Universidade de So Paulo Instituto de Fsica de So Carlos Bacharelado em Cincias Fsicas e Biomoleculares Biologia Celular e Molecular I 2012 Aula Prtica

ica 2: ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE E REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) A. Eletroforese em gel de agarose A eletroforese uma tcnica utilizada para separar molculas basicamente por carga e tamanho. O equipamento utilizado chama-se cuba de eletroforese e possui dois eletrodos: um negativo e outro positivo, capazes de gerar um campo eltrico. Desta forma, as molculas so colocadas em um suporte (gel) e migram para o polo que as atrai. Por exemplo, se a molcula for negativa, migrar para o polo positivo. O tamanho e a forma da molcula influenciam na velocidade com a qual a molcula migrar no gel. Quanto maior o tamanho e quanto mais complexa a forma, mais tempo demorar para que a molcula movimente-se em direo ao polo de atrao. Molculas de DNA possuem carga negativa devido aos grupamentos fosfato dos nucleotdeos. Desta forma, ao serem submetidas a um campo eltrico, migram em direo ao eletrodo positivo, sendo a velocidade de migrao dependente do tamanho da molcula. Para eletroforese de DNA, h dois tipos principais de tcnicas: 1) Eletroforese em gel de agarose: a agarose um polissacardeo extrado de uma alga marinha que quando solidificado forma uma rede porosa. A concentrao de agarose utilizada para fazer o gel influencia no tamanho do poro formado. Maiores concentraes de agarose produzem poros menores, dificultando a migrao de grandes molculas de DNA. Geralmente, o gel de agarose utilizado para separao de fragmentos de DNA de tamanhos superiores a 50 pb e tem menor capacidade de resoluo que o de acrilamida, porm apresenta maior extenso de separao, sendo que longos fragmentos de DNA (at 20.000 pb) podem ser separados em gel de agarose dependendo das concentraes usadas. A agarose no txica. 2) Eletroforese em gel de poliacrilamida: a poliacrilamida uma mistura de acrilamida (polmero linear) e bisacrilamida (polmero em forma de T). Geralmente, a poliacrilamida utilizada para separar fragmentos de DNA com tamanho inferior a 500 pb. A acrilamida neurotxica. Procedimento Na aula de hoje, utilizaremos a eletroforese em gel de agarose 0,8% para analisar a presena e a integridade do DNA genmico extrado da bactria Streptomyces clavuligerus na aula anterior. 1) Prepare um gel de agarose 0,8%: Pese 0,4 g de agarose, coloque-a em um erlenmeyer, e adicione 50 mL de tampo TAE [1X] (Tris-acetato-EDTA). Aquea a mistura na chapa aquecedora, em agitao, at a completa solubilizao da agarose (a soluo torna-se lmpida). 2) Espere esfriar at uma temperatura onde seja possvel encostar-se ao erlenmeyer, e adicione 5 L de soluo do corante Sybr Safe (10.000X concentrado, Invitrogen). 3) Coloque, no bero do gel, o pente para formar os poos. Verta o gel sobre o bero e espere solidificar (cerca de 15 min). Vide figura (a) a seguir. 4) Cuidadosamente, retire o pente do gel e coloque-o na cuba de corrida preenchida com tampo TAE. Vide figura (b) a seguir.

5) Em um tubo de 0,5 mL, misture 10 L de DNA genmico e 2 L de tampo de amostra (soluo contendo: 20% (m/v) de Ficoll 400; 0,1 M de EDTA pH 8,0; 0,1% (m/v) de SDS e 0,25% (m/v) de azul de bromofenol). 6) Aplique a mistura em um poo do gel de agarose 0,8%. Em outro poo, aplique 4 L do marcador de pares de bases (possui bandas de tamanhos conhecidos que servem como guia para identificar o tamanho dos fragmentos da amostra a ser analisada). 7) Ligue a cuba de eletroforese a 110 V por aproximadamente 1h. 8) Utilize o transluminador no comprimento de onda de 470 nm para analisar o resultado. Questes 1) Quais as funes do tampo de amostra e do tampo de corrida? 2) A visualizao do DNA poderia ser feita por colorao do gel com brometo de etdeo e visualizao em 260 nm. Por que usado Sybr Safe e luz de 470 nm ao invs de brometo de etdeo? 3) Qual foi o resultado das amostras de DNA genmico extradas na aula passada? B. Reao em cadeia da polimerase (PCR) A tcnica da reao em cadeia da polimerase (PCR, Polymerase Chain Reaction) foi desenvolvida por Kary Mullis nos anos 80 e lhe propiciou o prmio Nobel de Qumica em 1994. A PCR permite amplificar um gene de cpia nica em milhes de cpias, a partir de uma pequena quantidade do DNA original (DNA molde). O pr-requisito essencial a determinao da regio do gene que ser amplificada. Em seguida, so desenhados e sintetizados um par de oligonucleotdeos iniciadores (primers) complementares s regies flanqueadoras da sequncia a ser amplificada em cada fita do DNA. Geralmente, primers especficos possuem tamanho entre 17 a 30 nucleotdeos, teor de GC entre 40 a 60% e no so auto-complementares ou complementares entre si. O processo composto de trs etapas: desnaturao, anelamento (hibridizao) e extenso, que juntas correspondem a um ciclo da reao. Normalmente so realizados de 25 a 35 ciclos para cada reao na qual a taxa de amplificao exponencial, 2 n de ciclos. 1) Desnaturao: a 94 C, as fitas do DNA so separadas. 2) Anelamento: geralmente entre 45 a 65 C, os primers se hibridizam com suas sequncias complementares no DNA molde desnaturado. 3) Extenso: a 72 C, a DNA Polimerase, na presena ons Mg2+ e dNTPs (desoxinucleotdeos), sintetiza uma nova fita de DNA a partir da extremidade 3 OH do primer que se encontra hibridizado ao DNA molde. A descoberta da enzima Taq DNA Polimerase, oriunda da bactria Thermus aquaticus, que vive em fontes hidrotermais, permitiu

automatizar o processo utilizando-se os termocicladores. A enzima Taq possui uma atividade tima a 72 C, mas permanece estvel at 94 C. Alm da amplificao para clonagem molecular, a tcnica de PCR possui outras aplicaes como: teste de paternidade, diagnstico de doenas genticas e infecciosas, medicina forense, testes de organismos transgnicos, anlise de polimorfismo de DNA, sequenciamento de DNA e vrias aplicaes no uso das metodologias do DNA recombinante. Procedimento A partir do DNA genmico de Streptomyces clavuligerus, ser amplificado por PCR o gene cas2, que codifica a protena clavaminato sintase (CAS). A clavaminato sintase uma protena Fe (II)/2-oxoglutarato oxigenase importante na biossntese do cido clavulnico, um produto do metabolismo secundrio utilizado na indstria farmacutica como antibitico. 1) Coloque os regentes para degelar no banho de gelo e realize todo o preparo das amostras no gelo para evitar que as reaes se iniciem prematuramente. 2) Em um tubo de 0,2 mL, prepare a reao no volume final de 50 L conforme discriminado na tabela a seguir. Pipete os reagentes na mesma sequncia em que eles aparecem na tabela. Reagente gua milli-Q estril Tampo da Taq DNA Polimerase (10X) MgCl2 (25 mM) dNTPs (10 mM) Primer forward (100 pmol/L) Primer reverse (100 pmol/L) DMSO (dimetil sulfxido) DNA molde (DNA genmico) Pfu DNA Polimerase (1 U/L) Quantidade 32,5 L 5 L 5 L 1 L 1 L 1 L 2,5 L 1 L 1 L Concentrao Final 1X 2,5 mM 0,2 mM 100 pmol 100 pmol 5% 0,1 1 g 1U

3) Coloque o tubo no termociclador sob as seguintes condies de reao: Etapa Desnaturao inicial 35 ciclos (Desnaturao, anelamento e extenso) Extenso final Armazenamento Temperatura 95 C 94 C 69 C 72 C 72 C 4 C Tempo 5 min 30 s 1 min 90 s 10 min

A figura a seguir esquematiza os dois primeiros ciclos de reao.

Questes 1) 2) 3) 4) Descreva sucintamente a finalidade da PCR. Por que a PCR resulta em um fragmento de DNA de tamanho determinado? Em uma PCR convencional, partindo de uma molcula de DNA, qual o nmero de molculas aps 30 ciclos? Se fosse colocado apenas um dos primers, qual seria o nmero de molculas aps 2 ciclos? E aps 30 ciclos?

Informaes adicionais No site NCBI (National Center for Biotechnology Information), esto disponveis sequncias de genes, RNA e protenas de diversos organismos. No link http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6840451 encontram-se os registros para o gene cas2 (Gene ID: 6840451). Para mais informaes sobre as tcnicas, consultar : Sambrook J, Russel DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3th Edition. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 2001.