UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

10ma PRCTICA Aislamiento e identificacin de salmonella en harina de pescado Curso: Microbiologa pesquera Alumna: Marilli Milagros Sosa Sarmiento Profesora: Nancy Martinez Ordinola Grupo: F* Mesa: 1

Fecha de ejecucin: junio del 2011 Fecha de entrega: julio del 2011

2011

INTRODUCCION

Dentro del anlisis microbiolgico a productos alimenticios o insumos que sean utilizados para su elaboracin se pone nfasis en la determinacin de Salmonella ya que este desencadena una serie de intoxicaciones que podran ser letales para el hombre o el animal que consuma el alimento contaminado, siendo la salmonelosis la principal infeccin generada por esta enterobacteria gram negativa cuya transmisin tiene lugar por va fecal oral. El mayor predominio de la Salmonella se encuentra en la carne de aves, ganado vacuno, pavos y pollos, pero tambin se debe considerar los alimentos que se encuentran en contacto con las heces y materia fecal en general como la harina de pescado, principal insumo para la elaboracin de piensos y alimento artificial destinado a peces y camarones como suplemento protenico. La harina de pescado que se utiliza en la fabricacin de piensos para los animales con frecuencia tiene Salmonella como consecuencia de su contaminacin por roedores y aves. El marisco que se alimenta por filtracin y que es capturado en aguas cercanas a las costas contaminadas muchas veces, y los camarones precocidos congelados, han sido identificados como los productos de mayor riesgo dentro de este grupo. La evaluacin microbiolgica considera que los brotes fundamentalmente se deben a un tratamiento trmico inadecuado de los insumos como la harina de pescado, por lo que se debe de priorizar el control en los procesos de produccin para garantizar que el producto cumpla con los requerimientos sanitarios y se asegure la inocuidad del alimento.

REVISIN BIBLIOGRFICA La salmonelosis se define como una infeccin zoonsica puesto que la fuente principal de la enfermedad humana la constituyen los animales infectados. La transmisin tiene lugar por va fecal oral por medio de la cual el contenido intestinal de un animal infectado es ingerido con un alimento o con el agua. Los factores que cooperan en los brotes son principalmente el tiempo de uso incorrecto de la temperatura y un tratamiento trmico insuficiente. La contaminacin puede ser cruzada por contacto directo o cruzada por contacto indirecto de los materiales y utensilios de cocina. El mayor predominio de Salmonella est en las carnes, estando las canales contaminadas especialmente la carne de ave: pollo 35%, pavo 45%, vacuno y cerdo 1-5 % segn condiciones de los mataderos. Tambin en alimentos desecados (el coco rallado para repostera) y productos sin pasteurizar como huevo en polvo, huevo lquido y leche y sobre

todo en la cscara de los huevos frescos de aves de corral ya que contienen heces o materia fecal de la cloaca de la gallina. Los piensos compuestos tambin se suelen encontrar contaminados siendo stos el origen de la infeccin de los animales sobre todo en harinas de carne y huesos de baja calidad. El pescado, productos derivados y el marisco slo estn relacionados con la salmonelosis accidentalmente, aunque la harina de pescado que se utiliza en la fabricacin de piensos para los animales con frecuencia tiene Salmonella como consecuencia de su contaminacin por roedores y aves. El marisco que se alimenta por filtracin y que es capturado en aguas cercanas a la costa contaminada muchas veces, y los camarones precocidos congelados, han sido identificados como los productos de mayor riesgo dentro de este grupo. Los productos vegetales como por ejemplo las hortalizas que se utilizan para preparar ensaladas, han sido relacionados con brotes accidentales de fiebre tifoidea y salmonelosis, debido a la utilizacin de agua de riego contaminada o de deyecciones humanas y de estircol de los animales como abono. MEDIDAS DE CONTROL: 1. Asegurar que los piensos animales estn libres de Salmonella y los importados tratados convenientemente con calor. 2. Intentar eliminar la Salmonella de las granjas reproductoras, mejorando las condiciones higinico sanitarias de mataderos y granjas avcolas. 3. Evitar los riesgos de contaminacin cruzada, especialmente de los alimentos cocinados de los alimentos provenientes de los proveedores crudos, en fbricas y cocinas (comedores sociales y cocinas centrales). 4. Asegurar un calentamiento suficiente de los alimentos, seguido de una refrigeracin rpida cuando hayan de ser almacenados, evitando dejarlos mucho tiempo a temperatura ambiente. 5. Comprobar que los manipuladores de alimentos no son portadores de Salmonella mediante el chequeo y analtica anual por parte de la mutua. 6. Controlar los roedores, pjaros e insectos en las fbricas y terreno circundante. Aplicar un plan de D.D.D. (Desinsectacin, Desratizacin y Desinfectacin). 7. Incrementar la vigilancia y deteccin de Salmonella sobre todo en alimentos cocinados mediante controles y analtica bacteriolgica peridica. Las harinas de pescado se emplean mucho en las raciones de animales por su gran contenido proteico (60 70%). Su concentracin grasa varia, pero generalmente se encuentra en torno al 10%. Las harinas de pescado contienen todos los materiales

necesarios para el crecimiento microbiano, salvo humedad, que generalmente oscila entre 7 y 10%. El mtodo ms conveniente usado en la elaboracin de harina de pescado es el conocido como fusin hmeda; el pescado completo o triturado se transporta lentamente mediante un tornillo transportador a lo largo de un cilindro caliente; al mismo tiempo se inyecta en la ms vapor de agua. El material as tratado pasa a una prensa de tornillo que le extrae aproximadamente el 50% del agua y casi todo el aceite. La porcin slida de la prensa se lleva entonces a un rodillo secador de aire caliente muy largo en donde la temperatura de la masa de pescado se eleva lo suficiente para desecarla hasta un contenido de humedad menor del 10%. En la fase siguiente del proceso se enfra la masa a veces la harina se cura antes de pulverizarla y ensacarla apilndola en un cobertizo para permitir su oxidacin.

MATERIALES Y MTODOS
TOMA DE MUESTRA

Cuarteo: Colocar la harina de pescado sobre un papel y con la ayuda de una esptula estril dividir el todo en 4 porciones y cada uno dividirlo en cuatro, as sucesivamente, homogenizar primero por porciones y luego toda la muestra. Tomar 25g de la muestra de harina.
PRUEBAS MICROBIOLGICAS:

1. Enriquecimiento no selectivo o preenrequecimiento. 2. Enriquecimiento selectivo. 3. Siembra en placa en medio de agar selectivo. 4. Siembra de colonias sospechosas en medio de diferenciacin

1. ENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO O PREENRIQUECIMIENTO Materiales o o o o Papel de aluminio Balanza analtica Botella de vidrio Medio caldo lactosado

Mtodo o Mezclar los 25 g de harina de pescado con 225ml de Caldo lactosado. Incubar a 35C por 24 horas. 2. ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO

Materiales o o o o Pipetas Tubos de ensayo Medio caldo selenito cistina Medio caldo tetrationato verde brillante

Mtodo o o Pipetear 1ml del cultivo de preenriquecimiento en 10ml de caldo selenito cistina, incubar a 35C X 24 horas. Pipetear 1ml del cultivo de preenriquecimiento en 10ml de caldo tetrationato verde brillante, incubar a 35C X 24 horas.

3. SIEMBRA EN PLACA EN MEDIO AGAR SELECTIVO Materiales o o o o o Placas petri Asa de kolle Medio Agar xilosa lisina desoxicolato Medio agar salmonella shiguella Medio agar bismuto sultifo

Mtodo o Pasar una asada a c/uno de los medios de enriquecimiento selectivo a la superficie de una placa de c/uno de los siguientes medios: XLD, SS, BS. Extender de manera que se tengan colonias aisladas, sembrar por estras. Incubar las placas a 37 C durante 24 horas. 4. SIEMBRA EN COLONIAS SOSPECHOSAS EN MEDIOS DE DIFERENCIACION Materiales o o o o Tubos de ensayo Asa de kolle Medio Agar tres azucares Medio Agar lisina hierro

Mtodo o Tomar colonias sospechosas del medio Selectivo usado y pasarlo a los tubos con agar TSI (Agar tres azucares) y Agar lisina hierro (LIA) inclinados. Inocular los medios mediante siembra en estra de atrs hacia adelante en la superficie inclinada y a

continuacin por picadura en la columna de agar. Incubar los tubos durante 24 horas a 35C. RESULTADOS Y DISCUSION LIA: o o o TSI: o o o Para Selenito BS: Todo el tubo de color amarillo, puesto que hubo fermentacin de lactosa y de glucosa, no se apreci el perxido de hidrgeno. Para Tetrationato con XLD: Todo amarillo, puesto que hubo fermentacin de lactosa y de glucosa, no se apreci el perxido de hidrgeno. Para Tetrationato con SS: Todo amarillo, puesto que hubo fermentacin de lactosa y de glucosa, no se apreci el perxido de hidrgeno. Entonces, se puede afirmar que: No hay Salmonella en la muestra tomada de 25 gramos. Para Selenito con BS: Parte inclinado morado, no hubo descarboxilacin. Para Tetrationato con XLD: Parte inclinada morado, no hubo descarboxilacin. Para Tetrationato con SS: Parte inclinado morado, no hubo descarboxilacin.

XLD
Las colonias deberan ser transparentes u opacas (con el color del medio de cultivo), colonias transparentes con centro negro. Ac no se observa lo mencionado. (Reaccin negativa)

SS

Las colonias deberan ser transparentes, incoloras, algunas transparentes con el centro negro ac no se observa lo mencionado.(reaccin negativa).

BS
Se detecto en las colonias con centro negro en el medio de agar Bs. indica la presencia de salmonella en la harina de pescado reaccin positiva

DISCUSIN Se analizaron seis cultivos sospechosos (tres por cada medio). Comenzando con el medio Agar Lisina Hierro se observa que para Selenito con BS permaneci de color a morado, esto pues no hubo una descarboxilacin, por lo que se puede decir que no hay presencia de Salmonella tomando en cuenta la coloracin morada sin variacin de la parte inclinada del tubo. Para el caso de Tetrationato con XLD, se observ tambin la misma pigmentacin morada en la parte inclinada, por lo que se infiere que no hay presencia de Salmonella, finalmente el Tetrationato con SS present todo el tubo amarillo, puesto que hubo fermentacin de lactosa y de glucosa, no se apreci el perxido de hidrgeno, de manera se afirma que no hay presencia de Salmonella en ninguna de las muestras. Con el medio TSI se determina si hay degradacin de glucosa y degradacin de lactosa con o sin produccin de sulfuro de hidrogeno manifestando una coloracin negrusca en el fondo del tubo por accin del hierro. Observando los medios de TSI pudimos notar que el Selenito con BS mostr una coloracin amarillenta de forma completa, esto nos indica que hubo tanto degradacin de glucosa en el fondo, como degradacin de lactosa en la parte superior, por lo que se infiere que no se

puede tratar de Salmonella ya que este bacilo gram negativo solo degrada la glucosa y descarboxila la lisina alcalinizando el medio. En el caso del Tetrionato con XLD tambin hubo un predominio absoluto del color amarillo en todo el tubo, descartndose as la presencia de Salmonella. Finalmente se observ, que tambin el Tetrationato con SS mostr similares caractersticas coloracin amarilla en todo el medio. Los resultados tanto de LIA como de TSI expresan coherencia, ambos se registran una NO contaminacin de la muestra con Salmonella. Se observaron las placas con los medios selenito cistena y con tetrationato verde brillante ambos se sembr en las placas con medios (SSA, BSA, XLD) y solo dio reaccin positiva en las placas con el medio BSA tanto en selenito como tetrationato pues en este se dio el crecimiento de la coloracin negra en el centro de las colonias y el brillo metlico alrededor de ellas se deben a la produccin de sulfuro de hidrgeno y de la reaccin de los iones de bismuto con este. Es ente medio donde se da el principio de fermentacin de lactosa o sacarosa, sin embargo, en la prueba final de identificacin en los medios de diferenciacin (con TSI) se detecto lo siguiente que en el medio con selenito sali positivo, en la parte inclinada en el semi agar observndose el color amarillo, esto es, reaccin positiva a la lactosa; y en cuanto la parte recta se vio un vacio, este vacio a podido ser por la presencia de oxigeno. O sea indica que es negativa a la reaccin con glucosa, en el medio con tetrationato se identifico que la parte recta del tubo se observo un color amarillento lo que indica reaccin positiva a la glucosa sin embargo no se produjo la presencia de colonias negras (en el fondo del tubo) lo que muestra que es negativa a la produccin del sulfuro de hidrogeno. En cuanto al agar LIA en selenito se observo un color plomo en todo el tubo o sea que la reaccin es negativa a la descarboxilacin de la lisina, con tetrationato se observo que se mantuvo el color de medio violeta oscuro, o sea, sali reaccin positiva a la descarboxilacin de lisina, finalmente la prueba de LIA en ambos medios de selenito como tetrationato en su conjunto, seria negativa porque la presencia de uno implica la no presencia del otro.

CONCLUSIONES Las tres pruebas en el medio LIA resultaron negativas porque no se dio la descarboxilacin de la lisina por accin de la cadaverina, lo cual no alcaliniz el medio y por ende no hubo un cambio de coloracin. Las tres pruebas en el medio TSI fueron negativas porque hubo degradacin de la lactosa y se conoce que la Salmonella solo degrada la glucosa. Se puede concluir que no hay presencia de Salmonella, por lo que la harina de pescado analizada no presenta contaminacin de este enterobacteria.

RECOMENDACIONES Para este anlisis sera recomendable que se realizaron ms pruebas para as tener precisin en la identificacin como por ejemplo la pruebas de produccin de indol. Para el anlisis microbiolgico y bioqumico de la de harina de pescado es recomendable tener una muestra representativa de esta, para lo cual se recomienda usar el mtodo del cuarteo, el cual fue usado en la realizacin de este laboratorio.

BIBLIOGRAFA MCKERSON, JOHN; SINKEY, ANTHONY. Microbiologa de los Alimentos y sus procesos de elaboracin. Editorial Acribia. 1972. Zaragoza (Espaa). PELCZAR, MICHAEL J. PELCZAR. Elementos de microbiologa. Editorial 1981. McGraw-Hill,

Mara del Rosario Pascual Anderson, Vicente Caldern y Pascual Microbiologa alimentaria: Metodologa analtica para alimentos y bebidas; Segunda edicin; Publicado por Ediciones Daz de Santos, 1999; 464 pginas. http://www.ispch.cl/lab_amb/serv_lab/salmonella.html(19/6/9 hora4:14pm)

Caractersticas de la Salmonella Disponible en: http://www.analizacalidad.com/casalmo.htm