LA COLORACIN DE GRAM I.

Introduccin El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea. El modo ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Si se desea simplemente aumentar el contraste de las clulas para la microscopa, son suficientes los procedimientos que usan unos solo colorantes llamados de tincin simple. Sin embargo, a menudo se utilizan mtodos que no tien de igual modo todas las clulas, es el proceso denominado tincin diferencial. Uno muy usado en microbiologa es la tincin Gram. Basndose en su reaccin a la tincin Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos: gram positivas y gram negativas. Esta tincin tiene gran importancia en taxonoma bacteriana ya que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias. Mientras que las bacterias gram negativas son constantes en su reaccin, los microorganismos gram positivos pueden presentar respuestas variables en ciertas condiciones (son gram lbiles). Por ejemplo, los cultivos viejos de algunas bacterias gram positivas pierden la propiedad de retener el cristal violeta, y en consecuencia, se tien por la safranina apareciendo como gram negativas. Anlogo efecto se produce en ocasiones por cambio en el medio del organismo, o por ligeras modificaciones en la ejecucin de la tcnica. Por este motivo, es preciso atenerse, en la prctica, al procedimiento establecido. Para explicar el mecanismo de la tincin de gram se han propuesto varias hiptesis fundadas en la naturaleza qumica de las paredes celulares de los microorganismos. Aqu puedes ver las diferencias estructurales y qumicas de los dos tipos de pared bacteriana:

Pared Gram+ capa densa y uniforme de 200 a 800 A) cidos teicoicos polisacridos protenas (pocas veces) glicopptido (50% del peso seco) Pared Gram capa interna delgada de 20 a 30 A cubierta por capas externas de densidad menor) lipopolisacridos lipoprotenas protenas glicopptido (10% del peso seco)

El mecanismo de la tincin Gram es el reseado en el siguiente esquema:

Productos que se utilizan 1) Cristal violeta 2) Lugol solucin iodada 3) Alcohol

Reaccin y coloracin de las bacterias

GRAM + Clulas color violeta

GRAM Clulas color violeta

Se forma el complejo CV-I. Las clulas continan teidas de color violeta. Se deshidratan las paredes celulares. Se contraen los poros. Disminuye la permeabilidad. El complejo CV-I no sale de las clulas que continan teidas de color violeta. Clulas no decoloradas; Quedan teidas de color violeta.

Se forma el complejo CV-I. Las clulas continan teidas de color violeta. Eliminacin por extraccin de grasas de las paredes celulares. Aumenta la porosidad. El complejo CV-I se separa de la clula.

4) Safranina

Clulas decoloradas; Se tien de color rosado.

II.

Objetivos Comprender los pasos necesarios para realizar la tincin de Gram Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos, al igual de la aplicabilidad clnica de la tincin.

III.

Fundamento terico

La tincin de Gram o coloracin de Gram Es un tipo de tincin diferencial empleado en Bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre

al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella. La tincin de gram es la tcnica principal utilizada para el examen microscpico de las bacterias. Casi todas las bacterias de importancia clnica pueden detectarse con este mtodo. Las nicas excepciones son: Los microorganismos que se hallan casi con exclusividad dentro de las clulas husped (p. ej., clamidias).Los que carecen de pared celular (p. ej., micoplasmas y ureoplasmas).Los que tienen un tamao insuficiente para ser observados por el microscopio ptico (p. ej., espiroquetas).Los que tienen una diferente composicin en su pared y no captan los colorantes (p. ej., mycobacterias) El cristal violeta sirve como colorante bsico unindose a la pared celular bacteriana, con ayuda del mordiente (lugol) que refuerza la unin del colorante. Las bacterias Gram positivas, debido a la estructura y composicin bioqumica de su pared celular retienen el complejo cristal violeta-lugol y aun despus del tratamiento con el decolorante conserva el colorante bsico, por lo que se observan de color prpura o violeta al microscopio. Las bacterias Gram negativas pierden el colorante bsico cuando son tratadas con el decolorante debido a que

el alcohol disuelve el contenido lipdico de la pared celular (lo que aumenta la permeabilidad celular), dando como resultado la prdida del complejo cristal violeta-lugol. Las bacterias decoloradas captan entonces el colorante de contraste, razn por la cual estas bacterias se observan de color rojo al microscopio. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen. Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina). TECNICAS DE TINCION PARA LA MICROSCOPIA OPTICA. Preparacin del extendido: Los mtodos de tincin se utilizan en forma directa con las muestras del paciente o se aplican a los preparados obtenidos a partir del desarrollo de los microorganismos en cultivos. Por lo general las muestras se colocan sobre el portaobjeto con un hisopo que contiene el material del paciente o con una pipeta dentro de la cual se encuentra la muestra de lquido aspirado. El material que se va a teir se coloca en forma de una gota (si la muestra es lquida) o se rota (si la esta e un hisopo) sobre la superficie de un portaobjeto limpio y seco.

Es importante evitar la contaminacin de los medios de cultivo; por lo tanto, una vez que el hisopo toco la superficie de un portaobjetos no estril no debe utilizarse para la inoculacin posterior de medios de cultivo. Para la tincin de los microorganismos que crecen en cultivos puede utilizarse una aguja estril para transferir una pequea cantidad del cultivo desarrollado en un medio solido a la superficie del portaobjetos. Este material se emulsiona en una gota de agua o solucin salina 0.9% estril sobre el portaobjeto. En caso de cantidades pequeas que puedan perderse incluso en una gota de solucin fisiolgica se puede utilizar n aplicador de madera estril para obtener el material; luego este material se frota directamente sobre el portaobjetos que se va a teir se deja secar y se fija al portaobjeto mediante su colocacin sobre una platina caliente (a60C) durante por lo menos 10 minutos o cubrindolo con metanol al95% durante 1 minuto. Para examinar los microorganismos que crecen en medio lquido se aplica una muestra aspirada del caldo de cultivo sobre el portaobjetos, se seca y se fija antes de la tincin. La preparacin de los frotis vara de acuerdo con el tipo de muestra que se va a procesar y con los mtodos de tincin que se van a utilizar. No obstante la regla general para la preparacin de frotis es que debe aplicarse una cantidad de material suficiente sobre el portaobjeto para maximizar las posibilidades de detectar y diferenciarlos microorganismos. Por ltimo, el mtodo de tincin que se debe utilizar est determinado por el tipo de microorganismo buscado.

IV.

Materiales, equipos y reactivos Microscopio ptico Porta objetos Agua destilada Pipetas Pasteur asa o asa de siembra Mechero

Cristal Violeta Lugol Alcohol acetona Safranina

V.

Diseo experimental

Esterilizacin del asa de siembra. Aplicacin de colonia bacteriana en el portaobjetos. Re-suspender muestra en el portaobjetos. Secar al mechero. La gota de agua debe Se debe calentar por 5 ser pequea min aproximadamente, hasta que toda el agua se seque. Secado de la muestra sin aproximar demasiado a la llama para no estropearla fijacin de la muestra para que sea posible su tincin.

Despus de la fijacin el primer paso en la tincin de Gram es laaplicacin del colorante principal cristal violeta (metil rosanilina ovioleta de genciana) Esperar que transcurra 3 minuto. Escurrir y enjuagar.

Luego debe agregarse el lugol. Este debe aplicarse como el cristal violeta y tambin debe cubrir la muestra por 1 min. Luego se lava con agua corriente.

El cubrir la muestra con alcohol acetona para decolorarla es el paso ms crtico del procedimiento. Este debe cubrir la muestra y la reaccin debe ser detenida con el lavado con agua corriente. El tiempo debe ser el mismo para todas las muestras. Al ser tiempos por lo general muy cortos, se recomienda agregar el alcohol mientras ya se tiene la llave del agua corriendo, listo para el lavado.

El ltimo paso consiste en agregar una tincin de contraste, para teir las bacterias que pierden el cristal violeta. Para esto se agrega safranina cubriendo la muestra por 2 min, dependiendo. Luego se lava con agua corriente y secar con el flameado.

Secado de la preparacin con cuidado de no estropearla. Aplicacin de aceite de inmersin para objetivos de 100 aumentos. Adherirlo sobre el portaobjetos sin ponerle cubreobjetos. Colocacin de la preparacin en el microscopio observarla con el objetivo de 100 aumentos aproximar lo mximo.

VI.

Resultado

Se visualizaran las bacterias gram positivas de color violeta y las bacterias gram negativas de color rosado o rojizo. Bacterias gram positivas: Corresponden a las bacterias que mantienen la coloracin del cristal violeta despus del alcohol acetona, lo que les da un color violeta/morado. streptococcus pneumoniae bacteria gram positiva, desde cultivo bacteriano en agar sangre. Bacterias gram negativas: Corresponden a las bacterias que pierden la coloracin del cristal violeta despus del alcohol acetona y se tien con el colorante de contraste (safranina), lo que les da un color rosceo/rojizo. Escherichia coli bacteria gram negativa, cultivo desde agar macconkey

Gram positivos

Gram Negativos

VII.

Conclusin

El tamao de las bacterias dificulta su visin al microscopio, por eso la tincin de estas en la microbiologa es un apartado sumamente trascendente. La tcnica de tincin tiene como finalidad crear un contraste entre la clula y el medio que la rodea, y una de las ms importantes, tanto por su aplicacin clnica para hacer una identificacin preliminar de la bacteria causal de la infeccin y por su practicidad, es la tincin de Gram. Es por eso que esta tcnica se vuelve fundamental en el estudio de la microbiologa, y el conocimiento de su correcta realizacin es prcticamente obligatorio para todo aquel que se encuentra en el aprendizaje las ciencias mdicas. El estudio de la literatura acerca de la tincin de Gram nos permite tener un prembulo para poder diferenciar frente al microscopio los diferentes tipos de microorganismos, .Sin embargo, no hay que pasar por alto que es de suma importancia tener un completo estudio previo de los organismos y su reaccin a la tincin para poder dar una respuesta certera ante el cuestionamiento de la naturaleza de un microorganismo.

VIII.

Bibliografa Jawetz E., et al. Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Editorial Manual Moderno, 19a Ed. Mxico 2008; 702-703. Murray PR, et al. Microbiologa Mdica. Editorial Elsevier Mosby. 6a Ed. Espaa 2009: 158-159. Caldas A. L., Gua de Microbiologa y Parasitologa bsico clnica. Disponible en:http://www.facultadsalud.unicauca.edu.co/Documentos2010/DptoMedInt/ Tencion_de_gram.pdf.