Enzimas en Suero I y II

1) Dr. Jos G. Castao

Objetivos
Describir y manejar los parmetros fundamentales que definen la actividad enzimtica. Mtodos de medicin de enzimas como catalizadores y como protenas. Principales enzimas y utilidad clnica: Transaminasas, Fosfatasas, Creatina kinasa, troponinas, amilasa, GGT y PSA

Enzimas- Catalizadores biolgicos

Catalizadores
aumentan velocidad de reacciones qumicas un catalizador no se consume y convierte varias molculas de sustrato La concentracin final de sustratos y productos se rige por la ley de equilibrio qumico

Enzimas
Mayor parte protenas, algunas RNAs Aumenta velocidad de 106 a 1012 Condiciones de reaccin suaves Especificidad Regulacin

Propiedades de los Enzimas

Reacciones qumicas - rotura, formacin y reordenamiento de enlaces qumicos Especificidad
Dictada por el sitio activo del enzima Algunos sitios activos permiten la entrada de varios sustratos

Cofactores
Las cadenas laterales de los aminocidos de las protenas tienen un pequeo repertorio de grupos activos Necesidad de cofactores. Cofactores: Derivados de vitaminas, metales (Fe, Ca, Mg, Mn) pueden unirse como co-substratos o estar unidos al enzima de forma covalente (grupo prosttico) y permanecer unidos al enzima en multiples ciclos catalticos

Nomenclatura de Enzimas
Oxidoreductasas Transferasas Hidrolasas Liasas
Transferencia electrones (RedOx)

(EC Clase 1)

Transferencia grupos funcionales entre moleculas Rompen enlaces por entrada de H2O

(EC Class 2)

(EC Class 3)

Isomerasas Ligasas

Reacciones de eliminacin para formar dobles enlaces Reordenamiento de enlaces intramolecularmente Unen dos molculas con nuevos enlaces

(EC Class 4)

(EC Class 5)

(EC Class 6)

Base de datos de enzimas http://www.expasy.ch/enzyme Ejemplo

ID DE AN AN AN CA CA CC CC CC CC DI DI PR DR DR DR DR DR DR DR // 2.3.1.43 Phosphatidylcholine--sterol O-acyltransferase. Lecithin--cholesterol acyltransferase. LCAT. Phospholipid--cholesterol acyltransferase. Phosphatidylcholine + sterol = sterol ester + 1-acylglycerophosphocholine. -!- Palmitoyl, oleoyl, and linoleoyl can be transferred; a number of sterols, including cholesterol, can act as acceptor. -!- The bacterial enzyme also catalyses the reactions of EC 3.1.1.4 and EC 3.1.1.5. Norum disease; MIM:245900. Fish-eye disease; MIM:136120. PROSITE; PDOC00110; BRENDA; 2.3.1.43. EMP/PUMA; 2.3.1.43. WIT; 2.3.1.43. KYOTO UNIVERSITY LIGAND CHEMICAL DATABASE; 2.3.1.43. P10480, GCAT_AERHY; P53760, LCAT_CHICK; P04180, LCAT_HUMAN; P16301, LCAT_MOUSE; Q08758, LCAT_PAPAN; P30930, LCAT_PIG ; P53761, LCAT_RABIT; P18424, LCAT_RAT ;

Concepto de Isozimas
Isozimas son dos o ms formas de un enzima que catalizan la misma reaccin qumica pero tienen distinta secuencia primaria.
Por tanto codificada por distintos genes

Formacin de un complejo enzima-sustrato es el primer paso de la catlisis Sustrato se une al enzima en el sitio activo. A cantidad de enzima fija, la velocidad de la reacin aumenta con la concentracin de sustrato hasta que se alcanza la velocidad mxima de la reaccin.

Sitio activo
Llave cerradura - Emil Fischer (1890)
Sustrato + Enzima Complejo ES

Ajuste inducido - Daniel E. Koshland Jr. (1958)

Sustrato + Enzima Complejo ES

Velocidad de reaccin en funcin cantidad de sustrato

Velocidad reaccin (V) V max

[Sustrato] Velocidad: nmero de moles convertidos por unidad de tiempo

Concepto de VMAX y KM de una reaccin enzimtica

Velocidad de reaccin (V)

VMAX
VMAX 2

KM
[Sustrato]

Ensayo de actividad: Cuanta enzima est presente?

Usar: pH ptimo, temperatura ptima, etc Cantidades saturantes de sustrato y cofactores [Sustrato] = 10 x Km [S] >>>>> Km Vo [P] [E] = 1x [E] = 2x

[E] Linearidad con la cantidad de enzima

Tiempo Linearidad con el tiempo de reaccin

Curvas de progreso de la reaccin enzimtica

Aparicin de producto Parada Desaparicin de sustrato Lag V inicial [P] Lag V inicial Tiempo Tiempo [S] Parada

Velocidad inicial se considera cuando se ha consumido < 10% del sustrato

Medicin de actividad enzimtica

Medicin 2 puntos Parada Medicin mltiple y continua Parada

[P] Lag

[P] P/t V inicial Tiempo Lag P/t V inicial Tiempo

Medicin de actividad enzimtica: mtodos directos y acoplados

Directo LDH Piruvato + NADH Acoplado E1 Creatina +ATP E2 ADP + PEP CK PK Creatina- P + ADP Piruvato + ATP Desaparicin de Lactato + NAD absorbancia de NADH a 340 nm

Desaparicin de E3 Piruvato + NADH Lactato + NAD absorbancia de NADH a 340 nm E2= 5X E1; E3= 10 X E1. Concentraciones saturantes de sustratos: Creatina, ATP, PEP, NADH LDH

Medicin de enzimas como protenas

Un defecto enzimtico es una disminucin en la actividad de un enzima. Esto puede ser debido.
Tipo I: Cantidad reducida, pero la actividad especfica* es normal Tipo II: Cantidad es normal, pero la actividad especfica* est reducida debido a un defecto en el enzima. *actividad especfica = actividad enzimtica (moles/min) por
mg de protena

Enzimas como Protenas

(Ensayo enzimtico vs. Ensayo inmunolgico)
Los enzimas se siguen ensayando por su actividad enzimtica: desaparicin de sustrato o aparicin de producto. ES UNA AMPLIFICACION BASADA EN LA REACCION ENZIMATICA. Tcnicas inmunolgicas permiten medir la cantidad de enzima como protena (independiente de su actividad):
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) - La deteccin de cualquier enzima por medio de anticuerpos especficos contra esa protena Western blot (Deteccin de enzimas por anticuerpos especficos) Nos da el peso molecular y la carga (IEF) -> isozimas RIA (radioinmunoensayo)

Western blot e Inmunoblot

Protenas se obtienen de suero ( o de clulas) , y se preparan en soluccin para cargar en los pocillos de un gel de protenas (en condiciones nativas; o desnaturalizadas con detergentes, i.e. SDS). Se corre el gel y tras la electroforesis las protenas separadas se transfieren a una membrana (nitrocelulosa, PVDF, etc). La membrana se bloquea los sitios inespecficos y se aade anticuerpos contra la protena que queramos detectar (anticuerpo primario). Se lava el exceso de anticuerpo no unido. Se incuba la membrana con un anticuerpo anti- anticuerpo primario que lleve unido covalentemente una enzima que permita detectar posteriormente donde se ha unido. Se revela el Iblot con los sustratos adecuados que darn lugar a la formacin de color o a la emisin de luz (quimioluminiscencia)

Western e Inmunoblot

Transferencia a membrana de NC, PVDF

Revelado con Anticuerpo secundario

Inmunoblot Revelado : quimioluminiscencia y precipitado con color

Luminol peroxidasa Enzima: Fosfatasa alcalina 20Ab 10Ab Ag Membrana BCIP, NBT Color azul Luz Placa de Rayos X

Resultados de un inmunoblot

Reaccin de Ag y anticuerpo

Enzimas en suero tiles en diagnstico clnico

Enzima Fuente principal Aplicacin clnica

Alanina transaminasa (ALT) Aspartato transaminasa (AST) Fosfatasa alcalina* Amilasa* Creatina Kinasa* (CK)
LDH

Hgado >> Rin Corazn, Hgado, msculo, rin Hgado, hueso

Glandulas salivares, PANCREAS

Dao o enfermedad heptica Infarto Miocardio, hgado, msculo Remodelacin hueso

Enfermedades pancreticas

Corazn, Msculo y cerebro Infarto Miocardio, msculo Varios tejidos Hgado y Rin Prostata
Muy inespecfica Enfermedad hepatobiliar

-glutamiltranspeptidasa Prostate specific antigen (PSA)

carcinoma de prostata

* isozimas especficas de tejido

Transaminasas
L-Asp + -cetoglutarato (GOT) AST Oxalacetato + L-glutamato

Cofactor: Piridoxal fosfato ALT L-Ala + -cetoglutarato Piruvato + L-glutamato (GPT)

Especificidad de tejidos de AST y ALT

Concentracin relativa suero
10000

8000

* * *

Aspartato transaminasa (AST) Alanina transaminasa (ALT)

* *

6000

4000

2000

* * *

art iver scle dney reas leen ung BCs e L L H R Ki nc Sp Mu a . k P S

Transaminasas
AST sube en suero: 10 a 100 X AST sube en suero: Moderado 2 X- 5X Infarto de miocardio ALT sube en suero Afectacn heptica Hepatitis viral en paralelo a AST Necrosis heptica Shock, hipoxia Cirrosis heptica Ictericia colestsica Metastsis heptica Enf. Musculoesquelticas

LDH: lactato deshidrogenasa

Piruvato + NADH LDH Lactato + NAD

Elevacin en suero es muy inespecfica. Sube: Infarto miocardio. Insuficiencia cardaca. Anemia Megaloblastica. Hepatitis. Cncer metastasis. Traumatismos musculares. Distrofias musculares Varias isozimas: H Heart, M Muscle. LDH X: testculo
Punto de aplicacin

M4
LD-5 LD-4 LD-3 LD-2

H4
LD-1

+
Alb

Electroforesis de suero Isozimas LDH

Gamma

Beta

Alfa II Alfa I

Creatina Kinasa: Creatina (FosFo)Kinasa

Creatina +ATP CK Creatina- P + ADP Muy abundante en msculo esqueltico y cardaco, cerebro, estmago Poco abundante en hgado Isozimas: es un dmero de B y M. Combinaciones

14q32 19q13

B B 1 B 2 3

Cerebro Corazn Msculo

CK isozimas actividades en diversas patologas

Condicin clnica Creatina Kinasa Actividad (Units/L) Actividad Total Pacientes hospital no cardacos Pacientes inyeccin intramuscular Infarto miocardio hasta 24h Distrofia muscular de Duchenne (varn) Duchenne portador (hembra) 131 347 1556 1725 986 CK-3 (MM) 124 345 CK-2 (MB) 5.9 2 178 2.3 0.3 11 39 1.5 % CK-2

(2.7x -temp)
1338

(11x)
1052 971

(30x -temp)
673 15

(7.8X-crnico)

Creatina kinasa isozimas en el Infarto de Miocardio

MM MM normal IM MB 95 % MB 5%

CKMM

CKMB

CKBB

Gamma

Beta

Alfa II Alfa I

Alb

Cambios en suero: Infarto de Miocardio

50 20 Multiplos del limite establecido 10 Mioglobina Troponina cardiaca Creatina kinasa-MB Troponina Cardaca con angina inestable 5 2 1 0

Limite de decisin AMI Limite superior de normalidad

0 1 2 3 4 5 6 7 8 Das despus del infarto

Troponinas cardacas
Troponinas T e I son parte de la unidad motora del msculo y regulan la interaccin de actina con miosina. Hay isozimas de Troponina T e I especficas cardacas que pueden detectarse con tcnicas inmunolgicas muy sensibles.

Curvas ROC para TnT y TnI en el diagnstico de Infarto de Miocardio

Fosfatasa alcalina ALP (FA)

Es una glicoprotena de 74-92 kDa OALP H2O + R-O-P-O R-OH +H2PO4 pH >9.0 OH Funcin ? Aumento absorcin y excrecin Tejidos: Hgado: Hepatocitos y Canalculos biliares Hueso: Osteoblastos (calcificacin Intestino, rin: Membrana plasmtica Placenta

Fosfatasa alcalina: Isozimas +

Gamma
Beta Alfa II Alfa I Alb

Normal Normal Nios Embarazo Colestasis

32 32 32 4 32

Isozimas ALP 1: Biliar o renal 2: Heptica 3: Osea 4: Placentaria 5: Intestinal

32 1

La fosfatasa alcalina por ser una protena secretada est glicosilada

Tejidos

Suero

Hgado

Fragmentos Bilis

Las protenas del suero y extracelulares estn glicosiladas

con acido silico (cido Nacetilneuraminico) como unidad terminal. Las protenas

Asialoglicoproteinas son
reconocidas por receptores de asialoglicoproteinas y eliminadas por la bilis heptica

intracelulares no estn glicosiladas influye en la vida media:

ALP intestinal minutos ALP heptica 7 das

El tratamiento de suero con neuroaminidasa (elimina cido sialico) y permite diferenciar isozimas de ALP.
ALP ALP sea hgado

Neuraminidasa

Ambas isozimas

Fosfatasa alcalina en Clnica

Aumento de Actividad Total en suero:
Enfermedades seas: Hiperparatiroidismo (con deficit de Calcio), Enfermedad de Paget, Tumores seos, Osteomalacia y Raquitismo, Fracturas seas Enfermedades hepticas: Ictericia obstructiva extraheptica. Cncer o tumor heptico. Colestasis intraheptica. Hepatitis infecciosa. Cirrosis alcoholica Adolescentes y nios: est elevada 2 a 3 veces. Crecimiento seo

Fosfatasa alcalina en Clnica

Aumento de ALP por isozimas Isozima seo: Enfermedades seas antes mencionadas. Infarto Pulmonar. Insuficencia renal crnica. Isozima placentario: Embarazo durante el tercer trimestre Isozima intestinal: Alteraciones del Intestino delgado. Individuos con grupo sanguneo B u O Isozima heptico: las antes mencionadas. Pancreatitis aguda o crnica. Insuficiencia cardaca congestiva. Cirrosis Isozimas no identificadas (Regan o Nagao): en diversos tumores: cancer pulmonar, mama, ovario y colon

Alfa-Amilasa
Hidroliza enlaces glicosdicos alfa 1-4 de almidn, glucgeno y otros polisacridos. No hidroliza celulosa (beta 1-4), ni ramificaciones alfa 1-6. Dando lugar a glucosa, maltosa etc

NO

Amilasa Ca 2+

Glucosa Maltosa

Tejidos e isozimas: glndulas salivares: isozima S (S1, S2, S3). Est tambin presente en: pulmn, hueso, ovario y tiroides pncreas: isozima P (P1, P2, P3 muy poco) cuello uterino y trompas, epitelio intestinal yeyuno

Alfa-Amilasa. Significado clnico

Se eleva en suero especialmente en la pancreatitis aguda Otras causas de elevacin en suero: lcera perforada oclusin intestinal apendicitis aguda Rotura de Embarazo ectpico Adenocarcinoma pulmonar, ovario o pncreas Hay una hiperamilasemia no patolgica en el 1-2% de los individuos. Se debe a la unin de amilasa a IgG o IgA circulantes. Este complejo es demasiado grande para ser filtrado por el rin y por eso se da la hiperamilasemia. No tiene significado patolgico

GGT: -Glutamiltransferasa (-Glutamiltranspeptidasa)

-glutamylcysteinylglycine (glu-cys-gly) Glutation

-GGT transfiere el -glutamilo a otro aminocido. Es un enzima microsomal que se induce por consumo de alcohol, fenobarbital, etc
glu-cys-gly S S

R-O-OH
SH glu-cys-gly (GSH)

R-OH

Glutation peroxidasa glu-cys-gly

A.A -GGT Cys-Gly

(GSSG)
glu- AA

El enzima del suero es de origen heptico fundamentalmente

GGT: -Glutamiltransferasa Isozimas +

Gamma
Beta Alfa II Alfa I Alb

Normal Normal Hepatitis alcohlica Colestasis por drogas Cncer heptico 5 5

4 3 2 4 3 2 4 4 2 2 1

Elevacin de -GGT en suero: Cancer heptico primario X 10-20 Metstasis heptica X10-15 Cirrosis biliar primaria X10-15 Hepatitis crnica activa X7 Colestasis intraheptica X6 Colestasis extraheptica X5 Hepatitis alcoholica X4 Vigilancia del consumo de alcohol

Fosfatasa cida ACP

OACP H2O + R-O-P-O R-OH +H2PO4 pH < 5.0 OH Funcin ? Tejidos: Prostata 1000 veces superior a resto tejidos Hgado: Hepatocitos y Canalculos biliares Hueso: Osteoclastos (descalcificacin) Rin Plaquetas

ACP. Elevada en el cncer de prstata. Muy inespecfica. En la actualidad no se utiliza

PSA (Prostate Specific Antigen)

. PSA es una proteasa similar a la quimiotripsina (familia de la Kalikrena)
producido por el epitelio prosttico, y muy abundante en el fludo seminal. PSA se detecta en la mayor parte de los pacientes con cncer de prstata. En el suero se encuentra formando un complejo con el inhibidor de proteasas alfa-1-antiquimiotripsina (ACT). En el cncer de prstata un alto porcentaje de PSA se encuentra unido a ACT, ms que en la hiperplasia prosttica. Se determina por tcnicas inmunolgicas con anticuerpos especficos. Sus niveles disminuyen con la desaparicin del cncer de prstata, se utiliza para el seguimiento del tratamiento.

Rango de PSA normales varan con la edad: ng/ml 40 - 49 50 - 59 60 - 69 70 - 79 0.0 - 2.5 0.0 - 3.5 0.0 - 4.5 0.0 - 6.5