DETECCION DE SALMONELLA

I.

OBJETIVO Investigar la presencia de Salmonella en alimentos de consumo humano (huevo de gallina con pescado). Realizar un recuento de Salmonella. Conocer el mtodo de anlisis y el uso de los medios de cultivo.

II.

FUNDAMENTO TEORICO

El gnero Salmonella se incluye en la familia Enterobacteriaceae, integrada por bacilos Gram negativos anaerobios facultativos. Poseen, por lo tanto, las caractersticas generales de las enterobacterias: son fermentadores de la glucosa, catalasa positiva, oxidasa negativa y suelen ser mviles; representa una excepcin Salmonella gallinarum, siempre inmvil. La nomenclatura de Salmonella es compleja. Se han usado diferentes sistemas para referir a este gnero. Teniendo en cuenta que estas bacterias tienen una muy importante homologa general de su ADN, deberan ser caracterizadas como dos nicas especies. Esta propuesta, formulada por Le Minor y Popoff en la dcada de los ochenta, no ha sido completamente aceptada. No obstante, y teniendo en cuenta la necesidad de uniformizar la comunicacin entre los distintos actores (mdicos, veterinarios, qumicos, etc.), la mayora ha optado por seguir una antigua propuesta de Kaufmann, con las ms recientes modificaciones (formuladas desde el Centro de Referencia colaborador de la OMS, en el Instituto Pasteur); as, se divide el gnero en dos especies: Salmonella enterica y Salmonella bongori, diferenciables entre s por caractersticas metablicas tales como la hidrlisis del ONPG, el crecimiento en presencia de KCN y otras. Salmonella enterica se subdivide, a su vez, en seis subespecies: enterica (I), salamae (II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houenae(IV), e indica (VI) que corresponden a los antiguos subgneros. Estas subespecies son diferenciables bioqumicamente. Como todas las enterobacterias, el gnero Salmonella tiene tres tipos de antgenos: somtico (O), flagelar (H) y de envoltura, para Salmonella (Vi). Los antgenos somticos son termoestables y su especificidad radica en el componente polisacrido de la endotoxina, complejo protena- lipopolisacrido. Los antgenos O se clasifican en mayores y menores; los mayores son los que definen un grupo antignico. As, el factor antignico 0:4 caracteriza el antiguo grupo B, hoy llamado O:4, mientras que los antgenos menores tienen menor valor discriminativo. Por ejemplo, el antgeno O:12 lo presenta toda Salmonella

perteneciente a los grupos A, B y D. Pueden encontrarse otros antgenos menores generados por modificaciones qumicas o por conversiones fgicas. Los antgenos capsulares o de envoltura slo lo presentan algunos serotipos de Salmonella (Typhi y Dublin). Los antgenos flagelares son proteicos y termolbiles. Algunas serovariedades slo producen un nico tipo de antgeno H, siendo, en consecuencia, monofsicos. Sin embargo otros serotipos pueden producir alternativamente dos tipos de antgenos H, por lo que se denominan bifsicos. Mediante el uso de reacciones antgeno anticuerpo se determina la frmula antignica de una cepa y, a partir de dicha frmula, se la clasifica en serovar o serotipo siguiendo el esquema propuesto originalmente por Kauffman y White (que agrupa todas las serovariedades conocidas, mas de dos mil quinientos).

La presente tcnica para la deteccin de Salmonella en alimentos, describe un esquema general que consiste de 5 pasos bsicos: Pre enriquecimiento, es el paso en donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las clulas de Salmonella daadas, logrando de esta manera una condicin fisiolgica estable. Enriquecimiento selectivo, se logra a partir de un medio de cultivo que conjunte dos condiciones, por un lado debe incrementar las poblaciones de Salmonella y por otro inhibir otros microorganismos presentes en la muestra. Seleccin en medios slidos, este punto se deriva directamente del anterior y se utilizan medios selectivos, que restringen el crecimiento de otros gneros diferentes a Salmonella y que permitan el reconocimiento visual caracterstico de colonias sospechosas. Identificacin bioqumica, este paso permite la identificacin genrica de los cultivos de Salmonella y la eliminacin de cultivos sospechosos falsos. Serotipificacin, es una tcnica inmunolgica (antgeno-anticuerpo) que permite la identificacin especfica de un microorganismo.

Actuales Tcnicas de Diagnstico y Nuevo Sistema con PCR Mtodo serolgico rpido utilizando sangre total y un antgeno coloreado en una prueba rpida de aglutinacin en placa, aunque las infecciones identificadas mediante este mtodo deben ser confirmadas mediante una tcnica bacteriolgica clsica.

Tambin existen mtodos de aglutinacin, tales como las tcnicas de ELISA, principalmente usada para detectar a S. Enteritidis. La ventaja de los exmenes serolgicos es que se detecta la persistencia de los anticuerpos IgGcirculantes, aunque el principal inconveniente es que las concentraciones sricas de IgGpueden ser bajas al principio de la infeccin y por ende indetectables, mientras que la excrecin fecal es elevada. Otra ventaja de la prueba de ELISA consiste en su facilidad de aplicacin para la deteccin en gran escala de aves infectadas. Este enfoque ha sido reconocido por la Unin Europea y la OMS para S. Typhimurium y S. Enteritidis. Nuevo Mtodo de Deteccin Molecular

La tcnica molecular basada en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR, delinglsPolymerase Chain Reaction) diferencia de los mtodos tradicionales, que requieren 6 o 7 das para dar un resultado definitivo, por el mtodo de PCR esto mismo se logra en slo 1 a 3 das, dependiendo de diversas modificaciones en el protocolo de trabajo. Sistema con PCR

Un mtodo rpido aplicable a la deteccin e identificacin de Salmonella y de otros patgenos. Adems, las cepas carentes de antgenos somticos (O) y/o flagelares (H) (cepas rugosas), que slo son reconocidas como Salmonella spp. Por el mtodo tradicional de serotipificacin pueden ser identificadas mediante PCR, debido a que esta tcnica detecta secuencias especficas de DNA y no es alterada por variaciones fenotpicas, que se pueden evidenciar por patrones bioqumicos.

III.

MATERIALES Y EQUIPOS Frasco con 225ml de caldo peptonado bufferado o caldo lactosado. Tubos con 10ml de caldo de enriquecimiento selenito-cistina. Tubos con 10ml de caldo de enriquecimiento tetrationato seg. MUELLERKAUFFMANN. Placas con agar SS (SALMONELLA-SHIGELLA), o agar bismuto seg. WILSON-BLAIR. Placas con agar BPL (agar-verdebrillante-rojo de fenol-lactosa seg. Kauffmann). Tubos con agar hierro-tres azucares (TSI). Tubos de solucin salina (0.85% NaCl).

Antisuero polivalente 0 (somatico). Pipetas de 10ml. Portaobjetos para la prueba serolgica. Asa y agujas de inoculacin. Bao de agua caliente regulada 43C+0.1 o incubadora regulada a 3537C. Muestra de huevo de gallina roto, sin lavar, con trozos de pescado guardado en bolsa.

IV.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Los mtodos para aislamiento de Salmonella se consideran en los siguientes pasos: 1. Enriquecimiento no selectivo Pesar 25g de muestra, sembrar en 225ml de caldo de enriquecimiento caldo peptonado bufferado (pH 8) o alternativamente en 225ml de caldo lactosado. Incubar a 35-37C por 16-24 horas. Este paso es indispensable para alimentos desecados liofilizados.

2. Enriquecimiento selectivo Llevar 1ml del cultivo anterior a 10ml de caldo de enriquecimiento selenito y a 10ml de caldo de enriquecimiento tetrationato seg. Mueller y Kauffmann. Incubar a 3537C por 16-24 horas. Este paso es indispensable ara alimentos desecados liofilizados. 3. Aislamiento en placas de agar selectivo A partir de los cultivos incubados realizar siembras por estras sobre agar BPL y sobre agar SS. Incubar a 35-37C el agar BPL durante 24 horas y el agar SS. 1824C a 37C.

Examinar las placas: en el agar BPL las colonias sospechosas de salmonella son incoloras, de un color intermedio entre el rosa y el fucsia o entre traslucidas u opacas y el medio que las rodea vara entre rosceo a rojo. En el agar SS son incoloras y transparentes o transparentes con centro negro. En el agar bismuto sulfito son pardas, grises y negras y presentan a veces un brillo negro a medida que aumenta el periodo de incubacin.

A) Pruebas bioqumicas Elegir 2 o ms colonias sospechosas de cada placa. Si se trabaja con agar BPL y agar bismuto sulfito, purificar en placas con agar Mac Conkey. Sembrar en agar nutritivo inclinado. Incubar a 35-37C por 24 horas. Comprobar la pureza de los cultivos mediante la coloracin Gram. Realizar prueba TSI. Si se trabaja con el agar BPL y SS, realizar directamente la prueba TSI y dems pruebas bioqumicas.

Prueba TSI.degradacin lactosacarosa, glucosa, produccin de gas y H2S; en el medio de cultivo en

tubos d e agar inclinado de hierro tres azucares, el cual se inocula por puntura y estra, se incuba a 35-37C por 24 horas.

Interpretacin: Fondo: Amarillo: glucosa positivo Rojo o sin cambio: glucosa negativo Negro: formacin de H2S Burbujas o ruptura de agar: formacin de gas a partir de la glucosa Pico de flauta: Amarillo: lactosa y/o sucrosa positivo. Rojo o sin cambio: lactosa y sucrosa negativo. Las cepas tpicas de Salmonella dan reaccin alcalina (color rojo) en el pico de flauta y cida (color amarillo) en el fondo, con formacin de gas y 9 (en aproximadamente en el 90% de los casos) formacin de H2S (ennegrecimiento del agar). En presencia de una Salmonella lactosa positiva el pico de flauta del TSI es de color amarillo. Por esto la confirmacin preliminar de Salmonella no debe basarse solamente en los resultados del TSI.

V.

RESULTADOS Y DISCUSION Tabla de: Datos y resultados Colonias Alimento Agar SS. Agar BPL Descripcin Agar SS Colonias transparentes lisas incoloras algunas son transparentes con centro negro.

Huevo pescado

Agar BPL Colonias rosadas (lactosa-) algo transparentes y el medio esta decolorado.

VI.

CONCLUSIONES

o o o

Salmonella spp. adaptadas a vivir en el ser humano, entre ellas, S. typhi, S. paratyphi A, B y C; Salmonella spp. adaptadas a hospederos no humanos, que circunstancialmente pueden producir infeccin en el hombre, entre ellas, S. dublin y S. cholerae-suis; Salmonella spp. sin adaptacin especfica de hospedero, que incluye a unas 1800 serovariedades de amplia distribucin en la naturaleza, las cuales causan la mayora de las salmonelosis en el mundo. El caldo tetrationato sirve para enriquecer la muestra con salmonella.

o o o o o o o

Se hacen las pruebas fisicoqumicas en el caso que en la placa haya colonias de protius y salmonella (para distinguirlas) El Salmonella Shigella Agar es el medio especfico para la Salmonella. Este anlisis de deteccin de Salmonella se exige para productos terminados. La salmonella es una enterobacteria lactosa Esta en la heces de las aves, huevos de gallina (con el excremento pegado en la cscara del huevo) En la putrefaccin est la Salmonella, puede habitar en la carne molida y huevo en mal conservacin y coccin, en lospelos de los animales. Muere este microorganismo a 60 - 63C

VII.

BIBLIOGRAFIA Manual de medios de cultivo Merck http://www.menudospeques.com/salud/salmonela_salmonelosis.pp http://docencia.izt.uam.mx/smk/233208/practicas/Practica%202.pdf http://es.wikipedia.org/wiki/Salmonella http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Pagogenosnorm.Salmonella_17364.pdf http://es.scribd.com/doc/6593194/Microbiologia-de-Alimentos-Practica-n07Deteccion-de-Salmonella

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