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Prefacio

Prefacio
Prefacio La importancia de la ciencia que están por aplicar a veces se da por

Prefacio

La importancia de la ciencia que están por aplicar a veces se da

por sentada ya que los protocolos se han estudiado y se han vuelto a estudiar una y otra vez, de modo que exista una alta probabilidad de que tengan éxito y obtengan el producto molecular deseado. El trabajo que están a punto de realizar se basa en una ciencia desarrollada por científicos galardonados con el Premio Nobel. Werner Arbor, Daniel Nathans y Hamilton Smith recibieron este premio por su trabajo con enzimas de restricción. Stanley Cohen, Paul Berg y Herb Boyer lo recibieron por obtener la primera molécula de ADN recombinante. La molécula de ADN recombinante que ustedes utilizarán va más allá de su trabajo porque emplea el gen de un organismo eucariota, en lugar de uno procariota. Hace apenas unos años, en 1993, Kary Mullis recibió el Premio Nobel por el descubrimiento de la reacción en cadena de la polimerasa, una suerte de química elegante que utilizarán en el Laboratorio 8. De modo que la ciencia que aprenderán durante las próximas semanas es muy importante y continuará teniendo un papel importante en el desarrollo de la biotecnología y la medicina.

Su profesor merece buena parte del crédito por hacer que esta experiencia de laboratorio sea posible. Si bien Amgen provee los equipos y suministros necesarios para implementar los laboratorios, para que fuera posible utilizarlos, su profesor ha aportado muchas horas de preparación, a menudo durante las noches y los fines de semana. Si han disfrutado de esta experiencia de laboratorio, recuerden agradecerle a su profesor por haberla hecho realidad.

Este programa de extensión educativa es en gran medida el resultado del esfuerzo del Dr. Bruce Wallace, científico de Amgen, que creía fervientemente que la industria de la biotecnología tenía la responsabilidad de contribuir a la educación científica de nuestra sociedad. Antes de su fallecimiento, el Dr. Wallace logró ver su programa de extensión educativa crecer y evolucionar hacia la aventura del descubrimiento que usted está a punto de iniciar.

Estamos en condiciones de traer este programa a su establecimiento gracias a varias sociedades importantes: la Fundación Amgen, la Fundación de Pierce College, el Centro de Biotecnología del Condado de Orange/Los Angeles, el Instituto Bio-Bridge (biobridge.ucsd.edu/a1), New England Biolabs, Fotodyne, Invitrogen, Rainin Pipettes, VWR y Bio-Rad.

Si tienen alguna pregunta sobre estas prácticas de laboratorio, no duden en enviarme un correo electrónico a la dirección que se indica a continuación.

Martin Ikkanda Profesor de Biología Los Angeles Pierce College

IkkandMJ@piercecollege.edu

Tabla de Contenidos

Tabla de Contenidos

Tabla de

Contenidos

Tabla de Contenidos Tabla de Contenidos     Introducción a los microvolúmenes y el pipeteado 1.1

Tabla de Contenidos

 

 

Introducción a los microvolúmenes y el pipeteado

1.1

– 1.6

 
   

Análisis de restricción de

2.1

– 2.3

 

pARA y pKAN-R

 
 
 

Digestión de restricción de pARA-R Introducción a los plásmidos y las enzimas de restricción

2a.1–2a.4

 
 
 

Ligación de fragmentos de restricción de pARA y pKAN-R Producción de un plásmido recombinante: pARA-R

3.1–3.3

 
 
 

Confirmación de la restricción y la ligación utilizando electroforesis en gel de agarosa

4.1–4.4

 
 
 

Confirmación de la digestión de restricción de pARA-R

4a.1–4a.4

 
 
 

Transformación de la

5.1–5.6

 

Escherichia coli con un plásmido recombinante

 

 

Transformación de la Escherichia coli con pARA-R

 

5a.1–5a.4

 

 

Preparación de un cultivo “overnight” de la Escherichia coli

6.1

– 6.2

 
   

 

Purificación de mFP a partir de un cultivo “overnight”

7.1

– 7.6

 
   

 

Extracción del ADN genómico de células epiteliales bucales

8.1

– 8.5

 
   

Laboratorio

11
11

Introducción a los

microvolúmenes y el pipeteado

El propósito de esta práctica de laboratorio

es ofrecerles experiencia en el uso de algunas de las herramientas y las técnicas importantes más comunes en la biología molecular y presentarles algunas de las mediciones volumétricas de uso más frecuente en este campo de la ciencia. Se les brindará la oportunidad de practicar algunas de las destrezas que necesitarán para construir una molécula de ADN recombinante. Los instrumentos y suministros que utilizarán durante las próximas semanas son idénticos a los que se utilizan en los laboratorios de investigación.

Si bien los fundamentos teóricos sobre los que se han construido la biotecnología y las ciencias de ADN se remontan a principios de 1900, la mayoría de las técnicas de laboratorio empleadas son relativamente recientes. Y, aunque las técnicas que irán aprendiendo en las próximas semanas se han vuelto de rutina en los modernos laboratorios de investigación, son pocos los estudiantes secundarios y universitarios que tienen la oportunidad de experimentar la biología molecular con tal grado de sofisticación.

Cada vez que asistan a una clase de química, una de las cosas que notarán rápidamente será las diferencias en las cantidades de reactivos y productos químicos que em- plean. En un laboratorio de química típico, los volúmenes se miden en grandes cilindros graduados. Por lo general, las soluciones se miden en volúmenes de 50, 100 ó 200 mililitros (ml). Generalmente, el peso de los elementos

sólidos se expresa en gramos (g). En el laboratorio de biología molecular, por lo general los volúmenes se miden

en microlitros (µl); donde 1 µl equivale a 0.001 ml. El peso

a menudo se expresa en términos de microgramos (µg) o

nanogramos (ng), donde 1 µg equivale a 0.000001 gramo

y 1 ng equivale a 0.000000001 gramo.

Quizás se estén preguntando por qué los biólogos moleculares emplean volúmenes y cantidades de material tan pequeños. El motivo se relaciona con el costo de estos materiales y lo difícil que resulta obtenerlos. Por ejemplo, en el próximo laboratorio recibirán algunos plásmidos diseñados especialmente (ADN). Si este ADN se vendiera “por libra”, ésta costaría unos 360 millones de dólares. De modo que no se sorprendan si sólo les entregamos una cantidad diminuta de moléculas de ADN. La razón por la que estos productos químicos son tan costosos se relaciona con la dificultad para prepararlos en forma pura. Muchos de estos productos químicos se producen en organismos vivos, como las bacterias, y deben purificarse y separarse de las otras miles de sustancias presentes en la célula. Sin embargo, la biología molecular realmente requiere este nivel de pureza y precisión. A medida que realicen este trabajo de laboratorio, recuerden que están realizando biología molecular como en el mundo real.

Laboratorio 11 Materiales Solución 1 Solución 2 Solución 3 H 2 O destilada (dH 2

Laboratorio

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11

Materiales

Solución 1 Solución 2 Solución 3 H 2 O destilada (dH 2 O) Gel de agarosa al 0.8% (preparado con anterioridad) 1 x NaB (o TBE 0.5x)

Tubos de microfuga de 1.5 ml Micropipeta P-20 (2-20 µl) Puntas para pipeta desechables Marcador indeleble Equipo de electroforesis Suministro eléctrico Gradilla plástica para tubos de microfuga

Métodos

La micropipeta digital

Los protocolos de biología molecular exigen la utilización

de micropipetas ajustables. Las micropipetas se emplean para verter diferentes volúmenes de líquidos. Si bien los investigadores tienen varios tipos de micropipetas en su mesa de trabajo, estos laboratorios han sido diseñados para utilizar una P-20. Esta pipeta está fabricada para verter entre 2 y 20 µl. Se trata de un instrumento de precisión de alta calidad y es fundamental que aprendan a usarlo correctamente.

Les pedimos que lean y sigan estas precauciones:

No definan el ajuste por debajo de 2 µl ni por encima de 20 µl, a menos que su profesor se los indique.

No usen la micropipeta sin la punta desechable adecuada firmemente ajustada al cilindro. Si no utilizan una punta para pipeta contaminarán el cilindro de la pipeta.

No dejen la micropipeta con líquido en la punta ni la sostengan con la punta hacia arriba. Si la punta desechable no está bien ajustada al cilindro, el líquido puede caer nuevamente dentro de la pipeta.

Eviten que el émbolo haga un “chasquido” al retirar o eyectar líquido; con el tiempo esto destruirá el pistón.

Ventana del visor Cilindro
Ventana del visor
Cilindro

Botón del émbolo

Eyector de

la punta

Laboratorio

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Al aspirar (succionar) una solución, presionen el émbolo hacia la primera marca y bajen la punta de la pipeta por debajo del nivel de la solución de la que están tomando una muestra. Deben sostener el tubo que contiene la solución en la mano a la altura de

el tubo que contiene la solución en la mano a la altura de los ojos. Es

los ojos. Es importante ver que la solución entre realmente en la punta de la pipeta.

Lentamente suelten el émbolo y dejen que el líquido ingrese a la punta de la pipeta. Asegúrense de no aspirar aire en la punta.

Al verter (vaciar) el líquido, coloquen la punta de la pipeta en el tubo que recibirá la solución. Ubiquen la punta de manera que toque la

pared interior del tubo y se acerque al fondo. Lentamente empujen el émbolo hacia la primera marca y luego hacia la segunda. Mantengan el pulgar en el émbolo y retiren la punta del tubo en el que están vertiendo el líquido.

la punta del tubo en el que están vertiendo el líquido. Esto evitará que vuelvan a

Esto evitará que vuelvan a aspirar el líquido en la punta de la pipeta. Asegúrense de ver que la solución salga de la punta.

Asegúrense de ver que la solución salga de la punta. ■ Retiren la punta: para ello

Retiren la punta: para ello utilicen el botón eyector de la pipeta y arrójenla a un recipiente de residuos. Si vierten el mismo reactivo en tubos separados y no hay peligro de contaminación cruzada, pueden utilizar la misma punta varias veces. Para evitar la contaminación, es bueno depositar cada reactivo sobre la pared lateral cerca del fondo del tubo de microfuga sin tocar ninguno de los demás reactivos. Esta técnica les permite utilizar la misma punta para verter el reactivo en varios tubos que contengan un reactivo diferente.

Al verter un nuevo reactivo, utilicen siempre una punta nueva para evitar la contaminación.

Ejercicio de pipeteado Nº 1

Busquen la pantalla en el mango de la micropipeta y observen su configuración. Giren la

Busquen la pantalla en el mango de la micropipeta y observen su configuración. Giren la perilla estriada del mango en el sentido de las agujas del reloj para disminuir el volumen, o en sentido contrario a las agujas del reloj para aumentar el volumen. Al girar esta perilla, cambia la distancia que viaja el émbolo. Las cifras a continuación representan algunas de las configuraciones de la pipeta y los volúmenes de líquido vertido.

2 0 0
2
0
0
1 2 4
1
2
4
0 5 5
0
5
5
0 2 0
0
2
0
 

20.0 L

12.4 L

5.5 L

2.0 L

Coloquen una punta desechable en el extremo del cilindro de la pipeta. En un movimiento

Coloquen una punta desechable en el extremo del cilindro de la pipeta. En un movimiento de torsión con el dedo pulgar e índice, verifiquen que la punta esté firmemente ajustada al cilindro. Eviten tocar el extremo de la punta porque pueden contaminarla.

Recuerden que la punta debe estar en su lugar al utilizar la pipeta.

Coloquen el pulgar sobre el botón que activa el émbolo. Presionen el botón y observen

Coloquen el pulgar sobre el botón que activa el émbolo. Presionen el botón y observen que tiene una marca de “detención”. Si ejercen un poco más de presión con el pulgar, pueden presionar el botón del émbolo hasta llegar a una segunda marca. En esta marca se introduce un pequeño volumen de aire en la punta para eyectar la solución.

Ejercicio de pipeteado Nº 2

Utilicen un marcador indeleble para rotular los tres tubos de reacción: A, B y C.

Utilicen un marcador indeleble para rotular los tres tubos de reacción: A, B y C.

En la tabla de la página 1.4 se resumen los contenidos de cada tubo, pero

En la tabla de la página 1.4 se resumen los contenidos de cada tubo, pero sigan las instrucciones que comienzan en el paso 3 para preparar las muestras.

Tubo

dH 2 0

Solución 1

Solución 2

Solución 3

Volumen total

 

A 2

µ L

4 µ L

 

4

µ L

10

µL

B 2

µ L

8 µ L

 

10

µL

C 2

µ L

 

8

µ L

10

µL

Coloquen la micropipeta P-20 en 2 µl y viertan dH 2 O en los tubos

Coloquen la micropipeta P-20 en 2 µl y viertan dH 2 O en los tubos A, B y C.

Expulsen la punta en el recipiente de residuos de plástico y reemplácenla por una nueva.

Expulsen la punta en el recipiente de residuos de plástico y reemplácenla por una nueva.

 
Coloquen 4 µl de la solución 1 en el tubo A.  

Coloquen 4 µl de la solución 1 en el tubo A.

 
Expulsen la punta en el recipiente de residuos de plástico y reemplácenla por una nueva.

Expulsen la punta en el recipiente de residuos de plástico y reemplácenla por una nueva.

 
Utilicen una punta nueva y viertan 4 µl de la solución 3 en el tubo

Utilicen una punta nueva y viertan 4 µl de la solución 3 en el tubo A.

 
Utilicen una punta nueva y viertan 8 µl de la solución 2 en el tubo

Utilicen una punta nueva y viertan 8 µl de la solución 2 en el tubo B.

Utilicen una punta nueva y viertan 8 µl de la solución 3 en el tubo

Utilicen una punta nueva y viertan 8 µl de la solución 3 en el tubo C.

Guarden los tres tubos para la próxima parte de la experiencia.

Guarden los tres tubos para la próxima parte de la experiencia.

los tres tubos para la próxima parte de la experiencia. Laboratorio 11 Comprobación de la precisión

Laboratorio

11
11

Comprobación de la precisión y la consistencia del pipeteado

Los tubos A, B y C deben contener 10 µl de solución.

Los tubos A, B y C deben contener 10 µl de solución.

Preparen su micropipeta P-20 en 10 µl y coloquen una punta nueva en el cilindro.

Preparen su micropipeta P-20 en 10 µl y coloquen una punta nueva en el cilindro.

Verifiquen con cuidado el volumen de cada tubo de microfuga. Debe haber 10 µl en

Verifiquen con cuidado el volumen de cada tubo de microfuga. Debe haber 10 µl en cada uno de ellos.

Guarden los tubos A, B y C para la próxima parte de la experiencia.

Guarden los tubos A, B y C para la próxima parte de la experiencia.

Laboratorio

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Utilización de la electroforesis en gel para separar moléculas

La electroforesis en gel

es un método en el que se

utiliza corriente eléctrica y una matriz de gel (red) para separar moléculas como el ADN y las proteínas. Las moléculas que se separan tienen carga negativa

o se cargan negativamente.

Con la corriente eléctrica, las

moléculas cargadas son atraídas

y atraviesan una red del material que separará las moléculas de acuerdo con su tamaño, aunque

la forma molecular y el grado de electronegatividad influirán en

el movimiento al atravesar el gel.

Debido a que las moléculas tienen

carga negativa, se trasladarán por

el gel hacia el electrodo positivo

(rojo). A mayor carga negativa, mayor velocidad en la migración de la molécula.

En este laboratorio, su profesor ha preparado un gel compuesto por agarosa, un polisacárido (azúcar compuesto). La agarosa se mezcla con una solución electrolítica llamada borato de

sodio (NaB). Esta solución contiene iones que son átomos cargados eléctricamente. Estos iones ayudan

a conducir la corriente eléctrica a

través del gel. Como las moléculas son atraídas hacia el electrodo positivo, las más pequeñas pueden moverse en esta red de agarosa mucho más rápido que las moléculas más grandes. Por lo tanto, en toda la extensión del gel, las moléculas se separan por tamaño.

Su profesor ya ha preparado un gel de agarosa, pero deberán cubrir el gel de

Su profesor ya ha preparado un gel de agarosa, pero deberán cubrir el gel de agarosa con la cantidad adecuada de la solución reguladora de NaB para que el gel actúe adecuadamente. Dos grupos compartirán un gel. Lleven la cubeta hacia el suministro eléctrico que utilizarán para activar el gel.

Controlen que el gel esté ubicado en la cubeta de modo que los “orificios” estén

Controlen que el gel esté ubicado en la cubeta de modo que los “orificios” estén ubicados hacia el electrodo negativo (negro). Los colorantes están cargados negativamente y se moverán hacia el electrodo positivo (rojo).

Rellenen la cubeta con solución reguladora de NaB 1x (hay varios envases plásticos que contienen

Rellenen la cubeta con solución reguladora de NaB 1x (hay varios envases plásticos que contienen esta solución reguladora en el laboratorio) hasta un nivel que cubra toda la superficie del gel a una profundidad entre 1 y 2 mm. Controlen que el gel esté cubierto con la solución reguladora y que no aparezcan “hoyuelos” en los orificios; agreguen más solución reguladora si es necesario.

Preparen la micropipeta en 10 µl y carguen cada muestra en un orificio separado como

Preparen la micropipeta en 10 µl y carguen cada muestra en un orificio separado como lo indica su profesor. Usen una punta nueva para cada muestra. Recuerden que su grupo compartirá este gel. Un grupo cargará sus muestras en tres separaciones a la izquierda mientras que el otro utilizará las tres separaciones a la derecha. Es recomendable que tomen nota de la solución que colocan en cada separación.

Al cargar cada muestra, coloquen la punta de la pipeta en el centro y suavemente
Al cargar cada muestra, coloquen la punta de la pipeta en el centro y suavemente
Al cargar cada muestra, coloquen la punta de la pipeta en el centro
y
suavemente bajen el émbolo de la pipeta para expulsar lentamente
la
muestra. Utilicen ambas manos para sostener la pipeta
para evitar que se mueva. Dado que sus densidades son mayores que la
solución reguladora de NaB, los colorantes se hundirán en los orificios.
Punta para pipeta
Solución reguladora de NaB
Gel de agarosa
Orificio
Cierren la tapa con firmeza sobre la cámara de electroforesis. Conecten los cables

Cierren la tapa con firmeza sobre la cámara de electroforesis. Conecten los cables

eléctricos al suministro de energía. Asegúrense de que ambos cables estén conectados

al

mismo canal con el cátodo (–) al cátodo (negro con negro) y ánodo (+) al ánodo (rojo

 

con rojo).

Enciendan el suministro eléctrico y establezcan el voltaje en 130–135 v.

Enciendan el suministro eléctrico y establezcan el voltaje en 130–135 v.

Luego de dos o tres minutos, observen los colorantes para asegurarse de que se estén

Luego de dos o tres minutos, observen los colorantes para asegurarse de que se estén moviendo hacia el electrodo positivo (rojo). Comenzarán a ver que el colorante púrpura (llamado azul de bromofenol) comienza a separarse del colorante azul (xilenocianol).

En aproximadamente 10 minutos, o cuando puedan distinguir los tres colorantes, apaguen

En aproximadamente 10 minutos, o cuando puedan distinguir los tres colorantes, apaguen

el

interruptor de energía y desconecten los electrodos del suministro eléctrico. Háganlo

tomando el enchufe del suministro eléctrico, no jalando el cable con fuerza. Retiren con cuidado la tapa de la cubeta de gel para que puedan ver mejor los colorantes en el gel.

En un papel, registren las bandas o esquema de colores en cada una de las

En un papel, registren las bandas o esquema de colores en cada una de las franjas que contienen sus muestras. Utilicen esta información para responder las preguntas en la sección “Conclusiones”.

Dejen los geles en la cubeta de gel.

Dejen los geles en la cubeta de gel.

Conclusiones

Conclusiones Laboratorio 11 Los colorantes que separaron utilizando la electroforesis en gel fueron: naranja G

Laboratorio

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Los colorantes que separaron utilizando la electroforesis en gel fueron:

Los colorantes que separaron utilizando la electroforesis en gel fueron:

naranja G (amarillo), azul de bromofenol (púrpura) y xilenocianol (azul). ¿Qué carga eléctrica transportaron estos colorantes?

¿Qué evidencia les permitió arribar a esta conclusión?

¿Qué evidencia les permitió arribar a esta conclusión?

El tamaño molecular puede cumplir un rol importante en la separación ya que las moléculas

El tamaño molecular puede cumplir un rol importante en la separación ya que las moléculas pequeñas se mueven por la matriz del gel con mayor rapidez que las moléculas más grandes. El peso formular o molecular de estos colorantes son: naranja G (452.38), azul de bromofenol (669.98) y xilenocianol (538.62). Según sus resultados, ¿les parece que estas moléculas se separaron claramente por el tamaño?

¿Qué otros factores pueden haber jugado un rol importante en la separación de estos colorantes?

¿Qué otros factores pueden haber jugado un rol importante en la separación de estos colorantes?

¿Qué tubo contenía un solo colorante? ¿El A, B o C?

¿Qué tubo contenía un solo colorante? ¿El A, B o C?

Nombren este colorante.

Nombren este colorante.

Al aspirar una solución, ¿por qué es importante ver que realmente la solución ingresa a

Al aspirar una solución, ¿por qué es importante ver que realmente la solución ingresa a la punta de la pipeta?

Luego de cargar el gel, ¿permanece alguna solución en los tubos A, B o C?

Luego de cargar el gel, ¿permanece alguna solución en los tubos A, B o C?

¿Cómo se puede explicar que la solución quede en estos tubos?

¿Cómo se puede explicar que la solución quede en estos tubos?

BamH I

Hind III

Laboratorio

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Análisis de restricción de

pARA y pKAN-R

Los plásmidos son piezas circulares de ADN que

se encuentran naturalmente en las células bacteriales. Los plásmidos utilizados en la biología molecular han sido modificados a través de la ingeniería genética para facilitar la clonación de genes y la producción de proteínas (expresión del gen) en bacterias. Los genes resistentes a los antibióticos han sido diseñados en estos plásmidos y funcionan como marcadores seleccionables; es decir, estos genes nos permiten seleccionar las bacterias que albergan los plásmidos de aquéllas que no lo hacen. Si una bacteria contiene un plásmido con un gen resistente a los antibióticos, la bacteria podrá crecer y reproducirse en presencia de ese antibiótico; aquellas bacterias sin el plásmido no podrán crecer. Por lo tanto, se pueden utilizar antibióticos para seleccionar las bacterias que son resistentes y que probablemente tienen un plásmido con el gen resistente de aquellas bacterias que no portan el plásmido. En este laboratorio se utilizarán dos plásmidos: el pARA contiene un gen de resistencia a la ampicilina, amp r , y el pKAN-R contiene un gen con resistencia a la kanamicina, kan r .

El objetivo de este laboratorio tiene tres aspectos: 1) presentar un método comúnmente utilizado para analizar los elementos genéticos del plásmido de ADN; 2) analizar el papel y la naturaleza de las enzimas de restricción; y 3) realizar los primeros pasos para producir una molécula de ADN recombinante.

El plásmido pARA tiene 4058 pares de base (pb) de tamaño. Un “par de base” sería la adenina:timina o guanina:citosina y es el método más común que se utiliza para expresar el tamaño de las moléculas de ADN. El plásmido tiene el gen amp r , que codifica la proteína betalactamasa, una enzima que destruye el antibiótico de la ampicilina. Así, la betalactamasa le permite a las bacterias reproducirse en presencia de la ampicilina. Además, el pARA porta un gen para la proteína AraC, una proteína que ayuda a la bacteria a hacer proteínas codificadas por genes insertados en este plásmido. Un gen, incluso uno extraño, se puede expresar (producir) si está dentro de una

C a r a P B A D pARA 4058 bp r p m a
C
a
r
a
P
B
A
D
pARA
4058 bp
r
p
m
a

ubicación específica en este plásmido. La región del pARA rotulada como p BAD , en el mapa del plásmido, indica el lugar donde la ARN polimerasa necesita unirse para iniciar la transcripción. Los sitios rotulados como “BamH I” y “Hind III” representan los lugares de restricción de estas dos enzimas de restricción. Analicen el mapa del plásmido a continuación y ubiquen estos componentes del plásmido.

El plásmido pKAN-R porta el gen resistente a la kanamicina, kan r , que codifica una fosfotransferasa, enzima que transfiere un grupo de fosfato a la molécula de kanamicina destruyendo sus efectos antibióticos. La kanamicina es un antibiótico que mata a las bacterias evitando que se hagan proteínas. Si una célula no puede sintetizar proteínas, morirá. El gen kan r le otorga resistencia a la kanamicina a las bacterias que absorbió este gen. Además de kan r , el plásmido tiene el gen para la proteína fluorescente mutada, mFP, llamada proteína fluorescente roja “rfp”. El plásmido pKAN-R tiene aproximadamente 5,408 pb de tamaño.

Hind III BamH I r n a K pKAN-R 5408 bp rfp 702 bp r
Hind III
BamH I
r
n
a
K
pKAN-R
5408 bp
rfp
702
bp
r
f
p

El gen de la proteína fluorescente originalmente fue aislado del Discosoma sp, una anémona de mar encontrada en el océano Indo-Pacífico. El gen en estado natural ha sido mutado mediante un proceso llamado evolución dirigida, de modo que produzca colores que son mucho más brillantes que las proteínas en estado natural. El término “en estado natural” se refiere al gen original, el que encontraría en la naturaleza. El gen rfp ha sido transformado en un plásmido pKAN-R. Observen que el gen rfp de la mFP tiene ambos sitios de restricción: BamH I y Hind III en cada lado. Un “sitio de restricción” marca la ubicación específica donde la enzima cortará al plásmido de ADN. Si pKAN-R se digiere

con BamH I y Hind III, el gen rfp se cortará físicamente

del plásmido. Durante este laboratorio, sacarán el gen rfp del pKAN-R y sacarán el pequeño fragmento de 40 pb del plásmido pARA utilizando las mismas enzimas. Durante el próximo laboratorio, insertarán el gen rfp en el pARA generando una molécula de ADN recombinante.

Materiales

pARA (80 ng/µl) pKAN-R (80 ng/ µL) Enzimas de restricción (BamH I + Hind III) Solución reguladora de restricción 2.5x Agua destilada, dH 2 O

Micropipeta P-20 y puntas Tubos de microfuga de 1.5 ml Minicentrifugador Baño María a 37 °C Marcador indeleble

Métodos

Baño María a 37 °C Marcador indeleble Métodos Laboratorio 21 Preparación de la digestión de restricción

Laboratorio

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Preparación de la digestión de restricción de pARA-R

En este protocolo de laboratorio se utilizan las enzimas de restricción BamH I

y Hind III para digerir los plásmidos pARA y pKAN-R. Este es el primer paso para fabricar una molécula recombinante de ADN.

Consigan los siguientes cuatro tubos de microfuga: pARA, pKAN-R, BamH I y Hind III (mezcla de enzimas) y solución reguladora 2.5x.

Tomen cuatro tubos de microfuga de 1.5 ml limpios y utilicen un marcador para rotularlos de la siguiente manera:

A + = pARA + BamH I y Hind III

A - = pARA no digerido (pARA sin enzima) K+ = pKAN-R+ BamH I y Hind III

K- = pKAN-R no digerido (pKAN-R sin enzima)

A + = pARA + enzimas + solución reguladora
A + = pARA
+ enzimas
+ solución
reguladora

La matriz de reacción resume los reactivos utilizados en la digestión de restricción. Para preparar la solución de digestión, sigan las instrucciones específicas a partir del paso 4.

Tubo

Solución

dH 2 0

pARA

pKAN-R

Enzimas

Volumen Total

reguladora 2.5x

A+

4

µL

 

4

µL

 

2

µL

10µ L

A-

4

µL

2

µL

4

µL

 

 

10µ L

K+

4

µL

 

 

4

µL

2

µL

10µ L

K

-

4

µL

2

µL

 

4

µL

 

10µ L

Utilicen una punta nueva y agreguen 4µl de solución reguladora de restricción 2.5x en todos los tubos.

Agreguen 2µl de dH 2 O a los tubos rotulados A- y K -. ¿Cuál es el objetivo de este paso?

Utilicen una punta nueva y agreguen 4µl de pARA a los tubos rotulados con A+ y A-.

Utilicen una punta nueva y agreguen 4µl de pKAN-R a los tubos rotulados con K + y K -.

Agreguen 2µl de la mezcla de enzimas que contiene BamH I y Hind III, a los tubos A+ y K +. Agreguen las enzimas directamente a la solución en el fondo del tubo de microfuga. Asegúrense de utilizar una punta nueva para cada tubo para evitar la contaminación. Luego de agregar las enzimas, bombeen suavemente la solución hacia adentro y hacia afuera con la pipeta para que se mezclen los reactivos y tapen los tubos.

Si hay un minicentrifugador disponible, coloquen los tubos en el rotor, asegurándose de que los tubos estén en una configuración equilibrada y centrifuguen los tubos durante cuatro segundos. Este breve giro combinará todos los reactivos en el fondo de cada tubo.

Coloquen los cuatro tubos a baño María a 37 °C e incuben durante por lo menos 60 minutos.

Luego de los 60 minutos de incubación, la solución de digestión se puede mantener congelada, a –20 °C, hasta que sea el momento de la electroforesis.

Laboratorio

21
21

Conclusiones

Analicen los mapas de restricciones de los plásmidos pARA y pKAN-R. Dado que BamH I y Hind

III son endonucleasas de restricción específica, cortarán de manera consistente el ADN cuando éste

se encuentre con las secuencias de reconocimiento de base seis como se indica a continuación. La ubicación exacta donde se corta se llama sitio de restricción. La molécula de ADN consta de dos cade- nas de componentes básicos de nucleótidos. Estos componentes básicos están orientados en dirección opuesta en cada cadena. Por lo tanto, se dice que las dos cadenas que constituyen la molécula de ADN son “antiparalelas”. Para comodidad, podemos decir que una cadena está orientada en dirección de 5’ (“5 primo”) a 3’ (“tres primo”), mientras que la otra cadena está orientada de 3’ a 5’. Un cuidadoso

análisis de las secuencias de restricción revelará que la secuencia de los nucleótidos es un palíndromo,

es decir, dice lo mismo en ambas cadenas cuando se lee en dirección 5’

lo mismo en ambas cadenas cuando se lee en dirección 5’ 3’. Bam H I 5

3’.

BamH I

5 ,

G

G A T C C

3 ,

C

C T A G G

Hind III

5 ,

A

A G C T T

3 ,

T

T C G A A

3

5

3

,

5

,

,

,

Por lo tanto, cuando el Hind III se encuentra con esta secuencia de base seis, cortará la hélice de ADN entre

las bases de adenina adyacentes. Esto deja cuatro bases no apareadas que forman un “extremo cohesivo”.

5

3

,

,

3

T T C G A

A

,

5 ,

Extremo cohesivo

Extremo cohesivo

5

3

,

,

A G C T T A

3

5

,

,

¿Cuál es la secuencia de reconocimiento del Bam H I?  

¿Cuál es la secuencia de reconocimiento del BamH I?

 
En una dirección de 5’ 3’, ¿qué secuencia de bases representa los “extremos cohesivos de

En una dirección de 5’

3’, ¿qué secuencia de bases representa los “extremos cohesivos de cada uno”?

3’, ¿qué secuencia de bases representa los “extremos cohesivos de cada uno”?

Analicen los mapas de plásmidos pARA y pKAN-R y completen lo siguiente:

 
la digestión pARA producirá fragmentos y tendrá pares de base de largo.

la digestión pARA producirá

fragmentos y tendrá

pares de base de largo.

la digestión pKAN-R producirá fragmentos y tendrá pb y pb de largo.

la digestión pKAN-R producirá

fragmentos y tendrá

pb y

pb de largo.

Supongan que reciben un cultivo de bacterias que tiene uno o ambos plásmidos. Diseñen un

Supongan que reciben un cultivo de bacterias que tiene uno o ambos plásmidos. Diseñen un experimento simple que puedan usar para determinar cuál de estos plásmidos, pARA o pKAN-R, portaba las bacterias del cultivo.

Laboratorio 21

Laboratorio

21
21

Laboratorio

2a1
2a1

Digestión de restricción de pARA-R

Introducción a los plásmidos y las enzimas de restricción

Dos herramientas poderosas pero fundamentales

que se utilizan en la biotecnología son las enzimas de restricción y los plásmidos bacteriales. Las enzimas de restricción les permiten a los biólogos moleculares cortar las moléculas de ADN de diferentes organismos y recombinar las piezas moleculares para producir moléculas de ADN recombinantes. Los plásmidos son piezas circulares de ADN que se encuentran naturalmente en las bacterias. Mediante la tecnología del ADN recombinante y las enzimas de restricción, los plásmidos de ADN recombinante se pueden diseñar para que clonen genes o expresen proteínas codificadas por genes.

Las enzimas de restricción fueron observadas por primera vez por Werner Arbor en 1962. Arbor descubrió que, al parecer, algunas bacterias utilizaban un sistema inmunológico primitivo que no dejaba que el ADN viral se duplicara dentro de la célula huésped infectada. Algunos años más tarde, se descubrió que este mecanismo inmunológico involucraba una clase de proteínas ahora conocidas como enzimas de restricción. El nombre deriva de la capacidad de las enzimas de restringir el crecimiento de los virus en las células bacteriales. Las enzimas de restricción logran esto al romper un enlace en la cadena fosfato-azúcar del ADN viral; las enzimas cortan el ADN viral en pequeños fragmentos.

Las enzimas de restricción que se identificaron en primer lugar, al parecer, realizaron la digestión de la molécula de ADN al azar. Posteriormente, se encontraron y purificaron las enzimas de restricción que cortaban la cadena de fosfato- azúcar en un lugar específico o dentro de una secuencia de nucleótidos específica, por lo general, de cuatro a seis nucleótidos de largo. En la Tabla 1 se identifican algunas de estas enzimas de restricción específicas, su origen y las secuencias de nucleótidos que cada una reconoce. En 1978, Daniel Nathans (Universidad Johns Hopkins), Hamilton Smith (Universidad Johns Hopkins) y Werner Arbor recibieron el Premio Nobel de Medicina por su trabajo con las enzimas de restricción.

Origen

Enzima de restricción

Secuencia de

reconocimiento

   
     
 

Bacillus

BamH I

5

, G G A T C C 3 ,

amyloliquefaciens

3

, C C T A G G 5 ,

3 , C C T A G G 5 ,
   

Escherichia coli

EcoR I

5

, G A A T T C

3 ,

3

, C T T A A G

5 ,

Haemophilus

Hind III

5

, A A G C T T

3 ,

influenzae

3

, T T C G A A

5 ,

Tabla 1. Enzimas de restricción utilizadas en este laboratorio. indica los sitios donde se corta o se separa la cadena fosfato-azúcar.

sitios donde se corta o se separa la cadena fosfato-azúcar. Cuando las enzimas de restricción cortan

Cuando las enzimas de restricción cortan o digieren el ADN, los fragmentos que se obtienen, llamados fragmentos de restricción, poseen varias bases no apareadas que se extienden desde los extremos de corte. Estos son llamados “extremos cohesivos”. Si las moléculas de ADN de origen diferente se digieren utilizando la misma enzima de restricción, las bases no apareadas de cada pieza deben poder unirse (o recocerse), dado que las bases no apareadas en los extremos cohesivos serán complementarias, A:T y G:

C. Este es el único atributo de las enzimas de restricción que les permite a
C. Este es el único atributo de las enzimas de restricción que
les permite a los ingenieros genéticos combinar fragmentos
de ADN de diferentes organismos para producir moléculas
de ADN recombinante.
(a)
(b)

Figura 1. (a) molécula de ADN con sitios de restricción BamH I y Hind III (en negritas). Las flechas indican los sitios donde las enzimas cortarán la cadena fosfato-azúcar de la molécula de ADN. (b) La molécula de ADN inferior indica la ubicación de los “extremos cohesivos” (negritas).

Los plásmidos bacteriales son piezas circulares relativamente pequeñas de ADN que las bacterias pueden portar además de su ADN genómico (cromosoma único). En la naturaleza, el plásmido de ADN por lo general lleva de uno a varios genes que ayudan a que la bacteria sobreviva, tal vez brindándole resistencia a un antibiótico. Las bacterias pueden pasar a lo largo de los plásmidos

durante la conjugación (apareamiento). Las bacterias

que utilizamos en el laboratorio han sido mutadas, de manera que no pueden intercambiar plásmidos durante la

reproducción sexual.

Los plásmidos producidos en forma natural han sido

modificados de modo que realicen funciones específicas:

por lo general, la clonación y la expresión de genes. En este laboratorio se examina el pARA-R, un plásmido de ADN recombinante que ha sido modificado para que exprese el gen rfp a fin producir una proteína fluorescente roja mutante (mFP). El plásmido contiene varios elementos de control que le permiten a una bacteria portar este

plásmido para expresar un gen extraño. El gen se obtuvo originalmente del genoma del Discosoma sp., una anémona de mar encontrada en el océano Indo-Pacífico. En el mapa de plásmido a continuación se indican algunas de las regiones de control más importantes, araC and P BAD , y la ubicación del gen rfp. Además, se indica la ubicación de los dos sitios de restricción: uno para Hind III y otro para BamH I. ¿Cómo podrían proceder en el corte del gen rfp?

a r a C BamH I pARA-R 4720 bp rfp 702 bp Hind III P
a
r
a
C
BamH I
pARA-R
4720 bp
rfp
702
bp
Hind III
P
r
B
p
A
m
r
D
f
a
p

También tengan en cuenta que el plásmido posee un gen de resistencia a los antibióticos: amp r . Este gen le permitirá a la bacteria que porta el plásmido vivir en un ambiente que contenga el antibiótico ampicilina.

Materiales

pARA (70 ng/µl) Enzimas de restricción (Bamh I + Hind III) Solución reguladora de restricción 2.5x Agua destilada (dH 2 O)

Micropipeta P-20 y puntas Tubos de microfuga de 1.5 ml Minicentrifugador Baño María a 37 °C

O) Micropipeta P-20 y puntas Tubos de microfuga de 1.5 ml Minicentrifugador Baño María a 37

Laboratorio

2a1
2a1
Laboratorio 2a1 Métodos
Laboratorio
2a1
Métodos

Digestión de restricción de pARA-R

El objetivo de este laboratorio tiene dos aspectos:

1) analizar el rol de las enzimas de restricción y su importancia en la ingeniería genética; y 2) analizar un plásmido bacterial y cómo se utiliza en la biotecnología.

En este protocolo de laboratorio se utilizan las enzimas de restricción BamHI y Hind III para digerir el plásmido recombinante pARA-R. La digestión de

restricción aislará del pARA el gen rfp de un fragmento más grande del plásmido que contiene amp r , araC y P BAD . En el protocolo se utiliza un pARA-R de control no digerido, junto con un marcador de tamaño o escala de ADN que lo ayudará a identificar y confirmar el tamaño de los fragmentos de restricción.

Preparación de la digestión de restricción de pARA-R

Soliciten a su profesor los siguientes tres tubos de microfuga de 1.5 ml:

pARA-R, mezcla de enzimas y solución reguladora de restricción 2.5x.

Coloquen dos tubos de microfuga de 1.5 ml limpios y utilicen un marcador para rotular los tubos de la siguiente manera: A+y A-. Incluyan su número de grupo y horario de clase en cada tubo de manera que puedan ubicarlos en la próxima clase de laboratorio.

La matriz de reacción resume los reactivos utilizados en la digestión de restricción. Para

preparar la solución de digestión, sigan las instrucciones específicas a partir del paso 4.

Tubo

Solución

H

2 O

pARA-R

Mezcla

Volumen total

reguladora 2.5x

de enzimas

A+

4

µL

4

µ L

2

µ L

10

µ L

A-

4

µL

2

µL

4

µ L

 

10

µ L

Utilicen una punta nueva y agreguen 4µl de solución reguladora de restricción 2.5x para

ambos tubos.

Agreguen 2µl de dH 2 O al tubo rotulado A-. ¿Cuál es el objetivo de este paso?

Utilicen una punta nueva y agreguen 4µl de pARA-R a los tubos rotulados A+ y A-.

Lleven el tubo A+ a su profesor, quien verterá la mezcla de enzimas en el tubo o, si se les proporcionó esta mezcla de enzimas, agreguen con cuidado 2 µl de la mezcla de enzimas directamente en la solución del tubo A+ que contiene el plásmido y la solución reguladora. Luego de agregar las enzimas, cubran el tubo y den golpecitos suaves en la parte inferior de cada tubo para mezclar los contenidos.

Si hay un minicentrifugador disponible, coloquen los tubos en el rotor, asegurándose de que los tubos estén en una configuración equilibrada y centrifuguen los tubos durante cuatro segundos. Este breve giro combinará todos los reactivos en el fondo de cada tubo.

Coloquen ambos tubos a baño María a 37 °C e incuben durante por lo menos 60 minutos.

Luego de la incubación de 60 minutos, su profesor puede colocar los tubos en el congelador hasta que estén listos para la electroforesis (Laboratorio 4a).

Los plásmidos digeridos se pueden conservar a -20 °C de manera indefinida.

Laboratorio Conclusiones Analicen el mapa de restricción del plásmido pARA-R. Bam H I y Hin

Laboratorio

Conclusiones

Analicen el mapa de restricción del plásmido pARA-R. BamH I y Hind III son enzimas de restricción específicas y cortarán consistentemente el ADN bicatenario cuando se encuentren con su respectiva secuencia de reconocimiento

de base seis que se muestra en la tabla de la página 2a.1. Estas ubicaciones de corte se llaman sitios de restricción. La molécula de ADN consta de dos cadenas de componentes básicos de nucleótidos. Estos componentes básicos están orientados en dirección opuesta en cada cadena. Por lo tanto, se dice que las dos cadenas que constituyen la molécula de ADN son “antiparalelas”. Por convención, podemos decir que una cadena está orientada en dirección de 5’ (“5 primo”) a 3’ (“tres primo”), mientras que la otra cadena está orientada de 3’ a 5’. Un cuidadoso análisis de las secuencias de restricción BamH I y Hind III revelará que las secuencias de nucleótidos son palíndromos; es decir,

dicen lo mismo en ambas cadenas cuando se leen en sentido 5’

lo mismo en ambas cadenas cuando se leen en sentido 5’ 3’ 5 3 , ,

3’

5

3

,

,

A

T

A G C T T T C G A A

3

5

,

,

2a1
2a1

Por lo tanto, cuando el Hind III se encuentra con esta secuencia de base seis, cortará la hélice de ADN entre las bases de adenina adyacentes. Esto deja cuatro bases no apareadas que forman un “extremo cohesivo”.

, , 5 , A 3 , Extremo cohesivo 5 3 , 3 , T
,
,
5 ,
A
3 ,
Extremo cohesivo
5
3
,
3 ,
T
T C G A
5 ,
Extremo cohesivo
3
A G C T T
A
5 ,
¿Cuáles son las secuencias de reconocimiento de Hind III y BamH I?
En una dirección de 5’
3’, ¿qué secuencia de bases representa los “extremos cohesivos”?
Analicen el mapa del plásmido pARA-R y completen lo siguiente:
 

¿Cuántos fragmentos de restricción resultarán de la digestión de pARA con BamH I y Hind III?

¿Cuáles serán las longitudes aproximadas, en pares de base, de estos fragmentos de restricción?

¿Cuáles serán las longitudes aproximadas, en pares de base, de estos fragmentos de restricción?

¿Qué fragmento de restricción llevará el gen amp r ?

¿Qué fragmento de restricción llevará el gen amp r ?

¿Qué fragmento de restricción llevará el gen rfp ?

¿Qué fragmento de restricción llevará el gen rfp?

¿Qué fragmento de restricción llevará el gen rfp ? Supongan que su profesor les entrega un

Supongan que su profesor les entrega un cultivo de bacterias. El cultivo puede contener bacterias que portan el plásmido pARA-R o un cultivo que contenga bacterias sin el plásmido. Diseñen un experimento simple que puedan usar para determinar cuál de los dos cultivos les entregó.

Laboratorio

3
3

Ligación de fragmentos de restricción pARA/pKAN-R que

producen un plásmido recombinante pARA-R

En este laboratorio los fragmentos de restricción producidos durante el Laboratorio 2 se ligarán o se unirán, utilizando ADN ligasa, formando nuevos plásmidos recombinantes. Estos plásmidos recientemente formados representarán moléculas de ADN recombinante porque los cuatro fragmentos de restricción han sido recombinados de diferentes maneras para producir nuevas construcciones. Por ejemplo, suponga que los cuatro fragmentos de plásmidos se representaron con las letras A, A’, K y R, en los que A y A’ representan los fragmentos pARA, y K y R representan los dos fragmentos que resultan de la digestión de pKAN-R. Los plásmidos se pueden representar con cualquier combinación de dos letras, como AK o A’R, y cualquier combinación incluso de fragmentos numerados, como por ejemplo AKA’R o ARAAKK y así sucesivamente. Como pueden ver, hay muchos tipos de moléculas recombinantes que pueden resultar de mezclar estos fragmentos de restricción.

Como recordarán, las enzimas de restricción que estamos utilizando son BamH I y Hind III. Al cortar los plásmidos en los sitios de restricción BamH I y Hind III se dejan “extremos cohesivos”. Los extremos cohesivos del ADN cortado pueden ligarse a cualquier otro fragmento de ADN que tenga un extremo cohesivo adicional. Analicen el mapa del plásmido pARA a continuación para ver las ubicaciones de los sitios de restricción de BamH I y Hind III y los extremos cohesivos que se forman en los extremos de 5’ de su fragmento de restricción.

Dado que pARA tiene un sitio de restricción BamH I y otro Hind III, la digestión dejará dos fragmentos. A continuación se representan los fragmentos de restricción. Es importante

r a a C BamH I Hind III P pARA 4058 pb B A D
r
a
a
C
BamH I
Hind III
P
pARA
4058 pb
B
A
D
5 ,
r
G A T C C
3 , G
A
3 ,
4018 pb
T T C G A
5 ,
p
5’
A G C T T
m
40 pb
3’
A
G 3 ,
C C T A G 5’
a
recordar que el fragmento de restricción más grande porta el
gen amp r , el gen que suministra la resistencia a la ampicilina.

3.1

El fragmento más pequeño no porta ningún gen.

El plásmido pKAN-R tiene un sitio de restricción BamH I y otro Hind III que flanquea el gen rfp. La digestión de pKAN-R dejará dos fragmentos, uno será de 4706 pb y el otro, de 702 pb.

Con la ligación se unirá cualquiera de los dos extremos cohesivos BamH I con cualquiera de los dos extremos cohesivos Hind III. Deberían poder observar que son posibles combinaciones diferentes de fragmentos. La combinación que nos interesa es la del fragmento recombinado de 4018 pb pARA (que contiene el gen amp r ) con el fragmento de 702 pb pKAN-R (gen rfp). La combinación de estos dos fragmentos proporcionará un plásmido recombinante que llamaremos pARA-R.

Hind III BamH I r n a pKAN-R 5408 pb K rfp 702 pb 5
Hind III
BamH I
r
n
a
pKAN-R
5408 pb
K
rfp
702 pb
5 ,
G A T C C
3 , G
A
3 ,
4706 pb
T T C G A
5 ,
5’
A G C T T
702 pb
3’
A
G 3 ,
C C T A G 5’
La ligación del fragmento de 702 pb pKAN-R colocará
al gen rfp del plásmido en un lugar que le permitirá a
la bacteria sintetizar (expresar) la proteína fluorescente
mutante, mFP.
r
f
p

Inicialmente, los fragmentos de restricción se mantienen

juntos por el enlace de hidrógeno entre las bases de los

P B A D C Hind III a r m a p r a BamH
P
B
A
D
C
Hind III
a
r
m
a
p
r
a
BamH I
pARA
4720 pb
rfp
702 pb
r
f
p
T 5 A , 3 T A C G G C A T A T
T
5 A
,
3
T
A
C
G
G
C
A
T
A
T
,
3
5

ADN ligasa

+ ATP

ADN ligasa

+ ATP

T 5 A , 3 T A C G G C A T A T
T
5 A
,
3
T
A
C
G
G
C
A
T
A
T
,
3
5

nucleótidos que forman los extremos cohesivos. Cabe recordar que la adenina y la timina comparten dos enlaces de hidrógeno mientras que la citosina y la guanina comparten tres. Esto asegura que solamente coincidirán los extremos cohesivos complementarios.

Los enlaces de hidrógeno son enlaces químicos débiles y no son adecuados para mantener los extremos cohesivos juntos de manera permanente. La enzima ADN ligasa, con la energía suministrada por ATP, formará enlaces covalentes entre el azúcar y los grupos de fosfato del esqueleto del ADN. En el diagrama a continuación pueden ver las ubicaciones de estos enlaces en cada lado de la molécula de ADN. Cuando se forman los enlaces covalentes, estos completan la unión fosfodiéster entre los dos azúcares y el grupo de fosfato de cada cadena. Los enlaces químicos que resultan constituyen un enlace relativamente fuerte.

que resultan constituyen un enlace relativamente fuerte. Laboratorio 3 Materiales pARA digerido (A+ del laboratorio

Laboratorio

3
3

Materiales

pARA digerido (A+ del laboratorio 2)

pKAN-R digerido (K+ del laboratorio 2) Solución reguladora de ligación 5x con ATP

ADN ligasa T4 en el tubo rotulado “Lig” Agua destilada

Micropipeta P-20 y puntas Baño María a 70 °C Gradilla plástica para tubos de microfuga Marcador indeleble

Métodos

Tomen los tubos A+ y K+ de la gradilla que se encuentra en el

frente de la clase. Coloquen los dos tubos a baño María a 70 °C

durante 30 minutos. Esta exposición al calor desnaturalizará (inactivará) cualquier BamH I y Hind III que pudiera estar activo. ¿Por qué es importante esto?

Mientras sus tubos se encuentren a baño María, solicítenle a su profesor la solución reguladora 5x y un tubo deligasa. El tubo de ligasa contiene 2 µl de ADN ligasa. Rotulen este tubo con sus iniciales.

Luego de 30 minutos, duración del paso de incubación a 70 °C, agreguen 4 µl de A+ directamente en la ligasa de ADN en el fondo del tubo de Ligasa.

Utilizando una punta nueva, agreguen 4 µl de K+ a la solución en el tubo de Ligasa.

Utilizando una punta nueva, agreguen 3 µl de solución reguladora de ligación 5x directamente en la solución en el fondo del tubo Ligasa. Desechen el tubo de la solución reguladora.

Agreguen 2 µl de dH2O al tubo de Ligasa, utilizando una punta limpia. Suave y lentamente muevan el émbolo hacia adentro y hacia afuera para mezclar los reactivos. Realicen este paso sin salpicar la solución en los laterales del tubo de microfuga. En la tabla a continuación se resumen los contenidos del tubo de Ligasa.

A+

K+

Solución reguladora de ligación 5x

dH 2 O

Ligasa

Volumen total

4

µL

4

µL

3µ L

2

µL

2

µ L

15

µ L

Si hay gotitas de líquido en los laterales del tubo, centrifuguen brevemente el tubo para combinar los reactivos.

Coloquen sus tubos de ligasa, A+ y K+ en las gradillas en el frente de la clase. Su tubo de ligasa permanecerá durante la noche a temperatura ambiente.

Laboratorio

3
3

Conclusiones

¿Por qué es importante colocar los tubos A+ y K+ a baño María a 70 °C antes de preparar la reacción de ligación?

¿Qué creen que podría pasar si se omitiera este paso?

Realicen un diagrama para mostrar cómo se unieron los siguientes extremos cohesivos. (: = enlace de hidrógeno) Consulten la página 3.2 para ver el ejemplo de apareamiento de bases.

A

A G C T . . T

.

. .

 

.

.

.

T T C G A

A

Si bien son muchos los plásmidos recombinantes, dibujen tres plásmidos recombinantes posibles. Incluyan dentro de esos tres, la combinación en la que estamos más interesados, la que combina pARA con el fragmento pKAN-R que porta el gen rfp.

¿Pueden dos fragmentos rfp unirse y circular en el tubo de ligasa?

En la molécula de ADN, hay dos tipos de enlaces químicos: enlaces químicos covalentes y enlaces de hidrógeno. Describan brevemente cómo difieren estos enlaces en cuanto a qué tan fuertes son y en qué parte de la molécula de ADN los encontrará.

Durante la ligación, ¿cuáles de estos enlaces (hidrógeno o covalente) se forma primero? ¿Dónde se forman? ¿Qué enlaces se forman después y dónde?

¿Para formar qué enlaces se necesita ADN ligasa?

Laboratorio 3

Laboratorio

3
3

Laboratorio

14
14

Confirmación de la restricción y la ligación

Uso de electroforesis en gel de agarosa

Es importante en esta etapa de nuestro procedimiento experimental que confirmemos que el BamH I y Hind III han digerido los plásmidos pKAN-R y pARA originales, y que los fragmentos de restricción han sido ligados por el ADN ligasa. En este laboratorio se demostrará que tenemos moléculas de ADN recombinantes.

La electroforesis en gel es un procedimiento comúnmente utilizado para separar fragmentos de ADN según su tamaño molecular. Como los colorantes que separaron en el Laboratorio 1, los fragmentos de ADN migrarán por el laberinto de la agarosa. El ADN, debido a los grupos de fosfato, tiene carga negativa y se moverá hacia el electrodo positivo (rojo). Dado que es más fácil que las moléculas pequeñas se muevan por la matriz de agarosa, éstas migrarán más rápido que los fragmentos más grandes. Imagínense un grupo de corredores de campo traviesa cruzando una espesa selva tropical. Con todos los demás factores iguales, los corredores de menos altura podrán circular por la espesura de enredaderas que cuelgan y el denso follaje más rápido que los corredores más altos. De manera que los fragmentos más pequeños de ADN se moverán más rápido por la espesura de las moléculas de agarosa que los fragmentos más grandes.

Tomaremos todas las muestras de plásmidos: digeridos, no digeridos y ligados, y utilizaremos la electroforesis para separar estas piezas. Tal vez predijeron que sus plásmidos sin cortar producirían solamente una banda de ADN; no hay motivo para pensar lo contrario. Sin embargo, es posible que aparezcan dos o tres líneas en las franjas de plásmidos no digeridos. El motivo de esto es que los plásmidos aislados de las células existen de diversas formas. Una de las formas del plásmido se llama “superenrollada”. Es posible visualizar esta forma pensando en una pieza circular de tubería plástica retorcida. La torcedura o enrollamiento tiene como resultado una molécula muy compacta, que se moverá por el gel rápidamente debido a su tamaño.

que se moverá por el gel rápidamente debido a su tamaño. Una segunda forma de plásmido

Una segunda forma de plásmido es llamada “círculo mellado” o “círculo abierto”. Con frecuencia, un plásmido experimentará el rompimiento de uno de los enlaces covalentes ubicados en la cadena de fosfato-azúcar a lo largo de una de las dos cadenas de nucleótidos. El congelamiento y descongelamiento repetido del plásmido u otro tratamiento severo puede causar el rompimiento. Cuando esto ocurre, la tensión acumulada en el plásmido superenrollado se libera a medida que el plásmido enrollado se desenrolla. Esta forma de plásmido circular no se moverá tan fácilmente por el gel de agarosa como la forma superenrollada. Si bien tiene el mismo tamaño, en términos de pares de base, estará ubicado más cerca del orificio que la forma superenrollada.

más cerca del orificio que la forma superenrollada. La última forma del plásmido que podemos ver

La última forma del plásmido que podemos ver se llama “multímero”. Cuando las bacterias duplican los plásmidos, éstos por lo general se duplican tan rápido que terminan unidos como los eslabones de una cadena. Si los dos plásmidos se unen, el multímero será dos veces más grande que un solo plásmido y migrará muy lentamente por el gel. De hecho, se moverá más lentamente que el círculo mellado. Sus muestras de pKAN-R – y pARA –, luego, pueden tener tres bandas que aparecen en el gel. Comenzando muy cerca del orificio, pueden observar que el multímero se desplaza primero, seguido de una banda con forma circular mellada y finalmente una banda superenrollada.

circular mellada y finalmente una banda superenrollada. Utilizaremos una técnica de tinción especial que nos

Utilizaremos una técnica de tinción especial que nos permite ver los fragmentos incrustados en el gel; luego realizaremos un registro fotográfico del gel para

documentar este importante paso.

Materiales

Muestras de plásmidos:

K-, K+ A-, A+ Plásmido ligado (tubo “LIG”) Gel de agarosa al 0.8% Colorante de carga 5x NaB 1x (o TBE 0.5x)

Marcador de tamaño del ADN (25 ng/µl)

Micropipeta P-20 y puntas Tubos de microfuga de 1.5 ml Aparato de electroforesis Suministro eléctrico Lapicera para marcar Gradilla plástica para tubos de microfuga

para marcar Gradilla plástica para tubos de microfuga Laboratorio 14 Métodos Reúnan las cinco muestras de

Laboratorio

14
14

Métodos

Reúnan las cinco muestras de plásmidos y el marcador de ADN que su profesor les brindará y colóquenlos en la gradilla plástica para tubos. Deben tener seis tubos.

Consigan cinco tubos de microfuga de 1.5 ml limpios y rotúlenlos de la siguiente manera:

A-, A+, K-, K+, y L. El tubo de microfuga con el marcador ya debe estar rotulado.

En la siguiente tabla se resume la preparación de la muestra de plásmidos para la electroforesis. Vean los “Consejos” antes de preparar estos tubos.

Tubo

dH 2 0

Colorante

K+

K-

A-

A+

LIG

Volumen

de carga

total

A+

4

L

2

L

 

 

4

L

10

L

A–

4

L

2

L

 

 

4

L

 

– 10

 

L

K–

4

L

2

L

 

4

L

 

 

– 10

 

L

K+

4

L

2

L

4

L

 

 

 

– 10

 

L

L

3

L

2

L

 

 

 

 

L

5

10

L

Consejos:

Por ejemplo, al tubo rotulado con “A-”, agréguenle 4 µl de pARA-, 4 µl de dH2O y 2 µl de colorante de carga. El colorante de carga debe ubicarse en la gradilla plástica para tubos de microfuga al lado del tubo de dH 2 O.

Si estudian esta tabla, verán que pueden agregar agua a los cinco tubos, luego agregar el colorante de carga a todos los tubos sin cambiar la punta. Luego, viertan

la muestra de plásmido en cada tubo, cambiando la punta cada vez para evitar la contaminación.

Guarden el tubo “LIGque contiene su plásmido ligado; debe haber alrededor de 10µl restante en este tubo. Importante: regresen el tubo “LIG” a la gradilla con los tubos, en el frente del salón, porque lo necesitarán para el próximo laboratorio.

Centrifuguen todas las muestras para combinar los reactivos en el fondo de cada tubo. Asegúrense de que los tubos estén ubicados en una configuración equilibrada.

Preparen el gel y la cubeta de electroforesis para recibir las muestras de plásmidos.

Asegúrense de que los orificios de gel estén orientados hacia el electrodo negativo (negro).

Viertan la solución reguladora de NaB 1x (o TBE 0.5x) sobre el gel hasta que no haya “hoyuelos” que rompan la superficie de la solución reguladora sobre los orificios. Es importante que el gel esté completamente por debajo de la solución reguladora de NaB. No obstante, es recomendable que no utilicen demasiada solución en la cubeta para permitir que la corriente eléctrica vaya por la solución reguladora y no por el gel.

Coloquen sus muestras de plásmidos y el marcador al gel, con la pipeta y las puntas.

Continúa en la página siguiente

Laboratorio 14 Continuación desde la página anterior Compartirán este gel con otro grupo. A menos
Laboratorio
14
Continuación desde la página anterior
Compartirán este gel con otro grupo.
A menos que su profesor les haya hecho cargar sus muestras con un esquema
diferente, carguen sus muestras como se indica a continuación. Sigan las
instrucciones de carga que comienzan en el paso siete. Si cargan su muestra en
diferente orden, asegúrense de registrarlo en su cuaderno para tomarlo como
referencia más tarde.
marcador K+
K-
A+
A-
L
Utilizando un punta limpia, preparen su micropipeta P-20 a 10 µl. Aspiren 10 µl de su
“marcador de tamaño de ADN” y lentamente viértanlo en el orificio.
■ A medida que hacen esto, bajen suavemente la punta
de la pipeta por debajo de la superficie de la solución
reguladora directamente sobre, pero no dentro, del orificio.
Si colocan la punta dentro del mismo pueden dañar la pared
del orificio o perforar el fondo del mismo.
Esto no es aconsejable.
Punta para pipeta
Solución reguladora de NaB
Gel de agarosa
Orificio
■ Utilicen ambas manos para estabilizar la pipeta. Lentamente viertan la
muestra empujando hasta la primera marca de detención de la pipeta. Debido
al colorante de carga, la muestra tendrá una densidad superior a la solución
reguladora de electroforesis. Esto le permitirá a la muestra hundirse en el
orificio.
■ Importante: Mientras sostienen el botón en la primera marca, retiren lenta-
mente la punta de la pipeta de la cubeta de gel. Si han cargado su muestra cor-
rectamente, el orificio se llenará de una solución de color azul.
Realicen este mismo procedimiento con las muestras de plásmidos, siguiendo el orden in-
dicado en la página 4.3. Para cada muestra cambien la punta. Si eligen cargar sus muestras
en un orden diferente, asegúrense de registrar el orden de las muestras en su cuaderno.
Cierren la tapa de la cubeta de gel con firmeza sobre la cámara de electroforesis.
Conecten los cables eléctricos al suministro de energía. Asegúrense de que ambos
cables estén conectados al mismo canal (mismo lado), el negativo (negro) con el
negativo (negro) y el positivo (rojo) con el positivo (rojo).
En el suministro eléctrico, coloquen el voltaje en 130-135 v.
Luego de dos o tres minutos, observen el gel y asegúrense de que el colorante púrpura
(azul de bromofenol) se mueva hacia el electrodo positivo. Si se mueve en otra
dirección, hacia el electrodo negativo (negro), verifiquen los cables eléctricos para ver
que estén conectados al suministro eléctrico correctamente.
Asegúrense de regresar su tubo “LIG” al frente de la clase. Este tubo debe contener los
plásmidos recombinantes que utilizarán en el próximo laboratorio.
Su profesor explicará qué hacer con los geles: escuchen con atención. Si el tiempo
de laboratorio es breve, no les alcanzará para completar la electroforesis. El colorante
amarillo deberá llegar justo hasta el final del gel, en alrededor de 40 ó 50 minutos.

Conclusiones

Respondan a estas preguntas después de que tengan la oportunidad de analizar la fotografía del gel.

tengan la oportunidad de analizar la fotografía del gel. Laboratorio 14 ¿Cómo comparan sus resultados reales

Laboratorio

14
14
¿Cómo comparan sus resultados reales con sus predicciones sobre el gel?

¿Cómo comparan sus resultados reales con sus predicciones sobre el gel?

¿Aparecen algunas bandas en la fotografía del gel que no esperaban?

¿Aparecen algunas bandas en la fotografía del gel que no esperaban?

¿Cómo pueden explicar el origen de estas bandas inesperadas?

¿Cómo pueden explicar el origen de estas bandas inesperadas?

¿Observan evidencia de las tres formas de plásmidos en las franjas sin cortes?

¿Observan evidencia de las tres formas de plásmidos en las franjas sin cortes?

¿Hay pruebas de que hay más de una forma de multímero?

¿Hay pruebas de que hay más de una forma de multímero?

¿Por qué los plásmidos ligados están tan cerca del orificio?

¿Por qué los plásmidos ligados están tan cerca del orificio?

Dos de los fragmentos pKAN-R de 702 pb, los fragmentos del gen rfp , pueden

Dos de los fragmentos pKAN-R de 702 pb, los fragmentos del gen rfp, pueden formar un fragmento circular porque cada extremo de los fragmentos termina en un extremo cohesivo de BamH I y Hind III. ¿Hay pruebas de que haya un fragmento circular de 1404 pb en la franja ligada?

Laboratorio

4a1
4a1

Confirmacion de

la digestión de restricción de pARA-R

El objetivo de este protocolo es revisar los fragmentos de

restricción que resultan de la doble digestión de pARA-R por BamH I y Hind III (Laboratorio 2a). La electroforesis en gel es un procedimiento comúnmente utilizado para separar fragmentos de ADN según el tamaño molecular de los fragmentos de restricción o el número de pares de base. Como los colorantes que separaron en el Laboratorio 1, los fragmentos de ADN migrarán por el laberinto de la agarosa. El ADN, debido a los grupos de fosfato, tiene carga negativa y migrará hacia el electrodo positivo (rojo). Dado que es más fácil que las moléculas pequeñas se muevan por la matriz de agarosa, éstas migrarán más rápido que los fragmentos más grandes. Imagínense un grupo de corredores de campo traviesa cruzando una espesa selva tropical. Con todos los demás factores iguales, los corredores de menos altura podrían circular por la espesura de enredaderas que cuelgan y el denso follaje más rápido que los corredores más altos. De manera que los fragmentos más pequeños de ADN se moverán más rápido por la espesura de las moléculas de agarosa que los fragmentos más grandes.

Tomaremos ambas muestras de plásmido, digerido y no digerido, y utilizaremos la electroforesis para separar estos fragmentos de restricción. Tal vez predijeron que sus plásmidos sin cortar producirían solamente una sola banda de ADN: no hay motivo para pensar lo contrario. Sin embargo, es posible que aparezcan dos o tres líneas en la franja de plásmidos no digeridos (control). Este es el motivo: los plásmidos aislados de las células tienen varias formas. Una de las formas del plásmido se llama “superenrollada”. Es posible visualizar esta forma pensando en una pieza circular de tubería plástica torcida. La torcedura o enrollamiento del plásmido tiene como resultado una molécula muy compacta, que se moverá por el gel rápidamente debido a su tamaño.

que se moverá por el gel rápidamente debido a su tamaño. Una segunda forma de plásmido

Una segunda forma de plásmido es llamada “círculo mellado” o “círculo relajado”. Con frecuencia, un plásmido experimentará el rompimiento de uno de los enlaces covalentes ubicados en la cadena de fosfato-azúcar a lo largo de una de las dos cadenas de nucleótidos. El congelamiento y descongelamiento repetido del plásmido u otro tratamiento severo puede causar el rompimiento. Cuando esto ocurre, la tensión acumulada en el plásmido superenrollado se libera a medida que el plásmido enrollado se desenrolla. Esta forma de plásmido circular no se moverá tan fácilmente por el gel de agarosa como la forma superenrollada. Si bien tiene el mismo tamaño, en términos de pares de base, estará ubicado más cerca del orificio que la forma superenrollada.

más cerca del orificio que la forma superenrollada. La última forma de plásmido que pueden observar

La última forma de plásmido que pueden observar se llama “multímero”. Cuando las bacterias duplican plásmidos, estos por lo general se duplican tan rápido que terminan unidos como los eslabones de una cadena. Si los dos plásmidos se unen, el multímero será dos veces más grande que un solo plásmido y migrará muy lentamente por el gel. De hecho, se moverá más lentamente que el círculo mellado. La muestra de plásmido no digerido, pARA-R, puede tener tres bandas que aparecen en el gel. Comenzando muy cerca del orificio, pueden observar que el multímero se desplaza primero, seguido de una banda con forma circular mellada y finalmente una banda superenrollada.

circular mellada y finalmente una banda superenrollada. Utilizaremos una técnica de tinción especial que nos

Utilizaremos una técnica de tinción especial que nos permite visualizar los fragmentos incrustados en el gel; luego realizaremos un registro fotográfico del gel para documentar este importante paso.

Materiales

Muestras de plásmidos:

A– y A+ (del laboratorio 2a) Gel de agarosa al 0.8% Colorante de carga 5x NaB 1x (o TBE 0.5x) Marcador de tamaño del ADN (25 ng/µl)

Micropipeta P-20 y puntas Tubos de microfuga de 1.5 ml Aparato de electroforesis Suministro eléctrico Gradilla plástica para tubos de microfuga Lapicera para marcar

Métodos

para tubos de microfuga Lapicera para marcar Métodos Laboratorio 4a1 Reúnan ambas muestras de plásmidos y

Laboratorio

4a1
4a1
Reúnan ambas muestras de plásmidos y el marcador de ADN que su profesor les brindará

Reúnan ambas muestras de plásmidos y el marcador de ADN que su profesor les brindará y colóquenlos en la gradilla plástica para tubos. Deben tener tres tubos.

Agreguen 2 µl de colorante de carga a los tubos A+ y A-. Tengan cuidado

Agreguen 2 µl de colorante de carga a los tubos A+ y A-. Tengan cuidado de no contaminar las muestras de plásmido. El colorante de carga aumentará la densidad de cada muestra para que el ADN se hunda en el orificio del gel. El colorante de carga también contiene colorantes visibles para que podamos seguir el progreso de las muestras durante la electroforesis. El marcador de tamaño del ADN ya contiene colorante de carga. Sin hacer burbujas, bombeen suavemente la pipeta varias veces para mezclar el colorante de carga con las muestras de

plásmido. Asegúrense de utilizar una punta nueva por cada muestra de plásmido para evitar la contaminación.

Preparen el gel y la cámara de electroforesis para recibir las muestras de plásmidos.

Preparen el gel y la cámara de electroforesis para recibir las muestras de plásmidos.

Asegúrense de que los orificios de gel estén orientados hacia el electrodo negativo (negro).

Viertan la solución reguladora de NaB 1x (o TBE 0.5x) dentro de la cubeta de electroforesis hasta que no haya “hoyuelos” que rompan la superficie de la solución reguladora sobre los orificios en el gel. Es importante que el gel esté completamente sumergido debajo de la solución reguladora, pero es recomendable que no haya demasiada solución reguladora en la cubeta, dado que la electricidad corre solamente a través de la solución reguladora y no a través del gel.

Coloquen sus muestras de plásmidos y el marcador al gel, con la pipeta y las

Coloquen sus muestras de plásmidos y el marcador al gel, con la pipeta y las puntas. Pueden compartir este gel con otro grupo.

A menos que su profesor les haya hecho cargar sus muestras con un esquema diferente,

A menos que su profesor les haya hecho cargar sus muestras con un esquema diferente, carguen sus muestras como se indica a continuación. Sigan las instrucciones de carga que comienzan en el paso seis. Si cargan su muestra en diferente orden, asegúrense de

registrarlo en su cuaderno para tomarlo como referencia más tarde.

marcador A – A +
marcador
A –
A +

Continúa en la página siguiente

Laboratorio

4a1
4a1

Continuación desde la página anterior

Utilizando una punta limpia, preparen su micropipeta P-20 a 10 µl. Aspiren 10 µl de

Utilizando una punta limpia, preparen su micropipeta P-20 a 10 µl. Aspiren 10 µl de su “marcador de tamaño de ADN” y lentamente viértanlo en el orificio.

P-20 a 10 µl. Aspiren 10 µl de su “marcador de tamaño de ADN” y lentamente
Punta para pipeta Solución reguladora de NaB Gel de agarosa Orificio
Punta para pipeta
Solución reguladora de NaB
Gel de agarosa
Orificio

A medida que hacen esto, bajen lentamente la punta de la pipeta por debajo de la solución reguladora directamente sobre, no dentro, del orificio. Si colocan la punta dentro del orificio pueden dañar la pared o perforar el fondo del mismo.

Utilicen ambas manos para estabilizar la pipeta. Lentamente viertan la muestra empujando hasta la primera marca de detención de la pipeta. Debido al colorante de carga, la muestra tendrá una densidad superior a la solución reguladora de NaB o TBE. Esto le permitirá a la muestra hundirse en el orificio.

Importante: mientras sostienen el botón en la primera marca, retiren lentamente la punta de la pipeta de la cubeta de gel. Si han cargado su muestra correctamente, el orificio se llenará de una solución de color azul que contiene la muestra.

Cambien la punta de la pipeta y carguen 12 µl de la muestra A- en

Cambien la punta de la pipeta y carguen 12 µl de la muestra A- en el próximo orificio.

Cambien la punta de la pipeta y carguen 12 µl de la muestra A+ en

Cambien la punta de la pipeta y carguen 12 µl de la muestra A+ en el próximo orificio.

Cierren la tapa de la cubeta de gel con firmeza sobre la cámara de electroforesis.

Cierren la tapa de la cubeta de gel con firmeza sobre la cámara de electroforesis. Conecten los cables eléctricos al suministro de energía. Asegúrense de que ambos cables estén conectados al mismo canal (mismo lado), el negativo (negro) con el negativo (negro) y el positivo (rojo) con el positivo (rojo).

En el suministro eléctrico, coloquen el voltaje en 130-135 v.

En el suministro eléctrico, coloquen el voltaje en 130-135 v.

Luego de dos o tres minutos, observen el gel y asegúrense de que el colorante

Luego de dos o tres minutos, observen el gel y asegúrense de que el colorante púrpura (azul de bromofenol) se mueva hacia el electrodo positivo. Si se mueve en otra dirección, hacia el electrodo negativo (negro), verifiquen los cables eléctricos para ver que estén conectados al suministro eléctrico correctamente.

Su profesor explicará qué hacer con los geles, escuchen con atención . Si el tiempo

Su profesor explicará qué hacer con los geles, escuchen con atención. Si el tiempo de laboratorio es corto, no les alcanzará para completar la electroforesis. El colorante amarillo deberá llegar justo hasta el final del gel, en alrededor de 30 ó 40 minutos.

Conclusiones

Conclusiones Laboratorio 4a1 Las preguntas 1 y 2 deben responderse antes o durante la electroforesis. Además

Laboratorio

4a1
4a1

Las preguntas 1 y 2 deben responderse antes o durante la electroforesis.

1 y 2 deben responderse antes o durante la electroforesis. Además de utilizarla para separar fragmentos

Además de utilizarla para separar fragmentos de ADN, la electroforesis puede utilizarse para calcular su tamaño real. Por ejemplo, podríamos estar buscando un gen y sospechamos que tiene determinado tamaño. La electroforesis se puede utilizar para ubicar fragmentos dentro de ese rango de tamaño. Para hacerlo, necesitaríamos utilizar un gel con una mezcla de fragmentos de ADN de tamaños conocidos. La mezcla, llamada “marcador” o “escala”, funciona como control o estándar con el que podemos comparar las ubicaciones de otras bandas de ADN en el mismo gel.

En el diagrama a continuación, la franja “marcador” contiene 10 bandas de ADN de

tamaños conocidos. El tamaño de los fragmentos se brinda a continuación. Utilizando esta información y el mapa del plásmido de pARA-R, pronostiquen las ubicaciones de las bandas de ADN producidas en A- y A+. Es aconsejable revisar las diferentes formas de plásmidos descritas en la página 4a.1 y el mapa del plásmido pARA-R descrito en la página 2a.3.

Fragmentos marcadores

1

10.0 par de kilobase

2

8.0

3

6.0

4

5.0

5

4.0

6

3.0 (banda ancha)

7

2.0

8

1.5

9

1.0

10

0.5

marcador A- A+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
marcador
A-
A+
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Preguntas respondidas luego de la documentación de la electroforesis.

Comparen la fotografía de gel con su predicción. ¿Ven alguna banda de ADN inesperada?respondidas luego de la documentación de la electroforesis. En relación con la escala de ADN, ¿entre

con su predicción. ¿Ven alguna banda de ADN inesperada? En relación con la escala de ADN,

En relación con la escala de ADN, ¿entre qué dos bandas está ubicado el gen rfp? ¿Aquí es dónde predijeron que estaría ubicado?

En la franja A-, ¿ven algún indicio de que haya formas de plásmidos diferentes? ¿Qué

En la franja A-, ¿ven algún indicio de que haya formas de plásmidos diferentes? ¿Qué forma de conformación de plásmido migra más rápido? ¿Cuál es la más lenta?

La franja A+, ¿indica una digestión completa? Expliquen su respuesta.

La franja A+, ¿indica una digestión completa? Expliquen su respuesta.

¿Qué fragmento de ADN contiene el gen ampr? ¿Cuál es el tamaño de este fragmento

¿Qué fragmento de ADN contiene el gen ampr? ¿Cuál es el tamaño de este fragmento de restricción de ADN?

Laboratorio

15
15

Transformación de Escherichia coli

con un plásmido recombinante

Hasta aquí, han producido plásmidos recombinantes

ligados. Con suerte, algunos de estos ADN recombinantes tendrán fragmentos de pKAN-R de 702 pb, el gen rfp, ligados a un fragmento de restricción pARA más grande.

A este plásmido se le conoce como pARA-R. Ahora,

queremos que estos plásmidos recombinantes pasen a las células bacteriales para que podamos obtener las células que expresen el gen rfp y generar la proteína fluorescente mutante.

El proceso de incluir partes extrañas de ADN, como un plásmido, en una célula bacterial se denomina transformación. La transformación es un proceso que ocurre en la naturaleza, aunque probablemente es algo

poco frecuente. El médico británico Frederick Griffith fue

el primero en estudiar el proceso en 1928. Por lo general,

las bacterias transfieren un exceso de material genético cromosomático, como los plásmidos, durante la conjugación (sexo bacterial) en lugar de dejarse libradas a su suerte. Pero incluir plásmidos puede suministrar a las bacterias determinados genes que confieren una ventaja selectiva, por ejemplo, la resistencia a los antibióticos. Sin embargo, bajo condiciones experimentales, es posible preparar células de modo que alrededor de una célula en mil tome un plásmido del medio circundante.

Existen diversos factores que determinan la eficiencia de la transformación. Dos factores están relacionados directamente con el plásmido utilizado para la transformación. Cuanto más grande sea éste, menos probabilidades habrá de que ingrese a la bacteria. Recuerden que para que la bacteria tome ADN extraño, el plásmido debe pasar por la membrana plasmática y la pared celular de las bacterias.

Por lo tanto, los plásmidos pequeños tienen más

posibilidades de pasar por las membranas plasmáticas de

la bacteria (E. coli tiene dos) y la pared celular que los

plásmidos grandes.

Membranas plasmáticas celular Pared Plásmidos Plásmido ADN genómico
Membranas
plasmáticas
celular Pared
Plásmidos
Plásmido
ADN genómico

Los plásmidos pueden tener diferentes formas. La forma superenrollada entra con mayor facilidad a la célula, en tanto las formas de círculo mellado o multímero, es decir, dos o más plásmidos unidos, tienen mayor dificultad para hacerlo. El tubo de ligación que contiene los plásmidos recombinantes que prepararon, no contiene ningún plásmido superenrollado. El superenrollado de un plásmido requiere una enzima que se encuentra en la célula bacterial; ésta no estaba incluida dentro de su tubo de ligación. Los plásmidos recombinantes que prepararon son principalmente de círculo mellado, pero hay una gran variedad en el tamaño.

En la naturaleza, la transformación es relativamente poco frecuente. Para aumentar las posibilidades de que plásmidos recombinantes ingresen a las células bacteriales, utilizaremos células “competentes”. Esto significa que las células están preparadas para recibir plásmidos. En su mayor parte, no se encuentran células competentes en la naturaleza; éstas deben hacerse competentes en el laboratorio. Una forma común de hacerlo es embebiendo las células en cloruro de calcio.

Recuerden que el ADN tiene carga negativa. ¿Recuerdan por qué? Las membranas plasmáticas que rodean la célula bacterial también contienen grupos de fosfato y poseen carga negativa. El problema que se presenta al intentar pasar ADN con carga negativa por una membrana con carga negativa es que las cargas eléctricas iguales tienden a rechazarse. Cuando las células se vuelven competentes, se suspenden en una solución de cloruro de calcio porque los iones del calcio (átomos de calcio con carga positiva, Ca 2+) ayudan a neutralizar las cargas eléctricas negativas de la membrana plasmática y el plásmido. Neutralizando las cargas repulsivas mediante iones de calcio, el ADN plasmídico pasa con mayor facilidad por la membrana plasmática de la célula bacterial. Las células ya fueron hechas competentes y su profesor les entregará una alícuota. No obstante, deberán realizar el siguiente paso.

Ahora que hemos neutralizado las cargas negativas del ADN y de las membranas plasmáticas, necesitamos crear una diferencia de presión entre la parte interna y externa de la célula bacterial. Esto se logra, en primer lugar, enfriando las bacterias y luego sumergiéndolas rápidamente en agua tibia. Esto se denomina “choque térmico” y crea una situación en la que la presión externa de la célula es apenas mayor que la presión interna de la misma. Este gradiente de presión ayudará a trasladar el ADN plasmídico desde el exterior hasta el interior de la célula bacterial. Luego de este duro tratamiento, tendremos que alimentar a nuestras bacterias y dejarlas recuperarse durante algunos minutos antes de diseminarlas en placas de agar.

Una vez que las células se han recuperado, se tomarán muestras de estas células y se dispondrán en una serie

de placas de agar esterilizadas. Una de estas placas contendrá solamente alimentos bacteriales; la placa no contiene antibióticos. Rotulen esta placa como “LB”. La segunda, debe contener LB y ampicilina y deben rotularla como “amp”. La tercera placa debe contener LB, ampicilina y un monosacárido llamado arabinosa, y deben rotularla como “ara”.

La ampicilina es un antibiótico que evita que las bacterias formen completamente su pared celular. Las células que no resisten la ampicilina no pueden crecer en su presencia, las células nuevas simplemente se rompen o se lisan. Si una célula recibe un gen resistente a la ampicilina, amp r , producirá una proteína que destruirá químicamente la ampicilina y, de esa forma, podrá crecer con ampicilina en su medio.

La bacteria necesita arabinosa, un monosacárido, para expresar el gen rfp. Si una bacteria incluye pARA-R, la arabinosa ayuda a la enzima ARN polimerasa, necesaria para transcribir el gen rfp, para que se alinee correctamente en el plásmido. Esta relación se tratará en el próximo laboratorio.

Aunque la cepa de E. coli que se utiliza en estos laboratorios es relativamente benigna, es importante que utilicen técnicas adecuadas al momento de manipularlas.

que utilicen técnicas adecuadas al momento de manipularlas. Laboratorio 15 Materiales Tubo LIG (plásmidos

Laboratorio

15
15

Materiales

Tubo LIG (plásmidos recombinantes)

100

µl de células competentes (LMG)

350

µl de caldo de LB (esterilizado)

Hielo molido (en una taza de poliestireno) Placas de agar, esterilizadas

1 LB, 1 LB/Amp, 1 Lb/amp/ara

Micropipeta P-20 y puntas Micropipeta P-200 y puntas Baño María a 42 °C 1 paquete de esparcidores de células (compartido) Gradilla plástica para tubos de microfuga Tubos de microfuga de 1.5 ml Lapicera para marcar

Laboratorio 15 Métodos
Laboratorio
15
Métodos

Para que este laboratorio funcione sin dificultades, es importante que sepan qué tareas se les asignaron a cada miembro del grupo antes de comenzar. Un miembro debe preparar el hielo y conseguir las células competentes, otro puede recuperar los plásmidos ligados y otro puede conseguir las placas de agar, el caldo de LB y los tubos de microfuga limpios.

P+ P-
P+
P-

Tomen dos tubos de microfuga limpios. Rotulen uno “P+” y el otro “P-”.

Tomen una taza de poliestireno con hielo molido y coloquen un tubo que contenga 100 µl de células competentes dentro del hielo. Es importante que las células permanezcan a 0 °C. Además, coloquen los tubos P+ y P- en el hielo.

Tomen los plásmidos ligados de la gradilla para tubos de microfuga rotulada “tubos LIG”. Su tubo “LIG” deberá estar rotulado con su número de grupo y horario de clase.

Preparen la pipeta P-200 en 50 µl (configurada en “0-5- 0”) y coloquen una punta limpia en su cilindro. Con mucho cuidado, vuelvan a suspender las células moviéndolas suavemente hacia adentro y hacia fuera dos veces. Sostengan el tubo por el borde superior para evitar calentar las células con los dedos.

Repartan una alícuota de 50 µl de las células suspendidas en los tubos de microfuga P+ y P- previamente enfriados. Inmediatamente regresen las células al refrigerante. Sostengan los tubos por el borde superior para evitar calentar las células con los dedos.

Utilizando la pipeta P-20, agreguen 10 µl del plásmido ligado al tubo rotulado “P+”. Mezclen suavemente el plásmido con la suspensión de células bombeando la suspensión de células dos veces. Regresen inmediatamente el tubo P+ al hielo. No agreguen plásmido al tubo P–. Las células de este tubo servirán para el “control de plásmidos”.

Mantengan las células en el hielo durante 15 minutos.

Mientras las células incuban en el hielo, consigan lo

siguiente:

Cada una de estas placas de agar:

LB, LB/amp (LB + ampicilina)

y

LB/amp/ara (LB + amp + arabinosa)

Rotulen las bases de las tres placas que contienen agar con su número de grupo y horario de la clase. Escriban con letra pequeña y en el borde de la placa. Luego tracen dos líneas en las placas LB y amp por la mitad. Rotulen una de las mitades de cada placa “P+” y la otra mitad “P-”. Vean el diagrama a

continuación. No dividan la placa ara.

P- P+ Placa LB
P- P+
Placa LB
P- P+ Placa LB/amp
P-
P+
Placa LB/amp
P+ LB/amp/ara
P+
LB/amp/ara

Luego de la incubación de 15 minutos en hielo, lleven la taza de hielo que contiene las células a baño María a 42 °C. Retiren los tubos del hielo y sométanlos a baño María durante 45 segundos. Luego de un choque de calor de 45 segundos, colóquenlos otra vez en el refrigerante de inmediato durante por lo menos un minuto.

Luego de un minuto, utilicen la pipeta P-200 para agregar 150 µl (configurada en “1-5-0”) de caldo de LB al tubo P-. Tapen el tubo y den golpecitos suaves en la parte inferior del tubo dos o tres veces para mezclar.

Utilicen una nueva punta y transfieran 150 µl de caldo de LB al tubo P+. Cierren la tapa y den golpecitos suaves en el tubo para mezclar.

Soliciten a su profesor un paquete de esparcidores de células esterilizados. Trabajarán con el paquete cada dos grupos.

Ahora están listos para esparcir sus células bacteriales en las placas de agar esterilizadas.

Utilizando una pipeta P–200 (configurada en “0-5-0”), muevan suavemente la pipeta dos o tres veces para volver a suspender las células; luego aspiren 50 µl de células del tubo P - . Abran la tapa de la placa LB como una “almeja”. Viertan tubo P-. Abran la tapa de la placa LB como una “almeja”. Viertan estas

células en la mitad de la placa marcada

“P-”. Cierren la tapa.

placa LB como una “almeja”. Viertan estas células en la mitad de la placa marcada “P-”

Vuelvan a suspender las células bombeando suavemente con la pipeta, luego aspiren una segunda alícuota de 50 µl para la placa LB/amp. Recuerden que deben depositar

las células P– en la mitad de la placa rotulada “P-”.

Tapen la placa. P- 50 µL 50 µ L P- P+ P- P+ Placa LB
Tapen la placa.
P-
50 µL
50 µ L
P- P+
P-
P+
Placa LB
Placa LB/amp

Abran el paquete de esparcidores de células esterilizados

en la terminación más cercana a los mangos del

esparcidor. Compartirán este paquete con otro grupo. Retiren sólo un esparcidor y mantengan los demás esterilizados. Sostengan el esparcidor por el mango y no permitan que la terminación doblada toque ninguna superficie, ya que podría contaminar el esparcidor. Cierren el paquete para evitar que los demás esparcidores se contaminen.

Abran la tapa de la placa LB como una almeja y, suavemente, con un leve desplazamiento, diseminen las células por la superficie del agar, manteniendo las células en el lado P– de la placa. Intenten esparcirlas de forma pareja y a los lados de la placa.

Mango
Mango

Superficie

donde se

esparcen

Con cuidado, diseminen las células P- en la placa LB/ amp utilizando el mismo esparcidor y la misma técnica.

Coloquen el esparcidor usado en la bolsa para riesgos biológicos.

el esparcidor usado en la bolsa para riesgos biológicos. Laboratorio 15 Repitan los pasos 14-a hasta
el esparcidor usado en la bolsa para riesgos biológicos. Laboratorio 15 Repitan los pasos 14-a hasta

Laboratorio

15
15

Repitan los pasos 14-a hasta 14-e para sembrar las placas LB y LB/amp con el cultivo P+. Asegúrense de utilizar la pipeta “+” y un nuevo esparcidor para evitar la contaminación.

Ahora están listos para sembrar la placa LB/amp/ara. Utilizando la pipeta P-200 (configurada en “1-0-0”),
Ahora están listos para sembrar la placa LB/amp/ara.
Utilizando la pipeta P-200
(configurada en “1-0-0”), transfieran
100 µl del cultivo P+ a la superficie
de la placa LB/amp/ara. Coloquen
100 µl de células en varias áreas
de la superficie del agar en vez de
depositarlas en un solo lugar.
P+
100 µL de células
Levanten la tapa como una almeja y
diseminen las células uniformemente
sobre la superficie de la placa.
Giren suavemente la placa por debajo
del esparcidor P+ de manera que las
células se puedan diseminar por toda
la superficie de esta placa. Intenten
diseminar las células uniformemente
también a lo largo de la pared de la
placa.
P+
Placa LB/amp/ara
Cuando terminen, tapen la placa.
Coloquen las tres placas del lado derecho hacia arriba
durante cinco minutos.
Utilizando una cinta adhesiva de color, aseguren las
placas y colóquenlas en la incubadora, con el gel boca
arriba. Asegúrense de haber rotulado claramente las
placas con su número de grupo y el horario de clase.
Pueden marcar la cinta adhesiva para encontrarlas
rápidamente el próximo laboratorio.
Desechen el desecho celular contaminado: esparcidores,
tubos de células y puntas para pipetas, colocándolas en

la bolsa para desechos celulares contaminados que su

profesor les entregará.

Laboratorio

15
15

Conclusiones

Respondan a las preguntas 1 a 3 antes de ver los resultados de la transformación.

Anticipen el crecimiento, si ocurre, en las siguientes placas. Recuerden que las células del cultivo P+ recibieron los plásmidos recombinantes, mientras que las del cultivo P– no. Utilicen un “+” si anticipan el crecimiento y un “–” si anticipan que no crecerán.

P- P+ Placa LB
P- P+
Placa LB
P- P+ Placa LB/amp
P-
P+
Placa LB/amp
P+ LB/amp/ara
P+
LB/amp/ara

¿Qué tienen en común todas las células que crecen en las placas LB/amp y LB/amp/ara?

¿Qué fragmento de restricción deben tener todas para crecer en las placas con ampicilina?

¿Esperan que todas las células que crezcan en la placa LB/amp/ara se transformen con el mismo plásmido? Expliquen por qué.

¿Cómo podrían determinar qué células de la placa LB/amp/ara contienen pARA-R, el plásmido recombinante que han creado ligando el gen rfp con el fragmento de restricción pARA?

Laboratorio 15 Respondan a estas preguntas después de ver los resultados de la transformación. Utilicen

Laboratorio

15
15

Respondan a estas preguntas después de ver los resultados de la transformación.

Utilicen la siguiente tabla para comparar el resultado de la transformación real con los resultados

Utilicen la siguiente tabla para comparar el resultado de la transformación real con los resultados previstos. Vean los resultados “pronosticados” en la página 5.5.

Placa

Resultados pronosticados

Resultados reales

 

LB

   

LB/Amp

   

LB/Amp/Ara

   
Si sus resultados reales resultaron diferentes de lo esperado, propongan razones que expliquen estas diferencias.

Si sus resultados reales resultaron diferentes de lo esperado, propongan razones que expliquen estas diferencias.

¿Cuántas colonias rojas estuvieron presentes en la placa LB/amp/ara?

¿Cuántas colonias rojas estuvieron presentes en la placa LB/amp/ara?

¿Por qué las colonias rojas sólo aparecen en esta placa y no en la placa

¿Por qué las colonias rojas sólo aparecen en esta placa y no en la placa LB/amp?

¿Esperaban que algunas de las bacterias de la placa LB/amp se transformaran con pARA-R? Describan

¿Esperaban que algunas de las bacterias de la placa LB/amp se transformaran con pARA-R? Describan brevemente cómo podrían probar su respuesta.

Laboratorio

5a1
5a1

Transformación de Escherichia coli

con pARA-R

El proceso de incluir partes extrañas de ADN, como

un plásmido, en una célula bacterial se denomina transformación. La transformación es un proceso que ocurre en la naturaleza, aunque probablemente es algo poco frecuente. El médico británico Frederick Griffith fue el primero en estudiar el proceso en 1928. Por lo general, las bacterias transfieren un exceso de material genético cromosomático, como plásmidos, durante la conjugación (sexo bacterial) en lugar de dejarse libradas a su suerte. Pero incluir plásmidos puede suministrar a las bacterias determinados genes que confieren una ventaja selectiva, por ejemplo, la resistencia a los antibióticos. Sin embargo, bajo condiciones experimentales, es posible preparar células de modo que alrededor de una célula en mil tome un plásmido del medio circundante.

Existen diversos factores que determinan la eficiencia de la transformación. Dos factores están relacionados directamente con el plásmido utilizado para la transformación. Cuanto más grande sea éste, menos probabilidades habrá de que ingrese a la bacteria. Recuerden que para que la bacteria tome ADN extraño, el plásmido debe pasar por la membrana plasmática y la pared celular de las bacterias. Por lo tanto, los plásmidos pequeños tienen más posibilidades de pasar por las membranas plasmáticas de la bacteria (E. coli tiene dos) y la pared celular que los plásmidos grandes. Membranas plasmáticas

Pared celular Plásmidos Plásmido ADN genómico
Pared celular
Plásmidos
Plásmido
ADN genómico

Los plásmidos pueden tener diferentes formas. La forma superenrollada entra con mayor facilidad a la célula, en tanto las formas de círculo mellado o multímero, es decir, dos o más plásmidos unidos, tienen mayor dificultad para hacerlo.

En la naturaleza, la transformación es relativamente poco frecuente. Para aumentar las posibilidades de que plásmidos recombinantes ingresen a las células bacteriales, utilizaremos células “competentes”. Esto significa que las células están preparadas para recibir plásmidos. En su mayor parte, no se encuentran células competentes en la naturaleza; éstas deben hacerse competentes en el laboratorio. Una forma común de hacerlo es embebiendo las células en cloruro de calcio.

Recuerden que el ADN tiene carga negativa. ¿Recuerdan por qué? Las membranas plasmáticas que rodean la célula bacterial también contienen grupos de fosfato y poseen carga negativa. El problema que se presenta al intentar pasar ADN con carga negativa por una membrana con carga negativa es que las cargas eléctricas iguales tienden a rechazarse. Cuando las células se vuelven competentes, se suspenden en una solución de cloruro de calcio porque los iones del calcio (átomos de calcio con carga positiva, Ca 2+) ayudan a neutralizar las cargas eléctricas negativas de la membrana plasmática y el plásmido. Neutralizando las cargas repulsivas mediante iones de calcio, el ADN plasmídico pasa con mayor facilidad por la membrana plasmática de la célula bacterial.

Ahora que hemos neutralizado las cargas negativas del ADN y de las membranas plasmáticas, necesitamos crear una diferencia de presión entre la parte interna y externa de la célula bacterial. Esto se logra, en primer lugar, enfriando las bacterias y luego sumergiéndolas rápidamente en agua tibia. Esto se denomina “choque térmico” y crea una situación en la que la presión externa de la célula es apenas mayor que la presión interna de la misma. Este gradiente de presión ayudará a trasladar el ADN plasmídico desde el exterior hasta el interior de la célula bacterial.

Una vez que las células se han recuperado, se tomarán muestras de estas células y se dispondrán en una serie de placas de agar esterilizadas. Una de las placas contendrá sólo el alimento bacterial. Esta placa no debe contener antibióticos. Rotulen esta placa como “LB”. La segunda, debe contener LB y ampicilina, y deben rotularla como “amp”. La tercera placa debe contener LB, ampicilina y un monosacárido llamado arabinosa, y deben rotularla

como “ara”.

La ampicilina es un antibiótico que evita que las bacterias formen completamente su pared celular. Las células que no resisten la ampicilina no pueden crecer en su presencia, las células nuevas simplemente se rompen o se lisan. Si una célula recibe un gen resistente a la ampicilina, amp r , producirá una proteína que destruirá químicamente la ampicilina y, de esa forma, podrá crecer con ampicilina en su medio.

La bacteria necesita arabinosa, un monosacárido, para expresar el gen rfp. Si una bacteria incluye pARA-R, la arabinosa ayuda a la enzima ARN polimerasa, necesaria para transcribir el gen rfp, para que se alinee correctamente en el plásmido. Esta relación se tratará en el próximo laboratorio.

Aunque la cepa de E. coli que se utiliza en estos laboratorios es relativamente benigna, es importante que utilicen técnicas adecuadas al momento de manipularlas.

Laboratorio 5a 1 Materiales Placa con E. coli (LMG) Hielo triturado 10 µl de pARA-R

Laboratorio

5a 1
5a
1

Materiales

Placa con E. coli (LMG) Hielo triturado

10 µl de pARA-R (10 ng/µl)

1 ml 50 mm de CaCl 2

1 placa con LB

1 placa con LB y amp

1 placa con LB y amp y ara

Tubos de microfuga de 1.5 ml Asa de siembra esterilizada Esparcidores desechables de células (2)

Gradilla para tubos de microfuga

Marcador indeleble

Micropipeta y puntas P-20

Micropipeta y puntas P-200 Vaso de precipitados con desinfectante Baño María a 42 °C

Métodos

Preparación de células competentes para la transformación.

La transformación bacterial exige técnicas estériles . Es fundamental que sigan las instrucciones con precisión.

La transformación bacterial exige técnicas estériles. Es fundamental que sigan las instrucciones con precisión.

. Es fundamental que sigan las instrucciones con precisión. Repitan este procedimiento usando la misma asa

Repitan este procedimiento usando la misma asa de siembra, pero transfieran la colonia y suspendan las células

Utilicen el marcador para rotular como P+ uno de los tubos de microfuga esterilizados de

Utilicen el marcador para rotular como P+ uno de los tubos de microfuga esterilizados de 1.5 ml y el otro tubo como P-. El ADN plasmídico se agregará sólo al tubo P+.

en el tubo P-. Coloquen este tubo en el hielo triturado. Coloquen el asa de siembra en desinfectante o en una bolsa de desechos celulares para su correcta eliminación.

El tubo P- representará un control plasmídico negativo.

El tubo P- representará un control plasmídico negativo . Transfieran 10 µl de plásmido (pARA-R) directamente

Transfieran 10 µl de plásmido (pARA-R) directamente en

 

la suspensión celular del tubo P+. Agiten brevemente

Tomen el tubo que contiene CaCl 2 . Utilicen la pipeta P-   la mezcla

Tomen el tubo que contiene CaCl 2 . Utilicen la pipeta P-

 

la mezcla dando golpecitos suaves en la base del tubo de

200

y una punta limpia para transferir 250 µl de CaCl 2 a

microfuga con el dedo índice. Eviten salpicar la mezcla en

los tubos P+ y P-. Indicación: preparen la pipeta P-200 en

 

la superficie lateral del tubo de transformación. Regresen

125

µl y transfieran dos alícuotas a cada tubo rotulado.

el tubo P+ al hielo triturado.

La pipeta debe indicar “1-2-5” en la pantalla.

 
El instructor entregará a la clase un plato Petri con colonias de células de E.

El instructor entregará a la clase un plato Petri con colonias de células de E. coli. Utilicen un asa de siembra esterilizada para raspar suavemente dos o tres colonias grandes de bacterias del plato Petri y transferirlas al

grandes de bacterias del plato Petri y transferirlas al Incuben ambos tubos en hielo triturado durante

Incuben ambos tubos en hielo triturado durante 15 minutos. Asegúrense de que los tubos estén en contacto con el hielo. Es importante que las células se enfríen bien.

tubo P+. Den un golpecito con el asa contra la pared del tubo para quitar las colonias del asa. Tapen el tubo y muévanlo enérgicamente por la superficie de la gradilla

y muévanlo enérgicamente por la superficie de la gradilla Tomen una de cada una de las

Tomen una de cada una de las siguientes placas: LB, LB/amp y LB/amp/ara.

para tubos de microfuga para suspender las células en CaCl 2 . Continúen haciendo esto hasta que no se vean aglomeraciones visibles de bacterias. Coloquen este tubo en el hielo triturado.

de bacterias. Coloquen este tubo en el hielo triturado. Usando el marcador y una regla, dibujen

Usando el marcador y una regla, dibujen una línea en el medio de las placas LB y LB/amp, pero no en la placa LB/amp/ara. Realicen esta división en la base de gel de ambas placas. Rotulen con una “P-” y una “P+” las mitades de las bases de las placas LB y LB/amp y con un “+” la base de la placa LB/amp/ara.

P- P+ Placa LB
P- P+
Placa LB
P- P+ Placa LB/amp
P-
P+
Placa LB/amp
P+ LB/amp/ara
P+
LB/amp/ara

Laboratorio

5a1
5a1

Transformación de E. coli con pARA-R

Después del enfriamiento en hielo de 15 minutos, realicen un choque térmico en las células de ambos tubos mediante los siguientes procedimientos:Laboratorio 5a1 Transformación de E. coli con pARA-R ■ Trasladen el contenedor de hielo con los

Trasladen el contenedor de hielo con los tubos de transformación P+ y P- del paso 7 a baño María a 42 °C. Es importante que las bacterias experimenten un cambio bien abrupto de temperatura.

Mantengan ambos tubos a baño María durante 45 segundos exactamente.

Devuelvan ambos tubos al hielo triturado de forma inmediata durante al menos un minuto.

Después del enfriamiento de un minuto, vuelvan a colocar los dos tubos en la gradilla de tubos de ensayo y manténganlos a temperatura ambiente.triturado de forma inmediata durante al menos un minuto. Esparcimiento de las células transformadas en placas

Esparcimiento de las células transformadas en placas de agar

Coloquen las tres placas en el siguiente orden: LB, LB/amp, LB/amp/ara.

tres placas en el siguiente orden: LB, LB/amp, LB/amp/ara. Preparen la pipeta P-200 en 50µl. La

Preparen la pipeta P-200 en 50µl. La pipeta indicará “0-5-0”. Sostengan las células P- (control) entre el dedo pulgar e índice. Den

golpecitos suaves en la base del tubo para volver a suspender las

células. Depositen 50 µl de estas células en la mitad “-” de

las placas LB y LB/amp. No depositen estas células en la placa LB/amp/ara.

Abran el paquete de esparcidores esterilizados

de células en la terminación más cercana a los mangos del esparcidor. Compartirán

este paquete con otro grupo. Retiren sólo un esparcidor y mantengan los demás esterilizados. Sostengan el esparcidor por el mango y no permitan que la terminación doblada toque ninguna superficie, ya que podrían contaminar el esparcidor. Cierren el paquete para evitar que los demás esparcidores se contaminen.

Mango Superficie donde se esparcen
Mango
Superficie
donde se
esparcen

Abran la tapa de la placa LB como una almeja y, con movimientos suaves y deslizantes, esparzan las células por la superficie del agar, manteniendo las células sólo en el lado “–” de la placa. Intenten esparcirlas de forma pareja y a los lados de la placa.

Utilizando el mismo esparcidor, repitan el procedimiento de esparcimiento en la placa LB/amp.

Utilizando el mismo esparcidor, repitan el procedimiento de esparcimiento en la placa LB/amp.

Después de utilizarlo en la placa LB/amp, desechen el esparcidor de células en desinfectante o

Después de utilizarlo en la placa LB/amp, desechen el esparcidor de células en desinfectante o en una bolsa de desechos celulares.

Una vez que hayan vuelto a suspender las células en el tubo “P+”, utilicen una

Una vez que hayan vuelto a suspender las células en el tubo “P+”, utilicen una punta nueva y depositen 50 µl de células en el lado “+” de las placas LB y LB/amp; luego

depositen 150 µl de las células en la placa LB/amp/ara.

Utilizando un esparcidor de células nuevo, repitan los pasos 4 y 5 esparciendo las células

Utilizando un esparcidor de células nuevo, repitan los pasos 4 y 5 esparciendo las células en el lado “+” de las placas LB y LB/amp y sobre toda la superficie de la placa LB/amp/ara.

Desechen este esparcidor de células en desinfectante o en una bolsa de desechos celulares.

Desechen este esparcidor de células en desinfectante o en una bolsa de desechos celulares.

Utilicen cinta adhesiva para unir las placas. Escriban su nombre en la cinta para poder

Utilicen cinta adhesiva para unir las placas. Escriban su nombre en la cinta para poder reconocer las placas más adelante. Coloquen las placas boca abajo en una incubadora a 37 °C.

Incuben las placas entre 24 y 36 horas a 37 °C.

Incuben las placas entre 24 y 36 horas a 37 °C.

Conclusiones

Conclusiones Laboratorio 5a1 Respondan las preguntas 1 a 3 antes de ver los resultados de la
Conclusiones Laboratorio 5a1 Respondan las preguntas 1 a 3 antes de ver los resultados de la

Laboratorio 5a1

Respondan las preguntas 1 a 3 antes de ver los resultados de la transformación.

Anticipen el crecimiento, si ocurre, en las siguientes placas. Recuerden que las células del cultivo P+ recibieron el plásmido, mientras que las del cultivo P– no. Utilicen un “+” si anticipan el crecimiento y un “–” si anticipan que no crecerán.

P- P+ Placa LB
P- P+
Placa LB
P- P+ Placa LB/amp
P-
P+
Placa LB/amp
P+ LB/amp/ara
P+
LB/amp/ara

¿Qué tienen en común todas las células que crecen en las placas LB/amp y LB/amp/ara?

¿Qué fragmento del plásmido pARA-R permite que estas células crezcan en estas placas?

¿Qué tamaño tiene este fragmento en bases apareadas?

¿En qué placa/s anticiparían que las células expresarán el gen rfp?

Respondan estas preguntas después de ver los resultados de la transformación.