MANEJO DE MUESTRAS

La fiabilidad de un resultado laboratorial y su interpretacin dependen en gran parte de la calidad del material enviado al laboratorio. Por lo tanto, el manejo adecuado de las muestras, desde que se obtienen hasta que se procesan, es fundamental. Aunque las caractersticas de las muestras se indican concretamente en cada anlisis existen algunas normas de manejo de muestras que son bastantes generales. Estas normas se pueden clasificar en dos grandes apartados: Obtencin de la muestra En las extracciones de sangre, la puncin debe ser lo ms limpia posible evitando explorar con la aguja Enviar el volumen requerido y el tipo de muestra adecuado a el/ los test/s que se piden, utilizar el tubo indicado para cada caso, y respetar las seales de llenado del tubo. Mantener la muestra a temperatura ambiente o en nevera segn se indique. No congelar nunca la muestra a no ser que se especifique en la lista de pruebas. Para evitar la Lipemia que interfiere en muchos tests, es imprescindible dejar al animal en ayunas durante unas 12 horas Identificacin de la muestra Rellenar correctamente y lo mas completo posible el formulario de peticin de anlisis (facilitado por Vet Lab o disponible en www.vetlabsl.com) de forma legible. Dar al laboratorio la mayor informacin posible. No existen detalles insignificantes. Indicar tratamientos y vacunaciones as como una lista de sospechas de la enfermedad y la fecha y hora de obtencin de la muestra A nadie le gusta rellenar formularios, pero el laboratorio no puede trabajar sin ellos. La muestra se procesa segn las peticiones escritas en el formulario no en el tubo de la muestra. Se debe marcar claramente en todos las muestras, a quien pertenece y el origen de la muestra. A menudo de se remiten muestras de ms de un animal en el mismo envo, en ese caso, marcar los nombres diferenciables en cada tubo de forma clara y legible 1.- HEMATOLOGIA Las muestras de sangre entera para Hematologa son relativamente frgiles y requieren un cuidado especial: Evitar el exceso de succin durante la extraccin sangunea para no provocar hemlisis. Despus de la extraccin, la sangre debe ponerse en tubos con anticoagulante y mezclar cuidadosamente. El EDTA es el anticoagulante preferido para la mayora de exmenes hematolgicos Siempre que sea posible, asegurarse de que la relacin anticoagulante/sangre sea la correcta, llenando el tubo hasta el lugar indicado para evitar fenmenos de dilucin y/o distorsin celular por exceso.

 Realizar frotis sanguneos inmediatamente y/o refrigerar la sangre. El contacto prolongado de la sangre con el anticoagulante induce distorsiones celulares e incluso hemlisis a los 3 das a temperatura ambiente. No se pueden realizar contajes celulares en sangres de mas de 4 das de antigedad. | | 2.- COAGULACION La evaluacin laboratorial de los pacientes con defectos hemostticos requiere una atencin meticulosa en la metodologa y en los controles de calidad. Los estudios de coagulacin, son reacciones enzimticas que estn marcadamente influenciadas por manejos inadecuados de las muestras. Para evitar errores debidos al manejo de las muestras, se deben seguir las siguientes recomendaciones: Las muestras deben obtenerse con un grado de excitacin del animal mnimo, y sin excesivos pinchazos. Evitar la toma de muestras a partir de catteres, y usar siempre tubos de plstico con Citrato Sdico al 3,8% especficos para pruebas de coagulacin. Evitar los tubos de vidrio. Una vez obtenida la muestra, mezclar el tubo suavemente y dejar reposar 5-7 minutos. A continuacin, centrifugar la muestra a 2500-3500 rpm durante 15 minutos y separar el plasma por pipeteado a otro tubo de plstico dentro de los 30 primeros minutos post-extraccin. Refrigerar en caso de envo rpido, o congelar en caso de envo retardado (pueden aguantar 2 semanas). Si se quieren congelar las muestras, una vez separado el plasma debe realizarse una congelacin rpida en alcuotas para prevenir la formacin de cristales. La congelacin o descongelacin lentas pueden producir la crioprecipitacin de algunos factores de coagulacin. Los sistemas de coagulacin de los animales se activan a menudo ex vivo durante la toma o el transporte de la muestra. Existirn algunos casos donde sea aconsejable la extraccin de la muestra con jeringa citratada. En estos casos es mejor poner la cantidad justa del anticoagulante en la jeringuilla y hacer la venipuncin. Si se observa hemlisis o algn

cogulo, repetir la extraccin. La relacin anticoagulante/sangre, es crtica. El anticoagulante a usar es 1 parte de citrato sdico al 3,8 % y 9 partes de sangre. La desviacin de esta relacin limita la disponibilidad del calcio en el sistema y puede ser una causa de error. Ejemplo: para conseguir un volumen total de muestra de 3 cc se deben poner en la jeringa 0,3 cc de citrato y extraer 2,7 cc de sangre (0,3 x 9) 3.- BIOQUIMICA CLINICA La existencia del gran nmero de tests bioqumicos actualmente disponibles hace que esta disciplina aporte una amplia informacin sobre diferentes aspectos del metabolismo del paciente. Sin embargo, es importante recordar que no se deben usar los tests bioqumicos como sustitutos de otros procedimientos clnicos (examen fsico, RX...) Las investigaciones laboratoriales, deben ser una extensin de los exmenes clnicos y no una alternativa. | | Se pueden aplicar, en general, unas normas de manejo para este tipo de muestras:

 Para obtener suero, recoger la muestra sin anticoagulante y dejar coagular durante 1-3 horas. Una vez coagulada la muestra y retrado el cogulo, centrifugar, separar el suero y ponerlo en un tubo de plstico. Asegurarse de que todas los hemates se han quedado en el primer tubo para evitar la hemlisis durante el envo. Marcar el tubo, y refrigerar o congelar si no se va a enviar en los prximos 3 das. Normalmente por cada 1 cc de sangre entera se pueden obtener 0.3 cc de suero. | En caso de que la muestra solicitada se plasma (EDTA o Heparina), recoger la sangre en
tubos con anticoagulante, y centrifugar dentro de los 15 primeros minutos. Separar el plasma a tubos de plstico sin nada y refrigerar o congelar segn se indique. El envo de una muestra de sangre entera coagulada y no separada no es muy aconsejable. | Actualmente y en nuestro laboratorio, las causas ms frecuentes de resultados errneos, son: Interferencias por Hemlisis, Ictericia o Lipemia Muestra insuficiente Interferencia por extraccin sangunea post-tratamientos. Para un diagnstico correcto es vital extraer las muestras ANTES de cualquier terapia. 4.- ENDOCRINOLOGIA Excepto algunas hormonas que requieren unas condiciones de manejo especiales (indicado en el listado de pruebas analticas), y que es imprescindible seguir escrupulosamente, podemos decir que para las pruebas de Endocrinologa, se deben seguir exactamente las condiciones de manejo explicadas en el apartado de Bioqumica. | | El anlisis hormonal ideal no existe, y aunque los inmunoensayos que actualmente se utilizan sean fiables, la mayora de ellos suelen ser especficos de especie. En los animales, existen hormonas que tienen estructuras qumicas muy similares en todas las especies y otras que no. Esto implica que cada laboratorio debe realizar sus propios procesos de validacin de estas tcnicas. Por lo tanto, de la misma muestra en laboratorios diferentes se pueden obtener resultados diferentes. Es decir, el resultado debe interpretarse en relacin a los valores de referencia determinados para cada laboratorio, aunque la interpretacin del resultado, desde el punto de vista clnico, debe ser el mismo en todos ellos. 5.- FARMACOLOGIA TOXICOLOGIA La monitorizacin de las concentraciones plasmticas de un frmaco durante una terapia se usa para optimizar el rgimen de administracin a un paciente. Estas monitorizaciones estn indicadas cuando no hay una respuesta teraputica, cuando existe sospecha de toxicidad o para confirmar un abordaje teraputico. La concentracin de droga requerida en plasma para producir una respuesta teraputica adecuada se llama rango teraputico de la droga. Concentraciones por debajo de este rango se consideran sub-teraputicas, mientras que las concentraciones superiores al rango se consideran como txicas. Debido a que ciertas protenas transportadoras del plasma pueden producir interferencias en el test ,es imprescindible consultar con el laboratorio el tipo de muestra requerido para cada frmaco.

6.- URIANALISIS El objetivo del laboratorio es analizar muestras cuyas caractersticas in vitro, sean similares a las existentes in vivo. La orina es una mezcla inestable e impredecible, por esta razn, es recomendable que las muestras de orina sean examinadas tan pronto como sea posible o bien sean debidamente conservadas (aunque no exista preservativo ideal para todos los tests rutinarios en orina). Tanto desde el punto de vista citolgico como qumico, el urianlisis presenta algunas peculiaridades:

Aunque la composicin de la orina puede variar considerablemente durante el da, una muestra obtenida en cualquier tiempo del da puede ser satisfactoria para realizar anlisis de screening. Para el urianlisis hay que enviar una cantidad suficiente de orina reciente en un recipiente estril y especial para orina y hermticamente cerrado. Indicar siempre el mtodo de recogida de la orina ( Cistocentesis, sondaje,....) No se sabe bien cuanto tiempo pueden mantenerse las muestras de orina a temperatura ambiente sin que se afecta su composicin. Si se sospecha un ligero retraso en el anlisis o en el envo, mantener el recipiente refrigerado y sin luz para las pruebas qumicas. En las infecciones de orina, es muy importante obtener una muestra de orina no contaminada, para el ensayo cuantitativo de bacteriuria y piuria. La mayora de errores en el manejo de las infecciones del tracto urinario son debidos a errores en la recogida de muestras. El mtodo de eleccin para recoger la muestra es la Cistocentesis realizada de forma asptica Se debe realizar el cultivo a las 2 horas de la recogida, (no se deben cultivar orinas que han estado 2-3 horas a temperatura ambiente) o bien refrigerar la muestra al momento. Los contajes bacterianos son estables durante 24-36 horas en muestras refrigeradas 7.- MICROBIOLOGIA Si los usamos de forma correcta, los cultivos microbiolgicos pueden identificar agentes etiolgicos y por lo tanto, contribuir al diagnstico final, en cambio, estos mismos cultivos, usados incorrectamente pueden identificar agentes contaminantes y llevar a diagnsticos incorrectos. El valor de los cultivos microbiolgicos depende en gran parte de cmo se toma, se guarda y se enva la muestra. La prdida del agente etiolgico suele ser por que el medio de transporte o las tcnicas de conservacin son inadecuados. Las muestras se deben tomar aspticamente y ponerlas en el recipiente adecuado. | | Cuando empleamos una torunda es importante obtener una muestra suficiente, ya que los organismos existentes en la torunda son menos que los existentes en el tejido y puede que se pierdan algunos de los organismos ms lbiles durante el transporte de la muestra

 Marcar todas las muestras con el tejido de origen y la especie. El mismo agente bacteriano puede ser mucho o poco significativo dependiendo del tejido y/o de la especie de donde se obtiene la muestra. Adems dependiendo del tejido y de la especie de origen, se pueden requerir diferentes medios de cultivo para identificar y aislar agentes patgenos especficos Especificar siempre los tests que se piden y los patgenos que se sospechan, sobre todo en muestras donde pueda existir una flora bacteriana normal (heces, piel, mucosas orales ... ). Algunos especmenes requieren medios de transportes especiales. Las muestras de fluidos (cavidad corporal, pericardio, articulaciones ...) es mejor enviarlos en botellas de hemocultivo. Nunca enviar fluidos u otros especmenes en tubos con EDTA, ya que el EDTA es muy txico para las bacterias. Los especmenes para el aislamiento de patgenos anarobicos, requieren un cuidado especial, ya que las bacterias anaerbicas mueren en presencia de oxgeno. Si se tienen dudas sobre que muestras obtener y como obtenerlas llamar al laboratorio primero. | Los tests de susceptibilidad (antibiogramas) se efectan en aquellos cultivos donde ha habido un crecimiento suficiente, bajo condiciones de calidad controladas y que se consideran que contribuyen a la enfermedad. Las muestras obtenidas de animales bajo tratamiento puede que no den resultados satisfactorios por algn grado de supresin del organismo. | Los cultivos enviados para la identificacin deben ser cultivos puros, las placas que llegan al laboratorio con crecimientos mixtos no se examinan Para el cultivo de dematofitos, el rea cutnea afectada debe ser limpiada, y tomar raspados y/o arrancar pelos de los bordes activos, ponerlos en un contenedor estril, y enviar a temperatura ambiente. La mejor muestra son los pelos fluorescentes a la lmpara de Wood. El aislamiento e identificacin de algunos agentes micticos requiere a menudo un tiempo considerable y no se deben esperar los resultados antes de los 21 das, e incluso algunos organismos pueden requerir alrededor de 30 das 8.- ENFERMEDADES INFECCIOSAS Y PARASITARIAS 8.1.- PARASITOS INTERNOS Los diversos parsitos internos, tienen varios ciclos de vida. El ciclo de vida de la mayora de parsitos tiene al menos un estado en el cual se transmite de un husped a otro. Este estado es el que frecuentemente se detecta por los tests laboratoriales y se le llama estado diagnstico, y es el que puede abandonar el husped a travs de excreciones como heces o orina, o puede ser transmitido al prximo husped por artrpodos. Normalmente los tests usados estn destinados a detectar parsitos adultos o sus diversos estados del ciclo, como huevos, larvas en las excreciones o sangre de nuestros animales. Parsitos en heces: Preferiblemente, las muestras fecales deben ser recogidas del recto, y si esto no es

posible, se debe recoger la parte superior de heces recin depositadas. Las muestras fecales deben enviarse en los contenedores especiales para este uso, Y NO EN OTRO TIPO DE CONTENEDOR Normalmente estas muestras no necesitan otra conservacin que la refrigeracin. La mayora de parsitos (excepto algunos protozoos) pueden identificarse incluso 23 das despus de la recogida Ahora bien, existen ciertas ocasiones donde el tiempo entre la recogida y el examen puede ser mayor (o no se puedan refrigerar las muestras), y los huevos de los parsitos pueden eclosionar. En estos casos se deben guardar las muestras con Formol al 10 %. NO CONGELAR NUNCA UNA MUESTRA DE HECES Es recomendable notificar la sospecha clnica, ya que en principio, cada una de las tcnicas empleadas tienen objetivos distintos. La tcnica de Baermann separa las larvas de primer estado de las heces (til para Strongyloides Stercolaris), y la flotacin separa las heces de los huevos de varias especies de helmintos y quistes de protozoos (no detecta los trofozoitos de Giardia, que deben buscarse en heces muy recientes o utilizar tecnologa ELISA) Los resultados se informan como NEGATIVO o como la presencia de algunos, bastantes, o numerosos organismos. Es importante recordar que un alto nmero de huevos puede indicar un alto nmero de parsitos, pero que un nmero bajo de huevos no indica necesariamente un nmero bajo de parsitos. Para la deteccin de Hemoparsitos el primer paso, y fundamental, es hablar con el laboratorio ya que el tipo de muestra sangunea a obtener variar segn la sospecha clnica que se tenga Para el diagnstico de Filariosis existen principalmente dos tets.: El test de Knott, que se usa para detectar e identificar microfilarias de D.Immitis circulante, y la metodologa ELISA, usada para la deteccin de antgeno de adulto circulante. Es muy raro que este test sea negativo en una animal infectado. Para otros hemoparsitos se realizan evaluaciones (normalmente del buffy coat) de frotis sanguneos obtenidos de sangre perifrica. Esta tcnica de examen del frotis sanguneo se est sustituyendo por la bsqueda de DNA del organismo mediante tcnicas de PCR. 8.2.- PARASITOS EXTERNOS Son tcnicas destinadas a identificar los agentes causantes de ciertas lesiones drmicas, que suelen ser parsitos profundos (Sarcoptes, Notoedres, Demodex ). La toma de muestras de estos procesos consiste en: Mojar la hoja de bistur en aceite mineral o glicerina y realizar raspados cutneos en los
bordes de la lesin. La hoja de bistur debe estar en ngulo recto a la piel y asegurarse de que el raspado es lo suficientemente profundo mediante la aparicin de una hemorragia puntual mnima. La muestra obtenida, debe ser de color rosado. Poner la hoja de bistur junto al material obtenido en un recipiente cerrado. En la actualidad disponemos de un test ELISA para la deteccin de anticuerpos en muestras de suero frente a Sarcoptes Scabiei y frente a dermatofitos. 8.3.- SEROLOGIA Las tcnicas usadas en Medicina Veterinaria, incluyen La IFI, ELISA, Inmunodifusion, Fijacion complemento, Aglutinacin por latex, Inmunoblots... En general, el veterinario prctico no

necesita saber las peculiaridades de cada mtodo, sino que lo que el clnico debe saber para interpretar un resultado positivo, es la fisiopatologia de la enfermedad, y el tipo de test usado. En general, estos tests serolgicos detectan IgM y/o IgG. En algunas situaciones, la diferenciacin entre IgM e IgG sirve de ayuda. En general, la IgM se produce durante un periodo de tiempo corto post-infeccin (7-10 das), y su vida media es corta (4-6semanas). El problema con las IgM es que no son muy especficas, ya que al ser pentmera, puede experimentar ms reacciones cruzadas con antgenos no especficos. Si el test detecta slo IgG hacia el organismo agresor, un animal permanecer seronegativo durante las primeras 3-4 semanas siguientes al inicio de la enfermedad.

Obviamente, la presencia de anticuerpos especficos a un organismo indica una exposicin previa a este organismo, pero no es una prueba categrica de que exista infeccin o de que la enfermedad actual este causada por el organismo en cuestin. Por lo tanto se requerir la documentacin de una seroconversin (un aumento x 4 en el ttulo de anticuerpos para propsitos diagnsticos) para la confirmacin del diagnstico. Se deben evaluar una muestra obtenida durante la enfermedad aguda temprana, y una segunda muestra obtenida aproximadamente 3 semanas despus, y siempre debe efectuarse la interpretacin con el conjunto de signos clnicos. 8.4.- BIOLOGIA MOLECULAR En medicina veterinaria La PCR es el mecanismo de biologa molecular ms utilizado en procesos de diagnstico. La PCR es una tcnica capaz de generar in vitro grandes cantidades de un fragmento determinado de DNA con una secuencia especfica, a partir de cantidades mnimas del mismo. La gran sensibilidad y versatilidad de este mtodo ha revolucionado tanto las estrategias de estudio de la gentica, de los procesos evolutivos y de determinados aspectos diagnsticos. Una de las etapas ms importantes para la puesta en marcha de una PCR es la seleccin del segmento especfico de DNA que desea amplificar y disear y encargar la sntesis de cebadores. La composicin de los cebadores es un factor muy decisivo en el xito o el fracaso de una reaccin de amplificacin. | | La otra etapa crtica de esta tcnica es el control de la tcnica en s misma. Entre los diferentes problemas que pueden aparecer al utilizar la tcnica de PCR, el proceso de extraccin y la contaminacin tienen especial relevancia. La aparicin de amplificaciones inespecficas puede complicar la interpretacin de los resultados obtenidos. Esta amplificacin inespecfica de otras secuencias, adems de las deseadas, no es ms que el resultado directo de la capacidad de la tcnica. Debido a la gran sensibilidad de la tcnica para detectar DNA, es crtico mantener un control estricto en la extraccin y manejo de la muestra. Al ser una tcnica que detecta DNA del agente infeccioso, el tipo de muestra depender del ciclo de cada organismo. Cada tcnica tiene un tipo de muestra preferencial que incluso puede ser variable segn el protocolo. 9.- CITOLOGIA Y ANALISIS FLUIDOS Para evaluaciones citolgicas se requieren varios frotis fijados, no teidos, y realizados a partir de lquidos, aspiraciones con aguja fina, o impresiones de masas u rganos.

 Para la completa evaluacin de los lquidos en cavidades adems de los portas fijados, se necesita el lquido en EDTA para realizar las pruebas complementarias a la citologa. No refrigerar los frotis Se deben enviar fluidos en jeringuillas correctamente preparadas o en un tubo estril. Esto previene el sobrecrecimiento bacteriano, goteo de la muestra, y evita daos al personal. Es mejor no utilizar muestras obtenidas y conservadas con escobillones. Los cambios autolticos aparecen muy rpidamente en estas torundas Bibliografa
"Manejo De Muestras." BuenasTareas.com. BuenasTareas.com, 10 2011. Web. 10 2011. <http://www.buenastareas.com/ensayos/Manejo-De-Muestras/2912542.html>.