TRUMENTOS

En la espectrometra de fluorescencia se utilizan dos tipos generales de instrumentos: * Fluormetros de filtro. Utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz fluorescente. * Espectrofluormetros. Usan monocromadores de retculo de difraccin para aislar la luz incidente y la luz fluorescente. Ambos tipos de instrumentos utilizan el siguiente esquema. La luz de una fuente de excitacin pasa a travs de un filtro o monocromador, e incide sobre la muestra. Una parte de la luz incidente es absorbida por la muestra, y algunas de las molculas de la muestra producen una fluorescencia. La luz fluorescente es emitida en todas las direcciones. Parte de esta luz fluorescente pasa a travs de un segundo filtro o monocromador y llega a un detector, el cual muy a menudo se encuentra a 90 con respecto al haz de luz incidente para minimizar el riesgo de que la luz incidente reflejada o transmitida llegue al detector. Diversas fuentes de luz pueden ser utilizadas como fuentes de excitacin, incluyendo el lser, fotodiodos y lmparas; arcos de xenn y lmparas de vapor de mercurio. Un lser slo emite luz de alta irradiancia en un intervalo muy estrecho de longitudes de onda, por lo general a 0,01 nm, lo que hace innecesario el monocromador de excitacin o el filtro. La desventaja de este mtodo es que la longitud de onda de un lser no se puede cambiar mucho. Una lmpara de vapor de mercurio es una lmpara lineal, lo que significa que emite luz cerca del pico de longitudes de onda. Por el contrario, un arco de xenn tiene un espectro de emisin continuo con intensidad casi constante en el rango de 300-800 nm, y una irradiancia suficiente para las mediciones hasta justo por encima de 200 nm. En los fluormetros pueden usarse filtros y/o monocromadores. Un monocromador transmite luz de una longitud de onda y tolerancia ajustables. El tipo ms comn de monocromador utiliza un retculo de difraccin; es decir, la luz colimada entra en una rejilla y sale con un ngulo diferente dependiendo de la longitud de onda. El monocromador puede entonces seleccionar qu longitudes de onda transmite. Para permitir mediciones de anisotropa se aaden dos filtros de polarizacin: uno despus del monocromador de excitacin o filtro, y otro antes del monocromador de emisin o filtro. Como se mencion antes, la fluorescencia se mide ms a menudo en un ngulo de 90 en relacin a la luz de excitacin. Esta geometra se utiliza en lugar de colocar el sensor en la lnea de la luz de excitacin en un ngulo de 180 a fin de evitar la interferencia de la luz de excitacin transmitida. El monocromador no es perfecto y transmitir la luz con otras longitudes de onda diferentes a las establecidas. Un monocromador ideal slo transmite luz en el rango especificado y tiene una transmisin independiente de la longitud de onda. Al medir en un ngulo de 90, slo la luz dispersa por la muestra provoca luz. Esto se traduce en una mejor relacin seal-ruido, y reduce el lmite de deteccin a un factor de aproximadamente 10000,

si se compara con la geometra de 180. Por otra parte, la fluorescencia tambin puede ser medida desde la parte delantera, procedimiento que se utiliza a menudo para las muestras turbias. El detector puede ser de un solo canal o de mltiples canales. El detector de un nico canal slo puede detectar la intensidad de una longitud de onda en cada momento, mientras que el de mltiples canales detecta la intensidad en todas las longitudes de onda simultneamente, con lo que el monocromador de emisin o filtro es innecesario. Los diferentes tipos de detectores tienen sus ventajas y desventajas. El fluormetro ms verstil, con monocromadores dobles y una fuente de luz de excitacin continua, puede registrar tanto un espectro de excitacin como un espectro de fluorescencia. Al medir los espectros de fluorescencia, la longitud de onda de la luz de excitacin se mantiene constante, de preferencia en una longitud de onda de alta absorcin, y el monocromador de emisin escanea el espectro. Para medir los espectros de excitacin, la longitud de onda que pasa a travs del filtro o monocromador de emisin se mantiene constante y el monocromador de excitacin va escaneando. El espectro de excitacin generalmente es idntico al espectro de absorcin, ya que la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la absorcin.

ANLISIS DE LOS DATOS

A bajas concentraciones, la intensidad de fluorescencia es, por lo general, proporcional a la concentracin del fluorforo. A diferencia de la espectrometra visible o ultravioleta 'estndar', los espectros independientes del dispositivo no son fciles de alcanzar. Son varios los factores que influyen y distorsionan los espectros, y son necesarias correcciones para lograr el espectro 'verdadero', es decir, independiente de la mquina. Los distintos tipos de distorsiones se pueden clasificar en relacin al instrumento o a la muestra. En primer lugar, veamos las distorsiones derivadas del instrumento. Como punto de partida, la intensidad de las fuentes de luz y las caractersticas de la longitud de onda varan con el tiempo durante cada experimento. Por otra parte, ninguna lmpara tiene una intensidad constante en todas las frecuencias. Para corregir esto, se puede aplicar un haz separador despus del filtro o monocromador de excitacin, para dirigir una porcin de luz a un detector de referencia. Adems, debe tenerse en cuenta el rendimiento de transmisin de los monocromadores y los filtros, ya que tambin puede cambiar con el tiempo. La eficacia de la transmisin del monocromador vara dependiendo de la longitud de onda. Esta es la razn por la que debe colocarse un detector de referencia despus del filtro o monocromador de excitacin. El porcentaje de fluorescencia recogido por el detector tambin depende del sistema. Por otra parte, la eficiencia cuntica del detector, es decir, el porcentaje de fotones detectados, vara entre los diferentes detectores, segn la longitud de onda y el tiempo.

La correccin de todos estos factores instrumentales para conseguir un "estndar" del espectro es un proceso tedioso, que slo se aplica en la prctica cuando es estrictamente necesario. Es el caso de las mediciones de rendimiento cuntico o cuando se encuentra la longitud de onda con la mayor intensidad de emisin, por ejemplo. Como se mencion anteriormente, tambin surgen distorsiones de la muestra. Por lo tanto, algunos aspectos de la muestra deben tenerse en cuenta tambin. En primer lugar, la fotodescomposicin puede disminuir la intensidad de fluorescencia con el tiempo. La dispersin de la luz tambin debe tenerse en cuenta. Los tipos ms importantes de dispersin en este contexto son la dispersin de Rayleigh y la de Raman. La luz dispersa por dispersin de Rayleigh tiene la misma longitud de onda que la luz incidente, mientras que en la dispersin Raman la luz cambia a longitudes de onda ms largas. La dispersin de Raman es el resultado de un estado electrnico virtual inducido por la luz de excitacin. A partir de este estado virtual, las molculas pueden volver a un nivel vibracional distinto del estado basal. En los espectros de fluorescencia siempre se observa una diferencia de nmero de onda constante en relacin con la excitacin; por ejemplo, en el agua el pico aparece a un nmero de onda 3600 cm-1 inferior a la luz de excitacin. Otros aspectos a considerar son los efectos del filtro interior. Estos incluyen la reabsorcin, que ocurre porque otra molcula o parte de una macromolcula absorbe las longitudes de onda en la que el fluorforo emite radiacin. Si este es el caso, una parte o la totalidad de los fotones emitidos por el fluorforo pueden ser absorbidos de nuevo. Otro efecto del filtro interno se produce a causa de las altas concentraciones de absorcin de las molculas, incluyendo el fluorforo. El resultado es que la intensidad de excitacin de la luz no es constante a lo largo de la solucin. Como resultado, slo un pequeo porcentaje de la luz de excitacin llega a los fluorforos que son visibles para el sistema de deteccin. Los efectos del filtro interior cambian el espectro y la intensidad de la luz emitida y, por tanto, deben ser considerados al analizar el espectro de emisin de luz fluorescente.

APLICACIONES
La espectrometra de fluorescencia se utiliza en anlisis bioqumicos, mdicos, qumicos y de investigacin de compuestos orgnicos. Tambin se ha utilizado para diferenciar los tumores malignos de piel de los benignos. La fluorescencia tambin puede utilizarse para reorientar los fotones.

Fluorescencia del triptfano

Este tipo de fluorescencia es una prueba importante que puede ser usada para estimar la naturaleza del microambiente del triptfano (un aminocido). Cuando se

realizan experimentos con desnaturalizantes, surfactantes u otras molculas anfiflicas, el microambiente del triptfano puede cambiar. Por ejemplo, si una protena que contiene un nico triptfano en su ncleo "hidrofbico" se desnaturaliza con el aumento de temperatura, aparece un cambio de color en el espectro de emisin del rojo. Esto se debe a la exposicin del triptfano a un medio ambiente acuoso en contraposicin a una protena hidrofbica interior. En contraste, la adicin de un tensioactivo a una protena que contiene triptfano, que se encuentra expuesto al solvente acuoso, causar un cambio al espectro azul de emisin si el triptfano est incrustado en la vescula o micela de surfactante. Las protenas que carecen de triptfano puede ser enlazadas a un fluorforo. A 295 nm, el espectro de emisin del triptfano es dominante sobre la fluorescencia ms dbil de la tirosina y fenilalanina.