CO-INMUNOPRECIPITACIN Advertencia: se deben de contar con suficiente lisado proteco cuantificado, ya que sobre este lisado se realiza la estandarizacin

del control de carga y los geles experimentales. 1. En una caja (cantidades para caja de 60 mm) de cultivo de clulas de mamfero adherentes y transfectadas con las protenas de inters, retirar el medio cuidadosamente y dar 2 lavados con PBS frio, teniendo cuidado de no despegar la monocapa. CAJA DE 150 mm 2. Llevar al hielo y aadir 150 l de buffer de lisis (1% triton X-100) ms 10 l de inhibidor de proteasas. Se despega la monocapa con la palita raspadora.800 ul para las 2 cajas 3. Se homogeniza con pipeta y se transfiere a un tubo eppendorf. 4. Se agita en hielo por 20 min. 5. Se centrifuga 10 min a 13000 rpm a 4C, al finalizar el sobrenadante debe estar claro, si no es as se repite el paso de centrifugacin. En este paso se selecciona el volumen para el control de carga al hacer el western blot y se cuantifca protena. 6. Se usa un volumen proporcional a el control de carga cuantificado en el westernblot para el resto de la co-inmunoprecipitacion. 7. Para pre-aclarar la muestra se aaden las perlas de protena A/G agarosa a una concentracin de 30 l de perlas por cada mililitro de muestra y se incuba por 30 min a 4C en agitacin. (para cajas de 60mm con 200 l de buffer de lisis aadir 7.5 l de perlas de agarosa preparadas) 8. Se centrifuga la muestra a 3000 g por 30 segundos y se transfiere el sobrenadante a un tubo nuevo. 9. El sobrenadante final se incuba toda la noche a 4C en agitacin con 0.5 l de anticuerpo primario y se mezcla muy bien.1 ul DE ANTI-MYC 10. Se preparan las perlas de protena A/G agarosa, tomando 300 l del STOCK y dando 2 lavados con 300 l de buffer de lisis con triton X-100 aadido y centrifugando a 3000g por 30 segundos. Al final se disuelven las perlas en 100 l de buffer de lisis. 11. Se aaden las perlas de protena A/G agarosa preparadas a una concentracin de 140 g/l o a una proporcin de 1:1 de perlas y muestra y se mezcla muy bien a 4C por 4 horas. 12. Se centrifuga la mezcla a 3000g por 30 segundos y se retira el sobrenadante (que equivale a 1 volumen). 13. Al pellet se le aade un volumen igual de buffer de lavado frio y se vortexea, se centrifuga a 3000g por 30 s y se retira el sobrenadante. 14. Se repite 5 veces el paso 13. 15. Despus del ltimo lavado se aade 75 l de buffer de carga para SDS-PAGE y se calienta a 95C por 5 min. 16. Se centrifuga la mezcla a 3000g por 30 segundos y se transfiere al sobrenadante a un tubo eppendorf nuevo. 17. Se corre el gel desnaturalizante. 18. Para el inmunobloting: Una vez finalizado el SDS-PAGE se transfiere el gel a la membrana de nitrocelulosa, esto se hace colocando el gel y la membrana entre 2 piezas de papel y este sndwich se coloca en el soporte de transferencia.

19. La transferencia se corre en la cmara de electroforesis por 1hora a 120 volts y en condiciones frias. 20. Terminada la transferencia se bloquea la membrana por al menos 2 horas a temperatura ambiente y en agitacin, con PBS tween 0.1% y 5% de leche. 21. Al finalizar el bloqueo se aade el anticuerpo primario (1:200) por toda la noche. 22. Se lava con PBST 4 veces por 10 min cada lavado a 4C. 23. Se incuba con el anticuerpo secundario (1:60000) por 1 hora a temperatura ambiente en PBST 5% de leche. 24. Se lava 3 veces por 10 min con PBST y se revela.

BUFFER DE LISIS 20 mM Hepes 100 mM NaCl 1mM EDTA 1% Triton X-100 Inhibidor de proteasas 1X Para el inhibidor de proteasas se disuelve 1 tableta en 2 ml de agua y se alcuota en porciones de 50 l a -20C (concentracin 25X y es estable por 20 das) BUFFER DE CARGA 3.55 ml de agua 1.25 ml de Tris-HCl 0.5 M 2.5 ml de Glicerol 2 ml de SDS 10% 0.2 ml de azul de bromofenol 0.5% 30l de betamercaptoetanol

BUFFER DE CORRIDA (SDS) (1lt) Tris base 25 mM (3.02 g) Glicina 192 mM (14.41 g) SDS 1% BUFFER DE LAVADO DE PERLAS 20 mM Tris-HCl 150 mM NaCl 0.5% triton X-100 Se ajusta pH 7.4 se esteriliza por filtracin y se usa por 1 mes. BUFFER DE TRANSFERENCIA EN INMERSION (1lt) Tris Base 48 mM (5.81g) Glicina 39 mM (2.92g) Metanol 20%

PBST PBS ms 0.1% de tween.

ANTICUERPOS Anti-GFP para ver en western-blot se usa 1:1000. El anti Myc se usa 1:1000. El anti-mouse HRP se usa 1:60000. El anti-rabbit HRP se usa 1:5000.

Para el control: Se corre un western Blot contra la protena B previamente cuantificada en los lisados totales, despus se corre otro western blot normalizando la seal de la protena B y este sera el gel control de carga, los mismos volmenes se aaden (pero escalados) para hacer la inmunoprecipitacin de la protena A. Se corre un gel que ser revelado contra la protena B y otro contra la protena A la cual es la que se inmunoprecipit.