) enabled the sensitivity of the analysis to be maximised (Fig. 11). It is also pertinent to note from Fig. 11 that the difference that was detectable varied between pairs of sites and at present the scale of such variation cannot be predicted in advance. However, as a general rule at least six samples are required per sample in order to ensure that results have a statistical power > 0.8 (Kelly, 2001). The future: diatoms and the Water Framework Directive The focus of environmental monitoring has shifted with the adoption of the Water Framework Directive (WFD: European Union, 2000). Whilst the UWWTD gave ecologists an important role in the decision-making process, it is possible for a water body to be eutrophic yet still be technically in compliance with the UWWTD. This is because the targets outlined in Article 5 and Annex I are still drafted in terms of chemical concentrations in the final effluent. The WFD will change this by making good ecological status into the target for all improvements to the aquatic environment. However, this poses a number of challenges to ecologists including, most importantly, the need to develop the predictive capabilities of monitoring tools, particularly bearing in mind the scale of within-site variation noted above. The notion of good ecological status is one that is still evolving as Member States attempt to flesh out the brief definitions given in Annex V of the WFD. A key feature, however, will be an objective definition of good ecological status that can apply to any water body within a Member State and that can be calibrated against definitions used elsewhere in the European Union. Good ecological status will need to combine information from the entire aquatic biota, including algae, macrophytes, invertebrates and fish. The WFD calls for ecological status to be measured in terms of deviation from values that would be obtained from a similar site free from any human-induced stress, which requires the establishment of a network of reference sites to serve as a baseline against which such deviations can be measured.

minimum significant difference

20 15 10 5 0 0 2 4 6 8

B (5.64) A (7.32) C (2.28)

10

12

number of samples
Fig. 11. Number of samples necessary to detect a significant difference between sites upstream and downstream of major discharges on River Wear. The calculation is based on Schoenfeld (1998)s power analysis software and assumes a one-sided paired sample test with a P< 0.05 confidence limit and a statistical power of 0.8. Comparisons: A = Wolsingham (km 24.5 km) vs Bradley (km 28.5); B = Bradley vs Gaunless (km 43.5); C = Gaunless vs Sunderland Bridge (km 58.5); all distances downstream of Wearhead.

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin Tools such as the TDI which were developed for the UWWTD provide a useful first step towards fulfilling the requirements of the WFD, but their use has tended to be limited to limited geographical ranges, such that a sample site upstream of a sewage works acts as a reference site (of sorts) for a sample site downstream of the works. The discussion above has highlighted some of the problems encountered even when using this in practice and there will be some major intellectual challenges ahead if tools are to be developed that are capable of providing statistically-sound judgements of ecological status that are applicable to all river sites within a Member State.
Acknowledgements Thanks to Gestin Ambiental Viveros y Repoblaciones de Navarra S. A. for funding my participation at the workshop "Jornadas sobre empleo de la flora acutica como indicador biolgico para determinacin del estado ecolgico de los ros segn la Directiva Marco del Agua" (9 abril 2003). References Birks, H.J.B.; J.M. Line; S. Juggins; A.C. Stevenson & C.J.F. ter Braak (1990). Diatoms and pH reconstruction. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B 327: 263-278. CEMAGREF (1982). Etude de Mthodes Biologiques Quantitatives d'Appreciation de la Qualit des Eaux. Rapport Q.E. Lyon-A.F.B. Rhne-MediterranneCorse. Chessman, B.C.; P.E. Hutton & J.M. Burch (1992). Limiting nutrients for periphyton growth in subalpine, forest, agricultural and urban streams. Freshwater Biology 28: 349-361. Chiaudani, G. & M. Vighi (1974). The N:P ratio and tests with Selenastrum to predict eutrophication in lakes. Water Research 8: 1063-1069. Coring, E.; S. Schneider; A. Hamm & G. Hofmann (1999). Durchgehendes Trophiesystem auf der Grundlage der Trophieindikaation mit Kieselalgen. 219 pp. Deutscher Verband fr Wasserwirtschaft und Kulturbau e.V., Koblenz. European Community (1991). Council directive of 21 May 1991 concerning urban waste water treatment (91/271/EEC). Official Journal of the European Community Series L 135/40-52. European Union (2000). Directive 2000/60/EC of the European Parliament and of the Council of 23 October 20000 establishing a framework for Community action in the field of water policy. Official Journal of the European Communities L327: 1-73. Fosberg, C. & S-O. Ryding (1980). Eutrophication parameters and trophic state indices in 30 Swedish waste-receiving lakes. Archiv fr Hydrobiologie 89: 189-207. Holmes, N.T.H.; J.R. Newman; S. Chadd; K.J. Rouen; L. Saint & F.H. Dawson (1999). Mean Trophic Rank: A User's Manual. R&D Technical Report E38. Bristol: Environment Agency. Hrlimann, J. & F. Schanz (1993). The effects of artificial ammonium enhancement on riverine periphytic diatom communities. Aquatic Sciences 55: 40-64. Hynes, H.B.N. (1960). The Biology of Polluted Waters. 202 pp. Liverpool: Liverpool University Press. Kelly, M.G. (1998). Use of community-based indices to monitor eutrophication in rivers. Environmental Conservation 25: 22-29. Kelly, M.G. (2000). Identification of Common Benthic Diatoms in Rivers. Field Studies 9: 583-700. Kelly, M.G. (2001). Role of benthic diatoms in the implementation of the Urban Wastewater Treatment Directive in the River Wear, NE England. Journal of Applied Phycology 14: 9-18. Kelly, M.G. (2001). Use of similarity measures for quality control of benthic diatom samples. Water Research 35: 2784-2788. Kelly, M.G. & B.A. Whitton (1995). The Trophic Diatom Index: new index for monitoring eutrophication in rivers. Journal of Applied Phycology 7: 433-444. Kelly, M.G. & S. Wilson (submitted). Effect of phosphorus stripping on water chemistry and diatom ecology in an eastern lowland river. Kelly, M.G.; C. Adams; A.C. Graves; J. Jamieson; J. Krokowski; E.B. Lycett; J. Murray-Bligh; S. Pritchard & C. Wilkins (2001). The Trophic Diatom Index: A User's Manual. Revised Edition. R&D Technical Report E2/TR2, Bristol: Environment Agency. Lenoir, A. & M. Coste (1996). Development of a practical diatom index of overall water quality applicable to the French National Water Board Network. pp. 29-43. In Whitton, B.A. & E. Rott (Eds.): Use of Algae for Monitoring Rivers II. Univ. Innsbruck. Innsbruck. Li, C-W. & B.E. Volcani (1987). Four new apochlorotic diatoms. British Phycol. Journal 22: 375-382. Line, J.M. & H.J.B. Birks (1990). WACALIB version 2.1 - a computer program to reconstruct environmental variables from fossil assemblages by weighted averaging. Journal of Paleolimnology 3: 170-173. Peterman, R.M. & M. M'Gonigle (1992). Statistical power analysis and the precautionary principle. Marine Pollution Bulletin 24: 231-234. Redfield, A.C. (1958). The biological control of chemical factors in the environment. American Scientist 46: 205-221, Rott, E.; E. Pipp; P. Pfister; H. van Dam; K. Ortler; N. Binder & K. Pall (1999). Indikationslisten fr Aufwuchsalgen in sterreichischen Fliessgewassern. Teil 2: Trophieindikation. 248 pp. Bundesministerium fr Landund Forstwirtschaft, Wien, Austria. Sas, H. 1989. Lake Restoration by Reduction of Nutrient Loading: Expectations, Experiences, Extrapolations. St Augustin: Academia Verlag Richarz GmbH. van Dam, H.; A. Mertens & J. Sinkeldam (1994). A coded checklist and ecological indication values of freshwater diatoms from The Netherlands. Netherlands Journal of Aquatic Ecology 28: 117-133. Wright, J.F.; P.D. Armitage; M.T. Furse & D. Moss (1989). Prediction of invertebrate communities using stream measurements. Regulated Rivers: Research & Management 4: 147-155 Zelinka, M. & P. Marvan (1961). Zur Prazisierung der biologischen Klassifikation des Reinheit fliessender Gewasser. Archiv fr Hydrobiologie 57: 389-407.

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin Redes de control biolgico en Francia. Algo de historia y situacin actual
Jean Prygiel Agence de l'Eau Artois-Picardie - Mission Ecologie du Milieu France J.Prygiel@eau-artopis-picardie.fr

Desde 1999 existe en Francia una red nacional de monitoreo basada en la utilizacin del ndice biolgico de diatomeas. En realidad este ndice no cumple los requisitos de la Directiva Marco del Agua ya que, en algunos casos, utiliza grupos de especies en lugar de especies individuales, y se basa en abundancias relativas (referidas a 400 individuos). Sin embargo, se ha tratado de tomar en consideracin las desviaciones de los requerimientos de referencia identificando regiones naturales para las comunidades de diatomeas. Ya se han presentado las primeras propuestas para los valores de referencia y los lmites entre muy bueno-bueno, y buenomoderado para cada una de las cinco grandes regiones reconocidas para las diatomeas. Las propuestas se revisarn y actualizarn con los resultados de las redes de calidad. Adems se pretende que en el futuro sea posible comparar las listas de diatomeas con las de las estaciones de referencia mediante algn ndice de similitud como el de Bary-Curtis. En la actualidad no se realiza ningn tipo de monitoreo del fitoplancton en todo el territorio francs, a excepcin de la cuantificacin de clorofila a. Algunas cuencas poseen redes, muy limitadas tanto en el espacio como en el tiempo, para el control tanto cualitativo como cuantitativo (Loire, Loing, Meuse), que adems aportan datos muy difciles de interpretar. Durante los aos 1994 y 1996 en Artois-Picardie se estudiaron tanto los recuentos como los anlisis de pigmentos en grandes ros y canales, y se comprob que la variabilidad era demasiado grande y que era necesaria la elaboracin y estandarizacin de protocolos precisos. Adems existen otros problemas como la falta de un nmero suficiente de expertos o la ausencia de condiciones de referencia para el fitoplancton. Por ahora, se considera que el monitoreo tradicional del fitoplancton es demasiado caro y que los resultados son difciles de interpretar, por lo que parece ms adecuado proponer el uso de la cromatografa de alta resolucin para realizar anlisis de pigmentos especficos, ya que pueden ser ms rpidos, ms baratos y cumplen los requerimientos de la Directiva Marco, al ser tanto cuantitativos como cualitativos. Este tipo de aproximacin tambin podra ser adecuado para aguas costeras y de transicin. En todos los casos la calibracin y puesta al da del mtodo debe hacerse mediante estudios florsticos tradicionales.

Las algas filamentosas se incluyen dentro de los macrfitos que se utilizan en el clculo del ndice de macrfitos (IBMR, AFNOR, 2003). Este ndice es un buen indicador del nivel trfico. No existen mtodos estandarizados para el monitoreo de lagos aunque en los ms grandes se estudia el fitoplancton. El CEMAGREF propuso la realizacin de lo que llamaron diagnstico rpido y que incluye la qumica del agua, anlisis fitoplanctnicos (proporcin de grupos algales), adems de los invertebrados del sedimento (oligoquetos y moluscos). En la actualidad se est elaborando una propuesta para lagos someros y se han hecho algunos ensayos para comprobar si el ndice IBD puede utilizarse en lagos, aunque con protocolos de muestreo modificados. El ndice biolgico de diatomeas (AFNOR, T 90354, 2000) La red nacional consta de 836 muestras recolectadas entre mayo y agosto. Las determinaciones las realizan dos equipos de experiencia reconocida. El ndice biolgico de diatomeas (IBD) tiene como mbito de aplicacin los cursos de agua, excepto los de aguas salinas o las zonas de estuario. Su objetivo es la estimacin de la calidad del agua. Metodologa: muestreo de piedras, de substratos duros, de macrfitos o de substratos artificiales (por orden de preferencia) en zonas aclaradas de corriente mxima. 1.1. El rea de muestreo ser de 100 cm2. 1.2. El nivel de identificacin: especies o grupos de especies. 1.3. Valores del ndice de 0 a 20 (en cinco clases de calidad). 1.4. Clculo del ndice: el ndice tiene en cuenta la abundancia relativa de cada taxn, su perfil ecolgico a lo largo de las clases de calidad y su valor indicador. 1.5. Repertorio taxonmico: 209 taxones (631 considerando los sinnimos y las especies asociadas). Se distinguieron 11 grupos de estaciones, cada una de las cuales representa una comunidad particular caracterstica de condiciones ambientales especficas: 6 grupos en zonas con alteraciones antrpicas y 5 grupos de comunidades de referencia ligados a un contexto geoclimtico

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin particular y ligadas a caractersticas hidroecorregionales. Las cinco regiones de diatomeas diferenciadas (Fig.1) son: 1. Ros cidos de mineralizacin muy dbil. 2. Ros dbilmente mineralizados sobre substrato silceo. 3. Ros de montaa de pH neutro y mineralizacin dbil. 4. Ros alcalinos de llanura. 5. Ros alcalinos de montaa. del material la llev a cabo en todos los casos la misma persona. La variacin de los valores fue slo de una unidad en el valor del ndice IBD. La principal fuente de error fue la incertidumbre en las identificaciones de las especies de los gneros Cocconeis y Achnanthes s.l. Posteriormente se realizaron ejercicios de intercalibracin, para los que se seleccionaron 9 estaciones de agua dulce entre las 13 estaciones de la Red Homognea de Medida de Escaut: - un inventario por estacin realizada en noviembre de 2000. - envo a siete operadores de Francia y Blgica de un juego de 9 preparaciones (1 por estacin). - identificacin al mnimo nivel taxonmico requerido para el ndice IBD. - recoleccin de datos y tratamiento de datos. Los resultados (Fig. 2) indican que en todos los casos todos los operadores dieron el mismo perfil para las estaciones, pero las diferencias en los valores asignados fueron en algunos casos importantes. La principal fuente de error fue la confusin en la identificacin taxonmica de los pequeos Achnanthes. El fitoplancton en el monitoreo de algas El Ministerio de Medioambiente y Desarrollo Sostenible reconoci seis grandes cuencas hidrolgicas (MEDD). Por el momento no existe una red nacional de monitoreo del fitoplancton y slo se han llevado a cabo unos cuantos estudios cualitativos o cuantitativos en algunas cuencas: estudio de la influencia de una central nuclear (R. Loire), estudios cientficos (Seine, Lot, Charentes) o estudios de impacto (R. Scarpe). En el ro Loira se ha estado realizando un control desde 1989 en un nmero variable de puntos segn los aos. Los muestreos han sido mensuales y bimensuales para analizar tanto variables qumicas, como hidrolgicas o biolgicas, con identificacin de organismos (a nivel genrico excepto en el caso de desarrollos masivos que fue especifica) y clculos de densidad segn el mtodo termohl. Este estudio permiti comprobar que existe una gran e impredecible variabilidad cuantitativa intra e interanual, adems de que los desarrollos masivos (blooms) varan tanto en composicin florstica como en el momento del ao para cada estacin. Normalmente en primavera proliferan las diatomeas mientras que los clorfitos lo hacen en verano. Existe un gradiente tanto en abundancia como en diversidad desde la cabecera hasta la desembocadura, con un mximo en el curso medio. No se han apreciado relaciones entre los mximos de pigmentos y las mximas densidades celulares.

Fig. 1. Regiones de diatomeas diferenciadas en Francia.

Los valores de IBD de referencia del lmite entre estaciones de calidad muy buena y calidad buena quedan recogidas en la tabla siguiente:
Lmite de estado muy bueno 18 14 16 13 17 Lmite del EQR buen estado 0,93 15 0,93 11 0,85 14 0,80 11 0,86 14

Regin de IBD de diatomeas referencia 1 2 3 4 5 19 16 18 16 19

EQR 0,71 0,67 0,69 0,67 0,64

Diversos proyectos han permitido evaluar las fuentes potenciales de error en las distintas etapas de clculo del ndice de diatomeas. En primer lugar se realiz un proyecto en el que participaron 24 representantes de la comunidad cientfica, consultoras ambientales y de administracin. Cada participante realiz 28 clculos de IBD a partir de preparaciones microscpicas elaboradas a partir de la misma muestra. Tanto la recoleccin como la preparacin

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin

20

18

IBD

16

14
R eference Sam ple 1 Sam ple 2 Sam ple 3

12

A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X

O perator
Fig. 2. Resultados de intercalibracin: diferencias en el anlisis de las muestras.

En el ro Loing (afluente del Sena) se realizan controles desde 1992 hasta la actualidad. De los seis puntos seleccionados, slo 3 han sido regularmente muestreados desde marzo a noviembre para analizar variables qumicas, hidrolgicas y biolgicas (tanto cualitativas al nivel ms bajo posible, como cuantitativas). Se apreciaron importantes variaciones cuantitativas en los mximos de dominancia entre los aos. En primavera, con niveles muy bajos de nitrato e indetectables de fosfato, se desarrollan las diatomeas. Los tramos de mayor diversidad pertenecen al curso bajo, mientras que en las partes altas puede desarrollarse Planktolyngbya agardhii en densidades importantes. En los ros Saar y Mosel (cuenca del Meuse), se estudiaron seis estaciones, tres por ro, desde 1997 hasta la actualidad, con muestreos bimensuales desde marzo hasta octubre, para anlisis qumicos, hidrolgicos y biolgicos (cualitativo hasta un nivel genrico excepto diatomeas y cuantitativo, mediante clases de abundancia y biovolmenes). Tambin se muestre el zooplancton. Se pudieron apreciar grandes diferencias en las densidades celulares. Mientras en el ro Saar dominan las diatomeas centrales al final de mayo y una comunidad de diatomeas centrales, clorfitos y cianobacterias al final de agosto, en el ro Mosel slo se detecta un pico de biomasa en mayo-junio debido a diatomeas centrales. No parece existir correlacin entre los biovolmenes y la densidad celular.

Adems se comprob una gran variabilidad espacial y temporal en los datos y que el zooplancton muy raramente limita el desarrollo del fitoplancton. En el ro Lot (Adour-Garonne), se seleccionaron 15 estaciones muestreadas en periodos de estiaje en 1991-1992, con el fin de determinar el valor del fitoplancton que permitiera elaborar un modelo de la eutrofizacin a lo largo del ro. Los organismos se determinaron hasta un nivel genrico, excepto los taxones dominantes, y se cuantificaron tantos las densidades celulares, como los pigmentos y los biovolmenes. El grupo dominante es el de los clorfitos y se pueden diferenciar tres zonas: una superior en la que el fitoplancton procede de grandes embalses, un tramo medio con varias presas que permiten el desarrollo del fitoplancton y un tramo bajo en el que con la turbidez y la profundidad disminuye la biomasa algal, aunque pueden producirse florescencias de cianofceas. Adems se encontraron correlaciones significativas entre la concentracin de clorofila a y los biovolmenes y la densidad celular. Como principales conclusiones se pudo indicar que el tiempo de residencia, la transparencia, la profundidad y los nutrientes son los principales factores que determinan las comunidades de algas fitoplanctnicas. En la cuenca de Artois-Picardie, existen un buen nmero de arroyos lentos y canalizados ricos en fitoplancton, en los que se hicieron diversos estudios:

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin - estudio del impacto de las florescencias de cianofceas en el embalse de Val Joly y su desarrollo en los ros de aguas abajo. Se comprob que 20 km aguas abajo desaparece el dominio de las cianobacterias en el ro pero permanecen en el canal del Sambre. - estudio del efecto de la construccin de una depuradora en el ro Scarpe. estudio de las comunidades fitoplanctnicas en algunas de las estaciones de la red de control nacional (incluidos ros canalizados), con un muestreo mensual desde marzo a octubre para recoger datos qumicos, biolgicos, con identificaciones al menos a un nivel genrico. A pesar de la elevada artificializacin y elevada carga de nutrientes las comunidades fitoplanctnicas son similares a las descritas en otros pases europeos y se pueden reconocer hasta tres tipos diferentes de arroyos basndose en ellas y con correlaciones altas con nutrientes (nitrgeno, fsforo y silicio) adems de la temperatura. Entre las conclusiones metodolgicas se pueden mencionar: que es suficiente con recolectar una nica muestra en el centro del cauce, justo bajo el nivel del agua, pero que es necesario muestrear siempre a las mismas horas en los mismos puntos para minimizar las variaciones diarias y que la periodicidad del muestreo debe ser al menos quincenal. Se comprobaron tambin las dificultades en la repetibilidad y la reproducibilidad, ya que se obtienen variaciones muy grandes en las densidades celulares (de hasta un 24%) tanto dentro del mismo laboratorio como entre laboratorios, aunque las diferencias son menores para el mismo laboratorio. Tambin se aprecian diferencias a un nivel cualitativo incluso a nivel genrico. Otras fuentes detectadas de error son: los protocolos de muestreo, errores de identificacin, la ausencia de floras de referencia, la presentacin de los resultados, el nivel de especializacin de los tcnicos o el tiempo dedicado a los anlisis Todos estos estudios permiten extraer como conclusiones que existe una gran variabilidad en los datos tanto de campo como de laboratorio en una escala espacial y temporal y que aparentemente otros factores como caudal, temperatura o herbvoros, por ejemplo, pueden tener tanta o ms influencia que los nutrientes en el desarrollo de las comunidades fitoplanctnicas. Adems se ha comprobado que existe, en general, una escasa correlacin entre las densidades celulares y a biomasa. ((Traduccin del original en francs de Marina Aboal.))

Figura 4. Estaciones para el estudio de fitoplancton en Artois-Picardie.

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin Use of algae for monitoring of rivers and some matters of special importance in Norway
Eli-Anne Lindstrm Norwegian Institute for Water Research Jean Norway Eli.lindstroem@niva.no

Norway has a unique variety and diversity in nature types connected to watercourses. More than 250,000 km of river stretches, with average annual discharge above 1 m3 s-1, is registered (Homstvedt et al., 1989). 42 watercourses have an annual average discharge above 50 m3 s-1, and the largest watercourse, Gloma, has a discharge of 625 m3 s-1. As a consequence, methods and standards for river monitoring have been developed during the past 30 years (Holtan & Rosland, 1992). Periphyton investigations are a component in many monitoring programs. One reason for this is the exceptionally good growth conditions for periphyton in Norway. Most rivers: + are fast flowing, this means: - that the river bed mainly consists of rocks, a suitable substrate for periphyton. - continuous flow and exchange of nutrients. - no accumulation of metabolic products around the algae. + carry small loads of particulate material: - particle scouring is moderate. - light conditions are good. + are located far north and/or in the mountains: - long days, in summer 24 h daylight. - no closed canopy. + carry water all year, this: - allows enough time for algal growth. - prevents drying out of algae. A brief presentation of the methods and the major categories of river algal studies used for monitoring in Norway are given below. A more detailed presentation is given in the proceedings from the second symposium on the use of algae for monitoring rivers (Lindstrm, 1996). In addition to the presentation of the regular monitoring programs, some matters that have invoked special attention in Norway are discussed. REGULAR MONITORING Methods Methods for river algal studies can be divided in three main categories. 1. Standard monitoring methods - based on the naturally occurring periphyton community - give a description of: species composition, species number and diversity, species frequency,

estimation of quantitative occurrence and in some cases index calculations. At present two versions of standard monitoring methods are carried out. + "Method A" is detailed and fairly time consuming (Lindstrm, 1991). Due to its simplicity and replicability, diatom analyses are increasingly emphasised in "Method A". + "Method B" is a simplified screening version. A draft of this method is given in Jarlman et al. (1996). 2. Transect analyses - are carried out to achieve reliable estimates of algal biomass from percent cover of periphyton. + Underwater photography is done within a frame to allow exact mapping of the river bed along well defined transects across the river. The slides are analysed under a stereoscopic microscope. + Estimation of percent cover of periphyton on the river bed is done along marked belt transects. As for the underwater photography it is done within a frame to delimit the observed area. 3. Nutrient diffusing artificial substrates - are used to study the potential for growth of algae and the factors that control primary production. To get comparable and reproducible estimates of periphyton biomass is another objective. + Heavy, bottom seated metal cages have been used. For detailed description see Lindstrm (1996). + Since the method was first published by Fairchild & Lowe (1984), nutrient diffusing clay flower pots have been used in several experiments to study the conditions for growth of attached algae in lakes. After two interesting experimental studies in lakes (Lindstrm, 1996, and unpublished data) clay flower pots were used in running water for the first time in Norway in 1997 (Hylland et. al., 1997). + Both methods/substrates seem to work according expectations, but they need some adjustments to withstand the substantial and unpredictable fluctuations in discharge that occur in running water. Categories of river algal studies A brief outline of the main categories of algal studies is given below. The methods used is given in brackets.

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin + Basic surveys (Detailed method "A" and Transect analyses). Basic surveys are carried out from time to time. Such surveys are not always part of regular monitoring programs. + General pollution - eutrophication and saprobication (Detailed method "A" and Screening method "B"). Eutrophication from domestic sewage, runoff from farming and other local pollution sources has decreased, but can still cause problems in small watercourses. For periphyton studies both detailed and screening standard methods are used. The screening method B was applied, when more than 100 small rivers (approximately 200 localities) in the county of Moere and Romsdal were investigated in 1992-94 (Lindstrm & Relling, 1994). Most of the rivers receive local pollution from farming, and they were classified from moderately to very strongly polluted according to the periphyton investigations. The investigations were repeated in 1996-97, after actions were taken to reduce the pollution. According to the preliminary results (not published), the screening method "B" provided sufficiently detailed information to distinguish minor changes in water quality. + Heavy metal pollution (Standard monitoring: A detailed method). The previous presentation of river algal studies (Lindstrm, 1996) described a program that monitors the impacts of heavy metal pollution in the watercourse Gaula in Norway. This program is still running. New studies were be carried out in 1998. The objective was to assess the degree of restoration of the aquatic ecosystems more than five years after actions were taken to reduce the metal pollution in 1990-91. Other programs that assess the impacts of heavy metal pollution on periphyton are also running (Grande et al., 1996). + Hydroelectric power plants (Detailed method "A" and Transect analyses). Quite a few of the numerous watercourses that were subject to hydroelectric development in the past, do call for regular monitoring. One reason for this is the build up of high biomass of aquatic macrophytes, mosses and algae after the development of the powerplant. The vegetation cover changes the food supply for invertebrates and affects their habitat. Spawning grounds that are practically inaccessible to fish, because they are completely covered by vegetation is another impact that causes substantial concern. Transect analyses and underwater photography has proven to be a reliable method to measure the long term development of this biomass (Johansen, 1997). + Long-term studies in Reference- and Researchcatchments (All types of methods). The first Reference- and Researchcatchment was established in 1985, the second in 1994. Long term studies were carried out there, with the main objective to obtain better knowledge on the short and long term variability in natural biological communities. Scientist from different fields were participating. The periphyton investigations emphasise routine studies of species composition, species number and diversity, combined with transect analysis to document long term changes in biomass (Lindstrm, 1989). Case studies were also carried out. One example of a case study is the field experiments to test and develop the use of nutrient diffusing substrates in routine monitoring (Lindstrm and Johansen, 1995). + Airborne pollution - acidification (All types of methods). Due to the hard inert bedrock and thin soil covering a large part of Norway, a large part of the watercourses have very little buffering capacity. As a consequence, long range transboundary pollution is a major problem in Norway. Although the deposition of sulphuric acid has decreased since 1990, the N load has increased (Semb, 1994). In the most affected areas, the annual deposition is more than 3 g N m-2 yr-1. This has caused substantial concern in respect to the possible effects on plant growth. From all over Norway reports of increased growth of algae in lakes and rivers have caused additional concern (Lindstrm, 1993). The potential impacts and problems of increased growth of mosses and algae are several: - Rivers "filled up" with algae are unpleasant. The reputation that Norway is a country with exceptionally clean watercourses can be severely affected and the recreational value will be reduced. - Increased periphyton growth causes problems for fishing. Fishnets catch algae and mosses instead of fish, and so do the anglers. Spawning grounds get completely overgrown and are no longer available for the fish. - The original biota will change and the biodiversity seems to be threatened. A rich flora of nitrogen-fixing cyanobacteria seems to be decreasing and substituted by a few types of filamentous green algae. + Liming biodiversity. Large-scale liming of acidified catchments has started in Norway. The aim is to counterbalance some of the most obvious negative effects of acidification; total loss of all fish populations from thousands of lakes and rivers. Preliminary studies indicate that liming have

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin several effects on the entire biology in freshwater. Therefore, a program that will evaluate the impacts of liming was initiated this year, with biodiversity as a particular focus of interest. The program will last for at least five years, and both short- and long-term effects of liming will be studied. All types of methods will probably be applied in the periphyton studies. Pollution problems of particular importance and actuality in Norway If one looks ahead for future challenges in the use of algae for monitoring rivers, it seems as if Norway has some special responsibilities and some special problems. One important challenge is the protection of the great variety of pristine river habitats fairly unaffected by pollution. This includes the protection of the habitat itself, the conservation of the water quality and the biota. The objectives are obvious. Alteration and destruction of habitats is reported to be the most frequent cause to loss of biodiversity (Redeka Fulda, 1997). Some type of monitoring must be applied to secure the protection of these habitats and the conservation of biodiversity. Due to the complexity of the ecosystems and the problems to identify some of the algae, it seems as if new methods and strategies must be developed to obtain effective monitoring of the biodiversity of algal communities. The establishment of reference catchments is one attempt to monitor biodiversity and to counteract the human impairment of the freshwater ecosystems. The first Reference- and Research-catchment was established in 1985, the second in 1994 (vstedal & Bradland, 1996). Long term studies were carried out, with the main objective to obtain better knowledge about the short and long term variability in natural biological communities. Periphyton studies have been carried out in the fist reference catchment, the river Atna, since 1986 (Lindstrm & Johansen, 1997; Lindstrm et al., 2004). Standard monitoring methods were combined with underwater photography and transect analyses to document amongst others, natural variability and long term changes in biomass. Due to extensive and effective efforts during the last thirty years, to counteract pollution from domestic sewage, industrial wastewater and runoff from farming, eutrophication and saprobication are no longer the major pollution problem in Norway. At present long range airborne pollution seems to have the most widespread and serious impact on the ecosystems in Norwegian watercourses. It is at least two reasons for this. Due to the hard inert bedrock that covers large parts of Norway, the majority of the watercourses have unusually soft water, with low conductivity and low nutrient content. They do also carry small loads of particulate matter. As a consequence they have low buffering capacity and are particularly vulnerable to acidification. They are also vulnerable to other pollutants, such as heavy metals and micropollutants. Deposition of airborne nitrogen oxides, ammonia and other nutrients are causing additional concern. The global transport of micropollutants to the arctic and polar regions by air is another reason for concern. Transport by air is a very effective way of transport, and micropollutants from Europe can be transported to the pristine watercourses in the arctic regions within a few days. The accumulation of these pollutants in the upper levels of the nutrient web is surprisingly high. As the first level in this web, the algae are of particular interest. Methods that are able to map the mechanisms of uptake and accumulation of micropollutants in algae in arctic regions are needed. Climate change should be mentioned as well. The primary producers should be the first organism group to react to environmental changes caused by climate change. Environmental conditions that are likely to change and to affect periphyton are: temperature, length of growth season, precipitation (quality, amount and runoff patterns), nutrient availability (generally higher runoff during winter), light (less snow cover, increased insulation, increased UV-radiation), changed competition conditions and PERIPHYTON USED FOR BIOMONITORING ADVANCES AND PROBLEMS Some comments seen from a Norwegian viewpoint Advances Periphyton is an extremely good indicator of water quality. The organisms live attached to the substratum. They are exposed to all types of events and cannot escape during unpleasant events. They have no roots, and cannot like the macrophytes, extract nutrients from the sediments. They are directly dependant on the water to extract nutrients, etc. Therefore, the periphyton community at a given site is a direct and integrated response to the water quality and to the other environmental conditions at that site. Periphyton communities do generally display high diversity and a large number of the organisms have different lifespan strategy (R- contra K-strategy). Several periphytic algae react to short events and appear /disappear within a few days (e.g. several diatoms). On the other hand; some red algae were re-found at the exact same location after more than

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin 60 years. Differences in lifespan-strategy enables monitoring of short events as well as slowly occurring changes. The high diversity allows for monitoring of all types of pollutants. Problems 1. Periphyton taxonomy is difficult (more difficult for some groups than for others). 2. Some periphyton groups have incomplete/unrevised taxonomic literature. 3. The expertise is limited, regarding taxonomy as well as general experience. 4. Some watercourses are only periodically suitable for periphyton monitoring because they dry out during the dry (summer) season. 5. Some rivers have a closed canopy of trees that prevents the light from penetrating to the river bed (few primary producers without light).

6. Some rivers are unsuitable because they carry large loads of particulate matter, that may prevent the primary producers from establishing due to limited light and particle scouring. 7. Slow flowing rivers with fine particulate matter in the river bed, may not have a sufficiently stable substratum to allow for the establishment and development of a diversified periphyton community. Point 1-3 implies for all areas and types of rivers. Point 4-7 implies for several rivers in Central Europe, an area that have very few rivers compared to some of the outskirt countries in Europe (e.g. Norway, Greece, and Rumania). Norway has a tremendous number of watercourses, but we seldom encounter the conditions outlined in point 4-7.

Phycological surveys and monitoring in Portugal a summary

Calado, A.J.; S.F.P. Almeida & S.C. Craveiro Department of Biology - University of Aveiro P-3810-193 Aveiro PORTUGAL acalado@bio.ua.pt

The monitorization of inland water bodies using freshwater algae, involving the regular identification of algal communities and the evaluation of their change over time, is an important tool for assessing the quality of aquatic formations and, to some extent, estimate the direction of future changes. Although the recent enforcement of more strict environmental regulations at the European level has led to an increasing involvement of official water agencies in biological monitoring, much of the generally available information about algal communities in Portuguese waters comes from time-limited scientific researches and is therefore very fragmentary. The following is an attempt to summarize community level phycological work that may be used for comparison with the present day situation in the studied areas. We excluded from this account all phycological studies not specifically centred around particular aquatic formations, such as reports of species new for Portugal and revisionary work focused on taxonomic groups. Undoubtedly, the list of included works will be found faulty for two main reasons: disagreement with our decisions about what to include; and the absence of works we overlooked.

Studies on reservoirs and lakes are often concerned with the plankton community, whereas in rivers the main phycological component is the periphyton, either collected from different substrates or from the water column as (false) plankton. As the methods involved in the two types of studies are different, works on predominantly lenthic habitats are grouped separately from works on running waters. Reservoirs and small lakes The earliest plankton studies that include the identification of algae from Portuguese reservoirs are those of Frade (1952, 1954, 1957) on the plankton of Castelo do Bode (River Zzere), which contain notes on the changes that this artificial lake imposed on the river communities. Most important in this early period was the work of Nauwerck (1962), a detailed taxonomic study of algae from 18 locations, including 13 reservoirs, widely distributed from northern Minho to southern Alentejo; although based on a single sample per site, the work included chemical data and the description and illustration of many species of algae, most of which reported for the first time in Portugal. Oliveira, under the name Moita (1976), published the first Portuguese

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin yearlong phytoplankton survey, based on monthly sampling in Roxo Reservoir (Roxo stream, a tributary of River Sado). This was followed by a number of phytoplankton surveys in reservoirs located in several water basins, involving qualitative and quantitative analyses of the algal species, sometimes including biomass estimation through the calculation of biovolumes; the community data was combined with physical and chemical parameters to assess the trophic status of the studied waterbodies (partly summarized in Oliveira, 1987). The reservoirs were, in the basin of River Cvado (Northern Portugal): Venda Nova, Alto Rabago and Salamonde (Oliveira, 1982a; 1985; Oliveira et al., 1985); in the northern part of River Tagus basin: Santa Luzia, Cabril, Bou, Pracana, Idanha, Castelo do Bode (Oliveira, 1982b, c; Cabeadas et al., 1980; Andrade et al., 1988); and south of River Tagus: Montargil, Monte da Rocha, Odivelas, Arade, Bravura, Santa Clara, Caia, Campilhas, Magos, Maranho, Pvoa e Meadas, Vale do Gaio, Roxo, Pgo do Altar, Divor and Mula (Oliveira, 1984a, b, c; Ferreira, 1987; Oliveira, 1987). Based on monthly surveys conducted between 1979 and 1981, Coutinho (1990) and Oliveira (1992) reported on phytoplankton dynamics and ecology in Montargil reservoir (River Sr) and in Santa Clara reservoir (River Mira), respectively. Brito & Andrade (1991) reported on water quality in Castelo do Bode and mnias based on phytoplankton observations ranging from 1980 to 1990, a work integrated in an international cooperative project on water monitoring systems. While in most of the studied situations the trophic state of the system was recognized as the main driving force for phytoplankton composition and dynamics, in some cases pollution with heavy metals was shown to have an effect. The contamination with Cu was examined in Venda Nova reservoir (Oliveira 1982a, 1985). The effect on phyto- and zooplankton composition of Cu, Cd and Zn introduced from abandoned mines in River Sado was studied by Monteiro et al. (1995), who documented shift toward resistant species in the most polluted areas. More recent information on the phytoplankton of reservoirs in River Douro and adjacent basins is found in Vasconcelos (1991; Azibo), Branco & Guimares (1991; Torro), Branco et al. (1991; Ermal and Andorinhas) and Galhano et al. (1991; Bemposta). An assessment of phytoplankton variations in the small reservoir at Coimbra (River Mondego), strongly conditioned by short retention times, was reported by Craveiro & Santos (1988, 1999). Published studies on algal communities in Portuguese small lakes are scarce. Calado et al. (1991) reported on the algal community in the species-rich Pateira de Fermentelos (River Crtima) in the winter of 1986. The spring-summer transition was followed in Lagoa das Braas, a shallow, eutrophic lake located in coastal sand dunes (Calado 1993). Santos et al. (1996) concentrated on silica-scaled chrysophyte variation in three organic-rich marshes in the lower Mondego area. Phytoplankton and eutrophication in the city lakes of Oporto were examined by Moreira et al. (2000). Cyanobacteria and cyanobacterial toxins In most studies conducted in reservoirs, estimates of phytoplankton biomass, either involving species identification or derived from chlorophyll measurements, was used to evaluate the trophic status of the system. Eutrophic and hypertrophic water masses are prone to develop nuisance blooms, which will often be dominated by cyanobacteria. Increased awareness of cyanobacterial toxins and their potential effects on water users led to numerous studies in rivers and reservoirs throughout the country, increasing our knowledge of the distribution and importance of toxic species. Most of the work combining cyanobacterial species distribution in Portugal with toxicity evaluation was started by Vasconcelos (1993, 1994, 1995). More recent works include diversity and toxicity studies in water treatment plants (Pereira et al. 2001; Vasconcelos & Pereira 2001) and the detection of cyanobacteriaderived paralytic toxins (PSP) in reservoirs (Ferreira et al. 2001). See Vasconcelos (2001) for an overview of previous work. The distribution and toxicity of the invasive species Cylindrospermopsis raciborskii was studied by Saker et al. (2003a, b). Running waters, periphyton and the application of biological indices Several Portuguese researchers have concentrated on algal communities in running waters, most often with the objective of estimating water quality through the application of biological indices. Although lists of river algae collected in the water as (pseudo-) plankton have often included different taxonomic groups, works centred on the periphyton were in most cases restricted to the diatoms. For many of these works the emphasis was on the calculation of biological indices based on diatom epilithic communities, which usually require the adoption of specific sampling procedures. Commonly used were the saprobic indices (not restricted to diatoms, but often calculated from the diatom community only; Zelinka & Marvan 1961; Sladecek 1973, 1986) and their adaptation by Leclercq & Maquet (1987;

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin diatoms only), the diatomological index of Coste (1986) and its derived Economic Community Index CEC (Descy & Coste 1991), and the diatomological index of Descy (1979), which developed into the Specific Polluosensitivity Index SPI (see Descy & Coste 1991). The first published survey of the algal community of a Portuguese river is that of Oliveira & Caldas (1970). This work, which included both algal and non-algal waterborne organisms of River Almonda, was later expanded to include also the species living on the bottom (Oliveira & Caldas 1971). In a pioneering study, Rino & Gil (1987) analysed epiphytic, epilithic and waterborne communities of diatoms from the whole length of River Crtima, collected in autumn 1985 and in spring 1986; using quantitative data (cells/ml) for diatoms in the water column, they compared the efficiency of a number of indices in displaying the widely different pollution levels encountered, and obtained more accurate results with saprobic indices complemented with diversity measures, than with the diatom indices available (see above). In an imposing volume, Gil (1988) presented the results of an extensive ecological study of diatom communities in three rivers of the Vouga basin (central Portugal). The work included the detailed comparison of communities attached to four different types of artificial substrata, which involved the absolute quantification of species in a huge number of samples; the degree of taxonomic discrimination was unprecedented in Portugal, and the mass of biological and chemical data was integrated in numerous multivariate analysis diagrams. Fragments of this work were published in Gil et al. (1990, 1991). Caldas (1988) used epipelic (muddwelling) diatoms for monitoring two localities in River Tagus. Works by Cerqueira da Silva (1989, 1990, 1991) and Fidalgo (1990) report on waterborne algae of localities in rivers Tagus, Lima, Ave and Vizela. Microscope glass slides were used in studies of periphytic algae and other protists in rivers Cvado, Paiva and ncora (Cerqueira da Silva 1992, 1994, 1996). The analysis of epilithic and waterborne communities of diatoms from 18 localities in the lower reaches of rivers in the Vouga basin (centralnorth Portugal), conducted over a year, extended our knowledge of diatom autoecology and allowed the comparison of attached and detached river communities (Almeida & Gil 1998, 1999, 2000). Calculation of diatom indices from these extensive data showed that CEC and SPI produced more adequate results than saprobity-based indices, which failed to reveal the differences in pollution levels observed. Although the relative adequacy of CEC and SPI for discriminating between pollution levels in the studied area reflected the general agreement between the ecological characteristics of local diatoms and those of the index databases, discrepancies were noted for some taxa, leading to the suggestion of corrections in sensivity and indicator values (Almeida & Gil 2001; Almeida 2002). Biological indices tailor-made for monitoring the IBD Based on the experience with routine biological monitoring, including diatom sampling and identification, a group of researchers in France developed a diatom index that aims to combine reliability with simplicity, thereby reducing the length of the training period required for its application by water agencies. It is called Indice Biologique Diatomes (IBD) and, although its basic philosophy is similar to other indices based on quantified autoecological characteristics, its simplification lies in the reduction of the number of relevant taxa (limited to 209), avoiding the need to discriminate between very similar forms (Prygiel & Coste 2000). For best results, the IBD should be based on uncontaminated epilithic diatom communities, and detailed instructions were given for the sampling procedures. The proposal of the IBD, now in routine use in France, prompted a number of studies to check its applicability in Portuguese waters under different conditions. One common problem in Portuguese lowland rivers is the scarcity of adequate rocky substrates, leading to the replacement of epilithic by other benthic communities, which may, or may not, produce adequate results with the IBD. Ferreira et al. (2002) studied the effects of the effluent from a paper mill on periphytic diatoms developing on plastic artificial substrates placed upstream and downstream of the discharge point. The results were surprising, with the most polluted site showing the highest Shannon-Wiener diversity of diatoms. The results of the IBD were no better, with the highest (best) value obtained for the most affected section of the river (Craveiro et al. 2003). Absolute quantitative analysis revealed a much smaller number of frustules attached to the substrate in the most polluted area than in sections not affected by the effluent. However, only relative abundances of taxa are used in the calculation of current diatom indices, including the IBD, which are therefore vulnerable to similar situations. In a study of diatom communities differently affected by organic pollution in River Pavia, the IBD showed optimistic results, underestimating pollution levels in the most affected localities, whereas the SPI realistically

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin revealed bad water quality (Castro et al. 2003; Castro 2004). Nunes et al. (2003a) applied the IBD and SPI to diatom communities from streams affected by abandoned mines in the basins of rivers Mau and Caima; despite the contamination of stream sediments with Pb, Cd, Zn and Ni, both indices indicated medium to good water. However, heavy metal stress was indicated by valve deformations in some diatom species and by geochemical indices, suggesting the need to combine different approaches to discriminate between pollution levels (Nunes et al. 2003b). Ongoing work In response to European legislation, the Portuguese Water Institute (INAG), which holds the responsibility for the management of water resources, is now taking biological monitoring into its own hands, through collaborative projects with researchers in several universities. The first large scale test of the IBD in Portugal, involving samples from 58 places in northern rivers, gave promising results (Almeida et al. 2003), although the limits of applicability of the index still need clarification (see above). A larger project led by INAG is currently underway, involving partners from six Portuguese universities. Biological communities, including fishes, macroinvertebrates, diatoms and macrophytes, are being studied in rivers throughout the country to establish reference conditions and to determine the boundaries of classes of quality. Although the analysis of algal communities is still not legally required, some of the regional agencies under INAG have started regular phytoplankton sampling, especially in reservoirs, and performing quantification of cyanobacterial toxins when the plankton composition justifies it. Data on diatom ecology with regard to organic pollution are currently being added to an open database originally built by Calado (1990). The potential of this information as a tool for water quality estimation, entirely based of data from Portugal and therefore uninfluenced by other databases, is being evaluated.
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Muestreo del fitobentos en ros, lagos y humedales: requisitos y recomendaciones para la Directiva Marco del Agua, con especial enfoque a los trabajos desarrollados sobre diatomeas en la Cuenca del Duero

Sal Blanco1,2, Luc Ector2 y Eloy Bcares1 1: rea de Ecologa - Universidad de Len 24071-LEN degsbl@unileon.es 2: Centre de Recherche Public-Gabriel Lippmann, CREBS, 41 rue du Brill; L-4422 Belvaux LUXEMBOURG ector@lippmann.lu

Introduccin El empleo de algas (especialmente diatomeas) como indicadores ecolgicos de la

calidad del agua est suscitando desde hace varias dcadas un creciente inters por estos organismos en todo el mundo.

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin Decenas de estudios en Europa avalan la eficacia de los ndices biolgicos basados en diatomeas y en otras algas para el control del estado ecolgico del agua, fundamentalmente en medios lticos (Descy, 1976; Lange-Bertalot, 1979; Round, 1991; Whitton et al., 1991; Eloranta, 1995; 1999; Whitton & Rott, 1996; DellUomo et al., 1999; Prygiel et al., 1999b; Rott et al., 2003). Dentro de los ndices diatomolgicos, los ms empleados hasta ahora en Europa (Ector & Rimet, 2005) son el ndice de Poluosensibilidad Especfica (IPS, Coste en CEMAGREF, 1982) en Austria, Blgica, Eslovaquia, Espaa, Finlandia, Francia, Grecia, Hungra, Inglaterra, Italia, Luxemburgo, Portugal, Polonia, Suecia, Suiza, etc.; el ndice CEE en Andorra, Blgica, Espaa, Finlandia, Francia, Grecia, Hungra, Luxemburgo, Portugal; el ndice Biolgico de Diatomeas (IBD, Lenoir & Coste, 1996; AFNOR, 2000) en Francia, Luxemburgo, Hungra, Espaa y Portugal; los ndices saprbicos y trficos de Rott (Rott et al., 1997; 1999) en Austria; y el ndice de eutrofizacin/polucin de DellUomo (DellUomo, 2004) en Italia. En el mbito de la Unin Europea, la Directiva Marco del Agua DMA- (Parlamento Europeo, Consejo de la Unin Europea, 2000) contempla el uso de bioindicadores basados en fitobentos para la determinacin de la calidad ecolgica de las masas de agua epicontinentales con respecto a determinadas condiciones de referencia. La aplicacin de esta Directiva en Espaa ha llevado a diversos grupos de investigacin al muestreo sistemtico de varias cuencas hidrogrficas y al establecimiento en ellas de redes de biomonitorizacin basados en el empleo de ndices diatomolgicos. Las diatomeas epilticas en los ros de varias cuencas y regiones hidrogrficas ya han sido muestreadas en la Pennsula Ibrica (p. ej. Aragn en 2002-2003, Catalua en 2002-2003, Duero en 2004, Ebro en 2002-2003, Galicia-costa en 2003, Guadalquivir en 2004, Jcar en 2000, Norte en 2003-2004, Pas Vasco en 2003-2004, Portugal en 2004) As, durante los ltimos aos han surgido varios trabajos publicados sobre las comunidades de diatomeas bentnicas y su empleo como bioindicadores, principalmente en ros del norte de Espaa (Toms & Sabater, 1985; Sabater et al., 1987; 1996; 2003; Merino et al., 1994; 1995; Leira & Sabater, 2002; 2005; Cambra et al., 2003; Gom et al., 2004; 2005) y tambin en Portugal (Almeida et al., 1999; Almeida & Gil, 1998; 2000; 2001; Nunes et al., 2003). El empleo de indicadores especficos para sistemas lenticos, sin embargo, no est tan desarrollado en Espaa, aunque la relacin entre las comunidades de diatomeas perifticas y los parmetros ambientales en estos ecosistemas est demostrada (Hawes & Smith, 1993; Hoffman, 1994; Mayer & Galatowitsch, 1999; Blanco et al., 2003; Kitner & Poulckov, 2003). Dentro de este tipo de sistemas, destacan las lagunas someras y los humedales por su abundancia y diversidad en toda la meseta ibrica. Se trata de zonas de gran riqueza biolgica que, sin embargo, han sido escasamente estudiadas y no gozan de estados de conservacin adecuados. La necesidad de desarrollar bioindicadores especficos para estos ecosistemas es evidente. Muestreo de diatomeas bntnicas en los ros de la cuenca del Duero La Confederacin Hidrogrfica del Duero, en colaboracin con el rea de Ecologa de la Universidad de Len y el Centro Pblico de Investigacin Gabriel Lippmann de Luxemburgo, comenz en 2004 el establecimiento de una red de biomonitorizacin de la calidad del agua en los cursos fluviales de la cuenca del ro Duero mediante el uso de ndices diatomolgicos. En verano de este ao se efectu un primer muestreo preliminar sobre 140 puntos seleccionados a partir de las estaciones de la Red Integral de la Calidad de las Aguas (ICA), a fin de conocer mejor las comunidades de diatomeas de los ros de la cuenca del Duero y de poder comparar los resultados obtenidos mediante los ndices biolgicos con el registro de parmetros fisicoqumicos de estas estaciones. La metodologa empleada para el muestreo de comunidades de diatomeas epilticas de ros fue la estandarizada en diversas normativas de Francia y de la Unin Europea (AFNOR, 2000; 2003; European Committee for Standarization, 2003; 2004). La recogida, procesado y anlisis sistemtico de diatomeas bentnicas para la determinacin de la calidad del agua se discute ampliamente en Kelly et al. (1998). El resultado final conduce al clculo de varios ndices diatomolgicos, habitualmente mediante el programa OMNIDIA (Lecointe et al., 1993; 1999), originando un valor numrico que expresa la calidad general del agua en ese punto con respecto a los valores extremos que puede adoptar tericamente cada ndice. Los ndices se someten peridicamente a ensayos de intercalibracin (Prygel et al., 1999a; 2002) a fin de ajustar su valor indicador. La aplicacin de esta metodologa general requiere en la prctica de una adaptacin a las peculiaridades de cada sistema hidrogrfico. Los cursos fluviales de la cuenca del Duero, la ms extensa de la Pennsula Ibrica, son muy diversos desde el punto de vista hidrogeolgico, asentndose sobre sustratos de muy variada naturaleza. Adicionalmente, la mayora de los ros en esta regin estn regulados artificialmente, lo

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin cual supone una alteracin muy significativa en su hidrodinamismo natural que es necesario tener en cuenta al planificar las campaas de muestreo. El protocolo de muestreo exige considerar preferentemente tramos con corriente, ya que las muestras recogidas en zonas lenticas y semilenticas, o situadas ro abajo de los embalses, contienen frecuentemente especies planctnicas o clulas muertas procedentes de cursos superiores que no se corresponden con la comunidad de diatomeas caracterstica de ese punto. Algunas estaciones de la red ICA, no obstante, se asientan sobre tramos de escasa o nula corriente, en las proximidades de presas y azudes, lo que obliga frecuentemente a buscar zonas anejas ms propicias para poder realizar el muestreo segn las normas europeas, pero lo suficientemente prximas como para mantener la representatividad de los datos fisicoqumicos recogidos por la estacin. No obstante, siempre se efecta adems una medicin in situ de los principales parmetros (pH, O2 disuelto, temperatura y conductividad especifica) para caracterizar especficamente cada punto de muestreo. La mayor parte de la cuenca del Duero se sita dentro de la regin climtica mediterrnea, lo cual condiciona el rgimen hidrolgico de sus cauces fluviales en funcin de la distribucin estacional de las precipitaciones caracterstica de este clima. Las normativas proponen realizar los muestreos en el momento en el que los potenciales contaminantes se encuentren ms concentrados, siendo la poca estival aquella en la que usualmente los caudales de los ros no regulados son mnimos. Sin embargo, es frecuente encontrar en esta poca cauces secos o con un canal de estiaje cuyas dimensiones no son representativas de todo el lecho fluvial. An en el caso de hallar un caudal suficiente, es necesario tener en cuenta que el sustrato a muestrear ha de haber permanecido sumergido durante las ltimas cuatro semanas, condicin que no resulta fcil hallar en aos especialmente ridos. La heterogeneidad de sustratos inertes disponibles para la toma de muestras puede suponer un inconveniente adicional. La disponibilidad de piedras y rocas en determinados tramos puede ser nula o en todo caso insuficiente como para considerarse representativa del ambiente muestreado. Esta situacin es particularmente frecuente en ciertos cauces de la margen izquierda del ro Duero, que discurren por terrenos arenosos y limosos. Para estos casos, se recomienda muestrear sobre superficies duras verticales, tales como diques o pilares de puentes, o bien sobre macrfitos sumergidos. En cualquier caso, conviene evitar muestrear sobre comunidades epiplicas o epipsmmicas. Por ltimo, es necesario resaltar la considerable diversidad litolgica de los lechos fluviales muestreados (calcreos, silceos, margosos); sin embargo esta heterogeneidad no parece afectar el resultado de los ndices diatomolgicos ms usuales (Kelly et al., 1998). Muestreo de algas epifticas en sistemas lenticos de la Submeseta Norte El rea de Ecologa de la Universidad de Len est llevando a cabo actualmente diversos proyectos de investigacin sobre lagos y lagunas someras de la depresin del Duero, ecosistemas caracterizados por una notable diversidad florstica y faunstica, actualmente bajo diversas figuras de proteccin. Uno de los objetivos de estos estudios es el desarrollo de bioindicadores especficos para evaluar su estado ecolgico. Durante los veranos de 2003 y 2004 se llevaron a cabo sendas campaas de muestreo en una treintena de lagunas someras de Castilla y Len. Se realiz un anlisis detallado de los parmetros fisicoqumicos del agua y se recogieron muestras de toda la comunidad biolgica presente, incluyendo algas fitoplanctnicas y epifticas, tanto sobre vegetacin emergente como sumergida. Para ello se utilizaron muestreadores Kornijow (Kornijow & Kairesalo, 1994; Kornijow, 1998), que han demostrado su eficacia en el muestreo de fauna asociada a plantas. Los resultados preliminares (Blanco et al., en prep.) ponen de manifiesto la importancia de la comunidad periftica en el conjunto de la biocenosis lacustre y su influencia en el desarrollo de la vegetacin acutica. En Espaa, diversos estudios recientes han mostrado la potencialidad de las diatomeas como indicadoras del estado ecolgico en ambientes lacustres, tanto en humedales costeros (Trobajo, 2003) como en lagos de montaa (Linares, 2003) y lagunas someras (Blanco et al., 2004). El muestreo de diatomeas perifticas en sistemas lenticos someros necesita sin embargo una previa estandardizacin de los mtodos de recogida de muestras al nivel europeo y de la Pennsula Ibrica, ya que el epiliton est generalmente ausente. Las comunidades epifticas, por su parte, pueden verse condicionadas por la naturaleza de las distintas especies de plantas hospedadoras superficies colonizables, efectos alelopticos diferenciales (Cattaneo & Kalff, 1980; Blindow, 1987) - especialmente en lagos oligotrficos (Eminson & Moss, 1980). No obstante, Blanco et al. (2004) concluyen que los tallos de los macrfitos emergentes (helfitos como Typha sp., Scirpus sp., Phragmites sp., etc.) son el sustrato ms adecuado para estudios de biomonitorizacin, en base a una

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin serie de ventajas que presentan con respecto a otros posibles sustratos: - Son plantas comnmente distribuidas y presentes bajo un amplio espectro de condiciones ambientales, lo cual permite la obtencin de resultados comparables y reproducibles en todo Europa. - Presentan superficies verticales que minimizan la acumulacin de clulas muertas. Adems, su arquitectura es sencilla, posibilitando la medida directa de la superficie muestreada y por lo tanto estudios cuantitativos (p. ej. de productividad). - La comunidad epiftica no se altera significativamente en funcin del estado fenolgico de estas plantas (Caput & PlenkovicMoraj, 2000), y su composicin se relaciona estrechamente con las caractersticas ambientales del medio (Lakatos, 1989; cs et al., 1994) ms que con las de la planta sustrato (Cattaneo et al., 1998). - Estudios comparativos (Hoffman, 1994; Lenoir & Coste, 1994) no han encontrado diferencias significativas utilizando ndices diatomolgicos a partir de comunidades epilticas y epifticas. En comparacin con los resultados obtenidos en ros, los trabajos realizados hasta el momento en la meseta Norte demuestran que las diatomeas epifticas son mejores indicadores de la calidad del agua en lagos someros y humedales (Blanco et al., 2004) que los macroinvertebrados bentnicos (Garca-Criado et al., 2005). Conclusin y recomendaciones La implementacin de las redes de biomonitorizacin de la calidad del agua mediante diatomeas en los sistemas fluviales espaoles est an en su fase inicial. Los estudios realizados hasta ahora han demostrado, en trminos generales, la aplicabilidad en nuestras aguas de los ndices diatomolgicos diseados inicialmente para ros centroeuropeos. Sin embargo, como hemos sealado, es necesario tener en cuenta las peculiaridades de cada cuenca a la hora de disear una metodologa de muestreo especfica. En cualquier caso, es esencial seguir en la medida de lo posible los protocolos normalizados de muestreo si se desean obtener resultados comparables a nivel de la Unin Europea. A este respecto, se debe hacer un nfasis especial en la importancia que tiene la fase de recogida de muestras. Es necesario estudiar en cada estacin el comportamiento del curso de agua y la morfologa del cauce para seleccionar el punto de muestreo ptimo, recogiendo en l una cantidad de muestra que sea representativa de la comunidad presente. Como consecuencia de estos estudios, se estn completando los inventarios taxonmicos de diatomeas para las distintas cuencas, en las que se estn describiendo decenas de nuevas especies para la ficoflora ibrica (Gom et al., 2004; Monnier et al., 2004) con respecto al catlogo existente (Aboal et al., 2003), lo cual tiene de por s gran inters a nivel florstico y tambin biogeogrfico. Paralelamente a los trabajos ecolgicos, no hay que olvidar los anlisis puramente taxonmicos necesarios para contribuir a la estabilidad nomenclatorial y a estudios de biodiversidad. En este sentido, es recomendable la creacin de ficotecas de referencia, iconografas y bases de datos estandarizadas que permitan avanzar sistemticamente en el estudio de cada cuenca. Igualmente, la elaboracin por expertos de guas metodolgicas con la descripcin de las principales especies caractersticas de las distintas grandes cuencas hidrogrficas sera de gran ayuda para la formacin de personal tcnico en el anlisis de muestras, as como la organizacin de cursos anuales de formacin a la taxonoma y ecologa de las diatomeas y de ejercicios de intercalibracin al nivel regional, estatal y europeo. La DMA establece igualmente la necesidad de definir diferentes ecorregiones y tipologas de ros dentro de cada una de las cuencas fluviales mediante una relacin de parmetros fsicos (geologa, altitud, etc.). En la actualidad, los trabajos prioritarios deben orientarse a la definicin, dentro de cada ecorregin y tipo fluvial, de las condiciones de referencia respecto de las cuales evaluar la calidad del agua (Nijboer et al., 2004; Moog et al., 2004), como desviacin respecto al estado de alta calidad. Esta desviacin se mide a travs de un Cociente de Calidad Ecolgica (EQR) entre el estado actual de la masa de agua y su estado ptimo o de referencia. Las condiciones de referencia se corresponden con las de una masa de agua donde los impactos antropognicos son mnimos o nulos (Ector & Rimet, 2005), y representan el estado ecolgico ptimo de cada ecorregin. Con respecto a los sistemas lenticos, parece claro que las diatomeas deben ser incluidas como una de las comunidades prioritarias en el establecimiento de su calidad, pudiendo ayudar a dirimir los importantes problemas encontrados con otras comunidades citadas en la Directiva Marco del Agua. Sin embargo an son necesarios ms estudios sobre la ecologa de las diatomeas en estos sistemas. Especial atencin requiere el anlisis de las interacciones perifiton-sustrato y perifiton-fitoplancton, as como la determinacin precisa de los rangos autoecolgicos de las principales especies, fundamento de todos los ndices diatomolgicos. Los estudios pueden hacerse extensivos hacia otros ambientes acuticos poco conocidos, como el fitoplancton fluvial, las charcas efmeras o las turberas.

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin En conclusin, es evidente que los estudios de bioindicacin sern uno de los objetivos prioritarios de la presente generacin de alglogos en toda Europa. Los resultados cientficos futuros y, en definitiva, la conservacin y proteccin de los diversos ambientes acuticos, depender en gran medida de nuestra capacidad actual de elaborar un trabajo sistemtico y estandarizado en el mbito de cada cuenca hidrogrfica, de toda la Pennsula Ibrica y tambin en cada una de las grandes ecorregiones definidas en Europa.
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La Directiva Marco del Agua y las diatomeas como indicadoras de los humedales mediterrneos
Rosa Trobajo Pujades Natural History Museum Cromwell Road. London SW7 5BD UNITED KINGDOM manolito

La Directiva Marco del Agua (Directiva Europea 2000/60/EC) aprobada por la Unin Europea en el 2000 establece el marco comunitario de actuacin en el mbito de poltica de aguas y tiene como objetivo prioritario el que se alcance el buen estado ecolgico de los sistemas acuticos (aguas superficiales, estuarios, aguas costeras y aguas subterrneas) en el ao 2015. Especficamente la DMA pide un uso racional de los recursos hdricos y la conservacin, proteccin y mejora de la calidad de los sistemas acuticos. Desde el punto de vista de procedimientos, la DMA requiere la tipificacin de las masas de agua continentales, as como el establecimiento de las condiciones de referencia para cada tipologa de masa de agua, basadas en indicadores hidromorfolgicos, fsicos, qumicos y biolgicos y la evaluacin del estado actual de conservacin de las masas de agua utilizando dichos indicadores. Es importante destacar que la DMA es la primera normativa en gestin del agua que incluye los conceptos de estado ecolgico y estado de referencia de los sistemas acuticos. Puntos de partida interesantes pero que a su vez requieren de un buen conocimiento del funcionamiento de los ecosistemas acuticos. Los sistemas acuticos fluctuantes y de transicin (donde se incluyen los humedales costeros, estuarios, ramblas y marjales) se caracterizan por un gran dinamismo, elevada interaccin entre parmetros e intercambio de

materia y energa con los sistemas adyacentes (terrestre y acuticos), siendo precisamente esta complejidad en el funcionamiento lo que dificulta su estudio y tipificacin pero que a su vez tambin supone un reto. Algunas de las caractersticas de estos sistemas, como la baja profundidad y confinamiento, los hace especialmente vulnerables a la eutrofizacin y a la contaminacin qumica siendo difcil encontrar humedales costeros prstinos en Europa. Concretamente y durante siglos los humedales mediterrneos han estado sometidos a intensas explotaciones y manipulaciones por parte del hombre, y en la mayora de los casos describir las condiciones de estos ambientes para posteriormente definir su estado ecolgico es muy difcil sino imposible (Barnes, 1999). Quizs tendremos que aceptar que en estos sistemas no hay ambientes de referencia a priori y que como proponen Boix et al. (2004), solamente se podrn identificar a posteriori, una vez hecho el estudio exhaustivo de la calidad de los humedales mediterrneos. La utilizacin de indicadores biolgicos para evaluar la calidad de las aguas ha sido especialmente estudiada en los ecosistemas lacustres y fluviales. La utilizacin de ndices biolgicos basados en algas es particularmente adecuada en sistemas acuticos con gran varibilidad de carga o flujo de nutrientes (Whitton,

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin 1999) siendo ste el caso de muchos de los humedales mediterrneos (Quintana et al., 1998). Entre los diferentes grupos taxonmicos que forman las comunidades algales presentes en los sistemas acuticos, las diatomeas juegan generalmente siempre un papel importante, ya sea a nivel cuantitativo (en trminos de abundacia de especies) y/o a nivel cualitativo (en trminos de produccim) (Round, 1981; Sullivan, 1999). Las diatomeas son excelentes indicadoras ambientales (Margalef, 1955; Patrick, 1973; Coste, 1976; LangeBertalot, 1979; Kobayasi & Mayama, 1982; Fabri & Leclerq, 1986; Sabater et al., 1988; Rott, 1991; Kelly et al., 1995; Stevenson & Pan, 1999; Sullivan & Currin, 2000) ya que debido a su pequeo tamao (micras) y a su elevada taxa de reproduccin (algunas especies pueden presentar hasta 2 o 3 divisiones al da) las comunidades de diatomeas responden rpida y sensiblemente a cambios fsicos, qumicos y biolgicos que se producen en su entorno. Adems, el hecho de que vivan en casi la totalidad de los sistemas acuticos, que sean de fcil recoleccin y que los elementos estructurales de su esqueleto de silicio permitan su determinacin a nivel de especie con gran exactitud, son otras de las caractersticas de las diatomeas que facilitan su uso indicador. En Europa existen actualmente ms de 20 mtodos diferentes que evalan la calidad de las aguas de los ros basndose en la comunidad de diatomeas bentnicas, si bien estos mtodos han tenido que ser adaptados de acuerdo con el pas (segn reas geogrficas y climticas), en algunos pases como Reino Unido, Francia y Alemania se utilizan ya de forma rutinaria en el seguimiento de la calidad de las aguas fluviales (Prygiel et al., 1997). En cambio, no existe ningn ndice de diatomeas para evaluar la calidad de los humedales mediterrneos a pesar de que la importancia ecolgica y econmica de estos ambientes haya sido puesta de manifiesto (Ramade, 1990; Britton & Crivelli, 1993; Pearce & Crivelli, 1994) y que su conservacin haya sido reconocida como una prioridad a travs de convenciones (eg. Ramsar convention) e iniciativas (eg. Mediterranean Wetland Initiative MedWed-). En el caso concreto de Espaa, son muy escasos los estudios (ya sea utilizando las algas u otro tipo de organismo) encaminados a la evaluacin de la calidad de las aguas de los humedales en general y mediterrneos en particular. Sin embargo, ya existen estudios del funcionamiento de estos sistemas y a pesar de que actualmente no existe ninguna flora de diatomeas de los humedales mediterrneos, s existen trabajos puntuales acerca de las diatomeas de diferentes reas del mediterrneo espaol (Aboal, 1986; 1988; Aboal et al., 1996; Cambra, 1986; Cambra et al., 1988; Cantoral & Aboal, en prensa; Clavero-Oms, 2004; Clavero-Oms et al., 2000; Margalef, 1951; 1952; 1953; 1954; Margalef & Mir, 1973; Miracle et al., 1984; Romo & Miracle, 1994; Sabater et al., 1990; Salvat, 1997; Snchez-Castillo, 1987; 1993; Toms, 1988; Trobajo, 2003; 2004a y b) aunque estos trabajos todava son pocos sobre todo comparados con los estudios existentes de agua dulce (Sullivan, 1999; Underwood & Provot, 2000; Trobajo et al., 2004a). Sera pues quizs el momento de entender los humedales mediterrneos en su totalidad y de recopilar y ampliar la informacin de la que se dispone para poder obtener una base de datos slida a partir de la cual se pudiera elaborar un ndice que evale la calidad de la diversidad de ambientes acuticos presentes en ellos, ndice que sera nuevo en Espaa pero tambin en Europa. El camino por recorrer no es poco, todava hay bastantes zonas del mediterrneo espaol donde no se conoce la flora de diatomeas ni las especies representativas de estos ambientes y faltan todava estudios (de campo pero tambin experimentales) sobre los requerimientos de estas especies. Porque es el conocimiento de las especies de diatomeas representantes de los humedales mediterrneos as como de su ecologa (requerimientos de las especies y factores que afectan a las asociaciones) los requisitos previos e indispensables para su utilizacin como indicadoras del estado ecolgico de estos ambientes.
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Protocolo para la evaluacin de la calidad biolgica de los ros mediante las diatomeas. Aplicacin de la Directiva Marco en poltica de aguas de la Unin Europea (2000/60/EU)
Departamento de Medioambiente Generalitat de Catalua

Este protocolo est basado en las normas y prenormas europeas publicadas por la Comisin Europea de Normalizacin: Norma CEN/TC 230 prEN 13946 y prenorma prEN 14407 (2002) 1. PROTOCOLO DE MUESTREO Y TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS DE DIATOMEAS EPILTICAS DE LOS ROS.

Nota: si no se dispone de centrfuga se puede dejar sedimentar la muestra durante una noche, eliminando el sobrenadante con cuidado posteriormente. 1.2. Reactivos. 1.2.1. Fijadores. No es necesario el empleo de fijadores si las muestras se van a procesar de forma inmediata, siempre que se conserven a baja temperatura (4C) y en la oscuridad. - El lugol es adecuado para conservar durante periodos de tiempo cortos. Se recomienda formaldehido tamponado o etanol para periodos largos. Un mtodo alternativo es la ultracongelacin. - Solucin tamponada de glutaraldehido (HCHO) al 4% v/v. Diluir una solucin stock al 4% de formaldehido en una solucin tamponada a pH 7. Entre los tampones ms adecuados estn el HEPES (N-2- Hidroximetilpiperazina-n-2-cido sulfnico), borato y hexametil-tetramina. Se recomienda una solucin entre el 1,1 y el 4% v/v (la cantidad necesaria depender de la cantidad de materia orgnica presente en la muestra). Nota: el tampn es necesario para evitar la disolucin de los frstulos. -Etanol al 70% (C2H5OH). 1.2.2. Reactivos para la limpieza de diatomeas. - Solucin de perxido de hidrgeno (H2O2) al 30% (100 volmenes). - cido clorhdrico diluido 1M (HCl). - cido sulfrico concentrado (H2 SO4). - Permanganato potsico (KMnO4) en cristales. - cido oxlico saturado (H2C2O4).

1.1. Material. 1.1.1. Material de muestreo. - Equipo apropiado resistente al agua. - Botas de pescador. - Cepillo de dientes duros (o instrumento similar) o navaja (otra hoja adecuada). - Botes de muestreo con tapa hermtica. - Bolgrafo o rotulador permanente (o cualquier otro mtodo de rotulacin). Si se utilizan etiquetas, stas deben ser resistentes a las condiciones de humedad. - Raspador de mango largo con una red fina adherida para muestrear superficies duras verticales. - Caja con fondo de cristal (Aquascope) para la bsqueda de substratos idneos. 1.1.2. Material de laboratorio. - Campana extractora o sistema equivalente. - Placa calefactora, bao de arena o bao de agua. - Vasos de precipitados y tubos de ebullicin (uno por muestra). - Medios para medir volmenes de 20 ml de agentes oxidantes. - Pipetas Pasteur limpias. - Centrfuga (opcional). - Tubos de centrfuga resistentes a los agentes oxidantes utilizados para la limpieza de las diatomeas (opcional).

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin 1.2.3. Reactivos para la elaboracin de preparaciones permanentes. Se requiere un medio de montaje con un ndice de refraccin superior a 1,6. Las marcas registradas son NAPHRAX e HYDRAX. -en general las muestras deben ser recolectadas en la corriente principal de la zona de muestreo. Se deben evitar las zonas de corriente lenta, ya que permiten la concentracin de limos y detritus y la prdida de diatomeas epilticas. Es preciso eliminar cualquier tipo de contaminacin presente limpiando las piedras a muestrear en la zona de corriente mxima, lavar el bote en el que se ha de introducir la muestra con el agua del ro (repitiendo el proceso tres veces). Llenar el bote con 50 ml de agua del ro. Limpiar el cepillo de muestreo con agua limpia contra una superficie dura para minimizar las contaminaciones. Raspar las piedras para recoger la pelcula de diatomeas con ayuda del cepillo, que se lavar peridicamente en el bote de muestreo. El contenido final debera ser turbio y de color pardo. Si en el substrato hay algas filamentosas debern retirarse tantos filamentos como sea posible antes de proceder al raspado. En la medida de lo posible es conveniente evitar este tipo de substrato. En cada bote de muestra deben rotularse los detalles precisos para su identificacin: cdigo de la muestra, fecha de recoleccin, nombre del ro y nombre del municipio. El transporte de las muestras al laboratorio debe hacerse en un lugar fresco y oscuro. Si las muestras no van a ser transportadas al laboratorio antes de 24 horas es necesario fijarlas en el campo, siempre que no exista alguna razn que impida la utilizacin de fijadores en el campo. En todas las muestras debe indicarse el fijador utilizado. 1.4.2. Superficies verticales de infraestructuras. Este tipo de muestreo es a menudo necesario en las tierras bajas y en los ros navegables. Se recomienda muestrear a una profundidad de 30 cm. La manga de muestreo debe agitarse en el agua del ro para liberar cualquier material enganchado antes de proceder al raspado. Debe rasparse una superficie equivalente a 10 cm2. La manga debe lavarse en un contenedor con agua del ro. Debe repetirse la operacin tres veces y juntar las tres rplicas. 1.4.3. Utilizacin de substratos artificiales. Es recomendable utilizar substratos con superficies heterogneas y no superficies lisas (portaobjetos de vidrio). Deben mantenerse en el ro el tiempo suficiente para que se establezca una comunidad madura (al menos 4 semanas), aunque el periodo depender de las condiciones ambientales. El tiempo de exposicin deber ser ms largo por ejemplo en condiciones muy oligotrficas, bajas temperaturas o sombreado excesivo. Deben tomarse las precauciones precisas para evitar interferir con los usos normales del ro y para evitar, en lo posible, el vandalismo. Es

1.3. Procedimiento. 1.3.1. Seleccin de substrato. El substrato ideal son las piedras de las zonas sumergidas del lecho el ro, ya que son un substrato duro que puede ser extrado del ro para realizar el muestreo. En ausencia de este tipo de substrato se pueden utilizar estructuras realizadas por el hombre tales como pilares de puentes (siempre que no sean de madera) u otras, siempre que permanezcan sumergidas el tiempo suficiente (un mnimo de 4 semanas, aunque puede variar segn las condiciones). En ros profundos o con ausencia de substratos lticos se pueden introducir substratos artificiales. Tambin es posible muestrear macrfitos sumergidos aunque es necesario muestrear siempre la misma especie o el mismo tipo morfolgico si se quieren hacer estudios comparativos entre ros. 1.4. Seleccin del punto de muestreo. Por regla general debe tener unos 10 m de largo, aunque longitudes mayores pueden ser ms adecuadas dependiendo de la uniformidad fsica del medio y de la disponibilidad de substratos. Debe hacerse una descripcin detallada del punto de muestreo: localizacin, anchura, profundidad, tipo de substratos, presencia y abundancia de macrfitos sombra y otras caractersticas ecolgicas. Tambin se recomienda realizar alguna foto. En cada visita conviene apuntar todas las variaciones observadas as como todas las incidencia en el muestreo. 1.4. Metodologa de la recogida de muestras. 1.4.1. Superficies duras y naturales mviles. Como mnimo se debe muestrear cinco piedras, cinco rocas pequeas o cantos. Como mnimo debe muestrearse 10 cm2. En caso que no sea posible debe anotarse la razn. Entre las condiciones de microhbitat se sealan: -deben evitarse zonas muy sombredas o demasiado prximas a la orilla. -el substrato debe estar sumergido el tiempo suficiente, como ya se ha comentado anteriormente (al menos 4 semanas). La profundidad no es importante siempre que permanezca en la zona iluminada y que la superficie no haya estado expuesta al aire. Ser posible muestrear en todas las profundidades con unas buenas botas de pescador.

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin conveniente tambin colocar algunos substratos extra para compensar las posibles prdidas por vandalismo, crecidas, etc. Cuando se empleen substratos artificiales deben colocarse siempre en las mismas condiciones, en la misma fecha y durante el mismo periodo de tiempo. 1.4.4. Macrfitos y macroalgas sumergidas. Recolectar cinco rplicas de la planta en bolsas de plstico y transportarlas al laboratorio, agitarlas violentamente en un vaso de precipitados con agua destilada para soltar las diatomeas adheridas. Retirar las plantas, dejar que sedimenten las diatomeas. Eliminar el sobrenadante. Alternativamente se pueden cortar de forma aleatoria algunos tallos de las plantas sumergidas, colocndolos en botes de muestreo. Los fragmentos se pueden seccionar ms en el laboratorio, colocndolos directamente en los tubos de limpieza para proceder a la eliminacin de la materia orgnica. Las algas filamentosas se pueden escurrir, recogiendo la suspensin resultante, que contendr las diatomeas epfitas, en un bote. 1.4.5. Macrfitos emergidos. Este tipo de substrato slo debe ser muestreado si hay porciones que estn permanentemente sumergidas y no estn contaminadas con el sedimento del fondo. Los tallos deben cortarse al nivel del agua. Colocar un bote de muestreo boca abajo en los tallos cortados y cortar hasta la boca del bote. Despus girar el bote con el tallo dentro y cerrar. En el laboratorio liberar las diatomeas agitando o raspando con cuidado. 1.5. Pretratamiento previo a la observacin microscpica. 1.5.1.1. Fijacin y tratamiento preliminar en el laboratorio. Las muestras se deben transportar en oscuridad y a baja temperatura al laboratorio, dejndolas reposar 24 horas como mnimo para permitir que las diatomeas sedimenten y poder eliminar el sobrenadante. Como alternativa se puede centrifugar la muestra. Para eliminar los restos grandes de substrato o de plantas se puede utilizar primero un colador de cocina. La velocidad y el tiempo de sedimentacin de todas las diatomeas (incluidas las formas ms pequeas) depender de las caractersticas de la centrfuga utilizada. Es conveniente hacer alguna prueba previamente para estar seguros de no eliminar las diatomeas de menor tamao. Si no se aadi fijador en el campo debe hacerse ahora. Es recomendable realizar una observacin preliminar de la muestra y anotar cualquier caracterstica observada, por ejemplo, la abundancia de frstulos vacos. Siempre debe guardarse una parte de la muestra para el caso de que pueda ocurrir cualquier incidencia durante el proceso. 1.5.1.2. Mtodos de limpieza de diatomeas. El perxido de hidrgeno es el oxidante ms utilizado y el ms recomendado, pero otros mtodos pueden dar buenos resultados (Anexo A). En aguas ricas en carbonatos o en hierro es recomendable utilizar clorhdrico diluido (HCl). 1.5.1.3. Montaje de las preparaciones permanentes. Diluir la suspensin de frstulos limpios para conseguir una concentracin adecuada. Deben verse partculas finas en suspensin. Si la suspensin est ms concentrada se puede diluir con agua destilada. La densidad puede comprobarse haciendo una preparacin microscpica y observndola a x400. Si la suspensin est muy diluida puede concentrarse centrifugando. Nota: la dilucin de la suspensin tambin se puede realizar con etanol, lo que facilita la dispersin homognea sobre el cubreobjetos. Agitar el vial que contiene las diatomeas limpias. Utilizando una pipeta Pasteur limpia tomar una parte del lquido de la parte central del tubo. Depositar una gota o dos en un cubreobjetos redondo. Dejar que se evapore el lquido, dejndolo en un sitio caliente protegindolo del polvo, o calentndola suavemente en una placa calefactora. El resultado final debe ser una fina capa de color gris sobre el cubreobjetos. Seguir las instrucciones del fabricante en la utilizacin del medio de montaje. Una de las resinas ms utilizadas es NAPHRAX. Asegurarse de que el medio alcanza los bordes del cubreobjetos. Dejar enfriar y observar al microscopio. La concentracin ideal es aquella con la que se observan 10-15 valvas por campo x1000. Si la preparacin es muy densa se debe repetir con una suspensin ms diluida. Finalmente debe etiquetarse la preparacin. Debe consignarse la localizacin, la fecha y cualquier cdigo necesario que permita acceder al resto de la informacin necesaria. 2. PROTOCOLOS DE IDENTIFICACIN, RECUENTO E INTERPRETACIN DE MUESTRAS DE DIATOMEAS EPILTICAS DE ROS. 2.1. Requerimientos. - Equipo para registrar los recuentos de diatomeas: puede ser un formulario con una lista de taxones o

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin un programa de ordenador preparado para la introduccin directa de datos. - Guas de identificacin e iconografa: adecuadas al mbito de la zona de estudio. - Microscopio ptico: equipado con una platina mecnica y objetivos de gran aumento y de inmersin. Se recomienda el contraste de fases o el contraste interdiferencial. El microscopio debe estar preparado para hacer medidas (ocular micromtrico), con una resolucin de 1 micrmetro como mnimo. Los equipos de captura de imagen pueden ayudar a registrar las especies difciles y en la medida de la densidad de estras. - Medios para verificar las especies difciles. Se puede hacer de varias maneras: con dibujos, microfotografas de alta resolucin, imgenes capturadas mediante video. Es tambin muy til localizar el taxn en la preparacin utilizando la escala Vernier del microscopio. - Pauelo para limpiar las lentes. - Aceite de inmersin y aplicador. - Portaobjetos con escala micromtrica para calibrar el ocular micromtrico. 2.2. Criterios taxonmicos. Recientes debates sobre los fundamentos taxonmicos de las diatomeas han provocado la coexistencia de dos sistemas paralelos de nomenclatura. Es importante, cuando se utilizan las diatomeas para valorar la calidad del agua, realizar una identificacin correcta eliminando la posibilidad de cualquier error. La mayora de los ndices de calidad requieren una identificacin a nivel especfico, aunque algunos pueden utilizar el nivel genrico o una mezcla de ambos niveles. Es recomendable utilizar la nomenclatura de la flora del rea de estudio, aunque tambin se pueden utilizar las checklist nacionales o regionales. Cuando los convenios taxonmicos del ndice difieren de los de la checklist, los del ndice deben adaptarse. La nomenclatura definitiva a utilizar deber ser establecida al comienzo del trabajo. Deben citarse siempre los autores para evitar problemas de confusin nomenclatural. 2.3. Determinacin de los individuos para el recuento. Existen diferentes criterios para el recuento de las diatomeas, como utilizar la valva o el frstulo como individuo, o bien no distinguir entre valva y frstulo. El efecto que estos criterios puedan tener en el resultado final no ha sido evaluado pero los expertos creen que debe ser pequeo. No obstante, es importante que los criterios se clarifiquen por adelantado. En el caso de gneros como Navicula o Achnanthes no es posible distinguir con certeza entre frstulos y valvas aisladas en todas las ocasiones. 2.4. Determinacin del tamao de la muestra. Una medida tpica es contar entre 300 y 500 individuos, aunque dependiendo de los objetivos se pueden contar ms o menos. Valores menores podran carecer del rigor estadstico necesario para algunas aplicaciones. Debe indicarse por adelantado el nmero mnimo y mximo de individuos a contar de acuerdo con los objetivos de nuestro estudio. Pueden darse situaciones en las que la muestra est dominada por un taxn cosmopolita o por uno que no est incluido en el ndice utilizado. En estos casos slo los taxones que son relevantes para el ndices contarn en el total establecido de individuos a contar. Sin embargo, los taxones no incluidos tambin deben contarse ya que pueden contribuir a aportar informacin til para interpretar los resultados de los ndices. 2.5. Preparacin del microscopio. El ocular micromtrico, o cualquier otro aparato de medida debe calibrarse regularmente con ayuda de un porta con escala micromtrica. Una resolucin de un micrmetro es adecuada para los anlisis rutinarios. El segundo ocular puede estar equipado con una cuadrcula para ayudar en el recuento, que puede tener diferentes formas pero lo importante es que permita impedir contar dos veces el mismo individuo. Hay diferentes opciones para contar: hacer transectos con desplazamientos horizontales o verticales en los que cada diatomea que pasa por una lnea de la cuadrcula del ocular es identificada y contada. - identificar y contar todas las diatomeas visibles en un campo de visin y despus desplazarse con un movimiento horizontal o vertical, o al azar, a un nuevo campo de visin. - se pueden utilizar los mtodos al mismo tiempo para obtener el nmero preciso. En todos los casos se debe repetir el proceso hasta que se obtenga el nmero necesario para completar el recuento. El operador debe establecer criterios propios para definir situaciones en las que una diatomea no est completa en el campo de visin. Es importante seguir el mismo criterio, sea el que sea, en todo el recuento. Es importante que los campos de visin de los diferentes transectos no se solapen en ningn caso. Si un recuento no se acaba en una misma sesin, es til anotar la posicin de cada eje utilizando la escala de Vernier, para asegurarse de

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin no repetir el recuento en campos ya observados. Nota: se deben tomar precauciones cuando se utilizan diferentes microscopios, ya que las escalas de Vernier pueden ser diferentes. 2.6. Tratamientos de los frstulos rotos y las diatomeas no identificadas. Para evitar el riesgo de incluir fragmentos separados de valvas, debe decidirse el criterio a utilizar antes de iniciar el trabajo. Posible criterios: - incluir un individuo roto slo si incluye aproximadamente 1/4 de la valva. - incluir un individuo si contiene al menos un extremo y la parte central de la valva. - excluir todos los individuos rotos. Nota 1: el segundo criterio es difcil de aplicar en los casos en que la especie no tiene un rea central diferenciada. En este caso no se puede asumir que el nmero total de individuos es igual al nmero de extremos dividido por dos. Nota 2: la presencia de un nmero elevado de fragmentos puede indicar el arrastre de diatomeas de aguas arriba. Una diatomea puede ser no identificable por varias razones: que la diatomea est en posicin pleural, la imposibilidad de una visin clara o que se trate de un taxn desconocido para el identificador. Si hay un exceso de suciedad que oculta las valvas, es conveniente repetir la preparacin utilizando suspensiones ms diluidas para separar las diatomeas de la suciedad. Algunos taxones son identificables incluso en posicin pleural porque incluso en esta posicin tienen una visin caracterstica (Rhoicosphenia abbreviata). No obstante, esto no siempre es posible y en caso de duda se deben contar las visiones pleurales al nivel ms bajo posible (p.ej. Gomphonema o diatomea pennada en visin pleural). Este mismo criterio debe emplearse para cualquier otro individuo de la preparacin que no pueda ser identificado. La existencia de un nmero elevado de individuos no identificados puede ser debida a un problema con la preparacin o a los conocimientos del operador. La resolucin a adoptar depender del mtodo de evaluacin propuesto. Algunos ndices no precisan la identificacin de todos los taxones. Se recomienda que el nmero de taxones no identificados no supere el 12% del total contado. 2.6. Procedimientos analticos. a) Colocar la preparacin en la platina del microscopio y anotar la informacin ms importante en la hoja de recuento o el programa de ordenador. La informacin mnima recomendada es: nmero de muestra, nombre del ro, localidad y fecha de muestreo, fecha del recuento y analista. b) Seleccionar una buena posicin de la preparacin para comenzar. Se recomienda el margen, pero hay que asegurarse de que no existe efecto margen significativo (no hay una concentracin de individuos mayor en el margen que en cualquier otro punto de la preparacin). Nota 1: Si el recuento se hace por campos aleatorios, stos se deben localizar utilizando las escala de Vernier y una lista de nmeros generados aleatoriamente. c) Identificar todos los individuos presentes en el primer campo de visin utilizando un objetivo de gran aumento. Utilizar el mecanismo de enfoque para diferenciar entre una valva y un frstulo intacto. Si la unidad bsica es la valva, un frstulo son dos unidades. Nota 2: Un frstulo intacto tiene dos planos de enfoque donde las estras, el rafe y otras estructuras son claramente visibles. Debe utilizarse con cuidado el mecanismo de enfoque para observar la diferencia. Adems un frstulo intacto tiene propiedades pticas diferentes de una valva sola. Nota 3: si se encuentran diatomeas formando filamentos cada individuo debe ser contado por separado. Si el nmero de filamentos observados es elevado sera conveniente repetir la preparacin con agentes oxidantes ms agresivos. d) Si un individuo no se puede identificar deben tomarse fotografas, imgenes digitales o dibujos detallados. Debe describirse el taxn: forma y dimensiones de la diatomea, densidad de las estras, forma y medida del rea central, nmero y posicin de los estigmas y detalles de la terminacin de la rafe. e) Una vez que han sido identificados y contados todos los individuos de un campo, el recuento debe continuar hasta obtener el nmero de individuos preciso. f) En algunos casos puede interesar continuar el recuento y la identificacin de individuos despus de obtener el nmero requerido y considerar los restantes taxones como presentes. Hacer un recorrido con un objetivo mediano (x 400) puede permitir observar los taxones grandes (Gyrosigma) que pueden obviarse con aumentos mayores. g) Al final del recuento debe quitarse la preparacin de la platina y limpiar el aceite de inmersin del objetivo y de la preparacin. h) En los casos en que hay una especie muy abundante, una vez finalizado el recuento, calcular la proporcin de la especie dominante y continuar contando teniendo en cuenta todos los taxones menos el dominante. Continuar contando hasta volver a llegar al cmputo mximo sumando todos los taxones a excepcin del dominante. Despus se recalcula el valor del taxn dominante en funcin de la proporcin calculada inicialmente.

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin Nota 4: Por ejemplo si Cocconeis placentula representa 200 unidades de un total de 300, habra que utilizar el procedimiento comentado anteriormente, continuando el recuento de los otros taxones hasta llegar a un total de 300 y despus incrementar el valor de Cocconeis placentula con un factor de 3 con el objetivo de reflejar su abundancia real en la muestra. 2.7. Registro de datos, preparaciones y muestras. Las preparaciones de diatomeas se pueden guardar permanentemente, lo que permite revisar los resultados en el futuro. Por eso, es importante conservar las preparaciones de forma correcta, por ejemplo en algn herbario. Las preparaciones deben estar etiquetadas con un cdigo que permita identificarlas inequvocamente en una base de datos que contenga otros datos de la localidad: coordenadas geogrficas, datos qumicos, hidrolgicos... La suspensin de frstulos limpios tambin se debe etiquetar y guardar para permitir hacer nuevas preparaciones en caso necesario. Para prevenir el crecimiento microbiano o la disolucin qumica de los frstulos debe utilizarse un fijador como etanol o formol. Se recomienda tambin conservar las muestras fijadas por si fuese necesaria alguna comprobacin. 2.8. Interpretacin de los datos. 2.8.1. Utilizacin de ndices. La mayor parte de los ndices se basan en la abundancia relativa de los taxones presentes en la muestra. Muchos de ellos se han desarrollado para su uso en un rea concreta, pero comprobaciones posteriores han mostrado que algunos tienen una validez ms amplia. Antes de utilizar cualquier ndice es recomendable hacer una evaluacin previa del mismo. Los ndices no sirven para evaluar cualquier algunos tipos concretos de contaminacin (metales pesados). 2.8.2. Comparacin con las condiciones de referencia. Para evaluar el grado de la alteracin ambiental de un lugar es preciso compararlo con los datos de referencia. Los datos de referencia representan la comunidad natural esperada en el lugar en ausencia de alteraciones antrpicas significativas. De momento no se ha desarrollado ningn mtodo para efectuar la evaluacin con diatomeas bentnicas. 3. Obtencin de resultados y adaptacin a los ros catalanes. Introducir los datos en el programa OMNIDIA para obtener los valores de los ndices que calcula el programa, siguiendo las instrucciones del programa para su utilizacin. De todos los ndices que proporciona el programa se toma el ndice IPS como indicador de la calidad biolgica del agua en los ros catalanes. Este ndice vara del 1 al 20, siendo 1 el valor que indica la peor calidad y 20 la mejor. El rango de valores se divide en cinco categoras no equivalentes:
Color Calidad Valor ndice Muy buena 20= 17? Buena 17>13? Mediocre 13>9? Mala 9>5? Muy mala 5<?

Es preciso ajustar el valor del ndice en algunas ecorregiones: - en las cabeceras calcreas el valor ms alto que se puede alcanzar es de 18. El rango entonces ira de 17 a 18 (calidad excelente). El resto de categoras quedara igual. - el valor mximo que alcanza el ndice en tramos medios de ros grandes es 18. El rango en estos casos tambin oscilara de 17 a 18, como en el caso anterior. El resto de las categoras quedara igual. - en los tramos bajos el valor mximo alcanzado es de 13. Se dispone de pocos puntos situados en estos tramos por lo que es ms difcil reescalar el ndice. 4. Frecuencia del seguimiento. Se recomienda una frecuencia de un mnimo de dos muestreos anuales: uno en la poca de mnimo caudal y otro en primavera. Para las estaciones de referencia se propone un nico muestreo anual. ((Original cataln facilitado por Jaume Cambra. Traduccin del original cataln de M. Aboal))

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Metodologa para el estudio taxonmico y ecolgico del fitoplancton de las aguas continentales
Pedro Snchez Castillo Departamento de Botnica Facultad de Ciencias Universidad de Granada 18071 GRANADA psanchez@ugr.es

Los resultados obtenidos en cualquier estudio dependen, en buena medida, de una correcta aplicacin metodolgica. En esta nota tratamos de repasar todos los procesos de manipulacin que realizamos sobre las muestras de fitoplancton, desde su recoleccin en el sistema acutico, hasta la obtencin del listado de organismos con sus datos poblacionales, destacando aquellas secuencias del proceso que, a nuestro juicio, pueden ser fuente de algunos errores. Obtencin de las muestras El grado de exactitud que obtengamos en el conocimiento del sistema depender de la planificacin de la campaa de recogida de muestras. Si bien tradicionalmente se ha asumido la homogeneidad del fitoplancton de los ambientes continentales, no toda la masa de agua presenta las mismas caractersticas fsicas ni qumicas, por lo tanto sus poblaciones de algas pueden variar. Un primer paso importante es planificar el muestreo. Se tratar de localizar, en nuestro sistema, las principales fuentes de variacin que produzcan algn tipo de heterogeneidad que puedan afectar a la distribucin de las poblaciones: - La heterogeneidad horizontal es especialmente patente en aquellos sistemas que presenten flujo de agua (embalses y lagos abiertos), donde se debern tomar, al menos dos muestras, una prxima a la zona de aguas estancadas y otra prxima a la zona de entrada. Amplias zonas litorales con y sin vegetacin, tipo de sustrato, influencia de actividades antrpicas, etc, tambin pueden contribuir a la heterogeneidad de la masa de agua. - La heterogeneidad vertical es especialmente patente en aquellos sistemas profundos y estratificados, en los cuales se debern tomar muestras de superficie, y a distintos niveles de extincin de la luz. En cada punto de muestreo se pueden obtener dos tipos de muestras: - Muestras directas.- Se obtendrn sin alterar la concentracin y proporciones celulares presentes en el medio. Los recuentos celulares se llevarn a cabo sobre muestras directas o de sedimentacin,

las cuales se recogern bien con botellas especficas para este fin (van Dorn, Niskin, etc.) o bien mediante bomba peristltica. Las muestras obtenidas se guardarn en frascos de cristal (nunca de plstico) de color topacio y de una capacidad prxima a los 100 ml. Siempre que sea posible se conservaran en fro hasta su fijacin. - Muestras de arrastre.- Se tomarn mediante redes de fitoplancton, las cuales debern ser de un tamao de poro comprendido entre 10 y 25 m. En aguas oligotrficas, generalmente pobladas por especies pequeas, se utilizarn redes de 10 m, mientras en aquellas eutrficas (aguas verdes, pardas o marrones) se debern utilizar redes de mayor dimetro de poro para evitar su rpida obturacin. Dependiendo de los objetivos de nuestro trabajo, los arrastres podrn ser horizontales y/o verticales. Fijacin de las muestras Se llevar a cabo de forma inmediata, tras la recoleccin del material. La fijacin de las muestras debe perseguir dos objetivos, por una parte una correcta conservacin y por otra parte resaltar (o no ocultar) aquellos caracteres taxonmicos que nos permitan el reconocimiento de los organismos. Las muestras de arrastre se fijarn con formaldehido (hasta una concentracin final prxima al 4%.). Es recomendable calcular la cantidad de fijador a aadir para evitar un exceso del mismo, ya que es txico y de penetrante olor (muy molesto cuando se manipula la muestra en laboratorio). Las muestras de sedimentacin se deben fijar con una solucin de yodo iodurado (lugol), al igual que en caso anterior es recomendable cuantificar la cantidad a aadir para evitar un exceso de coloracin de las clulas. Una mezcla de lugol ( 2 ml) y formaldehido ( 0.5 ml) suele realizar una adecuada fijacin para el reconocimiento estructural, estas muestras se deben guardar en fro y revisar su fijacin peridicamente. Determinacin taxonmica La determinacin taxonmica debe ser previa al proceso de censo de las algas fitoplanctnicas. Para llevar a cabo la

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin determinacin se usarn las floras generales de mayor difusin, bien a nivel genrico (Bourrelly, 1966-1970; Margalef, 1957; Wehr & Sheath, 2003) o especfico (Ettl, 1985-2005; Huber-Pestalozzi, 19321983) as como aquellas monografas que faciliten la ms adecuada determinacin especfica o genrica (dependiendo de nuestros objetivos). Para determinar las especies presentes se utilizarn tanto las muestras de sedimentacin como los arrastres horizontales y/o verticales. Adems de la observacin de los caracteres taxonmicos es preciso realizar una adecuada cuantificacin biomtrica, la cual se deber llevar a cabo sobre 2030 individuos. Cuando la distancia al laboratorio lo permita, se mantendr una muestra viva para su observacin in vivo. La observacin de los organismos vivos (especialmente su coloracin) puede resolver muchas dudas taxonmicas (y ofrecernos momentos de gran fascinacin). Determinados grupos de algas precisan de un tratamiento especfico para la observacin de los caracteres taxonmicos, como son las diatomeas. Se trata de realizar una combustin de la muestra con un agente oxidante, tras la cual se llevar a cabo una centrifugacin y posterior montaje en resina de alto ndice de refraccin. Es conveniente realizar tratamientos individualizados de las diferentes muestras donde observemos diatomeas, lo que nos permitir comprobar la existencia de una o varias especies, casi imposibles de diferenciar en muestras de sedimentacin. Sedimentacin y recuento de las muestras Se llevar a cabo en microscopio invertido mediante el uso de cmaras compuestas de Utermhl (base con cubreobjetos enroscable y columna desmontable), cuyo volumen depender del grado de concentracin celular de la muestra, desde 2,5 ml hasta 100 ml. En ambientes fuertemente hipertrficos se proceder a una dilucin de la muestra o a la utilizacin de hematocitmetros. El tiempo de sedimentacin estar en relacin con la altura de la columna, establecindose como regla general un tiempo (en horas) equivalente a tres veces la altura de la cmara (en centmetros). Nos debemos asegurar que la superficie sobre la que se sita la muestra no est inclinada, ya que la inclinacin producira una sedimentacin sesgada. Cuando existan especies formadoras de flores de agua, las muestras se sometern a una pequea presin (en el interior de una jeringa del volumen adecuado) para facilitar el colapso de las vacuolas de gas, posibilitando de este modo su sedimentacin y observacin. Una vez transcurrido el tiempo adecuado se realizar el recuento celular que nos permitir calcular el censo de las diferentes poblaciones. La enumeracin de las clulas se puede llevar a cabo mediante el recuento total de la cmara o mediante mtodos ms rpidos (seleccionando parte de ella: campos al azar o transectos). En cualquier caso, este proceso se llevar a cabo teniendo en cuenta una serie de precauciones, las cuales evitarn algunos errores en la estimacin de las poblaciones: - Efecto de los bordes.- La distribucin celular en la mayor parte del fondo de la placa se realiza al azar, a excepcin de los mrgenes donde se manifiesta el denominado efecto de los bordes, que consiste en un incremento del proceso de sedimentacin debido a la proximidad de las paredes. - Recuentos diferenciales.- Sobre la superficie de la placa se deben hacer al menos dos recuentos diferentes. Uno se realizar para contar los organismos de mayor tamao (claramente diferenciables con los objetivos de menor tamao: 4x 10x). El otro se realizar para cuantificar aquellos otros de menor tamao, no claramente discernibles a pocos aumentos, cuya enumeracin se realizar con el objetivo 40x 100x, dependiendo de sus tamaos. - Contabilizacin de especies multicelulares (tricomas, cenobios, colonias).- Adems de conocer el nmero de agrupaciones, es de inters saber que nmero de clulas las forman, por lo que junto a cada individuo contabilizado anotaremos el nmero de clulas que lo componen. - Recuento de la especie ms abundante.- Para que el error estadstico sea asumible se ha de contar entre 100 y 400 individuos de la especie ms abundante. Clculo de los resultados Para llevar a cabo el censo de cada una de las especies detectadas (campos al azar), podemos utilizar la siguiente expresin:
N de clulas/ml = N de clulas x Superficie de la cmara N de campos x Superficie del campo x Vol. muestra

Si deseamos expresar nuestros resultados teniendo en cuenta el tamao de los individuos censados, el mtodo de clculo ms utilizado es aproximar la forma de la clula a un cuerpo geomtrico. Cuando la forma celular es relativamente compleja podemos utilizar la combinacin de varios cuerpos geomtricos. Por el mismo mtodo podemos calcular otros parmetros de inters ecolgico y que tambin pueden tener una aproximacin geomtrica como son la superficie celular y la relacin superficie/volumen. A partir de los biovolmenes individuales se puede obtener un dato de gran inters ecolgico, el biovolumen densidad (BD):

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BD = Volumen medio celular x densidad celular

Su expresin como biomasa responde a la consideracin de que la densidad fsica de las clulas de las microalgas es prxima a 1, por lo que ambos trminos seran equivalentes. Conservacin de las muestras en ficoteca El sedimento contado, junto al resto de la muestra no utilizada, se podr volver a fijar con formol y guardar en un tubo de ensayo (de vidrio) de pequeo tamao (~ 10 ml). Se taponar y sellar con cinta aislante y una vez etiquetado y/o numerado pasar a formar parte de nuestra coleccin de muestras. Esta ficoteca, adems de constituir una base cientfica de gran inters, es un instrumento de consulta para la resolucin de problemas que se presenten en futuras determinaciones. Del mismo modo, todas aquellas preparaciones permanentes, sobre todo las de diatomeas, se debern conservar con la misma finalidad que la antes comentadas para las muestras lquidas. Cada centro de investigacin en ficologa o limnologa debera conservar sus muestras en ficoteca, ya que esta constituye el registro cientfico de sus datos publicados, adems de ser fuente de consulta en trabajos taxonmicos de mbito ms general. APNDICE TAXONMICO Las diferentes especies que forman parte del fitoplancton se pueden englobar en tres tipos biolgicos claramente diferenciados: cocales, flagelados y filamentosos. Diferentes grupos taxonmicos han desarrollado especies que responden al mismo tipo biolgico. A continuacin se ofrece una clave bsica para la diferenciacin de los distintos grupos taxonmicos de mayor representacin en el fitoplancton. Cuando se alude a coloracin, siempre se refiere a la coloracin en muestras fijadas con lugol. I. Algas filamentosas. - Filamentos formados por clulas de pequeo tamao, donde es imposible diferenciar el cromatoplasma, o bien clulas de mayor tamao con clara estructura procariota.Oscilatoriales y Nostocales (Cyanoprokaryota) - Filamentos eucariotas, con clara diferenciacin de orgnulos: Filamentos formados por clulas que no presentan una patente tincin con el lugol. Clulas unidas por sus pices o por sus lados o por sus vrtices................Diatomeas Filamentos con clulas claramente teidas por el lugol, dando una coloracin claramente marrn.......................Ulotricales

II. Algas flageladas, generalmente con envoltura celular delgada o estrangulacin transversal patente. En ocasiones los flagelos desaparecen con la fijacin, entonces envoltura celular, heteropolaridad y vacuolas son importantes caracteres diagnsticos: - Clulas con estrangulacin transversal (cngulo), sulcus menos patente, pared celular rgida (teca) o no. Coloracin rojiza o marrn.................Dinofceas - Clulas de morfologa piriforme, globosa, elipsoidal o irregular, presentando 1, 2 4 flagelos: Clulas irregulares, lenticulares con estriacin manifiesta, o rodeadas por una lrica no transparente. Un flagelo y citoplasma de color rojizo, con grnulos (paramilon) diferenciados.....Euglenofceas Clulas de morfologa ms o menos regular, redondeadas o elipsoidales: Clulas poco teidas (amarillentas), tincin nunca de color marrn intenso: Flagelos en nmero de (1 ) 2 de diferente tamao. A veces cubiertas por lricas transparentes y en ocasiones formando agrupaciones..................Crisofceas Flagelos en nmero de 2, del mismo tamao, con una estructura filiforme (haptonema), recta o enrollada, situada entre los dos flagelos...........................Haptofceas Clulas fuertemente teidas, de color marrn intenso: Clulas elipsoidales, con 2 flagelos casi iguales y de insercin subapical. Citoplasma o pirenoide fuertemente teido.......Criptofceas Clulas de morfologa variable (globosa, discoidal, elipsoidal, piriforme o fusiforme), 2 4 flagelos de insercin apical. Aisladas o en agrupaciones: Clulas con 2 flagelos dispuestos a partir del pice o de una papila. Clulas aisladas o en agrupaciones.......Volvocales Clulas con 1 ( 2) flagelos, si son 4 se desarrollan a partir de una depresin apical.................Prasinofceas

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin III. Algas cocales, bien aisladas o bien formando agrupaciones de morfologa relativamente sencilla, a veces con vainas o paredes maternales dilatadas: - Cromatoplasma homogneo o nicamente interrumpido por inclusiones o vacuolas de gas, tincin variable. Clulas aisladas o formando agrupaciones de diferente morfologa.............Croococcales (Cyanoprokaryota) - Cloroplastos claramente diferenciados, uno o varios por clula. Pirenoides ausentes o presentes: Clulas poco teidas, pirenoides ausentes o poco teidos: Pared bivalva, valvas persistentes tras la muerte de la clula. Visiones valvar y comisural diferenciadas...................Diatomeas Pared celular normal, inclusiones lipdicas, formas pedunculadas frecuentes.......................Xantofceas Clulas fuertemente teidas, pared celular bien estructurada: Clulas sin divisin interna, reproduccin mediante autosporas o biparticin....................Clorofceas Clulas divididas en semiclulas simtricas (hemisomas), prolongaciones celulares frecuentes, reproduccin por biparticin........................Zigofceas
Bibliografa Alveal, K.; M.E. Ferrario; E.C. Oliveira & E. Sar. 1995. Manual de mtodos ficolgicos. Universidad de Concepcin. Concepcin. Bourrelly, P. 1966-1970. Les algues deau douce. Ed. Boube & Cie. Paris. Ettl, H. 1985-2005. Ssswasserflora von Mittleeuropa. Gustav Fischer Verlag. Stuttgart. Hillebrand, H. 1999. Biovolume calculation for pelagic and benthic microalgae. Journal of Phycology 35: 403-424. Huber-Pestalozzi, G. (ed.) 1932-1983. Das phytoplankton des Ssswassers. Binnengewasser. E. Schweizerbartsche Verlagsbuchhandlung. Stuttgart. Lobban, C.; D. Chapman & B. Kremer. 1988. Experimental Phycology: a laboratory manual. Cambridge University Press. Cambridge. Lund, J.; C. Kipling & E. Lecren. 1957. The inverted microscope method of estimating algal numbers and the statistical basis of estimations by counting. Hydrobiologia 11: 143-170. Margalef, R. 1955. Los organismos indicadores en limnologa. Instituto Forestal. Ministerio de Agricultura. Madrid. Riolobos, P.; M. Alvarez-Cobelas; C. Rojo; M.A. Rodrigo; E. Ortega Mayagoitia & S. Cirujano. 2002. Tcnicas habituales de anlisis fsicos, qumicos y biolgicos del grupo de investigacin del Agua. Real Jardn Botnico de Madrid. Madrid. Snchez Castillo, P. 1994. Mtodos para el estudio del fitoplancton. En: Cruz Pizarro, L. (ed.): Mtodos de anlisis de aguas y de tratamiento e interpretacin de datos hidrolgicos. Instituto del Agua. Universidad de Granada. Granada. Schwoerbel, J. 1975. Mtodos de hidrobiologa. Blume. Madrid. Wehr, J. & R. Sheath. 2003. Freshwater Algae of North America. Academic Press. Amsterdam.

Metodologa para el estudio taxonmico y ecolgico de picoplancton y plantas de las aguas continentales, la elaboracin de catenas vegetales y la estimacin de la biomasa
Miguel lvarez Cobelas Centro de Ciencias Medioambientales C.S.I.C. C/Serrano 115 dpdo 28006 MADRID malvarez@ccma.csic.es

Bacterias y picoplancton auttrofo (PPA) (Hobbie et al., 1977; Weisse, 1988) Obtencin de la muestra La misma muestra sirve para el recuento de bacterias y de PPA. Utilizamos botellas (botes) de 50-60 ml de plstico a las que aadimos 2 ml de formol al 40% en el laboratorio y rellenamos en el campo con la muestra de agua hasta 50 ml. Importante: debe llenarse nicamente hasta 50 ml. de muestra (utilizar la graduacin del bote o botellita si la tiene, o hacer una marca en la altura que se corresponda con los 50 ml.) para que se mantenga la concentracin final de formol al 1-2%.

Debe anotarse la cantidad de formol aadido para posteriormente hacer la correccin del volumen de fijador aadido sobre la concentracin celular final. Igualmente, debe enroscarse fuertemente la tapa del bote-botellita para que no se salga el formol durante el muestreo y tomar las precauciones necesarias en la manipulacin del bote a la hora de llenar la muestra. Deben mantenerse las muestras en la nevera, a ser posible, hasta el momento de su anlisis. Si no se dispone de refrigeracin, al menos deben situarse en la oscuridad porque la luz

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin disminuye auttrofo. la fluorescencia del picoplancton preparaciones se mantienen verticales, para evitar que el aceite se salga de la preparacin por gravedad. 11) Por ltimo, hay que recoger los residuos (puntas, agua, etc,) del naranja de acridina en contenedores apropiados para su posterior eliminacin como residuo txico. - Observacin de las bacterias teidas al microscopio de fluorescencia: 1) Debe utilizarse un microscopio de epifluorescencia. Dependiendo de la marca y del modelo del microscopio, los filtros tienen distintas nomenclaturas. El set de excitacin debe ser blue waveband de 470-500 nm. 2) Aseguraos de que la lmpara UV no haya sido apagada recientemente antes de volver a encenderla porque podra daarse el aparato. Anotar la hora de comienzo de la utilizacin de la lmpara. 3) Enfocad la preparacin con luz visible y, una vez enfocada, cambiad a la luz visible por la ultravioleta. 4) Recontad tantos campos (el campo para nosotros es el rea total de la cuadrcula ocular) como haga falta para llegar a 400 clulas, lo cual nos dar un error de recuento del 10%. Anotad el nmero de campos recontados. 5) En principio, la mayora de las clulas se ven de color anaranjado, pero, adems, pueden aparecer algunas de color verdoso, las cuales se incluirn tambin en el recuento total. La variacin de color se debe al tipo de cido nucleico, de doble o de simple cadena, en el que se intercala el naranja de acridina. Si hay morfologas muy diferentes, debe intentarse recontar por separado. 6) Fijad previamente un criterio con aquellas clulas que quedan en el lmite de la cuadrcula (por ejemplo: contad las que estn sobre dos de los bordes y no contis las que estn sobre los otros dos bordes). Precaucin: Evitad que el aceite de inmersin de la preparacin (que est en contacto con el naranja de acridina) manche el microscopio. 7) Apagad la lmpara ultravioleta, anotando la hora de apagado para informacin del siguiente usuario. - Clculo de la densidad celular: el nmero de microorganismos por ml se estima utilizando la siguiente frmula: Cel/ml = (c * Af / (Ac * V * n * F) ) - celPPA/ml
c: n total de clulas recontadas (400 o ms). Af :rea de filtracin en mm2 (calculado a partir del dimetro de la mancha que deja la torreta de filtracin sobre el filtro; determinadla utilizando un filtro blanco y tinta azul, por ejemplo).

Recuentos del bacterioplancton - Filtracin y tincin con naranja de acridina: todo el material utilizado en esta tcnica ser de uso exclusivo debido a la toxicidad del colorante utilizado. Hay que utilizar guantes, pero, sobre todo, evitad que el colorante entre en contacto con objetos no deseados. 1) Montar la torreta de filtracin con un filtro Nucleopore (GTBP 02500, Millipore; estn teidos de negro) de 0,2 m de dimetro de poro y acoplarla al sistema de vaco (la torreta debe estar perfectamente horizontal para que la distribucin de las clulas sea lo ms homognea posible). 2) Aadir un chorrito de agua destilada prefiltrada por 0,2 m a la que se le ha aadido formol (1% concentracin final). 3) Agitar convenientemente la botella de la muestra antes de tomar una alcuota. 4) Aadir el volumen de la muestra apropiado (variable dependiendo del origen de la muestra; entre 250 y 500 l en la mayora de los casos) con una pipeta automtica. La punta de la pipeta es siempre la misma para las distintas muestras y se ha de lavar varias veces con agua destilada y dos tres veces con la muestra siguiente cada vez que cambiamos de muestra. 5) Aadir el colorante: nosotros ponemos 80 l de Naranja de Acridina al 0,1% (solucin stock guardada en nevera en frasco oscuro) con una pipeta automtica (de hasta 250 l). 6) Aadir otro chorrito de agua destilada prefiltrada para que haga turbulencias y se mezcle todo bien (aunque con cuidado para que no salpique fuera, porque el naranja de acridina tie y es txico). 7) Esperar dos minutos. 8) Aplicar el vaco suavemente. Cuando haya filtrado todo el agua, se retira el filtro Nucleopore con unas pinzas Millipore de bordes esmerilados, dejando que se seque sobre un papel de filtro. Hay que evitar que le incida directamente la luz (los dejamos secando dentro de una caja de cartn). 9) Cuando el filtro est seco (unos 10 min aprox.), hay que montarlo sobre un portaobjetos. Colquese en la parte central del porta una gota de aceite de inmersin y, sobre ella, depositar el filtro. Adase una nueva gota de aceite sobre el filtro (sin que el gotero toque el filtro), colocando suavemente el cubreobjetos. En el borde esmerilado del portaobjetos se debe rotular el nombre de la muestra y el volumen filtrado. 10) Deben guardarse los filtros en refrigeracin hasta el momento de su observacin al microscopio. Nosotros utilizamos una caja de preparaciones que guardamos en vertical; as, las

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Ac : rea de la cuadrcula ocular en mm2, que es el campo observado. V : volumen de muestra filtrada en ml. n : n de campos recontados. F: Factor de correccin del volumen de fijador utilizado (por ejemplo, si aadimos 2 ml de formol a 50 ml de muestra, el factor de conversin es 0,96). celPPA/ml: descontar el n de clulas del picoplancton autotrfico, porque en la tincin tambin habremos teido las clulas del PPA.

- Estimacin de la biomasa: la estimacin de los biovolmenes y el clculo de la biomasa se pueden hacer de modo anlogo a las del fitoplancton. Los biovolmenes celulares de bacteriras pueden calcularse mediante anlisis de imagen, si se dispone de l, o en su defecto- pueden medirse la longitud y la anchura de las clulas mediante un pie de rey en fotografas ampliadas de las preparaciones microscpicas. Es necesario fotografiar un micrmetro objetivo para tener una referencia del tamao real. Las formas geomtricas a las que ms habitualmente se asemejan las bacterias son la esfera para los cocos y un cilindro acabado en dos hemiesferas para los bacilos. Si se desea calcular la biomasa en carbono, una aproximacin til es la de Bratbak (1985): 1 m3 = 0,22 pg C Recuentos del picoplancton auttrofo - Filtracin: el mtodo de filtracin es bsicamente el mismo que para las bacterias con la salvedad de que en este caso no se usa ningn colorante sino que las clulas se observan a partir de su autofluorescencia. 1) Montad la torreta de filtracin con un filtro Nucleopore (GTBP 02500, Millipore; estn teido de negro) de 0,2 m de dimetro de poro y acopladla al sistema de vaco. La torreta debe estar perfectamente horizontal para que la distribucin de las clulas sea lo ms homognea posible. 2) Aadid un chorrito de agua destilada prefiltrada por 0,2 m y fijada con formol (1% concentracin final). No es absolutamente necesario porque es extrao que crezca PPA en el agua destilada. 3) Agitad convenientemente la botella de la muestra. 4) Aadid el volumen de la muestra apropiado (muy variable dependiendo del origen; aprox. 5-10 ml con una pipeta automtica.). Es raro que pase un volumen mayor a travs del filtro porque las bacterias obstruyen en filtro. La punta de la pipeta es siempre la misma para las distintas muestras y se ha de lavar varias veces con agua destilada y dos tres veces con la muestra siguiente cada vez que cambiemos de muestra. En algunos casos, si hay mucho fitoplancton grande se puede prefiltrar

la muestra por malla de Nytal de 15m, eliminando as los organismos ms grandes y facilitando la filtracin. 5) Aadid otro chorrito de agua destilada prefiltrada para que haga turbulencias y se mezcle todo bien. 6) Aplicad el vaco suavemente. Cuando haya pasado todo el agua, retirad el filtro Nucleopore con unas pinzas Millipore y dejad que se seque sobre un papel de filtro. Debeis evitar que le incida directamente la luz. 7) Cuando el filtro est seco (unos 10 min aprox.), montadlo sobre un portaobjetos. Colocad en la parte central del porta una gota de aceite de inmersin y, sobre ella, depositad el filtro. Aadid una nueva gota de aceite sobre el filtro (sin que el gotero toque el filtro) y colocad suavemente el cubreobjetos. En el borde esmerilado del portaobjetos rotulad el nombre de la muestra y el volumen filtrado. 8) Guardad en refrigeracin hasta el momento de su observacin al microscopio de la manera indicada en el apartado dedicado al bacterioplancton. - Observacin al microscopio: es preciso utilizar un microscopio de epifluorescencia. Dependiendo de la marca y del modelo los filtros tienen distintas nomenclaturas. Aseguraos de que la lmpara ultravioleta no haya sido apagada recientemente antes de volver a encenderla porque podra daarse el aparato. Anotad la hora de comienzo de la utilizacin de la lmpara. 1) Enfocad la preparacin con luz visible y, una vez enfocada, cambiad a la luz ultravioleta, utilizando un filtro violeta-azul (400-500 nm). Las clulas eucariotas y las proclorofitas fluorescen de color rojo intenso. Las cianobacterias que poseen ficoeritrina I emiten una coloracin amarilloanaranjada brillante. Contad las clulas que se iluminen sin cambiar el campo. Una vez realizado ese recuento, cambiad al filtro verde-amarillento (520-560 nm) y se iluminarn en rojo las cianobacterias con ficocianina y en anaranjado las que poseen ficoeritrina II. 2) Recontad tantos campos (cuadrcula ocular) como haga falta para llegar a 400 clulas en total para cada filtro de fluorescencia y coloracin celular. Anotad el nmero de campos recontados. 3) Fijad previamente un criterio con aquellas clulas que quedan en el lmite de la cuadrcula. 4) Apagad la lmpara UV, anotando la hora de apagado para informacin del siguiente usuario. - Clculo de la densidad celular: el nmero de microorganismos por ml se estima de la forma indicada en el apartado de las bacterias (usando,

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin claro est, nicamente el primer trmino de la frmula). - Estimacin de la biomasa: si el picoplancton auttrofo tiene igual o menos de una micra de dimetro, entonces puede usarse el mismo mtodo que para las bacterias. Si su tamao fuera superior, seguiramos los criterios usados para el fitoplancton. Recoleccin de plantas (Moore, 1986; Bridson & Forman, 1998) Todos los organismos son indicadores de las condiciones en que viven. La denominacin de una planta con un nombre latino no supone slo el mero nombre cientfico. Tras l, hay toda una biologa del organismo en cuestin que refleja las condiciones en las que le es posible la vida a ese ser vivo. Por lo tanto, es fundamental una buena recoleccin de las plantas para poder identificarlas y, a partir de esa identificacin, deducir las principales caractersticas ambientales del hbitat donde residen. Fundamento Una recoleccin correcta es la base de la botnica, es la base de la biologa vegetal. Por otro lado, todas las normativas de conservacin ambiental se basan en la correcta identificacin de distintos especmenes vegetales y animales, para lo cual su recoleccin debe ser la mejor posible. Material y mtodo La recoleccin se debe hacer por hbitats. Para ello: 1) Deben delimitarse a grandes rasgos los hbitats principales presentes en un ecosistema acutico y en su entorno. A menudo, es difcil sealar dnde empieza y dnde termina un ambiente acutico porque los niveles del agua son muy cambiantes, sobre todo en ambientes mediterrneos. 2) Dentro de cada hbitat hdrico (zonas de borde o ecotono, aguas permanentes profundas, aguas permanentes someras, zonas de oscilacin hdrica estacional, etc.) se toman varias muestras de cada especie existente dentro de las distintas formaciones vegetales presentes. De cada individuo se incluirn raz, tallo, hojas, flores y frutos. 3) En las zonas ms profundas, en las que no puede accederse fcilmente, pueden utilizarse pequeos ganchos atados a un lastre y una cuerda suficientemente larga. Se arroja este artilugio al agua y una vez hundido se arrastra varias veces desde la orilla o desde la barca. 4) Se seleccionan las plantas que estn en mejor estado, pero siempre tomando ejemplares de todas las supuestas especies presentes. 5) Cada ejemplar, eliminando lo ms posible la tierra y otras adherencias y el agua, se dispone dentro de un pliego de papel absorbente, de tamao A-3 o similar. Se coloca convenientemente para que luego puedan observarse fcilmente los caracteres morfolgicos. No es conveniente que los pliegos estn muy llenos porque luego es ms difcil la observacin. En el caso de plantas grandes se cortan las partes ms representativas, ya que no es necesario preparar toda la planta. Si fuera necesario se emplearan dos pliegos para la misma planta. En el caso de las plantas acuticas ms delicadas es conveniente colocarlas encima de una cartulina, operacin que puede realizarse en la superficie del agua, extendiendo la planta con cuidado sobre la cartulina mojada. Las plantas acuticas es conveniente prepararlas en el momento de su recoleccin, y una vez preparadas se meten en una prensa de campo. En el caso de los carfitos es preferible mantenerlos en medio lquido para poder identificarlos fcilmente. Para ello se guardan en bolsas de plstico o botes con algo de agua a la que se aade un chorrito de conservante compuesto por 8 partes de alcohol etlico y una parte de glicerina. 6) Se redacta una etiqueta con la siguiente informacin: nombre del recolector, fecha (dames-ao), lugar de recoleccin, nombre tentativo (si se supone alguno). 7) Como las plantas suelen tener un gran contenido en agua, es conveniente cambiar los pliegos de papel en varias ocasiones durante los das subsiguientes. 8) Una vez secas por completo las plantas, se dispone cada una con su etiqueta en el pliego definitivo y, cuando se identifican se le asigna un nombre latino con su autor correspondiente y el nombre del botnico identificador. 9) Algunas claves bsicas para la determinacin de plantas acuticas son las de Moore (1986) y Comelles (1985) para los carfitos y la de Haslam et al. (1975) para las plantas superiores. 10) Paralelamente a la recogida, se anotan en un cuaderno las caractersticas ambientales de la formacin vegetal de la que se han tomado especmenes para su clasificacin. Por ejemplo: altura del agua, distancia a la orilla, contaminacin de visu, animales presentes, tipo de agua, tipo de sedimento, etc.

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ALGAS NMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorizacin Elaboracin de catenas vegetales (Braun-Blanquet, 1979; van den Berghen, 1982) Las especies vegetales se disponen a menudo en el paisaje a lo largo de gradientes, el ms conocido de los cuales es el altitudinal. El agua no es una excepcin, pues puede determinar un gradiente de hbitats desde las aguas permanentemente estancadas y profundas hasta zonas donde la influencia del agua sea prcticamente nula y las plantas accedan a ella gracias a un gran sistema radicular. A lo largo de ese gradiente, se sitan las distintas especies de plantas superiores en un lago, ro o humedal. Esa disposicin de las plantas en gradiente se denomina catena de vegetacin. Fundamento El fundamento es muy simple: el gradiente abitico hdrico implica una cadena de distintas especies vegetales. Material y mtodo Es recomendable efectuar el dibujo de catenas en dos pocas del ao distintas: con agua al mximo y con agua al mnimo de inundacin. Se proceder como sigue: 1) Se trazar una lnea recta imaginaria desde la zona nunca inundable del humedal, lago o ro hasta el centro del mismo. 2) Se cartografiarn las principales formaciones vegetales existentes a lo largo de dicha lnea imaginaria, indicando la anchura aproximada que ocupa cada una. La multiplicacin de dicha anchura por la longitud aproximada de la formacin nos dar la cobertura de la misma. 3) Se anotar la altura que alcanza el agua en el centro de cada formacin vegetal. 4) Se elaborar un dibujo a escala de cada catena. Esta elaboracin a escala permitir luego una cuantificacin de la catena, si se desea. Y si esa cuantificacin se hace porcentual referida al total del gradiente, podrn compararse cuantitativamente las catenas de distintas localidades y ecosistemas. Estimacin de la biomasa vegetal (Westlake, 1969) La cobertura de una especie en un ambiente determinado es un indicador til del espacio que ocupa, pero es fcil entender que una misma especie alcanzar diferentes biomasas para la misma cobertura segn sea la magnitud de las variables ambientales que condicionen su crecimiento. La biomasa de una especie es, por lo tanto, el aspecto de su biologa que mejor se relaciona con las condiciones ambientales. Ese es el inters de su determinacin. Fundamento La inmensa mayora de las plantas superiores crecen enraizadas en el suelo o en el sedimento. La determinacin de la biomasa de cada especie vegetal debe realizarse, por lo tanto, por unidad de superficie. Material y mtodo 1) Dependiendo del tamao de los individuos y de las manchas que formen esos individuos, se fabricar un cuadrado de madera o de metal. En la mayor parte de los casos son suficientes cuadrados de 0,5 x 0,5 metros e incluso inferiores, pero luego es conveniente dar los resultados en biomasa por metro cuadrado. 2) Dentro de cada formacin vegetal, se sita el cuadrado cinco veces distintas al azar. Despus de cada una, se corta la vegetacin a la altura del suelo o del sedimento. 3) Se elimina el agua lo ms posible. En el caso de los macrfitos sumergidos, esto puede hacerse en el campo con una centrifugadora de mano para lechuga. 4) La biomasa de cada cuadrado de muestreo se introduce en una bolsa de plstico que se etiqueta convenientemente. 5) Una vez en el laboratorio, se pesa el contenido de cada bolsa con la mayor precisin posible y luego en una cpsula de porcelana grande (si son plantas sumergidas) o en una bolsa de papel (si son plantas emergentes) se meten en una estufa a 110 C durante una semana hasta que la pesada resultante sea constante. La diferencia porcentual entre el peso inicial y el final nos da el contenido en agua de cada planta. 6) El peso seco final ser el de la biomasa seca de cada muestra por unidad de superficie, una vez transformada la extensin del cuadrado de muestreo al metro cuadrado (por ejemplo, si usamos un cuadrado de 0,5 x 0,5 metros, habr que multiplicar por 4 para dar la biomasa seca por metro cuadrado). 7) La biomasa no es una componente constante de ninguna formacin vegetal. Por eso, es conveniente calcular un promedio y una desviacin tpica de todas las muestras tomadas en una misma formacin vegetal en cada momento de muestreo.
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