Produccin y aplicacin de Trichoderma spp. como antagonista de hongos fitopatgenos. Dra.

Marusia Stefanova Nalimova

Laboratorio de Bacteriologa INISAV , Calle 110 y 5taB # 514 Playa, Ciudad de la Habana, Cuba

INTRODUCCION La problemtica de la utilizacin discriminada de los fungicidas y fumigantes, como el bromuro de metilo, que puede resumirse en fungorresistencia,contaminacin ambiental y toxicidad, ha motivado la bsqueda de otros mtodos efectivos y no perjudiciales para combatir los patgenos de plantas. Una respuesta positiva y concreta a la campaa mundial de limpieza del planeta es la utilizacin de microorganismos antagnicos competitivos para la proteccin de los cultivos de los patgenos fngicos del suelo, en particular especies del gnero Trichoderma han merecido la atencin mxima como agente biocontrol. Este hongo hiperparsito acta por medio de una combinacin de competencia por nutrientes, produccin de metabolitos antifngicos y enzimas hidrolticas, y micoparasitismo, adems produce sustancias promotoras de crecimiento de las plantas. El mismo coloniza las semillas y proteje las plntulas en la fase post-emergente de patgenos fngicos, la aplicacin directa al suelo ofrece incluso una proteccin mayor a los cultivos. En las condiciones de Cuba varias especies fngicas de los gneros Phytophthora, Fusarium, Sclerotium, Rhizoctonia y Pythium, entre otros, causan problemas de importancia econmica. En el tabaco la enfermedad "pata prieta" (Phytophthora nicotianae var nicotianae) segunda por su impacto negativo en el cultivo, implica anualmente gastos significativos para la fumigacin con bromuro de metilo, aplicacin de fungicidas sistmicos y localizacin de nuevas reas no contaminadas por el patgeno. Otra patologa fngica de importancia es el damping off cuyo incremento progresivo en condiciones favorables provoca serias afectaciones en los semilleros de tomate y otras hortalizas, otros numerosos cultivos sufren en diversas fases de su desarrollo ataque por Sclerotium rolfsii, hongo de amplio rango de accin. La reduccin de la incidencia de estos patgenos y la proteccin adecuada a los cultivos se logr mediante uso de biopreparados de cepas nativas de Trichoderma, reproducidas por mtodos alternativos con subproductos nacionales y parmetros controlados, aplicadas siguiendo metodologas y dosis establecidas de acuerdo a los resultados obtenidos en los ensayos de laboratorio, semicontrolados, campo y comprobados en la produccin. La experiencia obtenida en este sentido se expone a continuacin. REPRODUCCION MASIVA Y CONTROL DE CALIDAD DE BIOPREPARADOS DE Trichoderma. Para la reproduccin masiva de las cepas promisorias de Trichoderma para el control de hongos patgenos del suelo se utilizan mtodos bifsicos, lquido-lquido y lquido-slido. Los medios estn compuestos por subproductos agrcolas y de la industria azucarera. Los mtodos alternativos se emplean teniendo en cuenta la forma de aplicacin y el mecanismo de accin que ejerce la cepa en el control de los patgenos.

La produccin se acompaa por un reglamento de control de calidad que incluye verificacin de la pureza y la efectividad biolgica de cada una de las etapas del proceso y al producto final, el cual est constitudo por la biomasa del hongo, metabolitos y residuos del medio de cultivo. Si se recobra sobre un soporte adecuado su almacenamiento se puede prolongar a 3-4 meses a temperatura ambiente. Estas producciones se realizan en biolaboratorios mediante un proceso semi-industrial lo cual requiere de un personal bien adiestrado. Uno de los biopreparados obtenidos (A-34, T. harzianum) se emplea en cultivos hortcolas y otros como arroz, man, frijol, cucurbitceas, gladiolos, etc., contra R. solani, P. aphanidermatum, P. parastica, P. capsici, R. rolfsii y otros. El biopreparado A-53 (Trichoderma spp.) es destinado fundamentalmente al cultivo de tabaco contra P. nicotianae, R. solani, Pythium spp. Con la produccin lquida se obtienen concentraciones de conidios de 2 - 3 x 108 por ml, y con la slida de 2 - 3 x 109/g. Se encuentran en la fase final las investigaciones relativas a la fermentacin sumergida y en fase slida para la produccin industrial futura. La produccin anual de biopreparados de Trichoderma depende de la necesidad de los cultivos que se protegern pero la demanda mayor casi siempre corresponde a la poca de siembra y transplante. A continuacin se seala el flujo de produccin de un biopreparado de Trichoderma.

FLUJO DE PRODUCCION Cultivo bifsico lquido-lquido y lquido-slido Cepa de Trichoderma (inculo inicial) 0,5 - 2% v/v medio melaza levadura (control esterilidad y pH) incubacin 4-7 das__________________________ 1-5 % v/v 5-10 % v/v medio slido igual medio, condiciones y controles Recobrado incubacin 7-15 das secar control 2 % lote (microscopio, pH envasar bioensayos) almacenar recobrado (homogenizar) mezclar con materia orgnica aplicar directamente

secar envase almacenar MODO DE UTILIZAR LOS BIOPREPARADOS DE Trichoderma Tratamiento de las semillas El empleo de Trichoderma por medio de las semillas es probablemente la forma ms econmica y extensiva para introducir el biocontrol en la produccin, el mtodo sencillamente consiste en tratar las semillas con una suspensin acuosa de esporas o en forma de polvo, con o sin necesidad de adherente. As la semilla recibe una cubertura protectora cuyo efecto se muestra cuando la misma es plantada en el sustrato correspondiente. Las cepas de Trichoderma verdaderamente competitivas son capaces de colonizar la superficie de la raz y la rizosfora a partir de la semilla tratada. El aislamiento A-34 (T. harzianum) recomendado para combatir los patgenos fngicos en hortalizas es capaz de proliferar en el suelo a partir de las semillas tratadas y colonizar el sustrato antes que desarrolle la raz del pimiento y el tomate asegurando su proteccin adecuada. Entre 10 y 20 das de germinacin el tamao de la raz del pimiento est de 3,5 - 5 cm y la del tomate entre 1,5 - 3,5 cm mientras que Trichoderma se detecta a 7 cm de profunidad en concentracin de 102 con/g. Se comprob que la inmersin de las semillas durante 10 minutos en la suspensin del biopreparado A-34 (10 % v/v) garantiza una cobertura de las semillas entre 91 - 100 %, el posterior secado al sol no afecta la cobertura y la viabilidad de los conidios de Trichoderma. El bioagente fue recobrado de las semillas tratadas y almacenadas a 10 y 30C durante los 45 das del ensayo, lo que demuestra la posibilidad de mantener lotes tratados en almacenaje antes de la siembra, como mnimo por este perodo de tiempo. El tratamiento de las semillas reduce los contaminantes externos como Rhizopus stolonifer y otras especies de hongos en cucurbitceas, col, cebolla, rbano, remolacha, zanahoria, habichuela, tomate y pimiento entre otros; adems incrementa el porcentaje de germinacin y estimula el crecimiento. En las pruebas de proteccin de las semillas contra las infecciones post-emrgentes se registraron coberturas elevadas por el antagonista que reducen a menos de 50 % las infecciones por F. solani y a un 3 % las de R. solani en comparacin con un 90 % en el testigo. Las semillas tratadas con Trichoderma protegen eficientemente las plntulas en el semillero contra R. solani sin necesidad de tratamiento del suelo previo a la siembra. Tratamientos combinados semillas-sustrato Dentro del complejo fngico damping-off existen patgenos tales como P. parastica y P. capsici cuya incidencia no puede ser reducida significativamente con el tratamiento de las semillas o el suelo solamente. Para obtener valores efectivos en el control de estas enfermedades es necesario un empleo combinado semillas-suelo.

La combinacin semillas - sustrato redujo la incidencia del damping-off en condiciones de hidropnico a menos de 5 % mientras que en el rea testigo el nivel de plantas de tomate muertas fue superior al 70 %. El sustrato de basalto fue tratado por irrigacin 48 horas antes de la siembra, el bioagente (cepa H34) se mantuvo viable en la roca de basalto alrededor de 100 das. El hidropnico tena antecedentes de prdidas en la postura entre 70 - 80 % en aos anteriores que fueron repetidas en las unidades testigos no tratadas con Trichoderma. La disminucin de la mortalidad de plntulas y el aumento del rendimiento demuestran la efectividad del esquema de aplicacin semillas sustrato en la fase pre- y post- emergente en semilleros. Para semillas muy pequeas como es el caso del tabaco, el tratamiento de las mismas con Trichoderma no resulta efectivo. Para este cultivo la aplicacin del biopreparado se dirige al suelo, en el momento de la siembra las semillas se mezclan con el biopreparado y se riegan en la superficie de los canteros. La cepa (A-53 (Trichoderma sp) efectiva para patgenos en tabaco coloniza el suelo de forma progresivamente superior al desarrollo del sistema radical y brinda una cobertura adecuada a las plntulas en el semillero. A los 12 das la raz apenas tiene un 0,3 cm de largo mientras que la cepa de Trichoderma aplicada se detecta a 5 cm de profundidad, a los 24 das alcanza 17,2 cm. La efectividad de esta forma de introducir el biopreparado se comprob en la provincia Pinar del Ro, en la zona tabacalera ms importante del pas, en un rea aproximada de 15000 canteros. En los suelos tratados con el bioagente con nivel de infeccin por P. nicotianae bajo y muy bajo no se registraron afectaciones por el patgeno, efecto comparable con el obtenido por el propamocarb en reas de condiciones similares. Se comprob que la cachaza y la turba son soportes y vehculos eficientes para Trichoderma donde puede permanecer viable por ms de 30 das en condiciones ambientales sin que se altere la concentracin inicial del inculo. Aunque la aplicacin del biopreparado al suelo puede ser directa, la introduccin de una enmienda orgnica en los canteros previa a la siembra favorecer el establecimiento del bioagente y el desarrollo posterior de las plantas. Tratamiento posturas - plantacin En la fase de transplante de las hortalizas (tomate y pimiento) y el tabaco por la tecnologa habitual surge la necesidad de proteger la postura sana en la plantacin. El tratamiento de la radcula de las plntulas por 10 minutos en el biopreparado al 10 % permite la transportacin del bioagente a la plantacin que registra un efecto favorable cuando la incidencia en el suelo de patgenos fngicos es reducida. Posturas de pimiento tratadas y transplantadas a microparcelas altamente infectadas por P. capsici disminuy la muerte de las mismas a pesar de las declinaciones drsticas hasta los 35 das. En el caso del tabaco el efecto del tratamiento de la postura se reduce por el hecho de transplantar en surcos con agua abundante. La introduccin del biopreparado directamente en el surco reduce la incidencia de la pata prieta pero requiere de una mayor cantidad de biopreparado por lo que su utilizacin de esta forma debe ser analizada para algunos campos de mayor riesgo. Es evidente que la presencia de Trichoderma en la plantacin es necesaria, la forma ms eficiente sin duda es la transportacin del bioagente junto con el sustrato donde el mismo se encuentra previamente establecido como micobiota normal de la rizosfora. Esto sin duda se logra con la

tecnologa de produccin de postura en sepellones, Trichoderma se establece muy bien en el estircol, casting y biotierra que se utilizan como sustrato. La micropropagacin tambin ofrece la posibilidad de introducir la proteccin por Trichoderma en mltiples cultivos que se extienden por esta va. ESTUDIOS EPIDEMIOLOGICOS DE LOS PATOGENOS Y EL PAPEL DE LA PLANTA EN EL BIOCONTROL POR Trichoderma Es bien conocida la definicin de la enfermedad como resultado de una interaccin entre la planta hospedante y el patgeno, y organismos antagnicos que limitan la actividad del patgeno y/o elevan la resistencia de la planta. La importancia del hombre en esta relacin radica en saber manejar las especificidades de cada uno para lograr que prevalezca la interaccin a favor de la planta y el antagonista. Esto no es posible sin conocimientos de la etiologa de la enfermedad que se desea controlar, el hbito del hongo fitopatgeno, su forma de propagarse y permanecer en el campo. Trichoderma siendo un microorganismo competitivo ofrece una proteccin biolgica a la planta, destruye el inculo patgeno presente y contribuye a prevenir su formacin. Se confirm mediante un estudio epidemiolgico que la marchitez del pimiento ( P. capsici) aparece en el perodo floracin - fructificacin y con una propagacin rpida entre 7 - 10 das. En los campos con incidencia de la enfermedad se detect entre 5 y 35 propgulos/g de suelo. Desde luego no es posible esperar un buen control por Trichoderma en campos con antecedentes a favor del patgeno fngico. Esto fue claramente demostrado tambin en el cultivo del tabaco, las aplicaciones biolgicas dirigidas a suelos con infeccin media y alta por P. nicotianae solamente reducen el ndice de infeccin a un 30 % y a un 60 % respectivamente. El anlisis riguroso de los antecedentes y el nivel de inculo en el suelo ayuda a la toma de decisiones con vistas a proporcionar un control eficiente y optimizar la efectividad de Trichoderma. Tampoco se puede obtener el control deseado con el uso de Trichoderma cuando el material de siembra de hecho est contaminado con hongos nocivos y mucho menos de crecimiento rpido como S. rolfsii, p. ej. No se logr reducir el dao por este patgeno en topinambur, debido a que los bulbos tratados con el biopreparado resultaron ser portadores asintomticos del hongo, en este caso el tratamiento con benomyl result igualmente inefectivo. La incidencia de la marchitez del pimiento fue registrada fundamentalmente en terrenos encharcados, adems donde el cultivo fue doblado, todas las plantas con el llamado "cuello de ganso" resultaron afectadas, lo cual est acorde con el hbito del patgeno e indica la necesidad imperiosa de que los tratamientos con el biopreparado sean acompaados de prcticas culturales adecuadas para elevar su efectividad. El manejo de las plantas mediante la rotacin de cultivos favorece a Trichoderma a librar el suelo de los propgulos del patgeno, vulnerables durante su latencia en ausencia del hospedante, por esta razn la utilizacin del biopreparado en los cultivos a rotar en las reas altamente infectadas por P. nicotianae ser una forma a contribuir en la reduccin de la poblacin del patgeno en un menor plazo de tiempo. Adems la preparacin adecuada del terreno, la mejor fecha de plantacin, fertilizacin y riego actan a favor de la combinacin planta-Trichoderma asociadas.

La introduccin del biocontrol por Trichoderma en el manejo integrado de plagas por cultivo es la forma ptima de explotar las posibilidades que brinda el microorganismo como antagonista de suelo. COMPATIBILIDAD CON BIOFERTILIZANTES, BIOESTIMULANTES Y PLAGUICIDAS Desde luego para integrar hay que conocer entre otros aspectos la compatibilidad entre Trichoderma y los agroqumicos, as como la interaccin que existe con los biofertilizantes y bioestimulantes. Resulta que el tratamiento combinado con el bioestimulante Biozyne incrementa la germinacin y el crecimiento de las plantas de tomate, tambin existe compatibilidad con el biofertilizante a base de Azotobacter chroococcum , por tanto una combinacin entre ellos es factible incluso en tratamiento de semillas. El conjunto Trichoderma - Micorrizas favorece el desarrollo de las plantas del tabaco y no afecta el hiperparasitismo sobre P. nicotiane por lo que se pueden aplicar los bioagentes de forma conjunta. De los plaguicidas el mancozeb y thiram no deben emplearsse el mismo da con el biopreparado de Trichoderma por ser ligeramente a moderadamente txicos. El oxicloruro de cobre, metalaxyl, zineb, dimethomorph, mancozeb, dimethoato, lambdacihalotrina, difenamida, trifluralin y napropamida son compatibles con las cepas de Trichoderma. En el caso de desinfeccin de las semillas con hipoclorito de sodio y cido clorhdrico contra bacterias y virus, el posterior tratamiento con Trichoderma no se ve afectado, sin embargo no ocurre as cuando los mismos son tratados con hidrxido de calcio que prcticamente inactiva la accion del bioagente; algo similar sucede con el benomyl catalogado de txico en las pruebas de laboratorio. Los tratamientos de las semillas con Promec contra mosca blanca pueden efectuarse despus del tratamiento con el biopreparado de Trichoderma sin ejercer efecto negativo.

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