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EVALUATION OF THE ANTIOXIDANT ACTIVITY AND CONTENT OF PHENOLICS COMPOUNDS IN WINES PRODUCED IN PERU
ABSTRACT The phenolics compounds play an important role in the color and flavor of the food and drinks; his consumption has been a partner with charitable effects for the human health. There were studied 13 types of Peruvian wines elaborated in departments Ica and Lima. The content of compounds fenlicos estimated by the Folin-Ciocalteu method, values being obtained from 627 to 3321 mg GAE/L. The antioxidant activity was realized using two methods: first applying the DPPHmethod, the values are between 32 to 873 M DPPHfor a monitoring of 5 minutes; then using the catin ABTS+ the results expressed in TEAC and
Centro de Investigacin de Bioqumica y Nutricin. Facultad de Medicina Humana. Universidad de San Martn de Porres. Av. Alameda del Corregidor N 1531. La Molina Lima (Per), amariamj@yahoo.es Facultad de Medicina Humana UNMSM
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were between 2,4 to 17,6 mm Trolox. The phenolics compounds were quantified by HPLC: chlorogenic acid among 0,13 - 3,28 mg/L, caffeic acid among 0,47 - 15,08 mg/L, ferulic acid among 0,21 - 5,57 mg/mL, rutin among 0,017 - 0,57 mg/L, quercetin among 0,19 - 7,74 mg/L and kaempferol among 0,023 - 1,39 mg/L. The wine elaborated with the varieties Tannat and Petit Verdot presented major concentration of phenolic compounds and antioxidant activity for both methods. The presence of these antioxidant compounds would allow, a criterion of classification that should be considered in the nutritional information in the etiquette of the wines, providing advantages for producers and consumers. Key words: Wines, antioxidant activity, polyphenols, anthocyanins, flavonoids. INTRODUCCIN Las sustancias fenlicas se encuentran entre los constituyentes fundamentales de los vinos. Ellas determinan importantes caractersticas organolpticas, relacionadas con el color y el gusto. Dentro de los fenoles, los antocianos son responsables esenciales del color rojo, mientras los taninos se asocian con sensaciones gustativas, unas veces agradables relacionado a su estructura y concentracin y otras desagradables como amargo, aspereza, sequedad, astringencia1. Los compuestos fenlicos constituyen un enorme grupo de sustancias, en su mayora de origen vegetal, ampliamente distribuidas en la naturaleza. Se han clasificado en distintos grupos segn el nmero de tomos de carbono y la estructura de su esqueleto base. El vino contiene gran cantidad y variedad de estos compuestos antioxidantes, principales responsables de la buena fama de este extracto natural2. En la figura 1, se muestran esquemticamente los distintos grupos qumicos que componen los principales fenoles de la uva. Presentan propiedades antioxidantes que contribuyen a reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares, as como el resveratrol, cido glico, y quercetina han sido confirmados por tener actividad contra alergias, inflamacin, hipertensin, artritis y carcingenos3.
cidos hidroxibenzoicos
No flavonoides
Proantocianidinas
Catequinas Flavonoles
cidos hidroxicinnmicos
Antocianos Flavonoides
Flavonas
Fenoles de la uva
Figura 1. Principales fenoles de las uvas.
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El tipo y la concentracin de compuestos fenlicos en vinos es influenciado por la composicin qumica de la materia prima, el cual depende de la variedad, estado de maduracin, condiciones atmosfricas durante la maduracin y tipo de suelo. La tcnica usada durante el proceso de elaboracin del vino y las condiciones de envejecimiento tambin son importantes4. Los fenoles aldehdos (vanillin), cido benzoico (cido glico), cidos hidroxicinnmicos (cafeico, ferlico, p-coumrico) y sus steres obtenidos por condensacin con cido tartrico (cido hidroxicinnamoiltartrico), flavanoles, flavonoles (quercetina) y antocianinas, son extrados de la uva durante el proceso de elaboracin. Tambin flavanoles, como catequinas, presentes en las semillas como monmeros o polimerizados para formar proantocianidinas y taninos hidrolizables, estilbenos como resveratrol o stos en forma de glucsidos presentes en los vinos. El presente trabajo tiene como objetivo evaluar la capacidad antioxidante de los vinos, utilizando dos mtodos: mediante el ensayo de 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) y 2,2'azinobis-(3-ethylbenzothiazoline)-6 sulfonic acid (ABTS); determinar el contenido de polifenoles totales, -antocianinas, relacin color-antocianinas- y cuantificar cidos fenlicos (clorognico, ferlico, cafeico) y flavonoles (quercetina, kaempherol, rutina). PARTE EXPERIMENTAL Materiales Acetonitrilo grado gradiente, metanol grado HPLC, cido o-fosfrico al 85 % de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azobis(2methylpropion-amidine) dihydrochloride (ABAP), 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethilchroman2-carboxylic acid (TROLOX) de Aldrich (St.Louis, MO, USA), 2,2'-azino-bis(3ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) de Sigma (Steinheim, Alemania). Agua ultrapurificada con una conductividad de 18 M/cm, preparado para un sistema Elix o de smosis inversa (Millipore, Symplicity, USA). Los estndares quercetina, kaempherol, rutina, cido glico, cido cafeico fueron obtenidos de Sigma (Steinheim, Alemania) y cido ferlico, cido clorognico fueron obtenidos de Aldrich (St.Louis, MO, USA). Muestra Fueron colectadas de la seccin vinos de las cadenas de supermercados de Lima. Se muestrearon 13 tipos de vinos que, posteriormente, fueron analizados por triplicado en el Centro de Investigacin de Bioqumica y Nutricin de la Facultad de Medicina Humana de la Universidad de San Martn de Porres. Los vinos fueron estudiados segn el tipo de uva y zona de procedencia. Preparacin Un volumen de 10 mL de vino fue extrado cuatro veces con 7 mL de acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo fueron combinados y evaporados a 50 C en bao mara. El residuo fue disuelto in 10 mL de la mezcla metanol/agua (6:4 v/v); posteriormente fue filtrado con GHP Acrodisc Syringe filtro 25 mm con 0.45 m membrana de Pall Corporacin (Ann Arbor, USA) y analizado por cromatografa lquida.
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espectro entre 400 y 700 nm; los parmetros clsicos de glories estn dados por el registro de valores de absorbancia a 4 longitudes de onda 450, 520, 570, 630 nm; los valores triestmulo X, Y, Z, permitir obtener los valores de luminosidad, tonalidad, saturacin, intensidad de color rojo, azul y amarillo.
+ Secuestro de radical DPPHy ABTS
La actividad de secuestro del radical libre fue determinado por inhibicin de 1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), mtodo propuesto por Brand-Williams et al.9. Los valores de absorbancia fueron medidos durante 10 min y ajustados a una curva de calibracin DPPH (absorbancia = 0.01[M DPPH] + 0.0253) R2 = 0.9989 en un rango de (1 100 M). Las mediciones fueron realizadas a 515 nm. La actividad de secuestro para el catin ABTS+ (TRAP) fue desarrollada por mediciones del ensayo ABAP/ABTS. El radical ABTS fue generado en reaccin con ABAP, el cual acta como oxidante despus de una descomposicin trmica. En adicin a la actividad antioxidante, la concentracin depende de los radicales ABTS y por lo tanto, una disminucin en las absorbancias. Se utiliz Trolox anlogo de la vitamina E, como antioxidante de referencia; el TRAP fue expresado como capacidad antioxidante Trolox equivalente (TEAC); los valores fueron calculados mediante la siguiente ecuacin: (% inhibicin = 49.766[mM TEAC] -1.572) R2 = 0.9979 (Overveld et al.10 ). RESULTADOS Y DISCUSIONES cidos fenlicos y flavonoles, por HPLC En la Tabla 1, se muestra los resultados del contenido de cidos fenlicos y flavonoles de los vinos estudiados. Tabla 1. Contenido de fenoles expresado en (mg/L) en vinos producidos en Per.
Variedad Barbera-Malbec Tempranillo-MalbecCabernet Sauvignon Cabernet-Sauvignon Malbec-Tannat-Petit Verdot Tannat-Petit Verdot Malbec-Cabernet Sauvignon Malbec-Merlot Bodega Santa Gabriela. Chincha Alta cidos fenlicos Clorognico Cafeico Ferlico 0,242 0,856 0,165 0,254 0,138 1,357 0,235 0,355 8,393 5,267 15,083 4,466 6,499 5,296 7,105 3,182 0,840 3,444 0,590 5,664 2,612 0,354 0,369 0,334 Rutina 0,272 0,064 0,094 0,061 0,272 0,047 0,207 0,574 Flavonoles Quercetina 7,741 6,231 1,024 3,441 1,271 2,502 0,205 2,588 Kaempherol 1,391 1,189 0,023 0,642 0,227 0,032 0,133 0,274
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( Cont. Tabla 1 )
cidos fenlicos Clorognico Cafeico Ferlico 0,767 3,285 1,695 0,137 0,130 3,062 0,473 1,238 1,631 0,667 0,214 0,316 0,470 0,248 0,600 Rutina 0,309 0,017 0,421 0,100 0,275
Flavonoles Quercetina 2,080 1,322 0,444 0,563 0,199 Kaempherol 0,292 0,000 0,087 0,028 0,082
Tal como se observa en la Tabla 1, los contenidos de los cidos fenlicos y flavonoles es muy variable entre los vinos analizados, cuyos coeficientes de variabilidad se encuentran alrededor de 79 y 134 %; lo que indica una alta variabilidad; esta dispersin est asociada con las diferentes variedades de uva, rea geogrfica (condiciones climticas, altura, etc), edad del vino y el proceso de vinificacin (Gambelli y Santaroni)11. Por otro lado, los componentes, como el cido cafeico y rutina presentan una menor variabilidad respecto a la quercetina, kaempherol, cido clorognico y cido ferlico. Nuestros datos fueron confrontados con otros obtenidos por Gambelli y Santaroni11, los que muestran una concentracin de cido cafeico entre 2,5 a 17,9 mg/L y quercetina entre 1,5 y 12,8 mg/L mientras los vinos procesados en Per contienen quercetina entre 0,19 a 7,74 mg/L y cafeico entre 0,47 y 15,08 mg/L. Polifenoles totales por Folin-Ciocalteu En la Tabla 2, se muestra el contenido de componentes fenlicos de los vinos peruanos y el nmero de picos encontrados por HPLC. Tabla 2. Contenido de polifenoles totales en vinos producidos en Per.
Variedad/Zona Tannat-Petit Verdot (Ica) Malbec (Ica) Malbec- Cabernet Sauvignon (Ica) Malbec Merlot (Chincha) Cabernet-Sauvignon (Chincha) Malbec-Tannat- Petit Verdot (Ica) Tempranillo- Malbec- Cabernet Sauvignon (Ica) Total picos 27 21 23 27 26 28 23 Polifenoles totales (a) (mg GAE/L) 3321,67 2492,98 2364,40 2213,21 2212,02 2167,29 1821,55
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( Cont. Tabla 2 )
Variedad/Zona Grenache- Malbec (Ro Chilln) Bodega Santa Gabriela (Chincha) Barbera- Malbec (Caete) Oporto (Chincha) Borgoa (Caete) Cepa de Viedo Mendoza (Argentina)
(a)
Total picos 24 27 20 18 21 20
Polifenoles totales (a) (mg GAE/L) 1656,07 1540,60 1281,57 1207,26 721,55 627,50
De los datos mostrados en la Tabla 2, el contenido de polifenoles totales es muy variable; sin embargo, el nmero total de picos vrs. polifenoles totales presentan una correlacin ligeramente baja con un R2 de 37,49 %. Esta variacin entre estos parmetros es importante ya que los vinos difieren en su composicin con el tiempo de fabricacin 6. Antocianinas totales El contenido de antocianinas se presenta en la Tabla 3, los cuales son responsables del color rojo en los vinos. Tabla 3. Contenido de antocianinas expresado en malvidina-3-O-glucsido
Variedad/Zona Grenache-Malbec (Ro Chilln) Bodega Santa Gabriela (Chincha) Tannat-Petit Verdot (Ica) Malbec-Tannat-Petit Verdot (Ica) Barbera-Malbec (Caete) Malbec (Ica) Malbec-Merlot (Chincha) Tempranillo-Malbec-Cabernet Sauvignon (Ica) Cabernet-Sauvignon (Chincha) Borgoa (Caete) Malbec-Cabernet Sauvignon (Ica) Cepa proveniente de Viedo Mendoza Argentina Oporto
(a)
(mg malvidina-3-O-glucsido/L) 291,51 184,25 130,62 126,29 111,59 101,21 82,18 61,42 58,82 52,77 52,77 52,77 <5,00
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En la Tabla 3 se muestra el contenido de antocianinas de los vinos producidos en Per, los cuales presentan una disminucin en el contenido de antocianos. En otros estudios realizados se reporta que en vinos con edad mayor de 5 aos slo la malvidina-3-O-glucsido se encuentra en mayor concentracin que el resto de antocianos; sin embargo, la petunidina est presente en vinos jvenes; por otro lado, la peonidina y la cianidina decrecen durante el envejecimiento, mientras que la delfinidina se encuentra en concentraciones bastante reducidas.11 Parmetros de color En la Tabla 4 se muestra los resultados de intensidad del colorante, tonalidad, % de rojo, % de azul, y % de amarillo. Tabla 4. Parmetros glories de los vinos producidos en Per.
Variedad Tempranillo-Malbec-Cabernet Sauvignon Cepa de Bodega santa Gabriela. Chincha Alta Malbec Grenache-Malbec Malbec-Cabernet Sauvignon Malbec-Merlot Cepa de Viedo Mendoza Argentina Oporto Cabernet-Sauvignon Borgona Malbec-Tannat-Petit- Verdot Tanta Petit verdot Barbera- Malbec Intensidad del colorante 0,541 0,731 0,661 0,616 0,863 0,862 0,316 0,307 0,672 0,339 0,677 0,774 0,688 Tonalidad 1,05 1,17 1,19 1,23 1,25 0,95 1,55 12,19 1,01 1,18 1,16 1,15 1,10 % rojo 41,02 39,99 39,28 39,65 39,10 42,52 34,11 7,25 41,66 40,34 39,53 40,01 31,21 % azul % amarillo 15,93 13,25 13,85 11,46 12,19 17,25 12,95 4,31 16,06 12,09 14,72 13,94 34,39 43,05 46,76 46,87 48,89 48,72 40,23 52,94 88,44 42,28 47,57 45,76 46,05 34,39
De la Tabla 4, se observa que el color en los vinos es uno de los principales parmetros cualitativos, especialmente en vinos tintos, debido a que representan el primer factor organolptico que percibe el degustador.
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En la Tabla 5, se muestra los resultados del ensayo de DPPH frente a los vinos; los valores se registraron a 515 nm, durante 5 y 10 minutos; se us una curva de calibracin de DPPH, la que se encontraba en un rango de 1 a 100 M (y = 0,01x - 0,0253, R2 = 0,9989). Tabla 5. Capacidad de secuestro del radical DPPH.
Ensayo DPPH (M) 5 minutos Tanta-Petit Verdot (Ica) Malbec Merlot (Chincha) Malbec-Cabernet Sauvignon (Ica) Cabernet-Sauvignon (Chincha) Malbec- Tanta- Petit-Verdot (Ica) Tempranillo- Malbec- CabernetSauvignon (Ica) Grenache-Malbec (Ro Chilln-Lima) Malbec (Ica) Barbera- Malbec (Caete) Bodega Santa Gabriela (Chincha Alta) Borgoa (Caete) Cepa de Viedo Mendoza Argentina Oporto (Chincha) 872,88 552,12 525,09 512,96 469,98 401,16 342,62 335,68 301,55 291,56 166,15 58,54 31,78 10 minutos 1007,88 611,25 593,35 581,94 516,18 439,06 393,42 385,98 354,13 337,44 192,41 69,03 36,17
Variedad/Zona
Estos resultados demuestran que el vino formulado con la variedad de uva tanta-petit verdot present una mayor capacidad de secuestro frente al radical DPPH; sin embargo, el contenido de polifenoles, versus la actividad antioxidante, presentaron una alta correlacin; los vinos de menor color tienen una menor actividad. En la figura 2, se muestra esta correlacin. En la Tabla 6, se muestra los resultados del porcentaje de ABTS, inhibicin y TEAC; para los radicales generados por el sistema ABAP/ABTS, tambin se report que la misma variedad present una alta capacidad de secuestro.
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Sin lugar a duda, los vinos presentan una buena capacidad antioxidante frente a los radicales libres; diversas investigaciones tratan de identificar qu polifenol o grupos de polifenoles presentes en vinos contribuyen ms a su capacidad antioxidante. El nmero de grupos fenoxil incrementan esta actividad, como se determin para el ensayo DPPH y ABTS.
4000
Polifenoles totales (mg GAE/L)
30 25 20 15 10
0 500 1000 1500
Nmero de picos
Figura 2. Correlacin frente a polifenoles totales y actividad antioxidante; relacin nmero de picos vs polifenoles totales.
+ Tabla 6. Valores de TEAC mediante el ensayo ABAP/ABTS
Variedad/Zona Tanta-Petit Verdot (Ica) Malbec-Cabernet Sauvignon (Ica) Malbec Merlot (Chincha) Cabernet-Sauvignon (Chincha) Malbec-Tannat- Petit-Verdot (Ica) Tempranillo-malbec-cabernet-Sauvignon (Ica) Malbec (Ica) Grenache- Malbec (Ro Chilln-Lima) Barbera- Malbec (Caete) Bodega Santa Gabriela (Chincha Alta) Borgoa (Caete) Cepa de Viedo Mendoza Argentina Oporto (Chincha)
Mxima inhibicin, % 86,060,11 83,760,11 80,280,20 77,710,20 67,130,30 67,130,30 53,450,20 47,400,30 45,560,20 45,040,11 31,890,30 19,000,11 10,590,11
TEAC (mM) 17,610,023 17,150,023 16,450,040 15,930,040 13,800,061 13,770,061 11,060,040 9,840,061 9,470,040 9,370,023 6,720,061 4,130,023 2,440,023
Datos obtenidos por triplicado. TEAC ajusta a curva (y = 49,766x - 1,5722, r2 = 0.9979)
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CONCLUSIONES Los resultados obtenidos muestran que, de los vinos evaluados, el que fue elaborado con las variedades Tannat y Petit Verdot present mayor concentracin de compuestos fenlicos y capacidad antioxidante, por ambos mtodos. Adems, se encontr que en los vinos estudiados el contenido de compuestos fenlicos y antocianinas es variado, lo que puede deberse a condiciones de edad, tipo de proceso, altura y variedad de las uvas; estos factores tambin afectan la capacidad antioxidante de los vinos. Por lo que es necesario monitorear el comportamiento de compuestos fenlicos durante el envejecimiento de los vinos, para elaborar una cartilla de identificacin nutricional. Es importante tambin, en funcin de los resultados obtenidos, elaborar una clasificacin resaltando la capacidad antirradical, que servir de conocimiento para las vitivincolas en el momento del procesamiento de los vinos, tratando de optimizar al mximo cada uno de los procesos y operaciones, cuidando no slo las condiciones organolpticas del vino sino tambin los metabolitos secundarios que presentan efectos benficos para la salud. AGRADECIMIENTOS Al Dr. Frank Valentn Lizaraso Capar, Decano de la Facultad de Medicina Humana y al Dr. Benjamn Castaeda Castaeda, Director del Instituto de Investigacin de la FMH-USMP. REFERENCIAS Vila H. 2002. Efecto del tiempo de maceracin sobre el color, la composicin tnica y la astringencia de vinos Cabernet-Sauvignon y Malbec. Tesis Maestra. Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Cuyo. Mendoza, Argentina. pp 6 -7. 2. Frankel EN, Watherhouse AL, Teissedre PL. 1995. Principal phenolic phytochemicals in selected California wines and their antioxidant activity in inhibiting oxidation of human low-density lipoproteins. J. Agric. Food Chem. 43: 890 894. 3. Fernndez-Pachn M.S, Villao D, Garca-Parrilla M.C, Troncoso A.M. 2004. Antioxidant activity of wines and relation with their polyphenolic composition. Analytica Chimica Acta 513 (1): 113 - 118. 4. Bravo MN, Silva S, Coelho AV, Vilas-Boas L, Bronze MR. 2006. Analysis of phenolic compounds in Muscatel wines produced in Portugal. Analytica Chimica Acta 563: 84 - 92. 5. Ivanova D, Gerova D, Chervenkov T, Vankova T. 2005. Polyphenols and antioxidant capacity of Bulgarian medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology 96: 145 150. 6. Ribreau-Gayon J, Stonestreet J. 1965. Le dosage des anthocyanes dans le vin rouge. En : Casassa F, Sari S. 2006. Aplicacin del sistema Cie-Lab a los vinos tintos: correlacin con algunos parmetros tradicionales. Revista de Enologa N 5/8 Ao III. 7. Orak HH. 2006. Total antioxidant activities, phenolic, anthocyanins, polyphenoloxidase activities and its correlation of some important red wine grape varieties which are grown in Turkey. Electronic Journal of Polish Agricultural Universities: Food Science and Technology 9(1): 9 p. 8. Casassa F, Sari S. 2006. Aplicacin del sistema Cie-Lab a los vinos tintos. Correlacin con algunos parmetros tradicionales. Revista de Enologa N 5/8 Ao III. 9. Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C. 1995. Use of free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 28: 25 - 30. 10. Overveld FWPC, Haenen GRMM, Rhemrev J, Vermeiden JPW, Bast A. 2000. Tyrosine as important contributor to the antioxidant capacity of seminal plasma. Chemico-Biological Interactions 127: 151 - 161. 11. Gambelli L, Santaroni GP. 2004. Polyphenol content in some Italian red wines of different geographical origins. Journal of Food Composition and Analysis 17: 613 - 618. 1.