CARACTERSTICAS DE LOS CULTIVOS (CRECIMIENTO).

Uno de los principales distintivos de las bacterias es el aspecto resultante del crecimiento en diversos medios (caractersticas de crecimiento ), y caracteristicas como el Color (cromognesis), la abundancia del crecimiento, y aun el olor del cultivo, proporcionan todos ellos indicios para la identificacin de un cultivo desconocido. Para determinar las caractersticas de crecimiento de un cultivo puro es costumbre observar los siguientes tipos de cultivo. Los aspectos del crecimiento que se pueden observar en cada uno de los medios son los siguientes: 1) Colonia en placa de agar: (cultivos en placa). Tamao. El tamao de las colonias alcaza desde el sumamente pequeo, que solo mi de una fraccin de mm, hasta las grandes colonias de 5 a 10 mm de dimetro. Margen o borde. La periferia de las colonias bacterianas presenta formas muy diferentes, segn las especies. Puede ser circular lisa, o presentar irregularidades como lbulos redondos, muestras irregulares, proyecciones filamentosas o rizoides. Elevacin. Las colonias pueden ser muy planas (aplastadas) o espesas (elevadas). Las colonias elevadas ofrecen varios grados de convexidad superficial. Cromognesis o pigmentacin . Pueden ser coloreadas (pigmentadas) o no pigmentadas. Los diversos tintes rojo, amarillo, pardo y violeta, caracterizan ciertas especies. Caracteres pticos . Opacas, translcidas, u opalescentes.
Colonias en agar nutritivo

Forma:

Elevacin:

Borde:

2) Crecimiento en estras sobre agar (Inclinado). Cantidad. Escasa, moderada, o abundante,

Margen o borde de crecimiento. Uniforme o liso, o presentando irregularidades semejantes a las de las colonias en placas de agar. Consistencia o coherencia del crecimiento. Butirosa o mantecosa, que se retira fcilmente con el alambre; viscosa o fibrosa; seca y quebradiza. Cromognesis o pigmentacin. Semejante a la descrita en colonias en placas de agar. Crecimiento en agar inclinado .

3) Crecimiento en caldo nutritivo. Valor del crecimiento. Escaso, moderado o abundante. Distribucin del crecimiento en el caldo. Uniformemente distribuido (igualmente turbio); limitado a la superficie del caldo, cmo velo o pelcula; acumulado en sedimento, granuloso o viscoso. Olor. Ptrido; de frutas o aromtico; o imperceptible. Crecimiento en caldo.

4) Crecimiento de picado en gelatina.

Crecimiento (sin licuefaccin) a lo largo de la lnea de picadura. El crecimiento puede estar limitado a la lnea de inoculacin, o puede presentar varios grados de propagacin de esta lnea.
Licuefaccin de la gelatina. Puede avanzar por igual desde la superficie, o presentar diversos aspectos infundibuliformes de licuefaccin del medio. Crecimiento de picado en gelatina. Lnea de picadura Licuefaccin

Una de las caractersticas ms llamativas en los cultivos es la cromognesis o pigmentacin. No todas las bacterias presentan este distintivo. En algunas de las bacterias cromgeneas, el pigmento queda retenido dentro de la clula y se colorea slo la masa de clulas bacterianas, mientras que en otros el pigmento se segrega al exterior y aparece coloreado el medio La intensidad de la pigmentacin depende de la composicin del medio de cultivo y las condiciones de incubacin, Algunas especies bacterianas comunes que produce y retienen intracelularmente los pigmentos son las siguientes: Serratia marcescens Chromobacterium violceum Staphylococcus aureus Sarcina ltea Micrococcus flavus Micrococcus niger Rojo Violeta Amarillo oro amarillo limn amarillo Pardo o negro

Entre las especies bacterianas comunes que producen pigmento y lo segregan al medio se encuentran: Pseudomonas chlororaphis. Pseudomonas fluorescens Pseudomonas aureaginosa verdoso a amarillo verdoso a pardo oliva verde, azul a pardo oscuro.

Una vez que la observacin, del aspecto de los cultivos bacterianos (caractersticas de crecimiento) sugieren que puede ser un solo tipo de microorganismo, se deben efectuar pruebas complementarias (bioqumicas) para confirmar esta suposicin, as: como identificar el microorganismo especificado; pero las caractersticas del cultivo han dado una pista en cuanto al tipo de microorganismo de que se trata.

TCNICAS DE TINCIN.
Una de las herramientas principales para el estudio de las clulas es la tincin diferencial. Una tincin es diferencial cuando 2 o mas reactivos se aplican para impartir color a la clula o sus partes especificas, mientras que una tincin simple implica la adicin de un solo reactivo. La acumulacin gradual de gran nmero de pruebas citoqumicas ha hecho posible la identificacin de los constituyentes de la clula. Tambin se sabe desde hace tiempo que los aminocidos y protenas celulares reaccionan como bases y cidos dbiles con una gran variedad de materiales. En otras palabras, las protenas son sustancias anfotricas; se pueden ionizar ya sea como cido o base. La ionizacin es el proceso por el cual los tomos y molculas adquieren carga elctrica. La magnitud de la carga se indica con el signo + y -, que indican el tipo de carga. La ionizacin es el resultado de la prdida o ganancia de electrones, los cuales alteran la neutralidad elctrica de la partcula, y un in se define como un tomo o molcula con carga elctrica. Como las protenas constituyen la mayor parte de los slidos en la clula, ellas participan en la mayor parte de las reacciones de tincin. Para poder reaccionar exitosamente con una protena, una tincin biolgica debe ser capaz de ionizarse como cido o base, adems de producir coloracin. Generalmente estas sustancias se llaman colorantes bsicos cuando muestran fuerte afinidad por las porciones acidas de la clula y colorante cidos cuando presentan fuerte afinidad por las partes bsicas d la clula. Muchas veces resulta conveniente usar una mezcla d dos colorantes, uno cido y uno bsico, que tian de diferentes colores. Al tratar una clula con esta mezcla, los componentes cidos aparecen de color diferente que las partes alcalinas de la clula. Existen ciertas tcnicas y procedimientos comunes para todos los estudios citolgicos. Una de estas tcnicas trata de la preparacin celular para ser observada. Al hacer una preparacin al microscopio, debe depositarse en el portaobjetos una capa de clulas lo suficientemente delgada para penetrar el paso de la luz a travs de ella. En el caso de los microorganismos generalmente basta con un frotis de clulas microbianas para luego teirlas. Puesto que las clulas son tan pequeas, el objetivo se logra simplemente preparando una suspensin de clulas en agua y otro lquido; una gota de esta suspensin se extiende; sobre una rea del portaobjetos y se deja secar, obteniendo as una delgada capa de clulas sin necesidad de usar aparatos especializados.

Cuando se desea hacer un frotis de un caldo de cultivo de microorganismos, el caldo se aplica directamente al portaobjetos sin dilucin previa. . Al prepara un frotis de un medio solid, el problema a evitar es la presencia de demasiadas clulas. Para esto se toma del medio solid una minscula cantidad de material bacteriano el cual s emulsifica en una gota de agua de la llave sobre la superficie del portaobjetos. Una vez seco el frotis., debe aparecer ligeramente blanquecino. Una vez hecho el frotis hay que fijarlo, para asegurarse que las clulas no se desprendern durante los repetidos lavados a que se somete el portaobjetos para teir la preparacin. Durante la tcnica de fijado, se intenta detener toda actividad enzimtca en la clula antes de observarla al microscopio. Muchas si no todas las clulas poseen protenas enzimticas capaces de destruir gran parte de las estructuras intracelulares despus de la muerte de las clulas, por lo que si la clula no ha sido fijada adecuadamente antes de teirse la accin destructora de estas enzimas impedir la apreciacin de todo detalle. El calor adems de inactivar las enzimas, ayuda a adherir las clulas al portaobjetos, minimizando as la prdida de clulas durante el proceso de tincin. La tcnica de gota pendiente se utiliza con frecuencia cuando se desea determinar la capacidad de un microorganismo para desplazarse con locomocin propia. Aqu se observa el organismo en su estado natural, vivo y se puede ver si presenta algn tipo de locomocin propia. De ordinario, las bacterias son tan pequeas que debido a los choque con las molculas en movimiento del agua circundante, y otras molculas en solucin, las clulas bacterianas rebotan ligeramente en funcin de la suma de los impactos recibidos. Puesto que hay miles de millones de molculas que chocan simultneamente con la clula bacteriana, est parece vibrar al azar. La bacteria no da la impresin de llevar direccin definida, simplemente parece bailar dentro de un territorio dado. Por esto se dice que las bacterias presentan movimiento Browniano.
Aunque hay que hacer notar que los organismos mviles, son los que presentan movimiento propio, adems del movimiento browniano). Muchos microorganismos cuentan con rganos de locomocin que los capacita para moverse con direccin y sentido en un medio lquido. Es posible observar como estos organismos giran y se tuercen y a menudo se desplazan rpidamente por distancias relativamente grandes en el campo microscpico. Este tipo de desplazamiento es la motilidad real.

Otro mtodo para determinar la motilidad de un microorganismo es la siembra por picadura en un medio semislido (SIM). En ste las bacterias no mviles crecen solamente siguiendo la lnea de inoculacin, en tanto que las mviles crecen rpidamente y se difunden por todo el medio.

El medio SIM tiene la ventaja de permitir la movilidad bacteriana por medio de la produccin de cido sulfhdrico a lo largo de la lnea de crecimiento y la formacin de indol (coloracin rojo-purprea) despus de cualquier perodo de incubacin, en la superficie del reactivo de Kovacs'. La movilidad en este medio se observa por un crecimiento difuso turbidez lejos de la lnea de inoculacin. Si el microorganismo es mvil, y produce H2S se notar un color negro (turbidez), por el contrario, si el microorganismo no es mvil, la turbidez color negro, se encontrar en la lnea de inoculacin. La tincin bacteriana mas conocida es la de Gram, de carcter diferencial, llamada as en honor a su inventor Dr. Christian Gram. Se emplea para distinguir entre un grupo de microorganismos y otros. Usando esta tcnica es posible clasificar todas las clulas en por lo menos dos categoras. (Gram + y Gram -). La tincin de Gram constituye el punto inicial del procedimiento de identificacin de microorganismos y se compone de 4 reactivos: 1) Cristal violeta, es generalmente el primer colorante primario de la serie gram, su propsito es impartir color a todos los microorganismos en el frotis y puede ser sustituido por Violeta de Genciana. 2) Yodo lugol o Yodo Gram, es el segundo reactivo y acta como mordente (sustancia que aumenta o refuerza la unin entre un colorante y un sustrato). 3) Acetona-Alcohol, esta solucin se conoce como decolorante porque disuelve y arrastra fuera de las clulas el colorante primario. Es una mezcla de acetona-alcohol 95%, en proporcin 30y 70% respectivamente. Muchos microorganismos retienen el cristal violeta con gran tenacidad a pesar del decolorante. A estos se les llama Gram +. 4) Safranina, el cuarto reactivo d la serie es un colorante rojo, el cual se aplica como cotratincin. Aquellos microorganismos que se destieron con el decolorante, se han tornado invisibles (incoloros) por eso es que para tornarlos visibles se emplea una contratincin de diferente color qu el colorante primario. De manera .que se designa como Gram -, a cualquier organismo que tome la coloracin roja de la safranina. Este puede ser sustituido por Fucsina bsica. . Gram + son los organismos que retienen el colorante primario a lo largo de todo el proceso, y no toman el color de la safranina, simplemente porque ya han reaccionado completamente con el cristal violeta. . La edad del cultivo usado tambin determina los resultados finales de la tincin Gram. Es sumamente importante mencionar que la tincin Gram da resultados vlidos cuando se aplica a cultivos nuevos, de 24 horas o menos. Una vez que el cultivo se incuba por mas de 24 horas, muchas clulas gram positivas empiezan a perder su habilidad para retener el colorante primario.

Al envejecer, las clulas tienden a volverse gram negativas incluso las que eran gram positivas originalmente.
Para teir los flagelos se usa un procedimiento diferente. El colorante se aplica junto con el cido tnico como mordente, el cual se adhiere a la clula y a los flagelos en capas sucesivas hasta que la bacteria y los flagelos aumentan sus dimensiones. Esta tincin presenta muchos inconvenientes, una de las cosas que hay que evitar es la presencia de materia orgnica ajena a las clulas a teir en el portaobjetos. El mordente tiene tremenda afinidad por cualquier tipo de materia orgnica y por eso, teir intensamente cualquier rastro de desecho orgnico presente en el portaobjetos, por lo cual es importante asegurarse de que este se encuentre escrupulosamente limpio .